專利名稱：：結合反應性物質的微小粒子的沉降抑制方法及含其的試劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及結合有抗體或抗原等具有反應性的物質的微小粒子(以下，稱為結合反應性物質的微小粒子)的沉降抑制方法以及使用了該結合反應性物質的微小粒子的免疫測定用試刑.特別是涉及主要在臨床檢查領域中在利用了抗原抗體反應的免疫學測定中使用的結合反應性物質的微小粒子的沉降抑制方法以及使用了該結合反應性物質的微小粒子的免疫測定用試刑.
背景技術：
近年來，對于臨床檢查等各種檢查而言，從自動化和縮短測定時間的觀點出發，廣泛使用利用免疫反應測定生物試樣中的物質的方法.作為該免疫測定方法，可以舉出RIA法、EIA法、免疫比濁法、膠乳凝集法、膠體金凝集法、免疫色譜法等.其中，膠乳凝集法、膠體金凝集法等使用了結合有具有反應性的物質的微小粒子(結合反應性物質的微小粒子)的方法不需要進行反應液的分離、洗滌搮作，因此特別適用于測定的自動化以及縮短時間.但是，這些膠乳凝集法、膠體金凝集法由于結合反應性物質的微小粒子易于沉降，因此在使用時或測定時必須經常攪拌以使得該微小粒子的濃度均勻，具有易于產生測定誤差的問題.例如，在上述方法中使用的試刑通常由2種試刑構成，即主要含有輔助試樣的稀釋、試樣在主反應前的前處理和主反應的成分的第一試刑；含有作為主要參與反應的主成分的結合反應性物質的徵小粒子的笫二試刑.使用自動化分析裝置時，首先將試樣和笫一試劑分注到反應池中，經過一段時間后在反應池中分注第二試劑，從而將試樣、笫一試刑和笫二試刑三者混合，得到最終反應液，進行測定.此時，即便將含有結合反應性物質的微小粒子試刑(笫二試刑)放置在分析裝置中，也需要每隔一定時間攪拌笫二試刑，使濃度變得均勻.以往一直都沒有進行抑制這種結合反應性物質的微小粒子的沉降的研究.對于上述第一試刑、笫二試刑和最終反應液的組成而言，僅是為了提高微小粒子反應性的穗定性、促進反應而進行了改良(例如專利文獻1和2).在專利文獻1中，作為使致敏金屬膠體的反應性穩定化的方法，記栽了使含有致敏金屬膠體的溶液含有選自從鈣離子和鎂離子及鈀離子中選擇的金屬離子、疏酸葡聚糖、膽酸、脫氣膽酸、黃尿酸或它們的鹽中的l種或2種以上.在專利文獻2中，記栽了在使結合有測定對象物質的抗體(或抗原)的膠體金粒子與測定物質反應的溶液(最終反應液)中，含有0.4~2.5(WAV)%的平均分子量約為20,000以上的聚陰離子或其鹽作為反應促進劑.專利文獻1:日本特開平11-101799號公報專利文獻2:日本特開平6-213891號公報
發明內容因此，為了減小測定值的誤差，需求一種抑制結合反應性物質的微小粒子的沉降、長期且穩定地保持試刑或反應液中的濃度的技術.特別是在自動分子裝置中，在放置試刑后，如果疏于攪拌搮作則有可能產生測定誤差、導致臨床判斷錯誤，因此開發結合反應性物質的微小粒子在溶液中的沉降抑制方法以及使用了方法的測定試刑非常重要.因此，本發明的目的在于提供抑制結合反應性物質的微小粒子在分散液中該微小粒子沉降的方法.本發明的目的還在于，提供在靜置保存后或放置在自動免疫分析裝置中后不需要再次通過攪拌操作使其分散的、測定誤差小的試劑.本發明人為了達成上述課題而進行了深入研究，結果發現在結合反應性物質的微小粒子的分散液中，通過使選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環糊精、聚乙二醇、丙三醇中的至少1種化合物共存，可以抑制結合反應性物質的微小粒于的沉降、可以長期且穗定地保持分散液中的結合反應性物質的微小粒子的濃度，進而完成本發明.本發明提供結合有具有反應性的物質的微小粒子的沉降抑制方法，該方法包括在該微小粒子的分散液中共存有選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環糊精、聚乙二醇、丙三醉中的至少l種化合物的工序.