專利名稱：人體內生長激素變異的檢測方法、該變異及其應用的制作方法
本申請是申請日為2001年5月14日、發明名稱為“人體內生長激素變異的檢測方法、該變異及其應用”的中國發明專利申請No.01809392.2的分案申請。
本發明涉及一種檢測自然發生的生長激素突變的方法；還涉及由此檢測到的突變，及其在篩選生長激素紊亂患者方面或在制造適于治療此類紊亂的變體蛋白質方面的應用。
一個多世紀以前人們已經知道，人類的身材受遺傳因素的影響。雖然早在1912年，家族性矮小身材及其通常以隱性方式遺傳的特點就為人所知，但在科學文獻中正確地記載這些家族則是20多年后的事。而直到1966年人們才認識到隱性遺傳的矮小身材通常與單一性生長激素(GH)缺乏癥相關。
與生長激素缺陷相關的矮小身材，在出生人口中的發生幾率估計在1/4000到1/10000之間。其中大多數情況為偶爾發生的和自發性的，但5％到30％的病例有與遺傳病因相一致的輕度發病相關性。對生長激素缺陷的遺傳病因的證實，來自對家族性矮小身材的分子遺傳學分析，以及早期對發病個體中垂體表達的生長激素基因(GH1)突變損傷的闡述。家族性矮小身材也有可能是許多其它基因(如POU1F1，PROP1和GHRHR)突變所致，將不同的類型區分開來是重要的。
生長激素(GH)是一種多功能的激素，通過各種效應促進出生后骨骼和軟組織生長。對GH直接和間接作用的相對作用仍有爭議。一方面，GH在各種組織和器官中的直接效應現已得到闡明，并證明在多種細胞類型中存在生長激素受體。另一方面，有充分的數據表明大多數GH的效應是通過生長激素依賴的胰島素樣生長因子I(IGF-1)所介導的。IGF-I是由多種組織，主要是肝臟所產生的，并通過其受體促進包括骨、軟骨、骨骼肌在內的多種組織的發育和成熟。除了促進組織生長，GH還可發揮許多其它生物作用，包括生乳的、致糖尿病的、脂肪分解和蛋白質合成代謝的作用以及鈉和水的潴留作用。
在整個兒童期需要足量的GH來維持正常生長。GH缺陷的新生兒通常身高和體重正常。有些可能有陰莖過小或空腹性低血糖，伴隨低線性的出生后的生長，其隨著年齡的增長轉變為進行性生長遲緩。在單一性生長激素缺乏癥(IGHD)的個體中，骨骼成熟延遲，并通常伴隨著身高的發育延遲。經常會出現軀體肥胖、面貌年輕于實足年齡、恒牙出牙延遲的現象。在發病的成人中，可見與早老性人相似的皮膚變化。
家族性IGHD包含幾種不同的具有典型的遺傳方式的疾病。已知與GH1基因座位缺損相關的IGHD形式，連同目前檢測到的不同類型的基本損傷，列于表1中。
表1與GH1基因有關的遺傳性疾病的分類
這些損傷特性有助于解釋這些類型的IGHD的臨床嚴重程度、遺傳方式及針對外源性GH給藥時產生抗體的傾向性方面的差異。大部分病例是偶爾發生的，并被認為是由腦損傷或缺陷，包括腦水腫、染色體異常、組織細胞增多病、感染、輻射、眼中隔發育不良、外傷、或腫瘤侵襲下丘腦或垂體所造成的。磁共振成像檢查可從12％的IGHD患者中檢測出下丘腦或垂體異常。
盡管矮小身材、“高度速度”遲緩或生長速度遲緩及骨骼成熟延遲均可見于GH缺陷，但它們并非這一疾病的獨有特征，其它系統性疾病也可能導致這些癥狀。在本說明書中，“高度速度”或生長速度均指受試者或患者身高變化的速率，如以每年多少厘米來度量。
證明GH缺陷的刺激試驗采用L-多巴(L-Dopa)、胰島素誘導的低血糖癥、精氨酸、胰島素-精氨酸、氯壓定(clonidine)、胰高血糖素或心得安(propranolol)。不同試驗中不足GH峰效應(通常＜7-10ng/mL)不同。應進行LH、FSH、TSH和ACTH的相關缺乏癥的測定，以判斷垂體功能障礙的程度并制定最佳治療方案。
重組產生的GH在全世界都可買到，經皮下注射給藥。為獲得最佳結果，患有IGHD的兒童通常一經確診就開始進行替代治療。重組GH的初始劑量依體重或體表面積而定，但不同方案所用的確切數量及給藥頻率可能有所不同。在青春期，劑量隨著體重的增加而增加直至最大值。其后，GH治療應暫時停止，同時對個體的GH的分泌能力重新評價。確認為GH缺陷的，在成年期可接受低劑量的外源性GH。
使用GH進行治療的情況包括(i)已證明GH對其有效的和(ii)有使用報導，但不被認為是標準慣例的各種其它情況。已證明GH對其有效的疾病包括單一性GH缺乏癥、伴有并發性垂體激素缺乏癥(CPHD)的GH缺乏癥，以及特納綜合癥。前兩種疾病的個體對GH替代治療的臨床效應取決于(i)GH缺陷的嚴重程度和它對生長的不利影響，開始治療的年齡，出生時體重，當前體重和GH劑量；(ii)對相關的缺陷如甲狀腺激素缺陷的治療的識別與效應；(iii)是否因抗GH抗體的生成而使治療變得復雜。對患有特納綜合癥個體的治療效果，因其矮小身材的嚴重程度，染色體互補及開始治療的年齡而不同。
已報導的應用GH治療的其它疾病，包括治療某些骨骼發育不良如軟骨發育不全，Prader-Willi綜合癥，外源類固醇繼發性，或與長期感染性疾病，如類風濕性關節炎相關的生長抑制、慢性腎衰竭、極度先天性矮小、Russell-Silver綜合癥和子宮內的生長遲緩等。
有多種理由表明對家族性IGHD在分子遺傳學水平上的性質鑒定很重要。對相關位點的闡釋不僅可表明生長遲緩可能的嚴重程度，更重要的是，可表明當前各種治療方案是否恰當。同時，對潛在的基因損傷的檢測可確定該病的遺傳病因。它可能在預見(i)生長延遲的嚴重程度和(ii)隨GH治療產生抗GH抗體的可能性中還具有預后價值。在某些情況下，對病理損傷的了解還有助于解釋這種疾病的異常的遺傳方式，并由此對發病家族的咨詢而言十分重要。最后，對引起帶有功能障礙(與無功能相對)性GH分子的突變損傷的性質鑒定，可以對GH結構與功能產生新的認識。
在細胞水平上，一個GH分子結合兩個GH受體分子(GHR)，導致它們二聚化。據信GH結合的兩個GHR分子的二聚化，對于酪氨酸激酶JAK-2相關的信號轉導是必需的。研究表明，GH的各種作用可能是由單一類型的GHR分子所介導的，這些分子在不同組織中具有不同的胞質結構域或磷酸化位點。被JAK-2激活后，那些不同的胞質結構域可引起不同的磷酸化途徑，其一是生長效應，另外則是各種代謝效應。
GH是由垂體前葉的促生長細胞所分泌的22KDa的蛋白質。X-射線晶體學研究表明，GH包含以上-上-下-下的方式排列的兩對平行α-螺旋所形成的核心。這一結構借助分子間二硫鍵(Cys53-Cys165和Cys182-Cys189)得以穩定。兩個生長激素受體(GHR)分子與GH分子上的兩個結構不同的位點結合，依次與位點1和位點2相結合。GHR與GH的結合增強了GHR分子的二聚化。
對GH分子的掃描突變生成研究提供了GH與其受體間的結合相互作用的圖譜，而定點突變已用來探查特定殘基的功能。因此，用Arg替換Gly120(位于人GH第3個α-螺旋上)導致GHR不能與位點2結合從而阻斷了GHR的二聚化。與此相似，人GH蛋白質中的Phe44殘基對結合催乳激素受體非常重要。最后，已證實Asp115、Gly119、Ala122和Leu123對鼠GH分子的生長促進潛力至關重要。
二聚化GHR與胞內酪氨酸蛋白激酶JAK2的相互作用導致下游信號轉導分子中酪氨酸磷酸化、有絲分裂原-活化蛋白(MAP)激酶的刺激和信號轉導子及轉錄激活子(STAT蛋白)的誘導。這樣，GH可通過多條不同的信號途徑影響多個基因的表達。
通過表達GH1基因產生了幾種不同的GH同種型(GH1參考序列如圖5所示)。在9％的GH1轉錄產物中，外顯子2與外顯子3內45bp處的可變剪接受體拼接，從而缺失了32-46位的氨基酸殘基，形成20KDa的同種型，而不是正常的22KDa蛋白質。該20KDa的同種型顯示能夠促進生長和分化。決定可變剪接受體選擇的相關因素尚未性質鑒定，但其無疑具有復合體性質。在垂體腫瘤中可檢測到痕量的17.5KDa的同種型，它是由外顯子3編碼的32-71位密碼子的缺失所致。已報導在垂體中有缺少外顯子3和4或者缺少外顯子2、3和4的拼接產物，但它們編碼沒有活性的蛋白質。還有關于24KDa的糖基化的GH變體的描述。主要的22KDa同種型的氨基酸序列如圖6所示，其顯示了GH1基因編碼區核苷酸序列及包括26個氨基酸前導肽在內的蛋白質氨基酸序列。側面的數字表示氨基酸殘基序號。垂直箭頭側面的粗體數字指定出外顯子邊界。終止密碼子以星號標出。
編碼垂體生長激素(GH1)的基因位于染色體17q23上的5個相關基因簇內(
圖1)。現已測定了該66.5Kb基因簇的全部序列(Chen等人，基因組(Genomics)4479-497，1989，見圖5)。生長激素基因簇中的其它基因座為兩個絨毛膜生長催乳激素基因(CSH1和CSH2)，一個絨毛膜生長催乳激素假基因(CSHP1)和一個生長激素基因(GH2)。這些基因被長度為6-13bp的基因間區隔開，位于相同的轉錄方向上，在胎盤表達且受下游組織特異性增強子的控制。GH2基因位點編碼與GH1來源生長激素有13個氨基酸殘基差異的蛋白質。全部5個基因有十分相似的結構，即5個外顯子在相同位置上為短內含子所隔斷，這些內含子在GH1中的長度分別為260bp、209bp、92bp和253bp(圖2)。
GH1基因的外顯子1包含60bp的5’非翻譯序列(盡管在-54位有另一個轉錄起始位點)、-26～-24位密碼子和對應于26個氨基酸的前導序列的起始位點的-23位密碼子的第一個核苷酸。外顯子2編碼前導肽的其余序列及成熟GH的前31個氨基酸。外顯子3～5分別編碼第32-71、72-126和127-191位氨基酸。外顯子5還編碼結束于多聚腺苷酸化位點的112bp的3’非翻譯序列。在多聚腺苷酸位點3’100bp處有Alu重復序列元件。盡管這5個相關基因在整個5’旁側區和編碼區高度同源，但它們在3’旁側區存在差異。
GH1和GH2基因的mRNA拼接方式不同。如上所述，在9％的GH1轉錄產物中，外顯子2與外顯子3內45bp處的可變剪接受體拼接，形成20KDa的同種型，而不是正常的22KDa蛋白質。GH2基因不以這種方式可變剪接。缺少GH1的外顯子3所編碼的40個氨基酸的第3種17.5KDa的變體也已被報導。
CSH1和CSH2基因座編碼序列相同的蛋白質，它們在DNA水平上與GH1序列有93％的同源性。與CSH基因序列比較，CSHP1假基因在其“外顯子”中含有25個核苷酸的替換，及內含子2的供體剪接位點的專性+1位置處的一個G→A轉換，這使其表達部分失活。
