專利名稱：基于線粒體dna a13497g單核苷酸多態性檢測高原肺水腫易感性的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種疾病檢測用的試劑盒，具體涉及基于線粒體DNA A13497G 單核苷酸多態性檢測高原肺水腫易感性的試劑盒.
背景技術：
高原肺水腫(high altitude pulmonary edema, HAPE)是一種特發于高原寸氐 氧環境的肺水腫，起病急，iijl快，危害大，如果救治不及時，可在較短的時 間內發展至呼吸衰竭，甚至死亡，是嚴重威脅進入高原4健康和生命的急性 重癥高原病.近年的調查表明，在從平原進入海拔3700 m高原的漢族人群中， 高原肺7JC腫的發病率高達0.4%-2%。 HAPE發病有明顯的家族和個體易感傾向， 環境因素和遺傳因素均可以影響HAPE的發生，近年來，遺傳因素在HAPE發病 機制中的作用逐漸受到重視張雪峰，高原施工A^急性重型高原病患病率調 查，《高原醫學雜志》，2005; 15(3): 7-8;陳有，高原肺水腫發病機制研究進 展，《高原醫學雜志》，2005， 15 ( 2 ): 62-64;高鈺琪，高原肺水腫的發病機制 及防治，《人民軍醫》，2005; 482 ( 2 ): 108-111。有文^W核基因組中HAPE 發病環節相關基因多態性進行了研究，也發現一些基因的多態性與HAPE的發病 相關，但他們的結果不全一致，因而推測其他基因在HAPE的發病過程中發揮著 重^ft用Kumar R, Renin angiotensin aldosterone system and ACE I/D gene polymorphism in high—altitude pulmonary edema,《Aviat Space EnvironMed》，2004， 75 (11): 981-983; Hotta J et al， Polymorphisms of renin—angiotensin system genes with high—altitude pulmonary edema in Japanese subjects,《Chest》，2004; 126 (3): 825-830 ).
由于線粒體是動物細胞內唯一含有DM和蛋白質合成系統的細胞器，是氧傳 送鏈的生理終點站，是細胞氧耗的主要位點.它在低氧習服和適應中發揮著重 要作用。HAPE是一種低氧習服不良的急性高原病，因而線粒體在HAPE的發生中 發生著重要的作用Moudgil R， Hypoxic pulmonary vasoconstriction ，《J Appl Physiol》，2005; 98: 390-403，線粒體單核普酸多態性(SNP)廣泛應用與 疾病的關聯研究，已經發現一些疾病的發生與線粒體DNA (mtDNA)密切相關Kato， Mitochondrial DM polymorphisms in bipolar disorder ， 《J Affect Disord》，2001， 62: 151-164，
LDR (連接酶檢測反應)是一種經濟、快速的檢測SNP常用的方法，其檢測 原理是利用高溫連接酶實現對基因多態性位點的識別，高溫連接酶一旦檢測到 DNA與互補的兩條寡聚核苷酸接頭對應處存在著基因點突變類型的g錯配，則 連接反應就不能進行。測序分型原理如下
(1) 本技術方案先通過pcR(聚合sm反應)獲得含有待檢測突變位點的基
因片斷，然后進行LDR，最后通過測序儀電泳讀取檢測結果；
(2) 檢測結果表明，左邊位點，即突變位點一為A/C雜合子，右邊位點，即 突變位點二為T純合子(見圖l).
LDR與傳統的SNP分型手段相比，LDR技術有多項優勢 (1)準確度高與PCR等技術的假陰性假陽性相比，LDR技術可以比較準確的 對SNP進行分型；(2) 操作簡單:和目前的PCR技術相似，LDR反應操作簡單，對技術人員沒有 特殊的專業要求；
(3) 成本低:使用LDR檢測系統只需現有的PCR儀等分子實驗室儀器即可，無 需再投入大量的資金購置設備；
(4) 通用性強成熟的LDR檢測系統適用于各種SNP位點的分型；
(5) 高通量:LDR檢測系統可同時對多達上百個SNP位點進行分型，檢測效率 高，滿足復雜疾病及藥物基因組學的診斷需求.
