專利名稱：一種用于超薄切片的樣品包埋方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域中，樣品的包埋方法，特別是涉及一種用于制作超薄切 片的樣品的包埋方法。
技術背景電子顯微鏡是細胞生物學研究中的重要工具，不僅能夠研究細胞的亞顯微結構， 而且能對各種酶、除酶以外的其它蛋白質、核酸、脂肪等生化物質以及C^+等無機離 子進行精確的亞細胞定位；還能追蹤細胞內生化物質的合成、分解等動態變化，應用 非常廣泛。電子顯微鏡技術中，超薄切片制作是最基本、最常用的技術。超薄切片制 作過程中，對樣品的包埋是關鍵的步驟。胡適宜和徐麗云曾提出薄層包埋法(胡適宜， 徐麗云(1993)介紹一種超薄切片中細胞定位的薄層包埋方法，植物學通報，10(1): 63 64),后來邢樹平等又對這一方法進行改進(邢樹平等(1999)薄層包埋法的改進， 植物學通報，16 (4) : 468)，獲得了較好的效果。但是他們的方法不能使得樹脂在聚 合過程中保持與外界空氣隔絕，因此只適用于利用Epon812、 Spurr等環氧類樹脂進行 包埋的情況，而免疫電鏡中常用的LR White等樹脂，因其聚合過程中必須隔絕氧氣， 目前還只能采取傳統的膠囊包埋法(Scoccianti et al. (2003) Involvement of the ubiquitin/proteasome pathway in the organization and polarised growth of kiwifruit pollen tubes. Sex Plant Reprod 16:123-133)。而用膠囊法包埋的樣品(尤其是花粉管等)，在 包埋塊中的排列方向不一，因此在后續的切片過程中很難精確定位特定的組織或細 胞，嚴重影響后續的超薄切片的效率和質量。 發明內容本發明的目的是提供一種簡單有效的用于超薄切片的樣品包埋方法。一種用于超薄切片的樣品包埋方法，包括以下步驟1)在硬質支持物上設置一 可拆除的密封的槽體，所述槽體和硬質支持物之間是密封連接的；2) —可以彎折的蓋體，將其與所述槽體的頂部密封連接；其中，預留一部分尚 不進行密封連接的部位，作為樣品和包埋物植入口；3) 從所述樣品和包埋物植入口將所需包埋的樣品植入所述槽體中，再將包埋物 注入，并充滿所述槽體的內部空間；4) 將所述樣品和包埋物植入口部分的所述蓋體和所述槽體密封；5) 使注入槽體的所述包埋物固化；6)拆除所述蓋體、槽體及支持物，得到包埋了樣品的固化包埋物。 在上述過程中，槽體是用膠粘結在硬質支持物上的。可以用的膠的種類是非常廣 泛的，只要是能夠將槽體和硬質支持物粘結住即可，例如502膠等。為了方便將固化的包埋物取出，在所述硬質支持物上可以先粘結鋪設一層非透氣 性的隔離膜，所述槽體設置在該隔離膜上。所述用作隔離膜的材料也是非常廣泛的， 例如透明膠帶，就是一個很好的選擇。 一般市售的透明膠帶即可，其寬度應大于或等于硬質支持物的寬度；所述槽體是用膠粘結在隔離膜上的。所述蓋體和槽體之間是用膠粘結在一起的。可以用的膠的種類也是非常廣泛的， 只要是能夠將槽體和蓋體之間粘結住即可，例如502膠等所述槽體和蓋體的選材都是非常廣泛的，只要是不透水，能夠密封就可以。比如槽體可以用廢電話卡剪成的薄片制作(切割成約2mm寬的小條即可)，既經濟又方便。蓋體可以用具有一定柔韌度的透明膠片來充當。硬質支持物可以選擇載玻片或硬 質塑料等平整的物品。所述包埋物可以選擇的范圍是非常廣泛的， 一般的包埋材料均可以，例如丙烯酸 樹脂或環氧樹脂(Epon812樹脂或Spurr樹脂)。特別是對于丙烯酸樹脂LR White樹 脂尤為適用，因為該方法可以保證LR White樹脂與外界空氣的隔絕。在樹脂的固化過程中，根據不同的樹脂要采用不同的固化條件，LRWhite樹脂的 固化溫度為50—60°C，固化時間是24—48 h; Spurr樹脂的固化溫度為55—60°C， 固化時間是16 — 24 h; Epon812樹脂的固化溫度為37—45—60'C，固化時間是每步 12 h。本發明的方法簡單易行，可高效率地獲得較高質量的超薄切片，并應用于細胞超 微結構觀察和免疫電鏡觀察。樣品可以為花粉管、菌絲、懸浮培養的單細胞、原生質 體和需要精確定位的特定組織或細胞等。本發明方法中所用到的材料均是常見的材 料，沒有特殊的要求，甚至可以說是"廢物利用"。作為隔離膜的透明膠帶可以使得 聚合好后的樹脂薄片很容易地和載玻片分離；用電話卡小條自制的槽體可以根據實驗 需要隨意調整槽體的大小以及深度；而具有一定硬度的透明膠片既能保證在加樣以及 聚合時觀察樣品的位置，又能保證樹脂聚合過程中樹脂薄片不會發生大的變形。此外， 透明膠帶、電話卡小條以及透明膠片都具有空氣不通透性，加上選用502膠合劑作為 粘連劑，共同保證了槽體中的LR White樹脂與外界空氣隔絕。本發明使應用LR White 樹脂進行薄層包埋變得簡單易行，具有較大的實際應用價值。
圖l為本發明的流程示意圖。 圖2為本發明的方法制作的青扦花粉管頂端徑向超薄切片圖片。圖3為常規膠囊包埋法制作的獼猴桃花粉管頂端超薄切片圖片。
具體實施方式