據報導，在GH基因區域內存在大量的雙等位基因限制性片段長度多態性(RELPs)。其中5個(2個BglII，2個MspI，1個HincI)出現在高加索人和黑人當中，另外一個BamHI多態性主要出現在黑人當中。在這些多態性中觀察到高度的連鎖不平衡，與基因簇的較近的進化起源關系是一致的。HincII和BamHI多態性出現在緊靠GH1基因5′端。-75位核苷酸處A/G二態性所致的RsaI多態性出現在GH1啟動子區域，而相對常見的SphI多態性，還需進行充分地性質鑒定。在距GH1基因3’端大約19kb處，存在不同數量有高度提示性的(83％雜合性)重復的多態性；采用PCR方法，該多態性中的18種不同等位基因可通過片段大小加以區分(201bp-253bp)。
最后，GH1基因的啟動子/5’非翻譯區域570bp片段內含有17個不同的核苷酸，呈現出相當高水平的序列多態性(表2A)。
表2A已知的人GH1基因啟動子/5’非翻譯區域多態性[Giordano等人，人類遺傳學(Human Genetics)100249-255，1997和Wagner等人，歐洲內分泌雜志(Eur.J.Endocrinol.)137474-481](圖3)
表2A在人GH1基因啟動子/5’非翻譯區已知的多態性[根據Giordano等，Human Genetics 100249-255(1997)和Wagner等Eur.J.Endocrinol.137474-481].(圖3)
預測由-1、+3和+59處的多態性將引起GHDTA蛋白質中氨基酸替換，該蛋白質推定是由GH1基因啟動子上相應區域所編碼的(見下文)。一些序列變體出現的位置，正是GH1基因與其它胎盤表達的基因所不同的地方，這暗示其機制可能是基因轉換，而胎盤基因做為轉換序列的供體。
在對具有GH不足的青春期前矮小兒童的研究中，Hasegawa等人[J.Clin.Endocrinol Metab 851290-1295，2000]報導了GH1基因中3種多態性[IVS4 C→T 1101(在下文表7A和7B中也有報導)，T/G-278和T/G-57]和GH分泌及身高之間的關聯。
從第一個GH1基因缺失被報導以來，已經描述了許多更為微細的損傷。在某些病例中，這些損傷與罕見類型的GH缺陷相關，并對作為獲取對GH結構與功能的新認識的手段是非常重要的。
編碼生長激素(GH1)的基因是最早克隆的人類基因之一，很快，最早的導致遺傳性生長激素缺陷的大的缺失(6.7Kb型)就通過Southern印跡檢測出來。涉及GH基因的所有大的缺失均導致嚴重缺陷(IA型)，其特征是GH的完全缺失。大約70％的鑒定的GH1基因的缺失長度為6.7kb，而其它大部分的長度為7.6kb或7.0kb(表2B-涉及GH1基因或GH1基因鄰近部位的大的缺失，其導致GH缺陷和矮小身材)表2BGH1基因或其鄰近區域的大的缺失
此外，一些很不常見的缺失實例亦見報導。近年來，人們進行了許多嘗試，由Southern印跡轉向以PCR為基礎的方法作為突變篩選的工具。利用PCR擴增GH1基因和旁側區，然后對PCR產物進行限制性酶切消化，可以相當簡便地檢測出純合的GH1基因缺失。盡管這一方法成功地應用于排除危險妊娠中的GH1基因缺失純合性，它卻不能區分野生型的純合性基因與基因缺失的雜合性基因。除較短的6.7kb、7.0kb和7.6kb的缺失(只去除GH1基因)以外，該方法檢測不到其它缺失。
設計緊靠GH1基因兩側的PCR引物，從對照DNA樣本中產生790bp的片段。缺少這一片段被認為是GH1基因缺失，但是，用“非特異性PCR片段”作為PCR擴增的內對照必然使這一方法的可靠性受到某種程度的質疑。
象大的缺失一樣，三種GH1基因微小缺失也有報導；其中兩名患者也是6.7kb GH1基因缺失的雜合體(表3)。
表3導致GH缺陷和矮小身材的GH1基因中的少量缺失
在GH1基因編碼區內，只有7個不同的單堿基對替換見諸報導(表4)。
表4導致GH缺陷和矮小身材的GH1編碼區內的單堿基對替換
這些單堿基替換中有兩個是無義突變，將信號肽中的氨基酸殘基Trp-7和Glu-4變成終止密碼子。這些突變是唯一已知的導致IA型缺陷(非基因缺失)的基因損傷。這些損傷預示翻譯在信號肽內終止，因此不能產生有功能的GH分子。另外5個單堿基對替換(包括密碼子77處的R→C，公開于EPA790350中有關巨人癥的治療)是錯義突變，其導致產生功能異常的生長激素分子。這種自然發生的突變遠比人工誘導的突變更具提示性意義，因為前者原則上與臨床表型即該患者的身高直接相關。
通過對3個IGHD IA型的中國患者和2個對照者的GH1基因啟動子區域(在相對于轉錄起始位點的-60和+70間)的序列測定，首次找出了啟動子區域可能具病理意義的單堿基對替換。指出了幾處差異，但其可能是多態性，沒有進一步的性質鑒定。如上文所述，后來表明GH1基因啟動子區域顯示出非常高的序列多態性(在570bp片段中有17個變異核苷酸)(圖3)。可是與對照者相比，沒有發現這些序列變體在患者中存在的概率增加。
對GH1啟動子變異分別進行了調查研究，共檢測出22個變異多態性位點，大多數為單堿基對替換其中17個出現在ATG起始密碼5’端的550bp區域，3個出現在ATG 5’端-1075左右，2個分別出現在內含子1中的76和219位置處[Wagner等人，Eur J Endocrinol 137474-81，1997]。除了4種變體，所有其他變體也出現在對照者中，但并不認為是這4種變體導致了生長激素缺陷。只有一個變體位點出現在與轉錄結合位點同源的一段序列內在潛在的(但未確證的)NF-1結合位點內-333位，或者為CCAGA，或者為GAGAG序列。
因此，至今尚無在GH1基因啟動子內的具病理意義的突變的報導。
GH1基因內單堿基對替換對mRNA的拼接的影響已有描述。其中大部分與相對罕見的顯性形式的GH缺陷有關(表5)。
表5影響mRNA剪接和導致GH缺陷和矮小身材的單堿基對替換
轉染細胞mRNA體外表達分析表明，第4內含子供體剪接位點處的堿基顛換，可激活外顯子4供體剪接位點5’端73bp處的隱蔽剪接位點。這預示可產生異常的拼接產物，其缺少外顯子4所編碼的103-126氨基酸以及由于閱讀框架移動而摻入94個新氨基酸(其中包括29個由于GH1基因中正常3’非翻譯區的通讀而產生的氨基酸)。
由于外顯子4和5編碼的GH蛋白質區域被認為對蛋白質正確靶向到分泌小體至關重要，所以預測這種異常蛋白質不能正常分泌。然而，在IB型GH缺陷患者體內沒有發現針對外源性GH的抗體。免疫不耐受的屏蔽可能表明，至少某些異常蛋白質產物可以分泌，且其在循環中部分地穩定。7種已知的IVS3(表5)內的剪接突變與表現為發病家族常染色體顯性遺傳的II型缺陷有關。
具有截短的GH1突變或純合的基因缺失的GH缺陷患者，GH治療時有產生抗GH抗體的危險。相反，我們未見到任何描述伴隨錯義突變或剪接位點單堿基對替換患者體內產生同種抗體的報道。
迄今，沒有其它的突變基因型與臨床表型間相互關系的報導。在公開發表的文獻中，必要的數據極少且質量相差很大，但我們嘗試以粗略的中間分析法為手段，來衡量是否具大的基因缺失的患者與具剪接位點突變的患者在臨床和表型后遺癥上不同。發現GH1缺失患者的身高比標準年齡組均值(n＝29)平均低7.3SD，而GH1剪接突變患者的身高則平均低于均值(n＝17)5.4SD。盡管缺失患者的骨齡延遲更大，生長速度更低，但這些發現由于可能受到譜系偏性的影響，因而很難解釋。
因為大多數目前為止所描述的家族性GH缺失病例為常染色體隱性性狀遺傳，所以很可能某些遺傳缺陷狀態因家系小而未為人知。類似地，由新的GH1基因突變所致的GH缺陷病例可能被歸類為偶爾發生的，人們既不會采納也不會尋求對疾病的遺傳學解釋。最后，依照定義缺陷狀態所采用的標準，GH缺陷的表型和基因型譜全貌可能永遠不會引起臨床關注。由于這些原因，當前對GH缺陷存在范圍的估計可能是不準確的，也許因此嚴重低估了人群中的真實存在范圍。
被大多數認可的IGHD的定義結合了(a)嚴重的生長遲緩，通常-如上文所述-限定為身高＜-4.5SD；(b)降低的對刺激/激發作用的GH反應(即血清GH水平＜40ng/ml)；及(c)沒有其它導致生長遲緩的因素。在選擇患者進行研究時，嚴格遵守組成GH缺陷正式的定義，以及對各標準尤其是準則(b)相當統一的認同[Shalet SM等，Endocrine Rev19，203-223(1998)]，說明GH1突變譜不僅不全面，且不能代表較寬突變譜。因此，導致SD值不是非常低或GH水平降低不多的GH缺陷的突變(如基因編碼區的錯義突變或啟動子突變)極少會引起臨床重視。事實上，這可在某種程度上解釋為什么至今只有5種不同GH1基因的錯義突變的報導，這一結果對于一種在分子水平上研究了近20年、非常普遍的疾病而言，實在是史無前例的(人類基因突變數據庫(The Human Gene Mutation Database)；Krawczak等人，Hum Mutation 1545-51，2000)。
GH完全缺失引起易識別的嚴重臨床表型，其已得到廣泛研究。在那些患者表型不太嚴重，以及患者選擇標準經過實際確認的報導的研究中，患者確定方案通常用個體身高與對于其年齡的平均身高的偏差作為生長衰退的診斷指標。
用標準(a)和(b)選擇患者，如上所述，可用于判定程度嚴重的IGHD相關的生長衰退患者。我們曾提出，調整研究中的選擇患者所用的標準，可能將其生長衰退為GH缺陷譜不同部分的體現的患者包括進來，并可由此產生一套新的潛在突變損傷。某些該新損傷能產生穩定的但無功能的GH分子，其具有正常的免疫反應性，而幾乎沒有或沒有生物活性。根據放射性免疫測定試驗的結果，功能障礙的GH分子可能被錯誤地認為是正常的。如果這種功能障礙的變體是普遍的，那么當前依賴基于放射性免疫測定的GH“功能試驗”將導致GH缺陷的診斷不完全。進而也表明急需開發真正的功能性診斷分析方法。
我們認為身高增長速度是比絕對身高更為靈敏的生長障礙指標。聯合采用增高速度和骨齡延遲(也是由GH缺陷引起的骨成熟遲緩)的估算及其它一些正常變量，我們可以確定統一的患者群，其具有比典型的無GH的IGHD患者輕的表型，但這類患者與只基于身高選擇的患者相比，更可能具有GH1基因的損傷。另一個重要的指標是生長衰退，其可能伴隨或不伴隨矮小身材和/或增高速度遲緩和/或骨齡延遲。
