專利名稱：：用于檢測疾病相關標志物的磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種磁微粒分離化學發光免疫分析測定試刑盒及其制備方法。
背景技術：
：近十年來標記免疫分析技術的研究和應用發展迅速，已廣泛應用于生物醫學基礎理論研究及臨床疾病診斷各領域。其中技術工藝成熟，具有先進性且實用性強，易于推廣的主要有放射免疫分析、酶免疫分析、時間分辨焚光免疫分析和化學發光免疫分析等四種。這些超微量檢測技術的基本理論大體相同，但是所用示蹤劑及所發出的信號各不相同。根據大量的實驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩定性、準確性及發展前景來看，依次為化學發光免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。磁微粒具有超順磁性，在磁場下具磁場響應性，將磁微粒應用于免疫檢測的固相，將大大提高反應的表面積，更容易進行固相、液相分離，可提高;f全測的靈敏度。采用微小的磁微粒作為固相可增加包被表面積，從而增加抗原或抗體的吸附量，既加快了反應速度，也使清洗和分離更筒便。'磁分離-酶標記-化學發光技術是酶標記免疫技術的新發展，該技術以微米級磁微粒為載體，利用表面有機物提供的羧基活性基團與蛋白質氨基共價結合，釆用抗體進行"搭橋"成免疫磁微粒，可進行抗原、抗體反應。該技術的新穎之處有(l)利用順磁鐵微粒為固相載體，外包被單克隆抗體，增加抗原、抗體的接觸面積及底物發光面積，提高反應的靈敏度，并采用旋轉磁場使磁微粒起攪拌作用及分離結合抗原-抗體與游離抗體的作用。(2)在液相反應中，使用發光增強劑，將水分子從發光底物的發光位點排開，同時還可縮短發光的達峰時間。(3)單克隆抗體，提高了反應的特異性。-現有國外化學發光免疫分析試劑盒為封閉式全自動化學發光測量系統，需要昂貴的全自動化學發光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷和科研工作。本發明的試劑盒可應用于開放式的化學發光測量儀，磁微粒分離劑可以通用，操作簡便，使用成本低，更易推廣應用。
發明內容本發明同時解決了上述問題，即將磁微粒技術與化學發光免疫分析技術有效地結合，提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩定地檢測試劑盒，該試劑盒適于在產業上有效地推廣應用。本發明的目的是提供一種用于檢測疾病相關標志物的磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒。本發明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。根據本發明的試劑盒包括l)校準品；2)包被有鏈親和素的磁微粒；3)辣根過氧化物酶標記物和生物素標記物混合液；以及4)化學發光底物。進一步，根據本發明的制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以純品原料配制4交準品；2)制備辣根過氧化物酶和生物素標記物混合液；3)以鏈親和素包被磁微粒；4)分裝上述校準品、標記物混合液和化學發光底物魯米諾或異魯米諾；以及5)組裝為成品。在根據本發明的方法中，在標記步驟2)中，所述標記物混合液是將辣根過氧化物酶標記單克隆抗體與生物素標記的單克隆抗體以體積比為1:1混合，以20~50%小牛血清配制而成。在所述包被步驟3)中鏈親和素包被的磁微粒為1~3pm粒徑、四氧化三鐵內核、表面包裹帶有活性基團如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)的聚合物，其使用濃度為510mg/mL;通過碳二亞胺法進行包被磁微粒；以封閉液封閉包被的磁微粒，所述封閉液為含有1.0%牛血清白蛋白、1.0%酪蛋白、pH值為7.4的0.05mol/L磷酸緩沖液。具體的上述試劑盒可以包括校準品、磁微粒、標記物混合液、化學發光底物液與洗滌緩沖液等。其中，所述校準品的原料為標準級，純度不低于90%、抗體包被于磁微粒上、標記酶為辣根過氧化物酶、化學發光底物液為魯米諾或異魯米諾、洗滌緩沖液為Tris-HCl。本發明"用于檢測疾病相關標志物的磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒，'具有簡便、快速、靈敏、穩定等優點。該測定試劑盒的各項指標均達到或超過酶聯免疫分析法。并且，根據本發明的檢測系統為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學發光測量儀，特別適合廣大的中小醫院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。本發明的試劑盒是采用"雙抗體夾心一步法"反應模式，既有效地利用了磁微粒分離技術和化學發光技術原理，又確保了檢測的靈敏性和分離的有效性。另外，這種模式還便于操作和生產。本發明的試劑盒應用的是酶催化發光底物，通過檢測發光底物產生的光信號代替酶聯免疫分析中的顯色底物，因而具有與酶聯免疫分析同等的特異性，而靈敏度大大提高，比現今的酶聯免疫吸附分析靈敏度提高約IO倍，可為臨床診斷提供更為特異、快速、可靠的依據。圖1顯示了腫瘤醫院用本發明的CA19-9磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒和DPC試劑盒檢測80份腫瘤病人相關性的結果，其中，DPC試劑盒的測定值為X軸，本發明的試劑盒的測定值為Y軸，結果經統計學處理得相關系數r-0.9833,y=0.9286x-4.2054。