專利名稱：：人類免疫缺陷病毒抗原/抗體化學發光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種人類免疫缺陷病毒抗原/抗體測定試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：艾滋病，艮卩獲得性免疫缺陷綜合癥(AcquiredImmureDeficiencySyndrome,AIDS),是由人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的，目前尚不能治愈、病死率高的慢性進行性疾病。根據艾滋病臨床表現的不同，可將其分為急性感染期、潛伏期、艾滋病前期、典型艾滋病期四個時期。急性感染期的AIDS通常僅表現為發熱、皮疹、淋巴結腫大、乏力、出汗、惡心、嘔吐、腹瀉、咽炎等輕微癥狀，絕大多數患者在HIVl/2感染26周后，血清中可出現HIV抗體，可作為早期診斷和疾病篩査的重要指標。急性期癥狀持續314天后，AIDS出現一個長短不等的(平均210年)的無癥狀潛伏期，HIV病毒持續繁殖，具有強烈的破壞作用，患者卻無任何臨床癥狀。進行廣泛的篩查，特別是把好輸血關，可大大降低AIDS傳播的幾率。潛伏期之后,疾病繼續發展即進入艾滋病前期和典型艾滋病期，感染者由于免疫功能缺陷導致各種感染，病程發展的后期，感染者出現各種機會性感染和惡性腫瘤，發生嚴重后果和極高的死亡率。HIV病毒是一種逆轉錄RNA病毒，常見的為HIV-1型，HIV-2型病毒較為少見。電鏡下HIV病毒呈球形，直徑100120nm，可見一致密的圓錐狀核心，內含病毒RNA分子和酶(逆轉錄酶、整合酶、蛋白酶)，病毒外層囊膜系雙層脂質蛋白膜，其中(HIV-1型)嵌有gpl20和gp41，分別組成刺突和跨膜蛋白(HIV-2型相對應的蛋白為gp36)。囊膜內面為P17蛋白構成的衣殼，其內有核心蛋白(P24)包裹RNA。HIV-l+2型主要侵犯人類具有CD4+受體的細胞，特別是CD4+T輔助淋巴細胞，導致人類免疫系統缺陷，最終發生機會性感染和惡性腫瘤。HIV對單核巨噬細胞、CD8+T淋巴細胞與B淋巴細胞也有破壞作用，在疾病發生、發展、預后中也起著一定的作用。目前的AIDS病原學診斷技術主要包括病毒特異性抗體Anti-HIV檢測、病毒抗原檢測、HIV病毒分離、HIV病毒載量測定和HIV核酸測定等。抗體檢測是常規檢測方法，包括酶聯免疫試驗(ELISA)、明膠顆粒凝集試驗(PA)、免疫熒光試驗(IFA)和斑點印跡(層析或滲濾)及免疫印跡試驗(WB)等。免疫印跡試驗(WB)用作確證實驗，其它方法多用于篩選實驗。病毒抗體檢測以外的方法一般用在特殊情況，例如，p24抗原檢測實驗應用于急性HIV感染。檢測抗-HIV的ELISA法是國際上應用最早、發展最快、至今在血源篩查中普遍使用的檢測技術。ELISA第3代技術采用了"雙抗原夾心法"，不僅可檢測抗-HIVIgG，而且可檢測早期出現的IgM抗體，甚至可檢測少見的"0"亞型HIV抗體。1998年，國際上出現第4代ELISA試劑，在檢測抗-HIV的同時也可檢測p24抗原。化學發光免疫分析(Chemil咖inescenceImmunoassay,CLIA)于1977年問世，1985年第一代化學發光免疫試劑盒研制成功并投放市場。進入九十年代，化學發光免疫分析試劑盒的研制和自動化測量儀的生產取得了突破性進展，從而進入高速發展階段。化學發光免疫分析是繼熒光、放射性同位素和酶免疫分析之后發展起來的一項新的免疫分析技術，根據大量的實驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩定性、準確性及發展前景來看，在非放射性標記分析技術中化學發光免疫分析處于領先地位，代表了當今世界發展的方向和潮流，它不僅具有免疫反應的特異性，而且具有化學發光反應的高靈敏度(檢測限度可達10—15~10—18mol/L)。化學發光免疫分析技術具有靈敏度高、快速、準確、重復性好、效期長并安全無毒無污染等優點，成為取代放射免疫分析和酶免疫分析技術的首選。化學發光酶免疫分析是以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體)進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發光底物，在信號試劑作用下發光，用發光信號測定儀進行發光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP)，HRP常用的底物為魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰肼，luminol)或其衍生物如異魯米諾(4-氨基鄰苯二甲酰肼)等，魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，在過氧化物酶及活性氧的存在下，生成激發態中間體，當其回到基態時發光，其波長為425nm。