對于l個實施方式而言，在上述分散液中含有0.3~5質量％的上迷聚陰離子或其鹽、0.1~5質重％的上迷葡聚糖、0.1~5質重％的上述環糊精、0.3~5質重％的上述聚乙二醇、或5-40質量％的上述丙三醇.在其他實施方式中，上述聚陰離子及其鹽是具有硤酸基的水溶性高分子化合物.在其他實施方式中，上述聚陰離子是硫酸葡聚糖或肝素.在其他實施方式中，上述結合有具有反應性的物質的微小粒子是結合有抗體或抗原的膠體金粒子.本發明的試刑含有結合有具有反應性的物質的微小粒子、以及選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環糊精、聚乙二醇、丙三醇中至少1種的化合物，抑制該微小粒子的沉降.對于1個實施方式而言，在上述試劑中含有0.3~5質量°/。的上述聚陰離子或其鹽、0.3~5質量％的上述葡聚糖、0.1~5質量％的上述環糊精、0.5-5質量％的上述聚乙二醇、或5~40質重％的上述丙三醇.在其他實施方式中，上述聚陰離子及其鹽是具有硤酸基的水溶性高分子化合物.在其他實施方式中，上述聚陰離子是硫酸葡聚糖或肝素.在其他實施方式中，上述結合有具有反應性的物質的微小粒子是結合有抗體或抗原的膠體金粒子.本發明的試刑盒含有上述試刑.本發明的自動化免疫測定方法包括將上述試劑與試樣混合的工序.通過本發明，可以抑制結合反應性物質的微小粒子的沉降.因此，可以提供該微小粒子的沉降被抑制的試刑.該試刑由于該微小粒子的濃度可以被長期且均勻地保持，因此使用該試刑進行免疫測定時，即便不在每次測定時攪拌該試劑，也可以將結合反應性物質的微小粒子等量地分注到最終反應液中，因此可以得到誤差小的穗定的測定值.具體地說，當將含有結合反應性物質的微小粒子的試劑放置在自動分析裝置中長期地連續測定時或者隔一段時間測定時，不需要以往所必需的在每次測定時或每隔一段時間攪拌該含微小粒子試刑使分散液中的濃度變得均勻的搮作，即可得到經過長時間誤差也很小的正確的測定值.由此，在不需要對于測定者來說是一個很大負擔的繁瑣的挽拌採作的同時，還可以防止由于疏于攪拌搮作所產生的測定誤差和由此導致的臨床判斷錯誤.附困說明困1為顯示特定血清胱抑素c濃度測定值的經時變化的曲線困.困2為顯示特定鐵蛋白濃度測定值的經時變化的曲線困.具體實施方式1.結合反應性物質的微小粒子的沉降抑制方法本發明的結合反應性物質的微小粒子的沉降抑制方法包括使該微小粒子的分散液中共存有選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環糊精、聚乙二醇、丙三醇中的至少l種化合物的工序.在本發明的方法中使用的結合反應性物質的微小粒子是可以作為免疫測定試劑使用的微小粒子，優選為膠乳粒子和金屬膠體粒子.作為金屬膠體粒子，一般膠體金粒子易于使用，因此優選.膠體金粒子可以使用市售品，也可以是實驗者通過通常使用的方法、例如利用檸檬酸鈉將氣金酸還原的方法配制而成.膠體金粒子的粒徑通常為5nm~100nm，優選為30nm-60咖的范圍對于結合在上述微小粒子上的物質而言，只要是特異性結合在測定對象物質上的物質即可利用.例如可以舉出抗體、抗原、受體、凝集素、脫氣核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等具有結合親和性的物質.在本發明的方法中，使用聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環糊精、聚乙二醇或者丙三醇.在本說明書中，將這些化合物稱為沉降抑制物質.沉降抑制物質可以單獨使用，也可以組合2種以上使用.作為上述沉降抑制物質之一的聚陰離子，可以舉出碟酸葡聚糖、肝素、聚苯乙烯磺酸、透明質酸和硤酸軟骨素.作為聚陰離子的鹽，可以舉出葡聚糖硫酸鈉、肝素鈉等.在聚陰離子及其鹽中，從沉降抑制效果髙的觀點出發，優選使用具有硤酸基的水溶性高分子化合物.這種化合物例如有硫酸葡聚糖、肝素、葡聚糖碟酸鈉和肝素鈉.