為此，本發明提供了一種檢測GH1變異的方法，可有效作為個體GH功能障礙指標，該檢測方法包含以下步驟(a)從個體中獲得含有人GH1基因核苷酸序列的試驗樣本；及(b)將從試驗樣本中獲得的序列與已知的人GH1基因標準序列進行比較，其中試驗樣本序列與標準序列的差異指示存在可有效作為GH功能障礙指示物的變異(下文稱“GH1變體”)，其特征在于，試驗采樣個體符合以下標準(i)生長衰退，定義為一種生長模式[通過一系列身高測量繪制的，Brook CDG(Ed)臨床兒科內分泌學(Clinical PaediatricEndocrinology)第三版，第9章，p141(1995，Blackwell Science)]，即在標準身高記錄紙上進行繪圖時[Tanner等人，Arch Dis Child 45755-762，1970]，預報該個體的成年身高，處于根據該個體的父母身高所估計的個體目標成年身高的范圍之外。
本發明還提供了GH1變體，該變體是用本發明上文所述方法檢出的或能檢測到的。
本發明還提供了GH1變體的轉錄產物，如含有由GH1變體所編碼的氨基酸序列的蛋白質(下文的“GH變體”)，其中該GH1變體是用本發明上文所述方法檢出的或能檢測到的。
(本發明中，術語“患者”和“個體”在本發明的上下文中交替使用)。
標準(i)的有益參考文獻為Tanner和Whitehouse.Arch DisChild 52170-179，1976]。患者目標成年身高范圍通過父母平均身高(mid-parental height，MPH)來計算，范圍在平均身高的10-90％間，依性別而定MPH(男性)＝[父親身高+(母親身高+13)]/2±6～8cm，通常是7.5cm，而MPH(女性)＝[(父親身高-13)+母親身高]/2±6～8cm，通常是6cm。
這些是用于人生長范疇的標準試驗和方法，盡管上述基于Brook(同前，1996)關于用來預測目標身高范圍界限的公式的描述及Tanner(目前，1970)關于標準身高圖的描述的方法為本發明的優選方法，但其它任何可接受的計算方法，都可用來判定生長衰退。
因而這種標準根本不同于那些迄今在鑒定GH功能障礙患者時所用的標準，且涉及到根據父母身高預測患者的(未來)成年身高。
優選地，本發明的檢測方法中，除上述標準(i)外，試驗樣品采樣個體還符合如下一個或多個標準，即(ii)身高增長速度相對于年齡來說低25％；和/或(iii)根據Tanner-Whitehouse度量法，與實齡比較骨齡延遲至少為兩年；和/或(iv)沒有其它已知疾病可能產生上述標準(i)～(iii)包含的癥狀。
優選地，標準(ii)～(iv)可累加應用，因此對于特定個體/患者，需同時滿足標準(ii)、(iii)和(iv)。
對于標準(ii)～(iv)，各標準可根據本領域中易于獲得的和描述的已知方法和參數進行評價，如下文所詳細闡述(ii)以Tanner JM，Whitehouse RH.Atlas of Children’sGrowth，1982年，倫敦學院出版社(Academic press)；及Butler等人，Ann Hum Biol，17177-198，1990為原始資料，統計出第一個判定標準，即患者身高增長速度對于其年齡來說低25％。
(iii)Tanner JM，Whitehouse RH，Cameron N等人在骨骼成熟和成年身高預測(Assessment of Skeletal Maturity and Predictionof Adult Height)(1983，倫敦，學院出版社)中描述了Tanner-Whitehouse度量法估算骨齡延遲。本發明方法中，個體優選地表現出骨齡延遲3.5～4年(與實齡相比較時)。對個體的骨齡延遲進行一次以上的估算時，個體年齡越小，估算值發生的變化越大，例如，對一個2歲兒童進行多次估算可能得到的骨齡延遲結果在+/-6個月間變化，而3歲兒童可能在+/-4個月間變化。
(iv)因為矮小身材也可能由GH功能障礙以外的其它狀況繼發產生的，因此感染此類疾病患者的試驗樣本不在本發明方法之列。通過基線調查來判定未感染可引發與GH功能障礙相似癥狀的其它疾病的患者。因此“基線調查”(“Baseline investigutions”)包括排除，特別是排除甲狀腺機能衰退、甲狀旁腺功能衰退、營養吸收不良綜合癥如乳糜泄、腎臟與肝臟疾病、血液學疾病如貧血癥的方法，以及核對染色體異常如Tanner綜合癥不是導致生長功能障礙的原因的染色體核型。還應對患者實行全面的臨床檢查，以排除引起生長功能障礙的其它因素，如包括先天性心臟病的心臟疾病；慢性自身免疫疾病如類風溫性關節炎和腸炎；慢性呼吸疾病如嚴重哮喘或囊腫性纖維化；和骨骼問題如軟骨發育不全。完整的治療史也應作為醫學檢查的補充，不僅有助于排除上述已鑒別的物理性疾病，還可排除另外一種眾所周知的導致兒童生長缺陷的自閉癥。
任選地，(V)，還可對患者施行一項或多項生長激素功能試驗。術語“生長激素功能試驗”指生長激素分泌試驗，如上文中提到的刺激試驗，特別是胰島素誘導的低血糖癥試驗(IST)。
通常施行GH功能試驗的患者為矮小的；經臨床評定的，就診于內分泌門診一次以上進行身高監控的；沒有其它能檢測到的可致生長衰退疾病的；因此有理由接受對其經適當刺激后(如經胰島素靜脈給藥所引起的血糖急劇下降)，垂體產生生長激素分泌的能力的評估的。優選地，在本發明的方法中，個體生長激素功能試驗的結果是正常的。
因此，在根據本發明的檢測方法中，盡管可測定當前身高以應用于上述標準，但身高本身不用作該方法中選擇患者的標準。如上文所述，現有技術方法以偏離“正常”身高水平(即絕對生長)為標準來選擇患者。本發明不需要包括這樣的標準，因此本發明提供了排除或可以排除絕對身高作為選擇標準的診斷方法。
GH1突變譜的拓寬必然引致用分子遺傳學方式對遺傳性GH缺陷的重新定義。此外，對新型矮小身材的認識必然需要對GH缺陷作為一種疾病病種重新分類。這對篩選和確認那些用生長激素治療可能有益的短小身材的個體來說，顯然具有重要含意。
在本發明檢測方法中，采自患者的試驗樣本最好含有以標準方法從患者淋巴細胞提取的基因組DNA，例如口腔涂片、血液樣本或毛發中的淋巴細胞。通過任一適當方法對GH1基因進行基因測序和多態性分析，包括但不限于凝膠或毛細管電泳質譜分析和高溫測序(pyrosequencing)。優選地按如下步驟進行
1(a).擴增，優選PCR擴增含有完整GH1基因(啟動子，編碼區的5個外顯子，內含子和非翻譯區)的3.2kb片段，然后用設計好的引物對更小的、重疊組成片段進行巢式PCR，以確保GH1基因特異性。在使用已知6個引物的同時，發現有必要設計新的GH1特異性引物，以避免無意中PCR擴增出共生的、緊密連鎖的高度同源GH2、CSH1和CSH2基因及CSHP1假基因，造成交叉污染。因此，本發明方法可能包括，采用GH1基因特異性片段(即GH1基因特有的，在GH基因簇內4個其它共生基因(非GH1基因)中沒有發現此序列的片段)，和一種或多種GH1基因特異性引物(該引物不會與GH基因簇內4個其它共生基因(非GH1基因)中同源的旁側區相結合)，對個體或是任何疑為GH功能障礙個體的GH1基因進行PCR擴增。優選地，擴增完整GH1基因，和/或1(b)擴增，優選PCR擴增患者GH1基因上游約15kb處、跨越基因座控制區(超敏位點I和II)的全部基因組DNA或其片段[Jones等，Mol Cell Biol，15，7010-21(1995)]。基因座控制區(LCR)是影響GH1轉錄水平和時間的增強子區。LCR位于距GH1基因5′端14kb處，負責GH基因簇內基因的協同表達。采用新型寡核苷酸引物，對某些患者的2個重疊片段(254bp和258bp)進行PCR擴增(實施例5)；所有患者都可擴增出1.9kb的LCR片段(實施例5A)；及2.任選地，但優選地，采用Transgenomic WAVETMSystem[O’Donovan等人，Genomics 5244-49，1998]，通過變性高效液相色譜(DHPLC)對整個GH1基因或其片段進行突變篩選。之所以選用這種篩選方法是因為它快速，便宜，靈敏，可重復，而且，具有(至少在我們手中)＞95％的檢測效率。通過DHPLC檢測到的“帶遷移”(Bandshifts)可表示潛在DNA序列變異；(另外，也可采用無DHPLC步驟的對含有3.2kb GH1基因的PCR片段直接進行DNA測序的方法)；及3.通過DNA測序(自動或人工方法)對任意此類DNA變體進行性質鑒定；以及，任選地，但也是優選地，
4.使用適于損傷定位和功能缺陷機制推斷的方法學，對GH1基因損傷進行功能性質鑒定。
因此，本發明還提供了新型GH1基因特異性引物，用于上文所述GH1基因分析及各實施例中，該引物包括適用于DHPLC步驟的新型引物(詳見實施例3，表6)。
CTC CGC GTT CAG GTT GGC(GHD1F)；AGG TGA GCT GTC CAC AGG(GHD1R)；CIT CCA GGG ACC AGG AGC(GHD2R)；CAT GTA AGC CAA GTA TTT GGC C(GHD3F)；GGA GAA GGC ATC CAC TCA CGG(GHD4R)；TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC(GHD5F)；CGT AGT TCT TGA GTA GTG CGT CAT CG(GHD6R)；和TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC G(GHD7F)；及適用于LCR步驟的引物(全部5′→3′)，亦詳見實施例5和5A。
GTGCCCCAAGCCTTTCCC(LCR151159-1177)；TGTCAGATGTTCAGTTCATGG(LCR131391-1412)；CCTCAAGCTGACCTCAGG(LCR251346-1363)；和GATCTTGGCCTAGGCCTCG(LCR231584-1602)；和LCR 5A(5’CCAAGTACCTCAGATGCAAGG 3’)；和LCR 3.0(5’CCTTAGATCTTGGCCTAGGCC 3’)；和LCR 5.0(5’CCTGTCACCTGAGGATGGG 3’)；LCR 3.1(5’TGTGTTGCCTGGACCCTG 3’)；LCR 3.2(5’CAGGAGGCCTCACAAGCC 3’)；和LCR 3.3(5’ATGCATCAGGGCAATCGC 3’)(適用于1.9kb片段的測序)。
其它新型引物，用于整個GH1基因的PCT擴增(見實施例5D)，包括
GH1G5(5′GGTACCATGGCTACAGGTAAGCGCC 3′)；GH1G3(5′CTCGAGCTAGAAGCCACAGCTGCCC 3′)；BGH3(5′TAGAAGGCACAGTCGAGG 3′)；GH1R5(5′ATGGCTACAGGCTCCCGG 3′)；和GH1R3(5′CTAGAAGCCACAGCTGCCC 3′).
