專利名稱：甘草高效抗菌、抗氧化活性部位的分離及鑒定的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種簡便、快速分離植物高效抗菌、抗氧化活性部位的工藝及質量標準檢測方法，屬于中藥制備及鑒定技術領域。
背景技術：
在天然藥物的制備中，快速高效地提取、分離并鑒定目標生物活性部位的工藝及方法創新最為人們關注。更為需要的是如何生產并鑒定出已知生物活性的多種化合物是否有一致性。
甘草是多年生草本植物，是一種應用極其廣泛的中藥材，其味甘、平，能補脾益氣、止咳化痰、緩急止痛、解毒降火等。這些功能與甘草中所含的黃酮類、三萜類、多糖類等有效活性成分相關。從甘草中提取的抗氧化成分具有較強的清除自由基的作用，還具有抑菌、消炎、解毒、除臭的功能，如何針對性地分離提取甘草中具有抗氧化、抗菌生物活性部位，并對它們進行質量標準鑒定，目前還沒有一種簡便、快速的有效方法。
發明內容
本發明的一個目的在于提供了一種簡便、快速分離甘草高效抗菌、抗氧化活性部位的方法，并對所得到的活性部位進行質量標準鑒定。
本發明分離甘草有效部位并對其進行鑒定的方法包括如下步驟1)以≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似極性的有機溶劑或它們的混合物作為溶媒，于10～100℃超聲提取甘草材料10～30min；2)過濾，濃縮濾液；3)濾液直接干燥成粗品或者用石油醚提取后過濾、濃縮、干燥得到不同的活性部位；4)粗品選用不同極性的有機溶劑作為溶媒進一步精化分離出不同的活性部位；5)通過抗菌、抗氧化試驗評價這些不同活性部位的功能效果；6)通過質譜指紋鑒定，根據其功能確定這些不同活性部位所含化學基團是否具有一致性；7)通過HPLC指紋圖譜對照，結合其功能效果對比確定這些不同活性部位中相關功能化合物的相對含量。
在上述方法的步驟1)之前可先用水提取經粉碎的甘草材料，然后過濾取甘草渣進行超聲提取。在步驟1)中可利用超聲納米吸附提取工藝提高分離高效抗氧化、抗菌活性部位的產率，即在超聲提取過程中加入納米材料，讓超聲細胞破碎提取與納米吸附同時進行。納米材料優選納米級SiO2，粒度小于1000nm，或相似硬度、表面積、粒度的其他納米材料。納米材料用量與被提取植物原料比大于等于0.01％(重量比)，最佳用量為非水溶性目標成分的相同量。
在本發明的一個具體實施例中，上述步驟3)～4)濾液直接干燥制得粗品G007，再選用不同極性的有機溶劑作為溶媒進一步精化分離出不同的活性部位，如制備G017選擇的溶媒為乙酸乙酯，或相似極性的溶媒；制備G716選擇的溶媒為石油醚-乙酸乙酯，或相似極性的溶媒；制備G717選擇的溶媒為石油醚或相似極性的溶媒。
用上述工藝制備的具有高效抗氧化、抗菌生物活性的提取物G007、G017、G716及G717具有特定可測的化學特征。
在步驟5)通過抗油脂氧化試驗來確定這些不同活性部位的抗氧化效果；通過不同活性部位的最低抑菌濃度評價其抑菌效果選定檢測菌如變形鏈球菌(Streptocacusmutans)、粘性放線菌(Actinomyces viscosus)、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)，對上述活性組分的最低抑菌濃度(MIC)進行評價，按最低抑菌濃度分離高效抗菌部位如下(參見表I)G007MIC≤150ppmG717，G017MIC≤100ppmG716MIC≤10ppm通過質譜指紋鑒定，確定高效抗菌抗氧化提取物的主要化學基團，如根據上述抑菌的功能，確定使之功能體現的化學基團(G017的質譜指紋圖如圖2所示，G716的質譜指紋圖如圖3所示)。通過HPLC的指紋鑒定，確定相關化合物的相對含量(G007和G017的HPLC指紋圖譜比較如圖4所示)。
本發明提供了一種簡便、高效率提取、分離植物高效抗氧化抗菌活性部位的工藝及質量標準鑒定方法，該工藝及方法可延伸到其他中藥的提取與制備。其中，采用超聲波提取(ultrasonic extraction)的機械效應、空化效應、熱效應的優勢，結合納米材料的吸附，超聲波同時增大納米顆粒及介質分子的運動速度，增強介質的穿透力以達到從動植物種高效提取目標活性成分或部位的目的。通過質譜和HPLC指紋圖譜鑒定已知生物活性的多種活性部位，可簡便有效地確定其所含化合物是否有一致性及其相對含量。