本發明的方法在上述結合反應性物質的微小粒子的分散液中使上述沉降押制物質共存.作為使其共存的方法沒有特別限定.例如可以在結合反應性物質的微小粒子的分散液中加入沉降抑制物質，可以在沉降抑制物質、或者在利用分散介質將沉降抑制物質稀釋后的稀釋液中，加入結合反應性物質的微小粒子，還可以將結合反應性物質的微小粒子與沉降抑制物質混合并將該混合物加入到分散介質中.需要說明的是，分散介質沒有特別限定，可以使用水或者使用了后述緩沖刑的緩沖液等.本發明的方法中，分散液中的結合反應性物質的微小粒子濃度可以是在該領城中通常采用的濃度.在本發明的方法中，共存于分散液中的沉降抑制物質的濃度根據沉降抑制物質的種類而適當設定.例如，為聚陰離子或其鹽時，優選為0.3~5質量％、更優選為0.5-2質量％、進一步優選為0.7-1.1質量％.為葡聚糖或環糊精時，優選為0.1-5質重％、更優選為0,2~1.8質量°/。、進一步優選為0.5-1.5質量％.為聚乙二醇時，優選為0.3~5質量％、更優選為0，5~3質重°/。.為丙三醇時，優選為5~40質量％、更優選為10~35質量％.根據本發明的方法，通過在結合反應性物質的微小粒子的分散液中共存沉降抑制物質，可以抑制結合反應性物質的徵小粒子的沉降.因此，通過使用該方法，可以在分散液中長期、穗定地保持該微小粒子.2.含有結合反應性物質的微小粒子和沉降抑制物質的試刑本發明的試劑含有上述結合反應性物質的微小粒子和上述沉降抑制物質，根據需要還含有緩沖劑、糖、糖醇、白蛋白、氣化鈉、防腐劑及其他添加刑.該試劑由于抑制了結合反應性物質的微小粒子的沉降，因此長期地使該微小粒子的濃度保持均勻.本發明的試刑通常為液體狀，作為使用了結合反應性物質的微小粒子的試劑、特別是在該領域中通常使用的免疫測定用試劑的笫二試劑使用.本發明試劑中的結合反應性物質的微小粒子的濃度和沉降抑制物質的濃度沒有特別限定.從提高抑制結合反應性物質的徵小粒子沉降的觀點出發，優選為上述方法中所采用的濃度范閨.作為本發明試刑中所含的緩沖刑，可以舉出辨酸緩沖液；Tris-鹽酸緩沖液；琥珀酸緩沖液；雙甘肽、MES(2-(N-嗎淋代)乙橫酸)、HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)、TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、PIPES(哌喚-1，4-二(2-乙磺酸))、Bis-Tris(二(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷)等的Good緩沖液等.優選含有上述緩沖刑使試劑中的pH達到5~9或者濃度達到1~100mM.作為本發明試刑中所含有的糖和糖醇，可以舉出葡萄糖、甘露糖、砂糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇等.上述糖或糖醇在試刑中的濃度優選為0.01~10質量％.作為本發明試刑中可以含有的白蛋白，可以舉出牛血清白蛋白(BSA)等.白蛋白在試劑中的濃度優選為0.001~1質量％.作為本發明試刑中可以含有的防腐刑，可以舉出疊氮化鈉等.防腐劑在試劑中的濃度優選為0.01~0.5質重％.作為本發明試刑中可以含有的其他添加刑，可以舉出吐溫20、聚乙二醇月桂基醚、5-溴水楊酸鈉、水楊酸鈉、安息香酸鈉、苯磺酸鈉、苯盼、廉香萆盼等.本發明的試劑如上所述，由于結合反應性物質的微小粒子的沉降被抑制，因此該微小粒子的濃度長期地保持均勻.因此，例如當使用該試刑進行免疫測定時，即便在每次測定時不撹拌該試刑，也可以將結合反應性物質的微小粒子等量地分注到最終反應液中，可以得到誤差小的穩定的測定值.3.試刑盒本發明的試劑盒包含含有上述結合反應性物質的微小粒子和沉降抑制物質的試刑(本發明的試刑)，該試刑盒例如可以用在使用了膠乳凝集法、膠體金凝集法等的免疫測定、特別是自動化免疫測定中.