本發明中的檢測方法及用此方法可鑒定的或檢出的GH1變體還具有如下優點1.通過對新型損傷的確定和性質鑒定，擴充了已知的GH1基因的突變譜。
2.評價了GH1基因突變在矮小身材的病理學中的作用。
3.確定了新型GH1基因損傷的遺傳方式。
4.闡明了突變基因型和臨床表型間的關系。這被認為對GH缺陷的早期診斷和恰當的臨床處理是非常必要的。
5.評價了GH1基因突變對GH分子結構和功能的影響。這對評估那些具有相對輕微的矮小身材臨床表型的兒童來說，尤為重要。在這群患者中，可能產生具有免疫活性的、并因而在GH功能試驗中落到正常范圍內的功能障礙的GH。
6.開發了用于遺傳性GH缺陷的快速DNA檢測試驗。
7.評價了我們關于人群中GH缺陷未能全面檢出和低估的假定。
因此，對自然發生的GH1基因損傷的進一步性質鑒定，對于研究GH的結構、功能和表達具有相當的重要性。新型編碼序列變體的研究不但增進了我們對GH功能的了解，也增進了我們對GH和它的受體(GHR)間相互作用，以及GHR介導的信號轉導過程的了解。獲得的認識與新一代治療試劑的理性設計是正相關的。同樣，對啟動子區自然發生的GH1基因損傷的研究，將提供對GH1基因表達控制的新的認識。由此可以看出，寬的突變損傷譜，必將提高我們對突變基因型和遺傳方式的GH缺陷臨床表型間關系的了解。這些研究對于家族性GH缺陷的早期診斷和恰當的臨床處理無疑是很有必要的。
本發明因此還提供了GH1變體，其與GH1不同，并根據本發明方法可檢出，而用現有技術方法(例如依靠主要基于身高或其它標準或這些標準的聯合的患者選擇標準的方法)無法檢出。本發明中的這些GH1變體包括在下文實施例6及特別是表7B中性質鑒定的那些變體。
如上所述，目前評估GH分泌的試驗很多且各種各樣，沒有一種現有的試驗是理想的。因為人GH的分泌是脈動的，且GH脈動的振幅和頻率變化極大(受多種內因和外因的影響，包括睡眠、體育鍛煉、壓力及有關個體的青春期等)，因此要得到最佳的信息，試驗需要對患者在專用試驗室內的密切監察。因此這種試驗不僅耗時、昂貴，而且會給患者及其家屬帶來相當大的壓力。特別要提及的是胰島素誘導的低血糖癥試驗(IST)，如上文所述，很多醫生用它來評估GH分泌，但由于為成功實施必須誘導患者產生低血糖癥時，曾導致死亡現象發生。因此，決定進行某項試驗，例如IST，對矮小兒童評估前，謹慎的考慮是極為重要的。因而，用于篩選矮小患者的DNA試驗的建立，具有許多優于其它現有方法的優點。
為此，本發明提供了篩選疑為具有功能障礙的GH的患者的方法，該篩選方法包括如下步驟(a)從患者身上獲得含有人GH1基因核苷酸序列的試驗樣本；和(b)將從試驗樣本中獲得的序列的區域與預定的序列相應區域進行比較，特征在于該預定序列是選自根據本發明上述方法能檢測到的GH1變體。
更具體而言，本發明的篩選方法的特征在于，預定的序列是具有與GH1基因變體的某一區域相應的核酸序列的寡核苷酸，與野生型序列中相應區域相比，這一區域至少包括一種變異。
尤為優選的，該變異為本發明檢測方法可檢測到的，如下文實例6和表7中所確定的任一種。
優選的，試驗樣本中包含可使用常規方法提取的基因組DNA。
為此，本發明還提供了確定GH功能障礙的篩選方法，包括(a)從疑為GH功能障礙患者身上獲得第一份試驗樣本；及(b)將第一份試驗樣本中的GH1基因或GH1轉錄產物，或其片段(如cDNA)，與可從第二份試驗樣本中獲得的GH1變體的相應基因、轉錄產物或片段進行比較，該第二份試驗樣本取自符合如下標準的個體(i)生長衰退，其定義為一種生長模式[通過一系列身高測量來繪制的，Brook CDG(Ed)臨床兒科內分泌學(Clinical PaediatricEndocrinology)第三版，第9章，p141(1995，Blackwell Science)]，即在標準身高記錄紙上進行繪圖時[Tanner等人，Arch Dis Child 45755-762，1970]，預報患者的成年身高處于根據患者父母身高所估計的患者目標成年身高的范圍之外；和/或(ii)身高增長速度低于年齡的25％；和/或(iii)根據Tanner-Whitehouse度量法，與實齡比較骨齡延遲至少為兩年；和/或(iv)沒有其它已知疾病可能產生上述標準(i)～(iii)包含的癥狀。
方便地，本發明提供了篩選疑為GH功能障礙的個體的方法，篩選方法包括以下步驟(a)從個體身上獲得含有人GH1基因核苷酸序列的試驗樣本；和(b)將從試驗樣本中獲得的序列區域與預定的序列相應的區域進行比較，其中預定的序列選自本發明檢測方法鑒定的或是可鑒定的GH1變體。
預定序列優選地是具有與GH1基因變體的某一區域相應的核酸序列的寡核苷酸，與野生型序列中相應區域相比，這一區域至少包括一種變異。
本發明篩選方法中的第一份試驗樣本或試驗樣本優選地包含基因組DNA。
本發明篩選方法中，比較步驟可以常規方式進行，例如通過對GH1基因適當區域的測序，特別是在要檢測/比較的變體很少的情況下。當涉及相當大量的變體時，可使用DNA芯片技術，如其中該芯片是一種微型平行分析設備，其通過使標記的樣本DNA(來自患者的cDNA或基因組DNA)與固定于固相支持物上的突變特異性寡核苷酸探針微陣列雜交，來同時篩選多種已知或所有可能的突變[Southern，Trends Genet12110-115，1996]。
依照本發明的DNA篩選方法與現有試驗方法相比，優點包括1.對于患者，其僅涉及可在門診完成的單一血液試驗。大多數現有試驗中所需的住院、長期的醫療監控和重復的血液樣本采集，將不再需要。從而減少了所需費用、專科醫師花費的時間和每位受試患者的痛苦。
2.患者GH功能缺陷的早期診斷將成為可能。與其它方法相比，DNA篩選試驗的簡易性，使臨床醫生在處理患者時，可以更早地考慮進行試驗。目前，由于GH分泌試驗中存在的問題，醫生在將一個兒童診斷為IST前，會對門診兒童進行長時間的，甚至好幾年的評估。對GH缺陷遺傳病因學的早期診斷，能盡早采用GH治療，對表型不嚴重的個體而言，患者接受恰當治療的時機可能因此而提前數月甚至數年。
3.有更多的患者可進行GH功能障礙試驗。DNA試驗的簡易性使醫生可在患者首次就診于內分泌門診時，就將本試驗作為對所有矮小患者初始評估的一部分來施行。這很可能找出有可致嚴重生長問題的GH1基因損傷的患者，以及那些輕度損傷患者(例如編碼區錯義突變)。這些患者以前不可能引起臨床關注，因為他們的臨床/表型問題還未嚴重到被批準施行IST的程度，然而他們仍可能會得益于GH治療。
4.對于那些需要終生進行GH治療的患者的早期鑒定將是可能的。這些患者可能被鑒別出來并進行恰當的治療，不需借助于GH分泌的初始試驗或重復試驗，也不需階段性停用GH以評估治療進程(一種“無治療試驗”)。
5.對GH功能障礙家族成員的簡易的早期鑒定將是可行的。一旦引致生長問題的遺傳損傷從一個個體中被鑒定出來，就可相對容易地對其它家族成員進行同樣遺傳損傷的評估，并確定他們是否會得益于GH治療。
6.將提高診斷的精確性。同一實驗室內和不同實驗室間，GH分泌缺陷試驗分析結果重復性的變化是眾所周知的。DNA篩選將使這一問題成為過去。另外，GH分泌試驗結果在某些情況下可能非常難以解釋，例如，在患者同時患有甲狀腺功能衰退，或是青春期延遲的情況下。DNA篩選會排除這些疑點，并防止耽擱可能得益于治療的患者開始治療。
因此，本發明還提供了適于進行本發明篩選方法的試劑盒，其包括(a)具有與GH1基因變體的區域相應的核酸序列的寡核苷酸，與相應的野生型序列序列相比，這一區域至少包括一種變異；和(b)具有相應于(a)中所限定區域內的野生型序列的核酸序列的寡核苷酸；和任選地，(c)一種或多種適于進行PCR，從患者DNA中擴增目的片段的試劑。
這些試劑可能包括，例如，對應于GH1基因外顯子的PCR引物，和/或這里提到的引物，特別是在上文中提到的新型引物；和/或PCR所用其它試劑，如Taq DNA聚合酶。
優選的，試劑盒中的寡核苷酸包含20～25個堿基對，如對變體序列而言為20個堿基對，當變體為單堿基替換時相對野生型序列為20個堿基對，或者變體為5個堿基對缺失時相對野生型序列而言為25個堿基對。無論哪種情況下，必須選擇所選區域獨有的、在基因組其它任何位置都沒有重復的寡核苷酸片段。
顯然，在想要篩選多點變異，如15～20個或更多的情形下，試劑盒中應包含多達40種核苷酸或者更多。因此在另一篩選方法中，采用了DNA芯片技術，本發明為此提供了許多固定于支持物上的稱為試劑盒組分(a)的寡核苷酸。
也可使用其它的核苷酸檢測方法，如納米技術首創的信號擴增方法(如Q-打點)。也可使用單分子檢測方法(如STM)。在這些情況下，依照本發明的試劑盒可包含一種或多種使用這些方法時所用的試劑。
可選的，依照本發明的篩選方法和相應的試劑盒，可以以一種或多種所謂“代理標志物”為基礎，代理標志物指示GH1或GH變體的存在，或與其存在相關，如蛋白質/氨基酸序列，例如GH變體或GH1變體的特異性抗體。這種“代理標志物”可能包含(a)任何生物分子(包括但不僅限于，核苷酸，蛋白質，糖和脂類)；(b)化學化合物(包括但不僅限于，藥物，其代謝物及其它化學化合物)；和/或(c)物理特征，它的存在與否，或其在個體中的含量是可以測定的，且與GH變體或GH1變體的存在相關。
另外，依照本發明的適當的、其它的篩選方法，可能還包括獲得含有GH變體(即含有hGH變異的蛋白質/氨基酸序列，如用本發明方法檢測出的一種GH1變體編碼的蛋白質/氨基酸序列)的試驗樣本，其是利用常規蛋白質測序方法(包括質譜，微陣列分析，高溫測序，等等)，和/或基于抗體的檢測方法(如ELISA)可鑒定的，也包括進行一次或多次這種(些)蛋白質測序方法。
在另外的情況下，依照本發明的試劑盒可能包含一種或多種用于這些其它方法的試劑。
用本發明檢測方法可檢測到的GH1變體除作為GH功能障礙的篩選試驗標準外，可能還有另外的用途。例如，變異不在GH1基因啟動子區域的變體，可用來治療GH產量刺激過度的患者，如垂體分泌過多性巨人癥或肢端肥大癥患者。
