專利名稱：一種針對水產食品中氟喹諾酮類藥物殘留的可視化檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測水產食品中藥物殘留的方法，具體地說是涉及一種檢測氟喹諾酮 類藥物殘留的方法。本發明由國家自然科學基金項目(No. 30400336)和青島市科技項目 (03-1-NSH-2-2)資助完成。
背景技術：
氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones, FQs)是人工合成的新型廣譜殺菌性抗菌藥物，具 有抗菌譜廣，抗菌活性強，毒副作用小及與其他抗生素和抗菌藥物之間交叉耐藥性小等優 點，因而廣泛用于水產及畜禽養殖，已經成為我國目前常用的魚藥和獸藥之一。由于大量 和長期使用氟喹諾酮類藥物，使得氟喹諾酮類藥物在體內蓄積，并造成藥物在動物組織內 殘留，從而對食品衛生及人類健康具有潛在的危害性。近年來，關于FQs藥物臨床應用時 所產生的耐藥性、殘留毒性以及不良反應的報道越來越多，食品中相應殘留的檢測也愈加 引起人們的重視。目前檢測氟喹諾酮類藥物殘留的方法有微生物法、高效液相色譜法(HPLC)、色譜一 質譜聯用法(LC-MS)等。微生物法操作簡便，但檢測的周期長，靈敏度低；儀器檢測法雖 然非常靈敏、準確，但耗時長、耗資大，對人員素質要求高，不適合現場快速檢測。酶聯 免疫吸附法(ELISA)作為一種快速特異和靈敏度較高的免疫檢測技術應用于藥物殘留的 檢測體現了其優越性，但最快也要幾個小時才能報告檢測結果。1. 微生物法微生物法是一種抗菌藥物殘留檢測的篩選方法，其缺點方法的特異性較差，多種因素 都可以顯著影響檢測結果，而且分析周期長，一般不易于短期內取得結果。0kerman等(1998) 報道了用改進的歐洲四平皿法(Four-PlateTest， FPT)檢測市場上零售肉中恩諾沙星和環 丙沙星的殘留，四平皿法雖能檢測高濃度氟喹諾酮類藥物的殘留，但該法的檢測限高于歐 盟(EC)所規定的最低殘留限量(MRL)。2. 液相色譜法(LC法)高效液相色譜法(HPLC)是目前最為常用的色譜方法，目前國內外相關標準中基本采 用該方法為檢測氟喹諾酮類藥物殘留的標準方法。其優點在于靈敏度高，檢測限大多低于10ppb，精確度較高(回收率一般大于70%)，穩定性也比較好，但該法需要價格昂貴的色 譜儀器以及相關的實驗室條件，操作人員要求具有較高的專業技術水平，儀器的維護保養 也較為繁瑣，在目前情況下難以在養殖和加工現場針對大量樣品開展快速分析和現場檢 測。3. 液相色譜一質譜聯用法(LC-MS法)LC-MS法是對液相色譜法的進一步改進提高，其檢測靈敏度高，也更為準確精密。如 Turnipseed等(1998)報道了戳魚肌肉中恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星和雙氟沙星多殘 留確證的LC-MS檢測。但該法所需的儀器設備更加昂貴，步驟煩瑣， 一般僅用于殘留的確 認性檢測。4. 免疫分析方法目前用于氟喹諾酮類藥殘檢測的免疫分析手段主要是酶聯免疫反應(ELISA)。它具有 高度的專一性和靈敏度，但是分析程序較為煩瑣，最快也要幾個小時才能報告檢測結果， 操作人員需要具有較高的專業技能及操作經驗；酶對于外界因素的干擾較為敏感，檢測結 果的穩定性較差；此外需要酶標儀等儀器設備， 一般需要在實驗室中進行，難以進行現場 檢測。發明內容針對上述方法存在的問題，本發明提出了一種利用金標記免疫技術對水產食品中不同 氟喹諾酮類藥物殘留進行可視性現場快速檢測的方法。 