圖2顯示了腫瘤醫院用本發明的AFP磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒和DPC試劑盒檢測98份腫瘤病人相關性的結果，其中，DPC試劑盒的測定值為X軸，本發明的試劑盒的測定值為Y軸，結果經統計學處理得相關系數r-0.9909,y=0.9966x-7.783。圖3顯示了北華醫院用本發明的FSH磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒和DPC試劑盒檢測66份病人相關性的結果，其中，DPC試劑盒的測定值為X軸，本發明的試劑盒的測定值為Y軸，結果經統計學處理得相關系數r=0.9887,y=0.9530x+2.2401。圖4顯示了北華醫院用本發明的Ins磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒和DPC試劑盒檢測60份病人相關性的結果，7其中，DPC試劑盒的測定值為X軸，本發明的試劑盒的測定值為Y軸，結果經統計學處理得相關系數r=0.9689，y=0.932lx+0.4163。具體實施例方式實施例1制備本發明的CA19-9》茲微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒一、標記物制備1.辣才艮過氧化物酶標記CA19-9單抗采用高》典酸鈉氧化法，具體標記過程如下稱取5mgHRP溶解于lml雙蒸水中。于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaI04溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。力。20nl0.2MpH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mg抗體在lml0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。將上述液裝入透析袋中，對0.15MpH7.4PBS透析，4。C過夜。10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，加入等量優質丙三醇，分裝后，-20°。保存。2.CA19-9包被單抗用生物素標記，對PBS充分透析，加等體積甘油，-20。C以下保存。標記物混合液是由體積比為1:1~1:3的生物素標記抗體工作液和酶標記配對抗體工作液混合而成。二、CAl9-9校準品的制備用CA19-9純品配制，濃度分別為0、2、6、20、60、200U/ml，共6瓶。三、磁微粒的制備將粒徑為1~3pm的磁微粒子加磁場，靜置510min,倒出上清，用pH值為7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，并用該溶液進行懸浮，濃度為10-20mg/mL;每毫升懸浮液中加入鏈親和素100~200嗎和EDC,在4。C下攪拌過夜后，加磁場，靜置510min，倒出上清，用含有0.5%~1.0%牛血清白蛋白、0.5%~1.0%酪蛋白、0.02mol/L的磷酸緩沖液(pH為7.4)于室溫封閉3~4小時；最后用pH值為7.4、含0.5%BSA的0.05mol/LTris-HCl緩沖液清洗3~5次，并用該溶液配制成810mg/mL的工作液。磁微粒在4。C保存，不應凍存，用時輕輕搖勻。四、標記單抗稀釋液.Tris12.120gBSA5gProclinlml雙蒸水1000ml五、化學發光底物液本發明所使用的辣根過氧化物酶(HRP)的化學發光底物液的配制方法A液在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的對碘苯酚。B液在雙蒸水中加入種檬酸三鈉和檸檬酸，配制成O.lMpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，在此溶液中加入200mg/mL的過氧化氫溶液。使用方法A、B液雙組分試劑，在使用前根據使用量等體積混合。六、洗滌^_沖液Tris24gNaCl160gKC14gHC115mL去去離子水lOOOmL調整pH值至7.4。七、半成品及成品組成上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩定性檢定合格才能組裝成腫瘤相關抗原19-9磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒，組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。八、按照本領域中常規的制造及檢定規程對制備的試劑盒進行檢定，結果見下表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>腫瘤醫院用本發明的CA19-9磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒和DPC試劑盒檢測80份腫瘤病人。結果經統計學處理得相關系數r=0.9833,y=0.9286x-4.2054。說明"腫瘤相關抗原19-9磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒的臨床符合率、準確性、特異性、精密性、靈敏度和穩定性是完全合格的。