圖1是從甘草中提取分離高效抗氧化、抗菌活性部位的工藝流程圖。
圖2是G017的質譜指紋圖。
圖3是G716的質譜指紋圖。
圖4是G007和G017在365nm下的HPLC對照圖譜。
具體實施例方式
下面以具體實施例來說明本發明，但不以任何方式限制本發明。
實施例超聲納米吸附從甘草中分離提取高效抗菌抗氧化劑及其鑒定本發明以從甘草中提取分離高效抗氧化、抗菌活性部位為例，首先采用超聲波納米SiO2吸附法成功地提取并分離了抗氧化劑G007。納米SiO2具有硬度高、顆粒小、比表面積大、不溶于水或有機溶劑、吸附非水溶性物質能力強等優點。在超聲效應中，納米SiO2與超聲波的空化效應、機械效應的協同作用使介質極大地增強了穿透力，在縮短了破碎時間的同時，增速了吸附溶解雙向運動，促進了化學成分向溶劑中的溶解。
根據納米SiO2與植物化學成分的非永久性吸附的特點，選用不同極性的有機溶媒進一步精化分離出G717，G017，及G716。
提取的具體工藝流程參見圖1。超聲提取后過濾濃縮，濃縮液直接干燥得到粗品G007，而將濾液進一步用石油醚室溫提取5～20min，過濾、濃縮、干燥后得到G717。將粗品G007溶解于≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似極性的有機溶劑或它們的混合物中，上硅膠柱進行柱層析，室溫下用乙酸乙酯洗脫并干燥得到G017，用石油醚-乙酸乙酯(體積比1∶1)洗脫并干燥則得到G716。
本發明通過所提取的活性部位對食用油的抗氧化添加劑試驗來評價抗氧化功能(見表I)。用對口腔厭氧菌的最低抑菌濃度(MIC)來評價抗菌效果(見表II)。
表I.甘草抗氧化劑添加試驗*
*測試條件G007，G717 100ppm，茶多酚(固體)100ppm，大豆色拉油PV0，測試溫度110℃，空氣流量15L/h。
結論采用(Metrohm)公司679Rancimat測定不同種類的抗氧化劑對大豆色拉油的抗氧化效果，從甘草細胞中提煉而成的天然抗氧化劑G007、G717的抗氧化效果明顯優越。
表II.甘草抗氧化劑最低抑菌濃度試驗
結果G007、G717、G017、G716、G178分別為不同方法從甘草細胞提取的樣品，其中G178為常規大孔樹脂法提取的甘草黃酮。G716在其它獨立試驗中最低抑菌濃度為～3μg/ml。
通過對提取的活性部位進行生物活性檢測(見表I、表II)發現，G007、G717具有高效抗氧化功能及抗菌活性，而G017，G716則具有比一般甘草提取物高出500倍以上的高效抗菌功能。
通過對提取的活性部位進行質譜鑒定，發現這些具有相同活性的部位有共同相似的化學基團(見圖2、圖3)。其高效抑菌效果的化學基團應有如圖1、圖2所示的化學性質。圖中化學物質的含量差異可能決定生物活性的效果高低。從基團分子量推斷，這些特定提取物中包含有甘草黃酮、異黃酮、查耳酮類物質、甘草定甙、苷類等物質。
根據表II，G017的抗菌效果比G007高出約2-8倍，換言之，G017的MIC小于G007的MIC 2-8倍，這種生物活性的差異可通過HPLC指紋圖譜鑒別出來。
將甘草產品G007和G017用乙腈分別配制成20mg/ml的溶液，0.45μm過濾器過濾備用。進樣體積30μl；流速1.0ml/min；檢測波長365nm；用乙腈和1％冰醋酸水溶液梯度洗脫。得到的HPLC指紋對照圖譜如圖4所示，G017的峰1與G007的峰1含量相當，而峰2-6均比G007提高約1.28-5.17倍，因此圖4中的峰1-6為G017的特征峰，可作為G017高效抗菌、抗氧化活性部位的鑒別方法及參考質量標準。該方法也可延伸到其他產品及活性部位的鑒別及質量標準控制中。
從圖4可得，與G007相比，G017的峰1-6的含量變化如下表所示
權利要求