本發明的檢測方法包括以下步驟(1) 首先利用生物免疫技術，以牛血清蛋白(BSA)為載體蛋白，與氟喹諾酮類藥物偶連形成完全抗原，分別免疫小鼠和新西蘭兔來制備相應的抗體，分別用于膠體金的標記以及硝酸纖維素膜的包被；(2) 制備納米級的膠體金顆粒，并且將其與小鼠抗體反應，形成膠體金標記的抗體材料；G)自制反應板，在下部依次填充吸水濾紙和硝酸纖維素膜，膜的正面向上并對準 上部小孔后固定；(4) 硝酸纖維素膜預先進行兔源抗體的包被和封閉；(5) 將硝酸纖維素膜裁剪成邊長lcm的方形小片，在膜的正面用鉛筆畫出直徑3 — 4mm的圓圈，在圈內點樣。點樣的順序為a、取5pL樣品液滴加到反應板中央，室 溫下反應15min，b、 5pL膠體金標記的鼠源抗體，滲入反應5min; c、 0.01mol/L， pH=7.4 的PBS (含有0.1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液)漂洗三次；(6)同時以不含待測底物的緩沖液為樣品，按照同樣次序加入，作為陰性對照；肉 眼觀察結果，紅色斑點判斷為陽性樣本，即含有待測藥物殘留；否則為陰性樣本。 與其它測定方法相比較，本方明的主要優點在于(1) 有效縮短了分析時間，操作更為簡便快速， 一般可以在半小時內完成檢測，明 顯優于其它現有方法；(2) 檢測為可視化操作，肉眼判斷結果，不需要復雜的設備等實驗條件；(3) 可以組裝成試劑盒，便于攜帶組裝，能夠適用于不同場所，實現現場分析或在 線檢測，尤其適合現場大量樣品的快速篩選處理；(4) 利用抗體的交叉反應性能，可應用于多種氟喹諾酮類藥殘的分析檢測。
圖l是本發明用于加標檢測鰻魚肉中三種沙星的結果。其中，O-表示空白；E卜E2 、 E3分別表示濃度為20ng/mL、 50ng/mL、 100ng/mL的恩 諾沙星；Q、 C2 、 C3分別表示濃度為20ng/mL、 50 ng/mL、 100ng/mL的環丙沙星；N!、 N2 、 N3分別表示濃度為50ng/mL、 100ng/mL、 150 ng/mL的諾氟沙星。圖2是HPLC加標檢測鰻魚肉中三種沙星的圖譜。
具體實施方式
實施例l:鰻魚中恩諾沙星、環丙沙星和諾氟沙星殘留的快速檢測1、抗體的制備首先配制磷酸鹽緩沖液(O.OIM， pH7.4，簡稱PBS):取NaCl 8g， KC1 0.2g， Na2HP04.12H20 2.9g， KH2PO42.0g，加雙蒸水至1000mL，過0.22pm膜，室溫保存。碳二亞胺法合成程序為取15mgEF， 5.2mgNHS， 9.3mgEDC溶于0.5mL 二甲基甲 酰胺(簡稱DMF)中，室溫振蕩1.5h; 3000r/min離心30s，上清加入2mL含25mg載體 蛋白(牛血清白蛋白)的PBS溶液(預先溶有33X的DMF)，恒溫振蕩過夜(150r/min， 4'C);然后將反應物裝入透析帶中，先用含33%DMF的PBS溶液透析，逐步減少DMF 的量直至完全用PBS，透析完全后凍干，-S(TC保存。選取6~8周齡的健康BALB/C小鼠，進行免疫試驗。免疫前采血作為陰性血清。將 10mg完全抗原(以蛋白濃度計)溶于l.OmL生理鹽水中，與等量的弗氏完全佐劑(CFA)