,綜上，在本發明的研究過程中，本發明的發明人首先對所用的原材料進行了篩選實驗和質量鑒定，包括標記抗體與包被抗體的活性、》茲孩i粒的吸附性能和變異大小、HRP的活性、化學發光底物的發光強度及發光持續時間等。然后對包被方法進行了研究，用不同的包被緩沖液和封閉液進行實驗，選擇出最適合的包被液和剖閉液，-通過抗體不同包被濃度實驗找到最^i^變條件。對于HRP的標記可以有不同的方法，通過反復探索和對比實驗最終找到了簡便、產率高、成本低、質量可靠的標記方法，并對不同的酶稀釋液進行了長期的考察實驗，配制出了能夠使酶標記物長期保持活性穩定的稀釋液。本發明的發明人還對試劑盒的反應模式和反應條件進行了實驗研究，最終確定了雙抗體夾心一步法反應模式，并就不同的反應時間對實驗結果的影響進行了實驗，確定最適合的反應時間。通過對化學發光底物液發光持續時間的測定及不同發光時間對測定值的影響實驗表明在加入化學發光底物液后5-30分鐘之間進行測量為最佳，其結果也較為準確。實施例2制備本發明的曱胎蛋白(AFP)磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒除酶和生物素標記的抗體換成AFP單克隆抗體作為標記物混合物，才交準品濃度為0、5、20、60、200、500ng/ml不同以外，使用與實施例1相同的方法制備AFP磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒。按照本領域中常規的制造及檢定規程對制備的試劑盒進行檢定，見下表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>腫瘤醫院用本發明的AFP磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒和DPC試劑盒檢測98份病人。結果經統計學處理得相關系數r=0.9909，y=0.9966x-7.783。說明曱胎蛋白(AFP)》茲樣i粒定量測定試劑盒(化學發光法)的臨床符合率、準確性、特異性、精密性、靈敏度和穩定性是完全合格的。本發明除實施例1，2外的檢測試劑盒還包括以下產品腫瘤標志物系列癌胚抗原(CEA)、鐵蛋白(Fer)、P2微球蛋白((32-MG)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、p-人絨毛膜促性腺激素(|3-HCG)、游離(3-人絨毛膜促性腺激素(fp-HCG)、前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(fPSA)、腫瘤相關抗原125(CA125)、月中瘤相關抗原15-3(CA15-3)、月中瘤相關抗原50(CA50)、腫瘤相關抗原242(CA242)和肺瘤相關抗原724(CA724)磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒。這些試劑盒均可采用本發明所提供的制備方法，只是所釆用的抗體、校準品原料名稱不同，其組成、制備方法和檢測原理均相同。實施例3制備本發明的促卵泡生成素(FSH)^茲微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒除酶和生物素標記的抗體換成FSH單克隆抗體作為標記物混合物，校準品濃度為0、1.0、2.5、10、40、160mlU/ml不同以外，使用實施例1相同的方法制備FSH磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒。按照本領域中常規的制造及檢定規程對制備的試劑盒進行檢定，見下表3:表3檢驗項目檢驗標準檢驗結果準確性平均回收率在90.0-110.0%101.9%特異性與其類似物的交叉反應率《0.01%0.005%精密性cv(%)《15%(n,7%靈敏度《0.5mlU/mL0.4mlU/mL穩定性各試劑組分置37'C至少6天符合標準12北華醫院用本發明的FSH磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒和DPC試劑盒檢測66份病人。結果經統計學處理得相關系數r=0.9887,y=0.9530x+2.2401。說明"FSH磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒的臨床符合率、準確性、特異性、精密性、靈敏度和穩定性是完全合格的。本發明的檢測試劑盒還包括以下產品激素系列垂體泌乳素(PRL)、促黃體生成素(LH)和促曱狀腺素(TSH)磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒。這些試劑盒均可采用本發明所提供的制備方法，只是所釆用的抗體、校準品原料名稱不同，其組成、制備方法和檢測原理均相同。實施例4制備本發明的胰島素(Ins)磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒除酶和生物素標記的抗體換成Ins單克隆抗體作為標記物混合物，沖交準品濃度為0、1.2、5、15、50、150plU/ml不同以外，使用與實施例1相同的方法制備INS磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒。按照本領域中常規的制造及檢定規程對制備的試劑盒進行檢定，見下表4:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>北華醫P免用本發明的Ins》茲微粒化學發光免疫分析測定試劑盒和DPC試劑盒檢測60份病人，結果經統計學處理得相關系數r=0.9689,y=0.9321x+0.4163說明"胰島素(Ins)磁微粒定量測定試劑盒(化學發光法)的臨床符合率、準確性、特異性、精密性、靈敏度和穩定性是完全合格的。