本發明還提供了(a)一種或多種包含2個終止突變的GH或GH1變體在鑒定根本不產生任何生長激素的個體和依照常規診斷技術將被劃分為典型GHD的個體中的應用；(b)一種或多種GH或GH1變體，該變體使GH與生長激素受體或其結合蛋白(即體內的GH載體)的結合發生改變，由于通過結合其結合蛋白而使變體GH從垂體中的轉運受到削弱或抑制，導致未結合蛋白在去往組織受體的途中被破壞；(c)能破壞垂體中GH的鋅指貯存方式形成的GH或GH1變體；(d)GH變體或是GH1變體表達的蛋白質，其是具有GH受體拮抗性質的蛋白質，其受體結合常數決定了治療患者(為克服變異蛋白質的力量和抑制作用)所需外源性GH的量(劑量)；即變異蛋白質與野生型GH競爭結合受體；(e)依照本發明的GH變體或GH1變體在治療、診斷和檢測方法中的應用；(f)依照本發明的GH變體或GH1變體在確定個體對某種疾病的易感性中的應用；(g)依照本發明的GH變體或GH1變體在確定糖尿病、肥胖或感染易感性中的應用；(h)依照本發明的GH變體或GH1變體在確定結合缺陷和/或垂體貯積缺陷中的應用；(i)依照本發明的GH變體或GH1變體在確定肢端肥大癥拮抗劑治療的診斷劑量中的應用；(j)依照本發明的GH變體或GH1變體在醫學治療中的應用；(k)依照本發明的GH1變體在基因治療中的應用；(l)依照本發明的GH變體或GH1變體在確定一種或多種與疾病狀態相關的多態性中的應用；及(m)依照本發明的GH變體或GH1變體在制備治療組合物、診斷組合物或試劑盒，或檢測試劑盒中的應用。
因此，本發明還提供了組合物，其包含GH變體，特別是依照本發明檢測方法能檢測到的、且在此確定的GH變體，及其藥物可接受的載體。
此外，本發明還提供(a)編碼GH變體的核酸序列；(b)與序列(a)基本同源或在嚴謹條件下可與(a)雜交的序列；或
(c)除遺傳密碼簡并性外，與(a)或(b)基本同源或在嚴謹條件下可與(a)或(b)雜交的序列；或(d)(a)或(b)或(c)中任一種的特異性寡核苷酸。
還提供了(a)包含上述核酸序列的載體；(b)包含載體(a)的宿主細胞，如細菌宿主細胞；及(c)制備GH1變體的方法，其包括i)培養宿主細胞(b)；及ii)從培養基中收獲所產生的GH1變體。
(d)培養基中的上文所描述的序列、載體或細胞所編碼或表達的蛋白質或氨基酸序列。
將通過以下實施例對本發明作詳細闡述。
實施例1——患者選擇患者來源通常咨詢加的夫(Cardiff)的威爾士大學醫學院(University ofWales College of Medicune)Regional Paediatric Growth，Endocrine and Diabetes Service，并通過與其它類似的英國中心(即Newport、Birmingham、Bristol、Wrexham、Livepool、Stoke-on-Trent、Portsmouth和Southampton)的合作，對矮小身材兒童進行了鑒定。收集了完整的臨床病史，包括家族病史、家譜、生長參數記錄和早先施行的內分泌試驗。如果可能，記錄索引病例、其父母及同胞的準確發育學。用于分子遺傳學分析的血液樣本采自索引病例及適當的近親屬。另外的家系由John A.Phillips III教授(Nashville，TN，USA)，Mohamad Maghnie博士(Pavia，Italy)和Tamas Niederland博士(Gyor，Hungary)提供。迄今，已采集了692個GH功能障礙家系的樣本。
所用標準用于所有患者選擇的標準為(i)生長低于預定身高范圍的百分數的下限，依照本發明上文所描述的標準(i)確定；
(ii)身高增長低于25％；(iii)骨齡延遲至少2年，如在患者病例1中，與實齡相比，骨齡延遲了3.5～4年；(iv)所有其它試驗均正常；且(v)生長激素分泌試驗正常。
表5B中，*GH FT峰表示一種或多種標準生長激素功能試驗中的活性單位(IU/L)。“隨機”表示隨機采取的GH測量。ND表示“試驗未做”。包含身高百分數在內，和下文表7B提供的數據一起，用來闡明具有基本在該百分數以下的身高并不是選擇患者的必須標準；我們甚至在根本沒有身高減少的患者中發現了GH/GH1變異。
表5B研究的患者和所用標準的結果
實施例2——聚合酶鏈反應(PCR)擴增GH1特異性片段。
對65名不相關的患者進行了GH1特有3.2kb片段的PCR擴增。采用標準方法提取患者淋巴細胞的基因組DNA。
設計針對于GH1特有序列的寡核苷酸引物GH1F(5′GGGAGCCCCAGCAATGC 3′；-615至-599)和GH1R(5′TGTAGGAAGTCTGGGGTGC 3′；+2598至+2616)，采用ExpandTM高保真系統(Roche)進行PCR擴增含有人GH1基因的3.2kb單個基因組DNA片段。
每一反應使用兩個單獨的0.65ml的薄壁PCR管。第一管內含有各引物(GH1F和GH1R)500納克(ng)，200μM的dATP，dTTP，dCTP和dGTP和200ng的患者基因組DNA，補無菌水使其終體積為25μl。第二管含有5μl的10×反應緩沖液，補無菌水使其終體積為24.25μl。兩管都在冰上放置5分鐘。然后向第二管中加入0.75μl的ExpandTM聚合酶混合物，混勻后轉移入第一管。離心30秒，用30μl輕質礦物油(Sigma)覆蓋反應混合物。然后將反應混合物置于480或9700PCR可編程熱循環儀，溫度設置為95℃。
然后反應混合物在下述條件下擴增95℃，2分鐘，然后進行30個循環反應95℃30秒，58℃30秒，68℃2分鐘。在后20個循環中，每進行一個循環68℃的延伸步驟增加5秒。最后，于68℃再溫育7分鐘，然后冷卻至4℃以進行下一步分析。每批反應還設立一組空白(陰性對照)。空白反應管含有除基因組DNA外的所有試劑，以確保沒有試劑受到污染。
在進行巢式PCR前，取1/10體積(5μl)反應物在1.5％的瓊脂糖凝膠上進行分析，以評估PCR擴增是否成功。將PCR擴增成功的樣本稀釋100倍，用于進行巢式PCR。
實施例3——巢式PCR對實施例2中產生的片段進行巢式PCR，每例中產生7個重疊的亞片段，其合成一起跨越整個GH1基因。此外還對除3名患者外所有患者的基因座控制區城進行了PCR擴增(見實施例5)。
使用Taq Gold DNA聚合酶(Perkin-Elmer)，PCR-擴增初始的3.2kb PCR產物的7個重疊亞片段。用于這些反應的寡核苷酸，以及它們如在GH1基因參考序列中確定的序列位置，列于表6中。
1μl稀釋的長PCR產物(3.2kb)加入0.2ml的薄壁PCR管或96孔微量滴定板的孔內。加入5μl10×反應緩沖液，500ng適當的引物對(如GH1DF和GH1DR)，終濃度為200μM的dATP，dTTP，dCTP和dGTP，加無菌水至終體積為49.8μl，然后加入0.2μl的Taq Gold DNA聚合酶。
然后將PCR管或微量滴定板置于Primus 96熱循環儀上進行以下循環95℃，12分鐘，然后進行32個循環反應95℃30秒，58℃30秒，72℃2分鐘。然后于72℃再溫育10分鐘，冷卻至4℃以進行下一步分析。
在用WAVETMDNA片段分析系統(Transgenomic Inc.Crewe，Cheshire，UK)進行變性高效液相色譜分析前，取1/10體積(5μl)反應混合物在0.8％的瓊脂糖凝膠上進行分析以確定反應是否發生。為促進異源雙鏈的形成，PCR產物先在95℃變性5分鐘，然后經45分鐘逐漸再退火至50℃。產物上DNAsep柱(Transgenomic Inc)，并用0.1M含乙腈(BDH，Merck)的乙酸三乙胺緩沖液(TEAA pH7.0)，以2％/分鐘，0.9ml/分鐘的恒定流速進行線性梯度洗脫。根據PCR產物的大小調整梯度的起點和終點。每個擴增的樣本分析約需6.5～8.5分鐘，其中包括柱再生和平衡的時間。在用DHPLCMelt軟件(http://insertion.stanford.edu/melt.html)確定的熔解溫度(TM)下分析樣本，列于表6。洗脫的DNA片段用UV-C測定儀檢測(Transgenomic Inc.)。
表6用于DHPLC分析和DNA測序的寡核苷酸引物
實施例4——GH1特異性長PCR片段的克隆和DNA序列測定克隆DHPLC分析可以鑒定含推定DNA序列變化的DNA片段。為確定哪一等位基因含有推定的序列變化，將GH1特異性長(3.2kb)PCR片段克隆入PCR克隆質粒載體pGEM-T(Promega)。獲得克隆的方法是，在1×反應緩沖液和1μl T4DNA連接酶(3單位)體系內，加入50ng的GH1特異性長PCR片段和10ng的pGEM-T，終體積為10μl。反應物于10℃溫育16小時。將全部反應物放入1.5ml管中并在冰上冷卻。加入50μl的DH5α感受態細胞(Life Technologies)，在冰上放置30分鐘。然后將混合物在37℃熱休克20秒，重新在冰上放置2分鐘。然后加入0.95ml的YT×2培養基(每升含16g蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl)，將混合物于37℃搖動溫育1小時。將混合物涂布到預先溫育的、含有50μg/ml氨芐青霉素、IPTG和X-gal的平板上，于37℃溫育16小時，使長出單個的克隆。
每板挑取8個白色克隆，轉到另一塊劃有方格的板上。取少量的每個細菌克隆，使用GH1DF和GH1RF引物(見實例3，表6)和前面所述條件進行PCR擴增以確定GH1特異性長PCR片段的成功克隆。
含有GH1特異性長PCR片段的克隆在2ml YT×2培養基中培養；使用Qiagen spin miniprep試劑盒，按照操作指南從細菌中提取質粒DNA。用這種方法提取的質粒DNA，通過測定其在260nm的光密度進行定量，在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳以確證克隆大小是正確的。然后對其中4個克隆進行了序列測定。
DNA序列自動測定使用BigDye測序試劑盒(Perkin Elmer)，對含有GH1特異性長PCR片段的克隆進行序列測定，在0.2ml管或96孔微量滴定板內，在Primus 96(MGW)或9700(Perkin Elmer)PCR熱循環儀上進行。用于序列測定的寡核苷酸引物有GH1S1(5’GTGGTCAGTGTTGGAACTGC 3-556至-537)；GH3DF(5’CATGTAAGCCAAGTATTTGGCC 3’+189至+210)；GH4DF(5’GACTTTCCCCCGCTGTAAATAAG 3’+541至+560)和GH6DF(5’TCCCCAATCCTGGAGCCCCACTGA 3’+1099至+1122).