實施例1、利用本發明的方法制作青扦花粉管頂端LR White樹脂薄層包埋切片 如圖1所示，制作青扦花粉管頂端LR White樹脂薄層包埋切片的具體步驟如下:1. 如圖1一A所示，取l張潔凈的載玻片l，并在其中的一面粘貼上寬度和載玻 片1相同的透明膠帶2。2. 如圖1一B所示，裁取4條寬度均為2mm的塑料質地的電話卡小條，作為槽 壁3，其中兩條長lcm，兩條長2cm;用502膠將四條槽壁3粘結在一起，并將其底 部粘貼在透明膠帶上，形成一個槽體。3. 如圖1一C所示，裁取面積大于槽體橫切面的透明膠片作為蓋體4，并用502 膠將其粘貼于槽體上，但要留一角暫時不粘，作為放入樣品以及樹脂的樣品和包埋物 植入口 5。4. 如圖1一D所示，從樣品和包埋物植入口 5將6放入槽體總，并注滿LRWhite 樹脂，再用502膠將包埋物植入口 5處的蓋體5和槽體之間密封粘貼住。5. 將載玻片連同封閉好的槽體放入55'C恒溫箱中，進行熱聚合35h。6. 取出經過聚合的槽體，去除載玻片l、透明膠帶2、電話卡小條3以及透明膠 片4，得到一片聚合好的樹脂薄片。7. 然后按照一般的常規超薄切片技術進行切片和觀察即可。圖2為利用上述方法制作的青扦花粉管頂端的超薄切片，圖3為采用傳統的膠囊 法包埋制作的獼猴桃花粉管頂端的超薄切片(Scoccianti et al. (2003) Involvement of the ubiquitin/proteasome pathway in the organization and polarised growth of kiwifruit pollen tubes. Sex Plant Reprod 16:123-133)。可以明顯看到，用傳統方法得到的切片明顯偏離 徑向切面，用本發明的方法獲得的切片，在切片方向的精確定位上，其效果要明顯好 于用常規方法獲得的切片。當然，在上述實施例中，也可以不設隔離膜，直接將槽體粘結在載玻片上，同樣 可以達到本發明的目的，只不過將樹脂薄片從載玻片上取下時會有一定難度。如果制作用其它樹脂進行包埋的切片，和本實施例的步驟是相同的，只是根據不 同樹脂的性質調整聚合時的條件即可。
權利要求
1、一種用于超薄切片的樣品包埋方法，包括以下步驟1)在硬質支持物上設置一可拆除的密封的槽體，所述槽體和硬質支持物之間是密封連接的；2)一可以彎折的蓋體，將其與所述槽體的頂部密封連接；其中，預留一部分尚不進行密封連接的部位，作為樣品和包埋物植入口；3)從所述樣品和包埋物植入口將所需包埋的樣品植入所述槽體中，再將包埋物注入，并充滿所述槽體的內部空間；4)將所述樣品和包埋物植入口部分的所述蓋體和所述槽體密封；5)使注入槽體的所述包埋物固化；6)拆除所述蓋體、槽體及支持物，得到包埋了樣品的固化包埋物。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述槽體是用膠粘結在硬質支持 物上的。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于在所述硬質支持物上先粘結鋪設 一層非透氣性的隔離膜，所述槽體設置在該隔離膜上。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述隔離膜為透明膠帶；所述槽 體是用膠粘結在隔離膜上的。
5、 根據權利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述蓋體和槽體之 間是用膠粘結在一起的。
6、 根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述硬質支持物為載玻片；所述 槽體是用電話卡的塑料薄片制成的；所述蓋體為透明膠片。
7、 根據權利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述包埋物為丙烯酸樹脂或環氧樹脂。
8、 根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述丙烯酸樹脂為LRWhite樹脂; 所述環氧樹脂為Epon812樹脂或Spurr樹脂。
9、 根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述LR White樹脂和Spurr樹脂 的固化溫度為55—60。C，固化時間是16—24 h; Epon812樹脂的固化溫度為37—45 一60'C，固化時間是每步12 h。
10、 根據權利要求1或2或3或4所述的方法，其特征在于所述樣品為花粉管、 菌絲、懸浮培養的單細胞、原生質體、組織或細胞。
全文摘要
本發明公開了一種用于超薄切片的樣品包埋方法，該方法包括以下步驟1)在硬質支持物上設置一可拆除的密封的槽體，所述槽體和硬質支持物之間是密封連接的；2)一可以彎折的蓋體，將其與所述槽體的頂部密封連接；其中，預留一部分尚不進行密封連接的部位，作為樣品和包埋物植入口；3)從所述樣品和包埋物植入口將所需包埋的樣品植入所述槽體中，再將包埋物注入，并充滿所述槽體的內部空間；4)將所述樣品和包埋物植入口部分的所述蓋體和所述槽體密封；5)使注入槽體的所述包埋物固化；6)拆除所述蓋體、槽體及支持物，得到包埋了樣品的固化包埋物。本發明的目的是本發明使應用LR White樹脂進行薄層包埋變得簡單易行，具有較大的實際應用價值。
文檔編號G01N1/28GK101126684SQ20071012047
公開日2008年2月20日 申請日期2007年8月20日 優先權日2007年8月20日
發明者林金星, 盛仙永, 胡正海 申請人:中國科學院植物研究所