本發明的試刑盒作為免疫測定用試刑盒使用時，該試劑盒通常可以由以下物質構成含有輔助試樣的稀釋、試樣在免疫反應前的前處理和免疫反應的成分等的笫一試劑，本發明的試刑(笫二試刑)以及根據需要制作標準曲線用的測定對象物質的標準品.本發明的試刑盒可以根據結合在本發明試刑中橄小粒子上的反應性物質，將試樣中的各種物質作為測定對象.作為可以成為測定對象的物質(測定對象物質)，例如可以舉出白蛋白、血紅蛋白、血紅蛋白Alc、肌紅蛋白、鐵傳遞蛋白、乳鐵傳遞蛋白、血清胱抑素C、鐵蛋白、ot-胎蛋白、癌胚抗原、CA19-9、前列腺特異抗原、C反應性蛋白質(CRP)、纖維素分解產物(FDP)、胃蛋白酶原I和II、膠原等蛋白質；高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、超低密度脂蛋白等脂蛋白；脫氣核糖核酸、核糖核酸等核酸；堿性褲酸蘇、乳酸脫氣酶、脂肪蘇、淀粉醉等醉；IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等免疫球蛋白；B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人免疫不全病毒、幽門螺旋桿菌以及與它們的抗體等導致的感染癥相關的抗原或抗體；象噥啶醇、溴哌利多等藥物；性激素等激素等.作為含有供測定的測定對象物質的試樣，可以舉出血液、血漿、血清、尿、糞便(懸濁液)、骨tt液、腹水等生物試樣，從環境中獲得的樣品或其提取物等.4.自動化免疫測定方法本發明的自動化免疫測定方法使用本發明的試劑進行.該自動化免疫測定方法由于在試刑中結合反應性物質的微小粒子的沉降被抑制、其濃度長期地保持均勻，因此即便在每次測定時不攪拌該試刑，也可以將結合反應性物質的微小粒子等量地分注到最終反應液中，可以得到誤差小的穩定的測定值.本發明的自動化免疫測定方法，具體地說，將試樣、笫一試劑和本發明的試劑(笫二試刑)放置在自動分析裝置中，在試樣中依次自動混合第一試劑和第二試劑，從而進行.第一試刑和第二試劑的比例可以適當設定.本發明的試劑(第二試刑)優選稀釋2~9倍、更優選稀釋3~5倍.本發明的自動化免疫測定方法在長期間地連續測定時或者隔一定期間測定時，也不需要以往所必須的在每次測定時或每隔一定期間撹拌該含微小粒子試劑使溶液中的濃度均勻的操作，即可得到經長期誤差也很小的、正確的測定值.實施例以下根據實施例進一步具體地說明本發明，但本發明并不限定于此.在以下實施例中，只要沒有特別說明，％均表示質重/容量％(w/v%).實施例l:膠體金液的配制在1L951C的蒸餾水中一邊攪拌一邊加入2mL10%的氯金酸溶液，l分鐘后加入10mL2。/o檸樣酸鈉溶液，再攪拌20分鐘，之后冷卻到30TC.冷卻后，用0.1%碳酸鈣將pH調整到7.1.實施例2:血清胱抑素C測定用笫一試刑的配制在含有5%氯化鈉、0.2%EDTA、0.2%烷基苯基二磺酸鈉鹽、0.35%聚氣乙烯月桂基醚的0.5MBis-Tris(pH6.7)溶液中加入1.0~2.5%左右的聚乙二醇作為反應促進刑，制成血清胱抑素C測定用笫一試刑.實施例3:結合抗血清胱抑素C抗體的膠體金試劑(第二試劑)的配制用含有0.05%疊氮化鈉的10mMHEPES(pH7.1)稀幹抗血清胱抑素C抗體(夂3.'-Y:x株式會社)，使濃度達到50pg/ml.將100mL該抗血清胱抑素C抗體溶液加入到約1L在實施例1中配制的膠體金液中，在冷藏的狀態下攪拌2小時.進而，添加110mL舍有5.46%甘露醉、0.5%BSA和0.05%疊氮化鈉的10mMHEPES(pH7.1)，在37r下攪拌90分鐘.接著，以8000轉離心分離40分鐘，除去上清后，再加入約1L的含有3%甘露醇、0.1。/。BSA和0.05°/。疊氮化鈉的5mMHEPES(pH7.5)(A溶液)，使結合抗體的膠體金分散.進而，在8000轉離心分離糾分鐘，除去上清，使抗體致敏膠體金分散在A溶液中，使總量達到210mL，得到結合抗血清胱抑素C抗體的膠體金試刑(第二試刑).