在20μl終體積內，用3.2pmol適當的引物及4μl BigDye測序混合物對1μg克隆DNA進行序列測定。然后將管或微量滴定板放到熱循環儀上進行如下循環96℃，2分鐘，然后進行30個循環96℃30秒，50℃15秒，60℃4分鐘。純化前將反應物冷卻至4℃。
向完成的測序反應物中加入80μl75％的異丙醇進行純化。混勻后在室溫放置30分鐘。反應物于室溫，14000rpm離心20分鐘。去掉上清，向沉淀中加入250μl75％的異丙醇。混勻樣品并于室溫，14000rpm離心5分鐘。去掉上清，沉淀在75℃干燥2分鐘。
樣品隨后在ABI Prism 377或3100 DNA測序儀上進行分析。
實施例5——生長激素基因座控制區分析已知人GH1基因上游約14.5kb處的DNA區域，與GH1基因轉錄的組織特異性和發育控制相關[Jin等人，Mol Endocrinol 131249-1266，1999]。它被稱為基因座控制區(LCR)，從GenBank中可得到其DNA序列(登錄號AF010280)。核苷酸編號是基于GH LCR參考序列(圖4)。
1192位置處的多態性位點以粗體和下劃線標出。對其中部分區域進行了PCR和DHPLC分析。
使用參考現有DNA序列所設計的新型寡聚核苷酸引物，產生了2個覆蓋約400bp的重疊PCR片段片段1引物為LCR15(5’GTGCCCCAAGCCTTTCCC3’1159-1177)和LCR13(5’TGTCAGATGTTCAGTTCATGG3’1391-1412)；而片段2引物為LCR25(5’CCTCAAGCTGACCTCAGG3’1346-1363)和LCR23(5’GATCTTGGCCTAGGCCTCG3’1584-1602)。
使用Taq Gold聚合酶進行PCR取1μl患者基因組DNA，放入0.2ml的薄壁PCR管或96孔微量滴定板的一個孔中。然后加入5μl 10×反應緩沖液，500ng適當引物對(如GH1DF和GH1DR)，終濃度200μM的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，加無菌水至體積為49.8μl，再加入0.2μl的Taq Gold聚合酶。然后將PCR管或微量滴定板放到Primus 96熱循環儀(MWG Biotech)上進行如下循環95℃12分鐘，然后進行32個循環95℃30秒，58℃30秒，72℃2分鐘。然后再于72℃溫育10分鐘，使反應物冷卻至4℃以進行進一步分析。
在進行變性高效液相色譜分析(DHPLC)前，取1/10體積(5μl)的反應物在1.5％的瓊脂糖凝膠上分析以確定反應是否完成。按實施例3所描述的方法，在61℃的熔解溫度下進行DHPLC分析。
實施例5A——生長激素基因座控制區的進一步分析從40名對照個體和40名具有遺傳的GH缺乏癥患者中采集600ngDNA，使用如下新型引物進行1.9kb LCR片段的PCR擴增LCR 5A(5’CCAAGTACCTCAGATGCAAGG 3’)；和LCR 3.0(5’CCTTAGATCTTGGCCTAGGCC 3’；見圖4)，5mM dNTP和Roche High Fidelity DNA聚合酶。反應條件為98℃×2分鐘，94℃×15秒，58℃×30秒，72℃×1分鐘循環10次，58℃×30秒，72℃×1分鐘+每循環一次增加5秒，循環20次。PCR反應產物在2％瓊脂糖凝膠上分離，用手術刀切下對應于LCR片段的條帶。通過凝膠過濾去除瓊脂糖，洗脫DNA用于測序。用如下新型引物，在ABI3100自動測序儀上對1.9kb的LCR片段進行序列測定。
LCR 5.0(5’CCTGTCACCTGAGGATGGG 3’)；LCR 3.1(5’TGTGTTGCCTGGACCCTG 3’)；LCR 3.2(5’CAGGAGGCCTCACAAGCC 3’)和
LCR 3.3(5’ATGCATCAGGGCAATCGC 3’)用于覆蓋該區域。
實施例5B——利用螢光素酶報告子基因分析對GH1啟動子單倍型和推定的啟動子突變的性質鑒定。
用QuickChangeTM定點突變試劑盒，在pGL3-GH1構建體中引入特定的序列變體。這一方法涉及將2條互補寡核苷酸引物(每條引物都含有目的突變)與野生型構建體對應鏈的退火。然后使用高保真的PfuDNA聚合酶進行引物延伸，從而產生高度特異性突變效率，隨機突變水平較低。最終，dam甲基化的親代DNA，經甲基化或半甲基化的特異性內切酶DpnI進行消化，進而選出含有突變的質粒。
選擇簡便、高效的脂質體介導轉染法，將DNA導入大鼠GH3和人HeLa細胞。GH3細胞瞬時轉染所用試劑為TfxTM-50。它含有由合成陽離子脂分子(N，N，N，N-四甲基-N，N’-雙(2-羥乙基)-2，3-二(油酰氧基)-1，4-丁烷二銨碘化物)和L-二油酸磷脂酰乙醇胺(DOPE)。水化后，這些脂類可形成多層小囊，其與核酸結合并促進它們向細胞內的轉移。細胞用96孔板培養。從培養瓶中取出鋪滿的細胞，用新鮮培養基稀釋，計算每板孔至160％的鋪滿度的細胞密度。200μl稀釋細胞等分到每個板孔中，平板在含有濕紙的濕盒內37℃溫育過夜。這可使細胞在第二天被轉染時達到約80％的鋪滿度。
轉染混合物包含無血清培養基，DNA(pGL3-GH1和pRL-CMV)及TfxTM50試劑。每個孔含0.25μg pGL3構建體，2ng pRL-CMV和0.5μl的TfxTM-50試劑(這提供了TfxTM-50試劑與DNA間最佳的3∶1比例)，總體積為90μl。先混合培養基和DNA，然后加入TfxTM-50試劑。溶液立刻震蕩混勻，于室溫溫育20分鐘。在第15分鐘時，從培養箱中取出培養板，移去培養基，短暫震蕩混勻TfxTM-50試劑/DNA混合物，然后將90μl加入每個板孔中。將培養板放回培養箱溫育1小時后，然后向每板孔中加入200μl預熱(37℃)的完全培養基。再將細胞放回培養箱中，再培養24小時，然后裂解，進行報告子試驗。HeLa細胞的轉染與GH3細胞轉染基本相同。差別在于用TfxTM-20替代TfxTM-50，共轉染pRL-CMV量為1ng，計算每板孔為60％鋪滿度的細胞密度。
從37℃培養箱內取出培養的轉染細胞，移去培養基，加入50μl磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。輕搖培養板，然后移出漂洗液。向每培養孔內加入20μl被動裂解緩沖液，確保細胞單層被完全覆蓋。將培養板放到旋轉臺上，室溫放置30分鐘，然后-70℃凍存。溶化培養板，并離心，6000rpm，20秒。對每次報告子試驗，將微板發光計設置成進行2秒鐘測量前延遲，再進行10秒鐘的測量階段。50μl體積的螢光素酶測定試劑II(來自Dual Luciferase reporter Assay System(Promega，UK))直接加到第一孔中，測量并記錄螢火蟲螢光素酶活性。然后直接加入50μl的Stop&GloTM試劑，記錄Renilla螢光素酶活性。對每組細胞裂解物重復這一步驟。
實施例5C——GH變體信號轉導活性分析在我們的生物測定試驗中，選擇HK293細胞作為研究GH變體的靶細胞，因為這些細胞表現出GH受體表達的升高。在測定前，細胞置于24孔板中(每孔100,000個細胞)24小時，然后與STAT 5-效應的螢光素酶報告子基因構建體以及組成性表達的β-Gal質粒(CMV啟動子)共轉染，以修正轉染效率。經過夜轉染后，洗滌細胞并分別將其與稀釋到已知標準濃度范圍的變體GH及野生型GH一起溫育6小時。在此期間，GH受體的活化將導致STAT 5的活化和螢光素酶的表達。這樣，試驗中螢光素酶的表達就提供了GH受體的活化程度，即作用于細胞的GH的生物學活性的測定。經過6小時的溫育階段后，裂解細胞并用標準方法在平板光讀計上測定螢光素酶活性(依照Ross RJM等人發表在Molec Endocrin 11265-73，1997上的方法進行測定；試劑盒由Promega UK Ltd提供)。
實施例5D——體外剪接試驗使用新型寡聚核苷酸引物進行全部人GH1基因的PCR擴增GH1G5(5′GGTACCATGGCTACAGGTAAGCGCC 3′)；和GH1G3(5′CTCGAGCTAGAAGCCACAGCTGCCC 3′)將KpnI(GH1G5)或XhoI(GH1G3)加在適當引物的5′端，以擴增長1467bp的含有限制性酶切位點的片段。這些位點以下劃線標出。PCR擴增條件如下95℃45秒，58℃45秒，68℃2分鐘循環10次，然后95℃45秒，68℃2分鐘(每循環一次加5秒)，循環20次。
然后擴增的片段用限制性酶Kpn I和XhoI消化，并克隆入經同樣限制性酶消化的質粒載體pCDNA3.1(Invitrogen)中。克隆后，對片段進行序列測定以檢查錯誤。然后用重組質粒轉染大鼠垂體前葉GH3細胞。轉染后，細胞放置24小時。用RNAzol B(Biogenesis)提取RNA。
然后使用新型引物(BGH3(5’TAGAAGGCACAGTCGAGG3’))和Superscript II(Life Technologies)，用提取的RNA進行反轉錄。將5μg總RNA加入到500ng的BGH3中，終體積為12μl，70℃加熱15分鐘。樣品放在冰上冷卻，然后加入4μl 5×緩沖液，2μl 0.1M的DTT和1μl 10mM的dNTP’s。樣品加熱到42℃，加入200U(1μl)SuperscriptII，于該溫度下放置50分鐘。然后加熱至70℃加熱15分鐘以滅活Superscript II。
然后用反轉錄的RNA進行PCR。使用新型寡聚核苷酸引物，4μl反轉錄混合物進行PCR反應GH1R5(5′ATGGCTACAGGCTCCCGG 3′)；和GH1R3(5′CTAGAAGCCACAGCTGCCC 3′)經以下PCR循環，擴增長度為654bp的片段95℃45秒，58℃45秒，68℃2分鐘循環10次，然后95℃45秒，58℃45秒，68℃2分鐘(每循環一次加5秒)，循環20次。然后PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳、純化、測序。
實施例6——GH1基因突變和多態性依照本發明的選擇特征，迄今已對54種不同的新型GH1基因變體(“突變”，表7)進行了性質鑒定，基于下面所示的不同類型的證據，這些變異可能與矮小身材病因學相關。這些新型損傷包括31種不同的錯義突變，21種不同的啟動子/5′非翻譯區突變和2種剪接位點突變。此外，我們還檢測到71種GH1基因區域內的多態性(表7A)。
表7A在患者的人GH1基因(內含子，編碼序列和3′非翻譯區)中發現的多態性。給出了共生同源的GH2、CSH1、CSH2基因和CSHP假基因相似位置處的核苷酸以便比較。
*IVS4從Hasegawa(如前)處得知表7B中，核酸編號建立在圖5所示的GH1參考序列的基礎上，其中人GH1基因編碼序列的5個外顯子在上部顯示；翻譯起始點(ATG)和終止密碼子(TAG)以下劃線標出；多聚腺苷酸信號以粗體顯示并有下劃線；3′非翻譯區邊界在+1642處；+1為轉錄起始位點。文中提到的所有編號的突變損傷、多態性和寡核苷酸引物(基因座控制區域除外；見圖4)都可能與GH1基因參考序列有關。
表7B生長激素缺陷GH1基因突變和多態性
關鍵詞IVS間插序列(內含子)ND未檢測到突變或多態性UTR非翻譯區
a患者(克隆數)b基于GH1參考序列的核苷酸編號。At-31，有G或無G的可變等位基因。
c氨基酸殘基數和替換，(基于GH1參考序列的核苷酸替換和數目)。
d IVS數，核苷酸變化，堿基數e Miyata I，Cogan J，Prince MA，Kamijo T，Ogawa M，Phillips JA，Detection ofgrowth hormone defects by dideoxy fingerprinting(ddF)Endocrinol J.44149-154(1997)*首次在體內鑒定這種突變；以前因丙氨酸掃描突變而在體外鑒定到(Cunningham等.USP5849535(1998)).