發明內容
本發明的目的是提供一種基于線粒體DNA A13497G單核苷酸多態性檢測高 原肺水腫易感性的試劑盒，能用于高原肺7jC胂(簡稱HAPE)易感者的篩選，指導 HAPE的預防，
發明Ait過對206例漢族HAPE患者和144例漢族^對照的線粒體DNA (mtDNA)的第13497位點SNP進行對比分析，研究mtDM的SNP與HAPE的相 關性，尋找出了敏感可信的HAPE易感生物遺傳標記。步驟是先通過對26例漢 族無關個體的mtDM的全長擴增，測序，初步提示mtDNA的13497位點為'M 人邁tDNA的SNP高頻位點，然后利用mtDNA的10398位點多態性，通過RFLP(限 制性片斷長度多態性)將所有標本分為單倍群M和N。再通過PCR (聚合Sm 反應)-LDR (連接酶檢測反應)反應在大樣本中(單倍群M和N)檢測mtDNA A13497G SNP與HAPE的相關性.mtDM的13497G在病例組的單倍群M和N中都 高，在對照組的單倍群M和N中都低，因而13497G在所有漢族HAPE病例組頻 率為16.5%，在所有漢族對照組中的頻率為0.0% (P-0.000 ),結論線粒體 DM的13497位點上單核苷酸多態性G是HAPE發病的危險因素，可以作為HAPE的遺傳標志之一.因此，基于該SNP位點，可以設計適當長度的引物與探針， 用于PCR-LDR檢測高原肺水腫的易感性。
本發明所述的基于線粒體DM A13497G單核苷酸多態.,測高原肺水腫易 感性的試劑盒，其特征是該試劑盒包括以下分離包裝的試劑
試劑一，引物混合液，序列如下
上游引物HP1-F: 5，-ACATCTGTACCCACGCCTTC-3，；
下游引物HP1-R: 5，-TCGATGATGTGGTCTTTGGA-3，；
試劑二， PCR反應混合液；
試劑三，線粒體DNA的13497位點單核苷酸多態性A對照DM; 試劑四，線粒體DNA的13497位點單核苷酸多態性G對照DNA; 試劑五，探針混合液，三種探針序列如下 軀-F:
5，-GTGAGGAAAGGTATTCCTGCTAATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3，， 熒光物FAM標記；
② P1 - Dl:線粒體DM的13497位點為單核苷酸多態性A: 5，一TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTGATGTGGTCTTTGGAGTAGTAACCT -3，；
③ P1-D2:線粒體DNA的13497位點為單核苷酸多態性G:
5，-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTGGTCTTTGGAGTAGTAACCC -3，；
試劑六，連接反應混合液； 試劑七，電泳混合液。
所述的基于線粒體DM A13497G單核苷酸多態性檢測高原肺水腫易感性 的試劑盒，其特征是試劑一，引物^^液100nl;上游引物和下游引物各50jnl混合，濃度均 為10pmo1/ plj
試劑二，PCR^^混合液1000 p l;成分有1XPCR buffer, 2. OmMMgCh， 200 mM dNTPs， 1 U Taq酶，余量為蒸餾水；
試劑三，線粒體DNA的13497位點單核苷酸多態性A對照DM 50 p 1，濃 度為50ng/pl;
試劑四，線粒體DNA的13497位點單核苷酸多態性G對照DNA 50 i 1，濃 度為50ng/nl;
試劑五，探針混合液120 m 1，三種探針各40 n 1混合，該三種^#濃度均 為12. 5pmol/ulj
試劑六，連接^Jl混合液100pl;成分有pH7. 6的20mMTris-HCl， 25 mM 醋酸鉀，10mM醋酸鎂，10 mM 二硫蘇糖醇，lmM氧化型輔酶1, 0.1% Triton X-100, 0. 5 pi Taq DM連接酶，余量為蒸餾水；
試劑七，電泳混合液100Ml;熒光物質lx ROX和上樣緩沖液6xloading buffer各為50)i l'
本發明能用于平原Ai^高原前對高原肺水腫易感者的篩選，指導HAPE的 預防和治療，減輕急性重癥高原病的威脅，有利于1高原/^#^泉；該試劑 盒使用筒單，操作方便，檢測快速.