發光強度依賴于酶免疫反應物中酶的濃度。生物素-親和素免疫放大技術可極大地提高檢測方法的靈敏度，且特異性強，穩定性高，適用范圍廣，實驗成本低。生物素-親和素免疫放大技術有兩種基本類型，一類以游離親和素為中間物，分別連接包含生物素大分子的待測反應體系和標記生物素，后在此基礎上發展了親和素-生物素化酶復合物技術；另一類是直接用標記親和素連接生物素化大分子反應體系進行檢測，稱為標記親和素-生物素法。根據待測反應體系中所用的是生物素化第一抗體或生物素化第二抗體，又分為直接法和間接法。在間接法中，親和素-生物素系統可以與免疫分析檢測體系偶聯，放大終反應先將針對不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化抗體與抗原(標準抗原和待測抗原)同時反應，在固相載體表面形成雙抗體夾心免疫復合物，再加入親和素與復合物中的生物素結合，最終使反應信號放大，從而提高了免疫分析的靈敏度。化學發光免疫分析法結合生物素一親和素免疫放大技術是一種較先進而有效的方法。化學發光檢測需要一定的發光增強劑，并配有各自的過氧化物酶系統。主要是生物素與親合素、過氧化物酶(或堿性磷酸酶)結合，再經過化學發光及增強作用，將光量放大后檢測。生物素一親和素免疫放大技術結合化學發光免疫分析技術應用在HIV免疫分析中可大大提高檢測的靈敏度。另外，現有技術中的化學發光免疫分析試劑盒為封閉式全自動化學發光測量系統，需要昂貴的全自動化學發光測量儀，'從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷和科研工作。本發明的試劑盒采用微孔板化學發光免疫分析技術，既可應用于開放式的半自動化學發光測量儀，也可用于全自動的測量系統，可實現大批量快檢測，使用成本低，更易推廣應用。
發明內容本發明的發明人為了解決上述問題提出并完成了本發明。本發明的目的是提供一種生物素一親和素免疫放大技術結合化學發光酶免疫分析技術測定人類免疫缺陷病毒抗原/抗體的試劑盒。本發明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。根據本發明的人類免疫缺陷病毒抗原/抗體化學發光免疫分析測定試劑盒包括1)人類免疫缺陷病毒抗原和抗體同時包被的固相載體；2)生物素標記的人類免疫缺陷病毒抗體；3)酶標記的人類免疫缺陷病毒抗原和鏈霉親和素；4)上述酶所作用的化學發光底物；以及5)陰性對照物、人類免疫缺陷病毒抗原和抗體陽性對照物。具體地，本發明的試劑盒可以包括1)人類免疫缺陷病毒HIV1+2型抗原和HIV-1P24抗體同時包被的固相載體；2)生物素標記的HIV-1P24抗體；3)酶標記的HIV1+2型抗原和鏈霉親和素；4)上述酶所作用的化學發光底物；以及5)陰性對照物、HIV抗體HIV-1P24抗原陽性對照物。根據本發明的試劑盒，其中，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。根據本發明的試劑盒，其中，所述標記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。根據本發明的試劑盒，其中，所述化學發光底物為魯米諾、異魯米諾或1，2-二氧乙烷類衍生物。優選地，上述試劑盒中，所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛垸)-1，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。本發明同時提供了一種獨創的化學發光底物液，它由以下方法制備而成A液在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH8.5的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中加入Luminol、Tween20以及苯并熒蒽(結構如下圖所示)，混合均勻。B液在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成0.1MpH4.6的檸檬酸緩沖液，在此溶液中加入30%過氧化氫溶液。使用前將A液與B液按1:1比例混合后使用。