GH1參考序列是由Chen等人(1989)登錄到GenBank中的(登錄號J03071)。迄今為止所分析的68位患者中，在47人中發現有突變。除30，37，50和52號患者(純合的)，30，31，44，50，52，55，56，57，60，66，67號患者(混合型雜合的，反式非相同性損傷)(即在不同等位基因上)及7，23，30，31，32，36，47，48，50，52和70號患者具有2個或多個順式突變(即在同一等位基因上)以外，所有檢測到的突變均以雜合狀態存在。
(d)錯義突變在GH1基因編碼區內，共發現31種新型的堿基對替換，其改變了所編碼的氨基酸。這些錯義突變的致病性證據有四個來源(i)對照人群的研究，(ii)氨基酸替換的性質及所研究的殘基在進化上的保守程度，(iii)分子模建和(iv)它們的信號轉導活性的體外分析。
(i)對照中GH1編碼序列變異的研究對總共80名健康的高加索裔英國對照者的GH1編碼區的變異進行了篩選。在單一個體中發現有5例沉默替換[Asp26的GAC→GAT，Ser85的TCG→TCC，Ser85的TCG→TCA，Thr123的ACG→ACA和Asn109的AAC→AAT]。此外還有2例錯義突變[AAC→ACA，Asn47→Asp；GTC→ATC，Val110→Ile，等位基因4/160]；在我們的病人研究中(患者66)只發現Val110→Ile替換。分子模建表明這一替換對GH的結構具有有害的作用；Val110形成第3螺旋N-末端疏水核心的一部分，而替換成側鏈較長的Ile可能導致空間位阻。因此，即便Val110→Ile替換在對照組和患者組中出現的頻率都較高，它仍有可能會影響構象。盡管如此，在對照組中相對低的錯義突變有力地支持了患者組中發現的損傷的可靠性。
(ii)氨基酸替換的性質及相關殘基在進化上的保守程度一種錯義突變能否引起臨床關注，取決于許多影響因素，包括所研究的基因的序列結構，氨基酸替換的數量，被替換殘基在蛋白分子內的確切位置和直接環境，及其對蛋白質結構和功能產生的影響(Wacey等人，Hum Genet 94594-608，1994)。為評估檢出的錯義突變是否可能具有病理學意義，分別測定了變異的生物物理性質(表7C)。大多數情況下，變異是非保守性的，替換氨基酸明顯地不同于被替換氨基酸，從而支持了它們具有病理學意義的論點。
有關病理學中的錯義突變的證據來自進化保守數據，因為那些進化上保守的氨基酸殘基可能具有生物學功能。相反，進化上不保守的氨基酸殘基不太可能具有功能意義。因此病理學損傷傾向于發生在進化上保守的殘基上，而中性的多態性或罕見變異卻不這樣(Wacey等人，ibid)。因此，通過與19種其它脊椎動物直向同源的GH蛋白序列進行比較，根據其進化保守性檢測了發現與錯義突變有關的每種人GH殘基(表7C)。發現大部分受錯義突變影響的殘基高度保守，有時嚴格保守，再一次支持了這些損傷具有病理意義的觀點。
表7C相關殘基的錯義突變、生物物理性質和進化保守性
同源共生的GH蛋白質的比較(括號中為相對于人的同一性％、變異的保守性％)小鼠(66，77)，大鼠(64，75)，家兔(66，77)，鯨魚、狗(67，78)，豬(67，78)，綿羊(66，76)，母牛(66，76)，火雞(55，74)，小雞(56，73)，鴨(55，72)，烏龜、青蛙(45，68)，鯊魚、sea bream、rock cod、鮭魚、鯉魚(38，57)，金魚(37，57).
(iii)用分子模建來證明具有推定的功能效果的錯義突變分子模建研究表明錯義突變經常位于GH分子上與GH受體相互作用或可能影響GH-GH受體相互作用的區域。通過對人生長激素的X-射線晶體學結構中適當氨基酸的簡單置換，對錯義突變進行分子模建。然后從靜電相互作用、氫鍵、疏水性相互作用和表面暴露幾個方面比較了野生型和突變體“結構”。大部分錯義突變看來由GH分子結構變形引起，而不是功能紊亂引起。這種氨基酸替換可能導致分子的錯誤折疊或不穩定性。但下面的8種錯義突變看起來是產生功能性效果而不是單純的結構效果的氨基酸替換Ile4ValN-端，位點2內。丙氨酸掃描誘變(ASM)早就證明了Ile4替換影響GHR二聚化。
Gln22Arg螺旋1。Arg的引入導致同Asp26間的氫鍵消失。還導致在螺旋同側引入兩個正電荷。可能使螺旋構象變得不穩定或是與GHR上的Arg217發生不利的相互作用。
Lys41Arg環1。Lys41溶劑易接近的。直向同源基因中經常在相似位置上含有Arg。Lys41Nζ與GH殘基Tyr28和Glu32形成氫鍵，并與GHR上的Glu1270ε2有離子間相互作用。ASM顯示Lys41參與GHR結合。Arg的引入可能不增加GH對GHR的親合性。細微的變化不具必然的致病性。患者GH水平正常。
Glu56GlyGlu56處于螺旋1和2間的環區，含有部分結合位點1。Glu56與GHR上的Arg71相互作用。Glu56還與Lys168內部相互作用，Lys168構成GH-GHR復合物結合能量熱點的部分。
Arg64Gly環2。Arg64溶劑易接近的。Arg或Lys在這一位置處保守。ASM顯示Arg64參與GHR結合。堿性的Arg側鏈與GHR上的Asp164形成鹽橋和氫鍵。Arg64還與GHR的Trp169有疏水性相互作用。被Gly替換將削弱GHR的結合并可能使螺旋變得不穩定。患者GH水平正常。
Lys168Arg螺旋4。Lys168與GHR的Trp104間疏水性相互作用。預計沒有不利的相互作用。患者GH水平高于正常。
Lys168GluLys168與GHR的Trp104間有廣泛的疏水相互作用。通過形成有利的分子內靜電作用，其電荷可能穩定GH的活性構象。Glu替換可能不會產生對活性的嚴重影響。
Thr175Ala螺旋4。ASM顯示Thr175參與GHR結合；Thr175與GH分子中的Asp171，GHR上的Trp169、Arg43形成氫鍵。Ala的引入可能使螺旋變得不穩定從而降低受體結合活性。
以上提到的錯義突變可能提供這樣一種暗示，即存在自然產生的生長激素抑制物，其-除了依照本發明應用的選擇標準-可能還從未發現過。
(iv)GH變體的信號轉導活性分析使用螢光素酶報告子基因分析系統(依照Ross RJM等人在MolecEndocrin 11265-73，1997中報導的方法)來分析GH變體的信號轉導活性(生物活性)。為了使生長激素具有生物活性，它必須能與兩個GH受體結合并使受體二聚化。這將導致胞內稱為JAK2的酪氨酸激酶的活化。繼而，JAK2使轉錄因子STAT 5磷酸化并激活。磷酸化的STAT5二聚化，轉移到核中與STAT 5效應啟動子結合，從而開啟GH效應基因的表達。我們采用的GH生物活性分析要求這一途徑中的所有階段都是有功能的。從表7D中可以看到一些變體，如Q22R，K41R，W86R和S108R，與激活JAK/STAT信號轉導途徑能力的顯著降低有關。69號患者中的變異體E30G，顯著增強了激活JAK/STAT信號轉導途徑能力，因而可作為一種超激動劑(數據如圖8所示，其中RLU表示相對光單位)。
表7DGH變體的信號轉導活性的分析
螢光素酶報告子基因分析試驗結果用1nM劑量時(1nM約＝實驗中野生型GH的ED50)相對于野生型的活性百分數表示。P表示觀察值與野生型真實值之間差異的顯著性。NS表示“不顯著”在4名無親緣關系的患者中發現了一種錯義突變(Lys41Arg)，其中3人具有不同的單倍型背景。這與該位點處的頻發突變(即獨立突變事件)是一致的。IVS2中-1位處的G→A轉換突變在共8名明顯無親緣關系患者的8個等位基因上被發現；因為兩種不同的單倍型非常明顯，至少兩例這種損傷可能是頻發的，而其余可能是與家族一致的(identical-by-descent)。這些患者樣本中還有3個啟動子基因轉換事件。還發現了多例其它各種損傷[A→G-177(3)，A→G-248(2)，Leu-11Pro(4)，Ser108Arg(2)，Lys168Glu(2)，Phe176Ser(2)和Leu163Pro(2)]。總而言之，患者樣本中發現32/75(43％)等位基因的10個頻發突變。這對快速檢測GH1基因頻發性病理損傷的前景來說是令人鼓舞的。
(e)啟動子單倍型在我們在研究中，發現已知的GH1基因多態性核苷酸中15/17是變化的。將研究中患者組和對照組(157名高加索裔英國軍隊新兵)中的15處變化，歸納為共40種不同的單倍型。這些單倍型的頻率(表7F)在0.339(單倍型1)到0.0033(單倍型25-36)，到0(單倍型37-40，患者特有的，只在患者中發現，對照人群中沒有發現)間變化。
我們發現，這些啟動子單倍型在報告基因分析試驗中，驅動螢光素酶報告基因表達的能力不同。40個單倍型中的27個已經在大鼠垂體GH3細胞中進行了研究。對每種單倍型，進行3種不同實驗的6次重復(即共18次重復)。那些與螢光素酶報告子基因表達水平顯著降低[＜大多數普通單倍型的62％(no.1)]相關[并因而可能與體內GH1基因表達水平降低相關]的單倍型列于表7E，一起列出的還有它們在患者組與對照組中各自的頻率。
這些發現表明，正常人群中15％的個體可能是雜合的GH、其(至少體外如此)GH合成水平比擁有最普遍單倍型的那些個體低40％以上的啟動子單倍型。而且，可能正常人群中約有2％具有2種這樣的低表達單倍型(或相同的或不同的)，直接導致其GH水平顯著低于平均值。如果體內研究支持這一論點，那么診斷篩選方案中還應包括啟動子單倍型的確定及突變檢測。
表7E啟動子單倍型；利用螢光素酶報告子基因分析測定的其頻率和相對強度
表7F；研究過程中在對照組GH1基因中發現的不同啟動子單倍型的總結
給出的頻率來自對照組(157名高加索裔英國軍隊新兵)
(c)啟動子突變從我們的患者群中檢測到各種新型的啟動子變體(18種單堿基對替換，2種少量缺失，1種重大基因轉換)。這些損傷的可靠性的證據來自(i)對健康對照的GH1啟動子區域的研究，(ii)對不同哺乳動物物種受影響的核苷酸進化上保守程度的研究及(iii)體外借助螢光素酶報告子基因分析，確定它們對GH1啟動子的功能影響。