圖l LDR分型原理。
圖2線粒體DNA13497位點為單核苷酸多態性A. 圖3線粒體DNA13497位點為單核苷酸多態性G。
具體實施例方式
本發明所述的基于線粒體DM A13497G單核苷酸多態',測高原肺水腫易 感性的試劑盒，包括以下分離包裝的試劑
試劑一，引物^^液100jil;上游引物和下游引物各50nl混合，濃度均 為10p邊o1/ M 1，序列如下
上游引物HP1-F: 5，-AaTCTGTACCCACGCCTTC-3，；
下游引物HP1-R: 5，-TCGATGATGTGGTCTTTGGA -3，；
試劑二， PCR反應混合液1000 |i 1;成分有1XPCR buffer, 2. 0 mMMgCh， 200 mM dNTPs, 1 U Taq酶，余量為蒸餾水；
試劑三，線粒體DNA的13497位點單核苷酸多態性A對照DM 50 p 1，濃 度為50ng/Ml;
試劑四，線粒體DNA的13497位點單核苷酸多態性G對照DNA 50 |i 1,濃 度為50ng/pl;
試劑五，探針混合液120pl;三種^^針各40iil混合，該三種^^針濃度均 為12. 5pmol/ul，探針序列如下
① P1-F:
5，-GTGAGGAAAGGTATTCCTGCTAATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3，， 為熒光物FAM標記；
② P1 - Dl:線粒體DNA的13497位點為單核苷酸多態性A:
5，-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTGGTCTTTGGAGTAGTAACCT -3，；
③ P卜D2:線粒體DM的13497位點為單核苷酸多態性G:
5，-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTGGTCTTTGGAGTAGTAACCC -3，；試劑六，連接X^混合液100pl;成分有pH7.6的20mMTris-HCl， 25 mM 醋酸鉀，IO幽醋酸鎂，10 mM 4蘇糖醇，1mM氧化型輔酶I ， 0.1% Triton X-100, 0. 5 pl Taq DNA連接酶，余量為蒸餾水；
試劑七，電泳混合液100 nl;熒光物質lx ROX和上樣緩沖液"loading buffer各為50 p 1。
該試劑盒的所有試劑和耗材均能在上海生工生物技術fl良務有PIU^司，寶生 物工程(大連)有限公司等國內試劑公司購買到，引物與探針也可按照以上序 列在以上生物公司合成。
該試劑盒的使用說明
第一步，采用上海生工生物技術服務有限公司UNIQ-10柱式臨床樣品基因 組抽提試劑盒(貨號SK1342 )提取待測個體靜脈血液中白細胞基因組總DNA， 然后用紫外分光光度儀對DNA進行定量；
第二步，PCR反應體系配制，共配制三管；
第一管為待測樣本，取待測個體的dna 0. 5 m 1，試劑一 1 Ji 1，試劑二 18. 5 ji 1，混勻；
第二管線粒體DNA的13497位點為單核苷酸多態性T對照，取試劑三0. 5
試劑一 1m1，試劑二 18. 5m1，混勻；
第三管線粒體DNA的13497位點為單核普酸多態性C對照，取試劑四0. 5 jil，試劑一 1m1，試劑二 18. 5m1，混勻；
第三步，將第二步的三管已經混勻的物質分別;^A PCR儀中，均按以下條 件進行PCR反應94匸變性15分鐘—94匸變性30秒—56*C退火1分鐘— 72匸延伸1分鐘—94"C變性30秒—56匸退火1分鐘—72X:延伸1分鐘—94X:變性30秒—56X3退火1分鐘—72X:延伸l分鐘.......其中94X:變性30秒
—561C退火1分鐘—72r延伸1分鐘循環25次，最后721C終末延伸7min，得 到三管PCR產物；
第四步，用3%瓊脂糖皿電泳(電壓80V，電泳時間40分鐘)檢查第三 步所得的三管PCR產物，片斷長度均為208bp;
第五步，又取三只PCR管，每管均加入試劑五lnl，試劑六1.15pl，然 后每管分別加入笫三步所得的三管PCR產物各7.85pl，混勻；當mtDM為 13497A時，探針長度112bp，當為13497G時，探針長度115bp;
第六步，將第五步三管混勻物分別^UV PCR儀，進行LDR連接反應，LDR 反應程序均為，951C 2分鐘—94" 30秒—601C 2分鐘—30秒—60*C 2
^4中—941C 30秒—60*C 2分鐘.......其中94D 30秒—60"C 2分鐘共循環15
次，得到3管連接產物；
第七步，分別從第六步所得3管連接產物中各取2 n 1，均各與試劑七的2 yl混勻；在3730測序儀上進行測序電泳，電泳時電壓為3KV，電泳時間1.5 小時；
第八步，結果通過Gene咖卯er軟件進行數據分析，當連接產物長度為320 為單核苷酸多態性A，參見圖2;片斷長度為323bp時為單核苷酸多態性G，參 見圖3,當結果如圖3所示時，為HAPE易感個體.序列表
<110>中國人民解放軍第三軍醫大學