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>由此，根據本發明的試劑盒，所述化學發光底物包括A液和B液，其中，基于100mL所述化學發光底物A液，包括1.21gTris、295uL濃鹽酸、0.5g魯米諾、20PLTween20以及0.lg苯并熒蒽；基于100mL所述化學發光底物B液，包括0.73g檸檬酸三鈉、0.44g檸檬酸、100uL30o/o的H202溶液，其pH值為4.6。本發明提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟1)以人類免疫缺陷病毒抗原和抗體同時包被固相載體；2)以生物素標記人類免疫缺陷病毒抗體；3)以酶標記人類免疫缺陷病毒抗原和鏈霉親和素；4)配制上述酶所作用的化學發光底物；5)配制陰性對照物、人類免疫缺陷病毒抗原和抗體陽性對照物；6)分裝上述陰性和陽性對照、生物素標記的人類免疫缺陷病毒抗體、酶標記的人類免疫缺陷病毒抗原和鏈霉親和素和該酶所作用的化學發光底物；以及7)組裝為成品。根據本發明的方法，優選，所述包被固相載體的步驟包括以下步驟I)包被配制包被液，基于lOOOmL所述包被液包含1.59g的無水碳酸鈉和2.94g的碳酸氫鈉，所述包被液的pH值為9.6，然后將制備的包被液與適當濃度的人類免疫缺陷病毒抗原和抗體混合，并將所得混合液負載于固相載體上；II)用PBST洗液洗滌上述固相載體；以及III)封閉配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2PO4*2H20、2.9gNaH2P0412H20、10gBSA、20g蔗糖、lOOmL新生牛血清和lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.07.6，然后將所得封閉液負載于上述洗滌后的固相載體上。在上述方法中，優選，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。在上述方法中，優選，所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。在上述方法中，優選，所述化學發光底物為魯米諾、異魯米諾或l，2-二氧乙烷類衍生物。在上述方法中，優選，所述1,2-二氧乙垸類衍生物為(金剛垸)-1,2-二氧乙垸、3-(2'-螺旋金剛垸)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷、CSPD或CDP隱Star。具體地，本發明的試劑盒包括同時包被有HIV1+2型抗原和HIV-1P24抗體的化學發光包被板48或96孔、標記物2瓶、化學發光底物液2瓶、洗滌液1瓶、陰性對照1瓶、HIV抗體陽性對照1瓶、P24抗原陽性對照1瓶以及其它輔助試劑。其中，具體地，標記物1含有生物素標記的P24抗體；標記物2含有酶標記的HIV抗原和鏈霉親和素。其中，具體地，洗滌液為20倍濃縮洗滌液，由4g/LNaH2P04*2H20、58g/LNa2HP04'12H20、180g/LNaCl禾口10ml/LTween20配制成。本發明的試劑盒可以同時檢測HIV感染者血清或血漿中的HIV抗體和P24抗原，與目前檢測HIV抗體的方法相比，又進一步縮短了檢測窗口期；利用生物素親和素系統，使P24抗原檢測的靈敏度大大提高同時，本試劑盒采用化學發光免疫分析技術，比ELISA具有的檢測靈敏度，安全可靠，操作簡便，與國外的化學發光檢測系統相比價格低廉且不需要昂貴的全自動化學發光測量儀，為臨床HIV抗體和HIV抗原的檢測和血液安全篩查提供了一種新的檢測方法。本發明的試劑盒應用的是酶催化發光底物，通過檢測發光底物產生的光信號代替酶聯免疫分析中的顯色底物，因而具有與酶聯免疫分析同等的特異性，而靈敏度大大提高，比現今的酶聯免疫吸附分析靈敏度提高約10倍，可為HIV的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據。本發明的試劑盒采用了生物素-親和素體系，放大了反應信號，從而提高了免疫分析的靈敏度，且特異性強，穩定性高，適用范圍廣，實驗成本低，可更有效地檢測HIV。具體實施例方式實施例1制備本發明的人類免疫缺陷病毒抗原/抗體化學發光免疫分析測定試劑盒本發明的人類免疫缺陷病毒抗原/抗體化學發光免疫分析檢測試劑盒含有以下成分用HIV抗原和P24單克隆抗體同時包被的預包被發光板；用辣根過氧化物酶標記的酶標HIV抗原標記物和酶標鏈霉親和素；生物素化的P24抗體；含有Tween20磷酸鹽緩沖液的洗滌液(20倍濃縮洗滌液)；含有魯米諾、Tween20及其增強劑苯并熒蒽的化學發光底物液A;含有過氧化氫的化學發光底物液B;正常人血清的陰性對照；新生牛血清稀釋HIV抗體陽性人血清的HIV抗體陽性對照；以及新生牛血清稀釋P24抗原陽性人血清的P24抗原陽性對照。