實施例4:丙三醇或聚乙二醇的添加效果探討(1)血清胱抑素C濃度約為8mg/L的試樣(試樣1)的測定在結合抗血清胱抑素C抗體的膠體金試刑(笫二試刑)中加入丙三醇，使丙三醇含童達到33%，配制含有丙三醇的笫二試劑.在曰立7070自動分析裝置中分別放置血清胱抑素C濃度約為8mg/L的試樣(試樣1)、在實施例2中配制的笫一試刑和上述含有丙三醉的笫二試刑，在以下條件下測定放置時的吸光度變化重.(測定條件)在3pL試樣l中分注240nL第一試劑，在371C下加熱約5分鐘，接著分注60nL含有丙三醇的笫二試刑，在37"下反應.之后，在主波長546nm和副波長660nm下進行從測光點18到31的兩點測定，測定兩點間的吸光度變化量.需要說明的是，吸光度變化量是在分注上述笫二試刑時，分別對未拔拌的情況(未攪拌吸光度變化量)和預先挽拌過的情況(挽拌吸光度變化量)進行測定的.測定后，經過1天后，與上述同樣地搮作，測定經過1天后的吸光度變化量(未攪拌吸光度變化量和撹拌吸光度變化量).由所得的放置時和經過1天后的未攪拌吸光度變化量以及攪拌吸光度變化量，計算各個測定值之差.結果示于表l中.另外，除了使用含有2。/。聚乙二醇(PEG)的第二試劑(含有PEG的笫二試劑)、含有33%丙三醇和2%PEG的笫二試刑(含有混合物的笫二試刑)或直接使用笫二試刑來代替含有丙三醇的笫二試刑之外，與上述同樣地操作，測定吸光度變化量，計算測定值之差.結果一并示于表l中.表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(2)血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)的測定除了使用血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)代替試樣1之外，與上述(l)同樣地操作，計算測定值之差.結果示于表2中.表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*1…測定前攪拌笫二試劑(3)血清胱抑素C濃度約為lmg/L的試樣(試樣3)的測定除了使用血清胱抑素C濃度約為1mg/L的試樣(試樣3)代替試樣1之外，與上述(l)同樣地操作，計算測定值之差.結果示于表3中.表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*1...測定前攪拌第二試劑由上述表1~3的結果可知，在第二試劑中加有沉降抑制物質(丙三醇、聚乙二醇或丙三醇與聚乙二醇的混合物)時，與不加沉降抑制物質時相比，經過1天后的測定值差別很小.不加沉降抑制物質時，如果經過1天，則結合抗體的膠體金粒子由于重力而沉降，因此試刑液上層部分的濃度變稀.因而，如果在測定前不進行攪拌，則在自動分析裝置中試劑會從濃度稀的上層區域被分注到反應池中，因此直接參與反應的結合抗體的膠體金粒子量減少，吸光度變化量大幅度增加.因而，在靜置1天后，如果比較測定前攪拌了結合抗體的膠體金試劑的愔況和未攪拌情況的吸光度變化量，無論是否測定相同試樣，都有很大差別.由此可知，通過在結合抗體的膠體金試刑中添加丙三醇和/或聚乙二醉，可以抑制靜罝保存時結合抗體的膠體金粒子的沉降、可以保持結合抗體的膠體金試劑的均勻性.實施例5:葡聚糖或葡聚糖硫酸鈉的添加效杲探討(1)血清胱抑素C濃度約為8mg/L的試樣(試樣1)的測定在結合抗血清胱抑素C的抗體的膠體金試劑(第二試劑)中加入葡聚糖，使其含量達到1%,配制含有葡聚糖的笫二試劑.除了使用含有葡聚糖的笫二試刑代替含有丙三醇的笫二試刑、測定放置時經過3天后的吸光度變化量代替放置時經過1天后的吸光度變化重之外，與實施例4的(1)同樣地搮作，測定吸光度變化量，求出測定值之差.結果示于表4中.另外，除了使用含有1%葡聚糖碟酸鈉的笫二試刑(含有葡聚糖硫酸鈉的笫二試刑)或直接使用第二試刑來代替含有葡聚糖的笫二試刑之外，與上述同樣地搮作，測定吸光度變化量，計算測定值之差.