1.一種分離甘草抗菌、抗氧化活性部位，并對所得到的活性部位進行質量標準鑒定的方法，包括如下步驟1)以≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似極性的有機溶劑或它們的混合物作為溶媒，于10～100℃超聲提取甘草材料10～30min；2)過濾，濃縮濾液；3)濾液直接干燥成粗品或者用石油醚提取后過濾、濃縮、干燥得到不同的活性部位；4)粗品選用不同極性的有機溶劑作為溶媒進一步精化分離出不同的活性部位；5)通過抗菌、抗氧化試驗評價這些不同活性部位的功能效果；6)通過質譜指紋鑒定，根據其功能效果確定這些不同活性部位所含的主要化學基團的一致性；7)通過HPLC指紋圖譜對照，結合其功能效果對比確定這些不同活性部位中相關功能化合物的相對含量。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟1)之前先用水提取甘草材料，然后過濾取甘草渣進行超聲提取。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于在步驟1)加入納米材料進行超聲納米吸附提取。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述納米材料為納米級SiO2，粒度小于1000nm，或者是具有相似硬度、表面積、粒度的其他納米材料。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于按重量計納米材料用量與被提取的植物原料比大于等于0.01％。
6.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟4)粗品用≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似極性的有機溶劑或它們的混合物溶解后上層析柱，用乙酸乙酯或者體積比1∶1的石油醚一乙酸乙酯洗脫得到不同的活性部位。
7.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟5)選定檢測菌，通過不同活性部位的最低抑菌濃度評價其抑菌效果，所述檢測菌包括變形鏈球菌、粘性放線菌、具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌；通過抗油脂氧化試驗來確定不同活性部位的抗氧化效果。
8.一種分離自甘草的抗菌、抗氧化活性部位，由如下方法制備以≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似極性的有機溶劑或它們的混合物作為溶媒，于10～100℃超聲提取甘草材料10～30min，然后過濾，濾液濃縮后干燥制得。
9.一種分離自甘草的抗菌、抗氧化活性部位，由如下方法制備以≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似極性的有機溶劑或它們的混合物作為溶媒，于10～100℃超聲提取甘草材料10～30min，然后過濾，濃縮濾液，再用石油醚提取，過濾、濃縮、干燥后制得。
10.一種分離自甘草的抗菌、抗氧化活性部位，由如下方法制備將權利要求8所述的活性部位用≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似極性的有機溶劑或它們的混合物溶解后上層析柱，用乙酸乙酯洗脫得到。
11.一種分離自甘草的抗菌、抗氧化活性部位，由如下方法制備將權利要求8所述的活性部位用≥95％的乙醇或甲醇，或者是其它具有相似極性的有機溶劑或它們的混合物溶解后上層析柱，用體積比為1∶1的石油醚一乙酸乙酯洗脫得到。
全文摘要
本發明提供了一種簡便、快速從植物中分離高效抗菌、抗氧化活性部位的工藝及質量標準檢測方法。首先將經粉碎的植物材料加入到超聲提取機中，用適量的有機溶媒在10－100℃的溫度下，超聲提取10－30分鐘，過濾、濃縮、回收溶媒，干燥成初制品，再根據極性用不同溶媒分離而得到不同的高效抗菌抗氧化活性部位。通過生物活性檢測確認各活性部位的生物活性，并通過質譜指紋圖確定這些活性部位所含化合物之間是否具有一致性，同時通過HPLC的指紋鑒定可確定相關化合物的相對含量。
文檔編號G01N30/00GK101084985SQ20071011040
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月5日 優先權日2006年6月9日
發明者詹姆斯·周 申請人:北京未名寶生物科技有限公司, 桂林商源植物制品有限公司