一、用HIV抗原和P24單克隆抗體同時包被預包被化學發光板將包被用HIV重組抗原和P24抗體加至碳酸鹽緩沖液中混勻，加至發光板內，每孔100uL，溫育過夜，用含有Tween20的磷酸鹽緩沖液洗滌發光板3遍后，再加入含有BSA的磷酸鹽緩沖液，室溫靜置2小時后，棄去孔內液體，徹底干燥發光板，用鋁鉬袋封口包裝，完成HIV抗原/抗體同時包被的預包被發光板的制備。二、生物素化P24抗體的制備將生物素和P24抗體進行標記，制備成生物素化P24抗體。三、辣根過氧化物酶標記HIV抗原和標記鏈霉親和素用改良的過碘酸鈉法將HIV抗原和辣根過氧化物酶偶聯在一起，制備HIV抗原標記物；用改良過碘酸鈉法將鏈霉親和素和辣根過氧化物酶偶聯在一起，制備辣根過氧化物酶標記的親和素。四、化學發光底物液的制備A液在100ml雙蒸水中加入1.21gTris和295yL濃HC1配成0.1MpH8.5的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中加入O.5g的Lumino1、20uL的Tween20以及O.lg苯并熒蒽，混合均勻。B液在100ml雙蒸水中加入檸檬酸三鈉0.73g和檸檬酸0.44g，配制成0.1MpH4.6的檸檬酸緩沖液，在此溶液中加入100uL30%過氧化氫溶液。使用方法使用前將A液與B液按1:1比例混合后使用。五、其它組分的制備洗滌液為含有Tween20的磷酸鹽緩沖液，陰性對照為混合的正常人血清，HIV抗體陽性對照為新生牛血清稀釋的HIV抗體陽性人血清，P24抗原陽性對照為新生牛血清稀釋的P24抗原陽性人血清。六、半成品及成品組成上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩定性檢定合格才能組裝成測定試劑盒。組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。實施例23制備本發明的人類免疫缺陷病毒抗原/抗體化學發光免疫分析測定試劑盒除分別以塑料珠、磁性顆粒作為載體外，其余均以與實施例1相同的方法制備本發明的試劑盒。實施例4本發明的試劑盒的使用方法一、在化學發光包被板上加入樣品、生物素化抗體和對照物取HIV抗原抗體包被板，平衡至室溫后，每次實驗設陰性對照3孔，HIV抗體陽性對照2孔，HIV-1P24抗原陽性對照2孔，每孔分別加入100ul，樣品孔中每孔加入樣品50iU，再加入生物素化P24抗體50y1，混勻，貼上封板膜，置37'C溫育30分鐘。二、用洗滌液洗板甩去反應液，用稀釋后的洗滌液洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干。三、加入酶標記物除空白孔外，每孔加入含有辣根過氧化物酶標記的HIV1+2型抗原和辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素酶標記物100ul，貼上封板膜，靜置37'C30分鐘。四、用洗滌液洗板(方法與二相同)五、混合底物使用前將化學發光底物液A和B以1:1混合，置室溫避光反應5分鐘。六、測量發光強度在化學發光測量儀上依序測量各孔的發光強度(RLU)，測量時間l秒/孔。七、讀取結果根據待測樣本的RLU值與臨界值的比值S/CO值判斷，若S/C0值》1，則為陽性反應，說明樣本中含有HIV抗體或P24抗原；若S/C0值〈1，則為陰性反應，說明樣本中不含有HIV抗體或P24抗原。實施例5本發明的試劑盒的臨床實驗比對本發明試劑盒的臨床實驗比對，實驗結果見下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權利要求1、一種人類免疫缺陷病毒抗原/抗體化學發光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)人類免疫缺陷病毒抗原和抗體同時包被的固相載體；2)生物素標記的人類免疫缺陷病毒抗體；3)酶標記的人類免疫缺陷病毒抗原和鏈霉親和素；4)上述酶所作用的化學發光底物；以及5)陰性對照物、人類免疫缺陷病毒抗原和抗體陽性對照物。