結果一并示于表4中.表4<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>M…測定前攪拌第二試劑(2)血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)的測定除了使用血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)代替試樣1之外，與上迷實施例5的(1)同樣地搮作，計算測定值之差.結果示于表5中.表5<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*1...測定前攪拌笫二試刑由上述表4和5的結果可知，在第二試刑中加有沉降抑制物質(葡聚糖或葡聚糖硤酸鈉)時，與不加沉降抑制物質時相比，經過3天后的測定值的差別很小.由此可知，通過在結合抗體的膠體金試刑中添加沉降抑制物質(葡聚糖或葡聚糖硤酸鈉)，可以抑制靜置保存時結合抗體的膠體金粒子的沉降、可以保持結合抗體的膠體金試刑的均勻性.實施例6:肝素鈉的添加效果探討(1)血清胱抑素C濃度約為8mg/L的試樣(試樣1)的測定在結合抗血清胱抑素C的抗體的膠體金試刑(笫二液)中加入肝素鈉，使肝素鈉含量達到1%，配制含有肝素的笫二試劑.除了使用含有肝素的第二試劑代替含有丙三醇的第二試劑、測定放置時經過2天后的吸光度變化量代替放置時經過1天后的吸光度變化量之外，與實施例4的(1)同樣地搮作，測定吸光度變化重，求出測定值之差.結果示于表6中.表6<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>"...測定前撹拌第二試刑(2)血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)的測定除了使用血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)代替試樣1之外，與上述實施例6的(1)同樣地操作，計算測定值之差.結果示于表7中.表7<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*1...測定前撹拌笫二試刑由上述表6和7的結果可知，在笫二試刑中加有沉降抑制物質(肝素鈉)時，與不加沉降抑制物質時相比，經過2天后的測定值的差別很小.由此可知，通過在結合抗體的膠體金試劑中添加沉降抑制物質(肝素鈉)，可以抑制靜里保存時結合抗體的膠體金粒子的沉降、可以保持結合抗體的膠體金試刑的均勻性.實施例7:葡聚糖硫酸鈉的添加效果探討(經時變化)(1)血清胱抑素C濃度約為8mg/L的試樣(試樣1)的測定在結合抗血清胱抑素C的抗體的膠體金試刑(笫二試刑)中加入葡聚糖碟酸鈉，使葡聚糖硫酸鈉含量達到1%，配制含有葡聚糖硤酸鈉的笫二試刑.除了使用含有葡聚糖的笫二試刑代替含有丙三醇的笫二試劑、測定放置時經過2天后、3天后、6天后和7天后的吸光度變化量代替放置時經過1天后的吸光度變化量之外，與實施例4的(1)同樣地操作，測定吸光度變化量.由所得的吸光度變化量、使用通過已知濃度的標準液制作的標準曲線計算血清胱抑素C濃度.結果示于表8和困1中.表8<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>(2)血清胱抑素C濃度約為4mg/L的試樣(試樣2)的測定除了使用血清胱抑素C濃度約為4邁g/L的試樣(試樣2)代替試樣1之外，與上述實施例7的(1)同樣地搮作，測定吸光度變化重，求出血清胱抑素C濃度.結果示于表9和困1中.<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>n…測定前攪拌第二試劑由上述表8和9以及困i的結果可知，在第二試刑中加有沉降抑制物質(葡聚糖硤酸鈉)時，即便不進行特別地攪拌，與攪拌后的測定值相比也無變化，直至7日后都可以得到穗定的測定值.