充分混合形成乳濁液后進行腹腔注射，0.3mL/只，間隔兩周加強免疫一次，劑量與方法同 初次免疫，只是CFA換成弗氏不完全佐劑(IFA),總共加強免疫三次。最后一次免疫后 7d摘眼球取血，離心取上清液，-80°0貯存備用。選取健康的新西蘭雌性大白兔，靜養一周后耳動脈取血作為陰性血清。將10mg完全 抗原(以蛋白濃度計)溶于1.0mL生理鹽水中，與等量的弗氏完全佐劑(CFA)充分混合 形成乳濁液后進行頸部皮下散點注射(0.1mL/點)，l.OmL/只，間隔兩周加強免疫一次， 劑量與方法同初次免疫，只是CFA換成IFA (弗氏不完全佐劑)，重復三次。最后一次不 加佐劑，直接由耳靜脈注射抗原，7天后頸動脈取血，離心取上清液，-S(TC貯存備用。 2、抗體的純化取lmL抗體與lmLPBS混合，按照40%硫酸銨飽和度加入相應的硫酸銨，在冰浴中攪 拌30min使蛋白沉淀出來，4"C下10000轉/分離心15min，將上清液移出，沉淀用lmLPBS 溶解，在0.01MPBS中透析48h，每12h更換透析液一次。粗純后經ELISA篩選到的具有抗體活性的組分，4'C10000r/min離心處理60min，使用 superdexTM75柱分離(1.5mL/min， 280nm測吸光值)，收集各組分采用ELISA進行抗體活 性鑒定，取其中活性最高者為檢測材料。3 、金標記抗體的制備取lmU^的氯金酸溶液于100mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，轉移至250mL燒杯 中，在磁力攪拌器上加熱至沸騰，攪動下準確加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H507 H20)水 溶液2mL，金黃色的氯金酸水溶液在2min中內變為紫紅色，繼續煮沸15min，冷卻后用超 純水恢復到原來體積。即可制成15nm粒徑的膠體金。將20mL制備好的膠體金溶液調節至pH8.0，加入純化好的鼠抗體lmg，混勻，室溫下 攪拌反應10min，加入5X的BSA至終濃度為1W，再次反應10min， 4。C下4000r/min離心 20min，棄去沉淀，上清液再次4。C下10000r/min離心60min，小心移去上清液，沉淀重新 溶解于2mL含有lXBSA、 0.02^NaN3的0.01MpH8.0的磷酸緩沖液中，即為10%濃縮的膠 體金標記多抗溶液，4t:下保存備用。4 、硝酸纖維素膜的包被與封閉用pH=9.6碳酸鹽緩沖液(CBS)包被恩諾沙星兔多抗，每點20pL， 37。C包被2h， 0.1。/o牛血清白蛋白37'C封閉2h，含0.1%吐溫的磷酸緩沖液(PBST， pH=7.4)洗滌3次。 5、樣品前處理5. 空白樣品用電動勻漿機勻漿，稱取5.0g勻漿后的樣品，添加不同濃度的沙星標準品，
加入5mL甲醇-PBS (1:1,V/V)混合提取液，于高速均質機處理2min， 4"C下以4000r/min 離心10min，轉移上清液；沉淀用同樣方法重復處理一次，合并兩次上清；上清液再次以 4'C10000r/min離心10min，棄去沉淀；上清液在45'C真空旋轉蒸發15min, 4000r/min離 心2min，上清液定容至5mL。取lmL過0.22pm微孔濾膜，備用。 5、樣品檢測取5^L樣品液滴加到硝酸纖維素膜中央，室溫下反應15min;滴加5pL金標抗體，待 其滲入后反應5min;用洗滌液反復洗滌三次，肉眼觀察結果。同時以不加沙星的提取液 為陰性對照。與對照相比出現肉眼可見的紅色斑點則判斷為陽性樣本，否則為陰性結果。 檢測結果如圖1所示，三種不同種類和濃度的沙星均呈現陽性。 對照例l:用高效液相色譜法(HPLC)檢測恩諾沙星和諾氟沙星樣品處理方法同上。色譜條件 色譜柱反相色譜柱ds柱(300mmX4. 6mm)流動相乙腈四丁基溴化銨溶液=5: 95 (V/V)流速1. 5mlVmin激發波長280咖，發射波長450nm柱溫40°C 進樣量20nL 液相色譜圖見圖2。 