<120>基于線粒體DM A13497G單核香酸多態性檢測高原肺水肺易感性的試劑盒 <130>
<140>200710092816. 1 <141>2007-10-09 <160> 5
<170> Patentln 3. 3
<210> 1
<211〉 20
<212> DM
<213>人工合成
〈221〉上游引物HP1-F
<400> 1
acatctgtac ccacgccttc 20
<210> 2
<211> 30
<212>腿
<213>人工合成
〈221〉下游引物HP1-R
<400> 2
tcgatgatgt ggtctttgga 20
<210> 3 <211〉 56 <212> DNA <213>人工合成 <221〉 PI-F <400> 3
gtgaggaaag gtattcctgc taatgttttt tttttttttt tttttttttt tttttt 56
<210> 4 <211> 56 <212> DNA <213>人工合成 <221> Pl -D1 <400〉 4
Utttttttt tttttttttt tttttttttt tgatgtggtc tttggagtag taacct 56
<210> 5 <211〉 56
12<212>腿 <213>人工合成 <221> PI-D2 <400> 5
ttttttttu tttttttttt tttututt UUgatgtg gtctUggag tagtaaccc 59
權利要求
1、基于線粒體DNA A13497G單核苷酸多態性檢測高原肺水腫易感性的試劑盒，其特征是該試劑盒包括以下分離包裝的試劑試劑一，引物混合液，序列如下上游引物HP1-F5’-ACATCTGTACCCACGCCTTC-3’；下游引物HP1-R5’-TCGATGATGTGGTCTTTGGA-3’；試劑二，PCR反應混合液；試劑三，線粒體DNA的13497位點單核苷酸多態性A對照DNA；試劑四，線粒體DNA的13497位點單核苷酸多態性G對照DNA；試劑五，探針混合液，三種探針序列如下①P1-F5’-GTGAGGAAAGGTATTCCTGCTAATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，為熒光物FAM標記；②P1-D1線粒體DNA的13497位點為單核苷酸多態性A5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTGGTCTTTGGAGTAGTAACCT-3’；③P1-D2線粒體DNA的13497位點為單核苷酸多態性G5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTGGTCTTTGGAGTAGTAACCC-3’；試劑六，連接反應混合液；試劑七，電泳混合液。
2、 根據權利要求1所述的基于線粒體DM A13497G單核苷酸多態性檢測高 原肺水腫易感性的試劑盒，其特征是試劑一，引物混合液100nl;上游引物和下游引物各50nl混合，濃度均 為10pmo1/ n l'，試劑二，PCR反應^^液1000 p l;成分有1XPCR buffer, 2. OmMMgCl2， 200 mM dNTPs， 1 U Taq酶，余量為蒸餾水；試劑三，線粒體DM的13497位點單核苦酸多態性A對照DNA 50 n 1，濃 度為50ng/jLi 1;試劑四，線粒體DNA的13497位點單核苷酸多態性G對照DM 50 n 1，濃 度為50ng/Ml;試劑五，探針混合液120 n 1，三種探針各40 n 1混合，該三種^^濃度均 為12. 5pmol/ul;試劑六，連接^Ji混合液100pl;成分有pH7. 6的20mMTris-HCl， 25 mM 醋酸鉀，10mM醋酸鎂，10 mM 二琉蘇糖醇，lmM氧化型輔酶I ， 0.1% Triton X-IOO， 0.5 nl Taq DNA連接酶，余量為蒸餾水；試劑七，電泳混合液lOOjil;熒光物質lx ROX和上樣緩沖液6xloading buffer各為50 m 1
全文摘要
本發明涉及基于線粒體DNA A13497G單核苷酸多態性檢測高原肺水腫易感性的試劑盒，其特征是該試劑盒包括以下分離包裝的試劑試劑一，引物混合液；試劑二，PCR反應混合液；試劑三，線粒體DNA的13497位點單核苷酸多態性A對照DNA；試劑四，線粒體DNA的13497位點單核苷酸多態性G對照DNA；試劑五，探針混合液；試劑六，連接反應混合液；試劑七，電泳混合液。本發明使用簡單，操作方便，檢測快速，能用于平原人進入高原前對高原肺水腫易感者的篩選，指導HAPE的預防和治療，減輕急性重癥高原病的威脅，有利于進入高原人群健康。
文檔編號G01N27/447GK101470096SQ20071009281
公開日2009年7月1日 申請日期2007年10月1日 優先權日2007年10月1日
發明者劉福玉, 羅勇軍, 羽 翟, 蔣春華, 建 陳, 高文祥, 高鈺琪 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學