相反，不加入沉降抑制物質時，如果不在測定前進行攪拌使結合抗體的膠體金粒子濃度均勻，則結合抗體的膠體金粒子會慢慢沉降，試劑上部的結合抗體的膠體金粒子濃度變稀，從而分注到反應體系中的結合抗體的膠體金粒子重減少、隨著天數的增加測定值降低.由此可知，通過在結合抗體的膠體金試劑中添加沉降抑制物質(葡聚糖硫酸鈉)，可以抑制結合抗體的膠體金粒子的沉降、可以使結合抗體的膠體金粒子濃度在試劑中長期地保持均勻.因而，在靜置在自動分析裝置上的狀態下不進行攪拌，也可以得到穗定的測定值.實施例9:鐵蛋白測定用笫一試劑的配制在含有5%氟化鈉、0.2%EDTA和0.35%聚氣乙秌月桂基酸的0.5MPIPES(pH6,5)溶液中加入1.5~2，0%左右的聚乙二醇作為反應促進劑，制作鐵蛋白測定用第一試劑.實施例10:結合抗鐵蛋白抗體的膠體金試劑(鐵蛋白測定用第二試劑)的配制用含有0.05%疊氮化鈉的10mMHEPES(pH7,1)稀釋抗鐵蛋白抗體7弋W》抹式會社)，使濃度達到50叫/mL.將100mL該溶、夜加入到約1L在實施例1中配制的膠體金液中，在冷藏條件下擾拌2小時.進而，加入110mL含有5.46°/。甘露醇、0.5。/。BSA和0.05%疊氮化鈉的10mMHEPES(pH7.1)，在37TC下攪拌卯分鐘.接著，以8000轉離心分離40分鐘，除去上清后，再加入約1L的含有3%甘露醇、0.1%BSA和0.05%疊氮化鈉的5mMHEPES(pH7.5)(A溶液)，使結合抗體的膠體金分散.進而，在8000轉離心分離40分鐘，除去上清，使抗體致敏膠體金分散在A溶液中，使總量達到280mL，得到結合抗鐵蛋白抗體的膠體金試劑。實施例ll:葡聚糖疏酸鈉的添加效果探討(1)鐵蛋白濃度約為760ng/L的試樣(試樣4)的測定在結合抗鐵蛋白抗體的膠體金試劑(第二試劑)中加入葡聚糖硫酸鈉，使葡聚糖硫酸鈉含重達到0.2%,配制含有0.2%硫酸葡聚糖的笫二試劑.在日立7070自動分析裝置中放置鐵蛋白濃度約為760ng/L的試樣(試樣4)、在實施例9中配制的笫一試刑和上述含有0.2%硫酸葡聚糖的笫二試刑，在以下條件下測定放置時的吸光度變化量.(測定條件)在10pL試樣4中分注iiL第一試刑，在"1C下加熱約5分鐘，接著分注80^L含有0.2。/。硫酸葡聚糖的笫二試劑，在3^7TC下反應.之后，在主波長505nm和副波長700nm下進行從測光點l8到31的兩點測定，測定兩點間的吸光度變化量。需要說明的是，吸光度變化量是在分注上述笫二試劑時，分別對未攪拌的情況(未攪拌吸光度變化量)和預先撹拌過的情況(攪拌吸光度變化重)進行測定的.與上述同樣地操作，測定從測定當天開始經過2天后、4天后和7天后的吸光度變化量(未攪拌吸光度變化重和攪拌吸光度變化量).由得到的放置時、經過2天后、經過4天后和經過7天后的未攪拌吸光度變化量以及攪拌吸光度變化童，使用通過已知濃度的標準液制作的標準曲線計算鐵蛋白濃度.結果示于表IO中.另外，除了使用含有1.0%破酸葡聚糖的第二試刑、含有2.0%破酸葡聚糖的笫二試刑或直接使用笫二試劑來代替含有0.2%碟酸葡聚糖的笫二試刑之外，與上述同樣地採作，測定吸光度變化量，計算鐵蛋白濃度.結果一并示于表IO中.需要說明的是，使用含有2.0%碟酸葡聚糖時和直接使用笫二試刑時(對照)的鐵蛋白濃度一并示于田2中.表10<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*1."測定前攪拌笫二試刑(2)鐵蛋白濃度約為520ng/inL的試樣(試樣5)的測定除了使用鐵蛋白濃度約為520ng/mL的試樣(試樣5)代替試樣1之外，與上迷實施例11的(1)同樣地搮作，測定吸光度變化量，求出鐵蛋白濃度.結果示于表ll中.需要說明的是，使用含有2.0%硤酸葡聚糖時和直接使用笫二試劑時(對照)的鐵蛋白濃度一并示于困2中.