實施例2:本發明檢測效果及其與HPLC法的比較表1 HPLC法對加標鰻魚肉的檢測結果(n-3)添加濃度回收率 (%)平均回收率 (%)相對標準偏差 (%)恩諾沙星1069.3/65.9/72.469.22.652073.7/69.8〃8.273.93.435070.1/67.6/78.372.04.57環丙沙星1078.9/70.2/74.774.63.552084.5/80.6〃9.981.72.025086.9/79.3/84.483.53.16諾氟沙星1069.5/73.麵.970.12.852075.6/74,5/68.572.93.125071.9/82.1/75,876.64.20 目前國內外對于食品中氟喹諾酮類藥殘的要求，根據不同藥物品種和不同食品類型存 在差異，但最低檢出限一般要求在50ng/kg以上。采用本發明的檢測方法，恩諾沙星和環 丙沙星在添加濃度為20ng/mL時，肉眼可以判斷為陽性，而諾氟沙星檢出限則在50ng/mL; 同一檢測重復三次的結果基本一致；前處理方法的加標回收率基本可以保證在70%以上。 這表明，該方法的主要性能，如靈敏度、準確度等完全可以滿足實際檢測的要求；但檢測 時間只需要25-30分鐘，明顯少于HPLC;操作較為簡便，陽性結果肉眼可見，不需要大 型、昂貴的儀器設備，非常適合于現場大量樣品的定性快速篩選檢測。
權利要求
1.一種針對水產食品中氟喹諾酮類藥物殘留的可視化檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)首先以牛血清蛋白為載體蛋白，結合氟喹諾酮類藥物偶連形成完全抗原來制備兩種不同的特異性抗體，分別用于膠體金的標記以及硝酸纖維素膜的包被；(2)以制備的一種特異性抗體與納米膠體金顆粒結合形成金標記抗體材料；(3)以硝酸纖維素膜為固相載體包被另外一種特異性抗體，并進行封閉；(4)將樣品提取液、金標記抗體液以及洗滌液分別點到硝酸纖維素膜上；(5)同時以不含有待測物的提取液代替樣品液，以同樣次序點膜反應，作為陰性對照；(6)樣本膜與對照膜進行比較，以出現肉眼可見的紅色斑點判斷為陽性樣本，即含有待測藥物殘留；否則為陰性樣本。
2. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于未知樣中的氟喹諾酮類藥物在測定前需 要進行提取純化。
3. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的氟喹諾酮類藥物為恩諾沙星、環 丙沙星或諾氟沙星。
4. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述的特異性抗體為鼠源抗 體。
5. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟(3)中所述的特異性抗體為兔源抗 體。
全文摘要
本發明公開了一種針對水產食品中氟喹諾酮類藥物殘留的可視化檢測方法，該方法利用生物免疫技術，以牛血清蛋白為載體蛋白，偶聯氟喹諾酮類藥物制備相應的特異性抗體；將制備的特異性抗體與紅色的膠體金顆粒結合形成金標記抗體材料；以硝酸纖維素膜為固相載體，事先以另外來源的抗體進行包被和封閉；依次將樣品液、金標抗體和洗液點膜，同時以不含有待測物的提取液制備陰性對照；與陰性對照比較，根據出現肉眼可見的紅色斑點的出現與否，判斷樣本是否為含有待測物的陽性樣本。本發明具有較高的靈敏度和準確度，操作簡便快速，不需要額外的分析儀器設備，結果肉眼可見，可應用于多種氟喹諾酮類藥殘的現場快速篩選檢測。
文檔編號G01N33/543GK101210923SQ20071011607
公開日2008年7月2日 申請日期2007年12月20日 優先權日2007年12月20日
發明者曹立民, 李振興, 洪 林, 潔 江, 隋建新 申請人:中國海洋大學