本發明的^r測試劑盒還包括以下產品血清C肽(C-P)》對斂粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒。這些試劑盒均可采用本發明所提供的制備方法，只是所采用的抗體、校準品原料名稱不同，其組成、制備方法和檢測原理均相同。實施例5本發明磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒的使用方法以實施例1制備的CA19-9磁微粒分離測定試劑盒的具體操作如下1)自4'C冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘；2)將圓底聚苯乙烯試管編號；3)反應管中分別加待測樣本和各濃度校準品每孔加0、2、6、20、60、200U/ml各25pl，然后各孔加標記物10(^1,用微量震蕩器充分振蕩混勻，室溫溫育1小時；4)每管加磁分離劑混勾，室溫放置5分鐘，將各管插入磁分離器上，放置2分鐘后，傾倒上清，倒放在吸水紙上吸干，再將分離器復位(切勿拔出試管)；5)每管加稀釋洗滌液50(Hd，從磁分離器上取下試管架，混勻，將試管架放回磁分離器，扣緊，放置2分鐘，再傾倒上清，分離器倒放在吸水紙上吸干后，再將分離器復位(勿拔出試管)，重復操作一次；6)各孔加化學發光底物液lOOpl;7)必須于加化學發光底物液后的第30~90分鐘內測量，在化學發光測量儀上依序測量各孔的發光強度(RLU)，測量時間1秒/孔；8)以校準品濃度為橫坐標，RLU值為縱坐標繪出標準曲線，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的CA19-9的濃度。本發明用于檢測疾病相關標志物的磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒的使用方法和操作過程與CA19-9磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒的使用方法和操作過程完全一致。權利要求1、一種用于檢測疾病相關標志物的磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括:1)校準品；2)包被有鏈親和素的磁微粒；3)辣根過氧化物酶標記物和生物素標記的疾病相關標志物抗體；以及4)上述酶所作用的化學發光底物為魯米諾或異魯米諾。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述疾病相關標志物為1)腫瘤標志物系列其中，所述腫瘤標志物為曱胎蛋白、癌胚抗原、鐵蛋白、(32微球蛋白、人絨毛膜促性腺激素、(3-人絨毛膜促性腺激素、游離(3-人絨毛膜促性腺激素、前列腺特異性抗原、游離前列腺特異性抗原、胂瘤相關抗原125、腫瘤相關抗原15-3、肺瘤相關抗原19-9、腫瘤相關抗原50、紳瘤相關抗原242或腫瘤相關抗原724;.2)激素系列其中，所述激素為垂體泌乳素、促黃體生成素、促卵泡生成素或促曱狀腺素；3)糖尿病標志物系列其中，所述糖尿病標志物為胰島素或血清C肽。3、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)以純品原料配制校準品；2)用辣根過氧化物酶和生物素標記疾病相關標志物抗體；3)以鏈親和素包被磁微粒；4)分裝上述校準品、標記物混合液和化學發光底物魯米諾或異魯米諾；以及5)組裝為成品。4、如權利要求3所述的方法，其特征在于，在標記步驟2)中，所述標記物混合液是將辣根過氧化物酶標記單克隆抗體與生物素標記的疾病相關標志物單克隆抗體以體積比為1:1混合，以20~50%小牛血清配制而成。5、如權利要求3所述的方法，其特征在于，在所述包被步驟3)中鏈親和素包被的磁微粒為13pm粒徑、四氧化三鐵內核、表面包裹帶有活性基團的聚合物，其使用濃度為5~10mg/mL;通過碳二亞胺法包被磁微粒；以封閉液封閉包被的磁孩i粒，所述封閉液為含有1.0%牛血清白蛋白、1.0%酪蛋白、pH值為7.4的0.05mol/L磷酸緩沖液。6、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述活性基團為氨基或羧全文摘要本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種用于檢測疾病相關標志物的磁微粒分離化學發光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。根據本發明的試劑盒包括1)校準品；2)包被有鏈親和素的磁微粒；3)酶標記物和生物素標記的疾病相關標志物抗體；以及4)化學發光底物。進一步，根據本發明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以純品原料配制校準品；2)以鏈親和素包被磁微粒；3)制備酶和生物素標記物混合液；4)分裝上述校準品、化學發光底物和酶和生物素標記物混合液；以及5)組裝為成品。本發明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩定等優點。文檔編號G01N33/543GK101377490SQ20071012111公開日2009年3月4日申請日期2007年8月30日優先權日2007年8月30日發明者唐寶軍,應希堂,胡國茂申請人:北京科美東雅生物技術有限公司