表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>"…測定前攪拌笫二試刑由上迷表IO、11以及閨2的結果可知，在笫二試刑中加有沉降抑制物質(葡聚糖硤酸鈉)時，與不加入沉降抑制物質時相比，在經過2天后、經過4天后和經過7天后的測定值差別很小.特別是使用含有1.0%葡聚糖碟酸鈉的笫二試劑和含有2.0%葡聚糖碟酸鈉的笫二試刑時，即便經過7天后，經過攪拌時的測定值與在測定前未攪拌結合抗體的膠體金試刑時的測定值完全沒有差別.不添加沉降抑制物質時，如果不在測定前進行攪拌使結合抗體的膠體金粒子濃度均勻，則結合抗體的膠體金粒子會慢慢沉降，試刑上部的結合抗體的膠體金粒子濃度變稀，從而分注到反應體系中的結合抗體的膠體金粒子量減少、隨著天數的增加測定值降低.由此可知，通過在結合抗體的膠體金試劑中添加沉降抑制物質(葡聚糖硫酸鈉)，可以抑制結合抗體的膠體金粒子的沉降、可以使結合抗體的膠體金粒子濃度在試刑中長期地保持均勻.因而，在靜置在自動分析裝置上的狀態下不進行攪拌，也可以得到穗定的測定值.產業實用性根據本發明可以抑制結合反應性物質的微小粒子的沉降.因此，可以提供該微小粒子的沉降被抑制的試刑.該試刑可以將該微小粒子的濃度長期地保持均勻.因而，使用該試劑進行免疫測定時，即便不攪拌該試劑也可以將結合反應性物質的微小粒子等量地分注到最終反應液中，因此可以得到誤差小的穗定的測定值.由此，在不需要對于測定者是個較大負擔的繁瑣的攪拌操作的同時，還可以防止由于疏于挽拌搮作所產生的測定誤差和由此導致的臨床判斷錯誤.該試刑和含有該試劑的試劑盒對于自動化免疫裝里特別有用.權利要求1.一種結合有具有反應性的物質的微小粒子的沉降抑制方法，該方法包括在該微小粒子的分散液中使選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環糊精、聚乙二醇和丙三醇中的至少1種共存的工序。2.權利要求l的方法，其中，在所述分散液中含有0.3~5質重％的所述聚陰離子及其鹽、0.1~5質量％的所述葡聚糖、0.1-5質量％的所述環糊精、0.3~5質量％的所述聚乙二醇或5~40質量°/。的所述丙三醇.3.權利要求1或2的方法，其中，所述聚陰離子或其鹽為具有疏酸基的水溶性高分子化合物.4.權利要求3的方法，其中，所述聚陰離子為碟酸葡聚糖或肝素.5.權利要求l-4任一項所述的方法，其中，所述結合有具有反應性的物質的微小粒子是結合有抗體或抗原的膠體金粒子.6.—種試刑，該試刑含有結合有具有反應性的物質的微小粒子和選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環糊精、聚乙二醇和丙三醇中的至少1種化合物，抑制該微小粒子的沉降.7.權利要求6的試刑，在所述試刑中含有0.3~5質量％的所述聚陰離子及其鹽、0,1~5質量％的所述葡聚糖、0.1~5質量％的所述環糊精、0.5~5質量％的所述聚乙二醇或5~40質量％的所述丙三醇.8.權利要求6或7的試刑，所述聚陰離子或其鹽是具有硤酸基的水溶性高分子化合物.9.權利要求8的試劑，所述聚陰離子為碟酸葡聚糖或肝素.10.權利要求6~9任一項所述的試刑，其中所述結合有具有反應性的物質的微小粒子是結合有抗體或抗原的膠體金粒子.11.一種試刑盒，該試刑盒含有權利要求6~10任一項所述的試刑.12.—種自動化免疫測定方法，該方法包括將權利要求6~10任一項所述的試劑與試樣混合的工序.全文摘要本發明提供通過抑制結合反應性物質的微小粒子在分散液中的沉降使分散液中的結合反應性物質的微小粒子濃度保持均勻的方法。本發明提供結合有具有反應性的物質的微小粒子的沉降抑制方法。該方法包括在該微小粒子的分散液中使選自聚陰離子及其鹽、葡聚糖、環糊精、聚乙二醇和丙三醇中的至少1種共存的工序。文檔編號G01N33/553GK101266244SQ20071008639公開日2008年9月17日申請日期2007年3月15日優先權日2007年3月15日發明者田中睦申請人:愛芙樂賽制藥株式會社