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)人類免疫缺陷病毒HIV1+2型抗原和HIV-lP24抗體同時包被的固相載體；2)生物素標記的HIV-1P24抗體；3)酶標記的HIVl+2型抗原和鏈霉親和素；4)上述酶所作用的化學發光底物；以及5)陰性對照物、HIV抗體和HIV-1P24抗原陽性對照物。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。5、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發光底物為魯米諾、異魯米諾或1，2-二氧乙烷類衍生物。6、如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛垸)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。7、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發光底物包括A液和B液，其中，基于lOOmL所述化學發光底物A液，包括1.21gTris、295"L濃鹽酸、0.5g魯米諾、20nLTween20以及0.lg苯并熒蒽；基于100mL所述化學發光底物B液，包括0.73g檸檬酸三鈉、0.44g檸檬酸、100"L30。/o的H2O2溶液，其pH值為4.6。8、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)以人類免疫缺陷病毒抗原和抗體同時包被固相載體；2)以生物素標記人類免疫缺陷病毒抗體；3)以酶標記人類免疫缺陷病毒抗原和鏈霉親和素；4)配制上述酶所作用的化學發光底物；5)配制陰性對照物、人類免疫缺陷病毒抗原和抗體陽性對照物；6)分裝上述陰性和陽性對照物、生物素標記的人類免疫缺陷病毒抗體、酶標記的人類免疫缺陷病毒抗原和鏈霉親和素和該酶所作用的化學發光底物；以及7)組裝為成品。9、如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述包被固相載體的步驟1)采用以下方法I)包被配制包被液，基于1000mL所述包被液包含1.59g的無水碳酸鈉和2.94g的碳酸氫鈉，所述包被液的pH值為9.6，然后將制備的包被液與適當濃度的人類免疫缺陷病毒抗原和抗體混合，并將所得混合液負載于固相載體上；II)用PBST洗液洗滌上述固相載體；III)封閉配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2PO42H20、2.9gNaH2P0412H20、10gBSA、20g蔗糖、lOOmL新生牛血清和lmL生物防腐劑，所述封閉液的pH值為7.07.6，然后將所得封閉液負載于上述洗滌^的固相載體上。10、如權利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。11、如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。12、如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述化學發光底物為魯米諾、異魯米諾或1,2-二氧乙烷類衍生物。13、如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述1，2-二氧乙烷類衍生物為(金剛垸)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種人類免疫缺陷病毒抗原/抗體化學發光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。根據本發明的試劑盒包括1)HIV抗原和抗體包被的固相載體；2)生物素標記的HIV抗體；3)酶標記的HIV抗原和鏈霉親和素；4)上述酶所作用的化學發光底物；以及5)對照物。進一步，根據本發明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)HIV抗原和抗體包被固相載體；2)以生物素標記HIV抗體；3)以酶標記HIV抗原和鏈霉親和素；4)配制化學發光底物；5)配制對照物；6)分裝；以及7)組裝為成品。本發明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩定等優點。文檔編號G01N33/543GK101363853SQ20071011998公開日2009年2月11日申請日期2007年8月6日優先權日2007年8月6日發明者應希堂,胡國茂,詹先發申請人:北京科美東雅生物技術有限公司