(i)對照組中的GH1啟動子變體對157名高加索裔英國人對照組的GH1啟動子區域進行了突變篩選。在2例個體中檢測到唯一一種相應于患者樣品中發現的突變的序列改變，即-48位的G→A轉換。另外3種對照組特有的替換出現在單一個體中(+62A→G，-123T→C，-373G→A)。最后，在一個個體內發現了基因轉換(最小-57～-31，最大-168～-6)，其也是對照組特有的。因此，從對照組檢出的變化遠少于患者組，這一發現與患者突變具有病理意義是一致的。
(ii)進化上的保守采用10種哺乳動物中的對應于GH1基因轉錄起始點上游130bp處的DNA序列。當進行歸類時，發現7/10病例中，患者體內突變的核苷酸是進化上保守的(+31T→C，-18C→T，-24A→G，-30T→C，Δ5G-57～-61，ΔG-57～-61及-108C→T)。這一發現與患者組內發現為突變的核苷酸的功能重要性是一致的。
(iii)對GH1啟動子突變的螢光素酶報告子基因分析在報告子基因分析試驗中，比較了各種推定的啟動子突變對螢光素酶基因表達的驅動能力(表7G)。在大鼠垂體GH3細胞和人HeLa細胞中，對每種單倍型在3種不同的實驗條件下進行6次重復(即共重復18次)。在HeLa細胞中，發現因-30T→C的轉換和Δ5G-57至-61的缺失，其水平顯著低于正常表達水平(GH3細胞中也有此傾向)。因而，報告子基因分析試驗支持了這兩種損傷的病理相關性。
表7G推定的啟動子突變及報告子基因的表達
(d)影響mRNA剪接的突變剪接位點處發現有兩種新型的變異體，一種是外顯子3中供體剪接位點處T→C的轉換，另一種是外顯子2受體剪接位點的專性AG二核苷酸的普通單堿基替換。通過體外剪接分析對后一突變進行了進一步的性質鑒定。它的致病性證據來自分析條件下，觀察到的它導致GH1mRNA轉錄物上外顯子3的“跳讀”(排除)的現象。
(e)人GH1基因多態性我們研究過程中，從GH1基因的外顯子，內含子或3′非翻譯區(3′UTR)中鑒別出71種不同的推定的多態性(表7A)。大多數多態性只出現一次，且可能屬罕見變異。除IVS4 T→A 1169多態性由Hasegawa等人(ibid)報導過外，所有多態性都是新發現的。IVS1-4表示內含子位置(f)基因座控制區多態性在基因座控制區共發現11種推定的多態性。它們是154G→A，154G→C，457G→A，505G→T，507T→G，661C→T，1055C→T，1429C→G，1568T→G，1615-1620ΔGGTGGT和1934T→C。殘基編號同圖4中的參考序列。總體上，患者組與對照組在等位基因頻率上沒有明顯差異。但是，505G→T，1055C→T和1934T→C替換是患者組特有的，因而可能會影響這些個體中GH1基因的表達。
權利要求
1.一種檢測方法，用于檢測可有效作為個體GH功能障礙指示物的GH1變異，這種檢測方法包括步驟a)從個體中獲得含有人GH1基因核苷酸序列的試驗樣本；及b)將從試驗樣本中獲得的序列與已知的人GH1基因標準序列進行比較，其中試驗樣本序列與標準序列的差異，指示存在可有效作為GH功能障礙指示物的變異(下文稱“GH1變體”)，其中提供試驗樣本的個體符合以下標準(i)生長衰退，定義為一種生長模式[通過一系列身高測量來繪制的；Brook CDG(Ed)臨床兒科內分泌學(Clinical PaediatricEndocrinology)第三版，第9章，p141(1995，Blackwell Scieace)]，其在標準身高記錄紙上進行繪圖時[Tanner等人，Arch Dis Child 45755-762，1970]，預示該個體成年身高處于根據個體父母身高所估計的個體成年目標身高的范圍之外；(ii)身高增長速度低于該年齡的25％；(iii)根據Tanner-Whitehouse度量法，與實齡相比骨齡延遲至少為兩年；和/或(iv)沒有其它已知疾病可能產生上述標準(i)～(iii)包含的癥狀。
2.權利要求1的方法，其中與實齡相比骨齡延遲在2～4年范圍內。
3.任一前述權利要求的方法，其中個體在標準生長激素功能試驗中的結果正常。
4.任一前述權利要求的方法，其中檢測方法包含任意一種能確定個體GH1基因序列的測序方法。
5.任一前述權利要求的方法，其中檢測方法包含用(a)一種GH1基因特異性片段，即GH1基因特有的，其序列在GH基因簇的4種其它共生基因(非GH1基因)中沒有發現的片段；和(b)一種或多種不能與GH基因簇的4種其它共生基因(非GH1基因)內同源旁側區結合的GH1基因特異性引物，對個體的GH1基因進行PCR擴增。
6.權利要求5的方法，其中GH1基因特異性引物選自GH1F(5’GGGAGCCCCAGCAATGC 3’；-615至-599)和GH1R(5’TGTAGGAAGTCTGGGGTGC3’；+2598至+2616)。
7.任一前述權利要求的方法，其中檢測方法包含對個體整個GH1基因進行PCR擴增和對個體GH1基因的重疊組成片段進行巢式PCR。
8.任一前述權利要求的方法，其中檢測方法包含對GH1基因的全部或跨越基因座控制區域的基因組DNA的片段進行PCR擴增。
9.任一前述權利要求的方法，其中檢測方法包含用DHPLC方法對個體GH1基因的全部或片段進行突變篩選。
10.任一前述權利要求的檢測方法，其檢測方法還包含使用一種或多種選自下列的引物CTC CGC GTT CAG GTT GGC(GH1DF)；AGG TGA GCT GTC CAC AGG(GH1DR)；GGG CAA CAG TGG GAG AGA AG(GH2DF)；CCT CCA GGG ACC AGG AGC(GH2DR)；CAT GTA AGC CCA GTA TTT GGC C(GH3DF)；CTG AGC TCC TTA GTC TCC TCC TCT(GH3DR)；GAC TTT CCC CCG CTG GGA AA(GH4DF)；GGA GAA GGC ATC CAC TCA CGG(GH4DR)；TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC(GH5DF)；GTG TTT CTC TAA CAC AGC TCT C(GH5DR)；TCC CCA ATC CTG GAG CCC CAC TGA(GH6DF)CGT AGT TCT TGA GTA GTG CGT CAT CG(GH6DR)；TTC AAG CAG ACC TAC AGC AAG TTC G(GHD7F)；CTT GGT TCC CGA ATA GAC CCC G(GH7DR)；GTGCCCCAAGCCTTTCCC(LCR151159-1177)；TGTCAGATGTTCAGTTCATGG(LCR131391-1412)；CCTCAAGCTGACCTCAGG(LCR251346-1363)；GATCTTGGCCTAGGCCTCG(LCR231584-1602)；LCR 5A (5’CCAAGTACCTCAGATGCAAGG 3’)；LCR 3.0(5’CCTTAGATCTTGGCCTAGGCC3’)；LCR 5.0(5’CCTGTCACCTGAGGATGGG 3’)；LCR 3.1(5’TGTGTTGCCTGGACCCTG 3’)；LCR 3.2(5’CAGGAGGCCTCACAAGCC 3’)；LCR 3.3(5’ATGCATCAGGGCAATCGC 3’)；GH1G5(5′GGTACCATGGCTACAGGTAAGCGCC 3′)；GH1G3(5′CTCGAGCTAGAAGCCACAGCTGCCC 3′)；BGH3(5′TAGAAGGCACAGTCGAGG 3′)；GH1R5(5′ATGGCTACAGGCTCCCGG 3′)；和GH1R3(5′CTAGAAGCCACAGCTGCCC 3′).
11.GH1變體編碼的蛋白質或氨基酸序列，所述GH1變體選自a)此處實施例6和表7中所述的未發表的那些變體。b)選自或編碼在表7B“生長激素缺陷；GH1基因突變和多態性”中編號為10，12，20，30，32，33，36，37，50，53，62，63和66的患者中鑒定的變體
c)包含選自下列的變異的變體-1處IVS2受體剪接位點G→A(702)[于表7B中的編號為37的患者鑒定到]；-57至-61，5G缺失[于表7B中編號為36的患者中鑒定到]。d)包含或編碼Asn47Asp(748AAC→GAC)的變體，其為實施例6(a)(i)中定義的對照組中觀察到的錯義突變。
12.人GH變體，該變體具有選自下列針對GH野生型的氨基酸替換Leu→Pro-11；Asp→Asn 11；Lys→Arg 41；Ser→Phe 71；Glu→Lys 74；Gln→Leu 91；Ser→Cys 108；Ser→Arg 108；和Val→Ile110。
13.權利要求11或12的人GH變體，選自Lys41Arg；Ser71Phe和Ser108Arg。
14.權利要求11的人GH變體，其為Val110Ile。
15.一種篩選方法，用于篩選疑為GH功能障礙的個體，該篩選方法包括步驟(a)從個體中獲得含有人GH1基因的核苷酸序列的試驗樣本；和(b)將從實驗樣本中獲得的序列的區域與預定序列的相應區域比較，其中預定序列選自如權利要求11中所述的GH1變體。
16.一種篩選方法，用于篩選疑為GH功能障礙的個體，該篩選方法包括步驟a)從個體中獲得含有人GH1基因核苷酸序列或其編碼的氨基酸序列的試驗樣本；和b)分析試驗樣本中是否存在GH1變體，或GH變體，或分析是否存在一種或多種代替標志物，其指示GH1變體或GH變體的存在或與其存在相關；其中GH1變體或GH變體與相應野生型序列相比，至少具有一種變異，而且可從第二份試驗樣本中獲得，該第二份試驗樣本取自符合如下標準的個體(i)生長衰退，定義為一種生長模式[通過一系列身高測量來繪制，Brook CDG(Bd)臨床兒科內分泌學(Clinical PaediatricEndocrinology)第三版，第9章，p141，1995，Blackwell Science]，其在標準身高記錄紙上進行繪圖時[Tanner等人，Arch Dis Child 45755-762，1970]，預報該個體成年身高處于根據個體父母身高所估計的個體目標成年身高的范圍之外；(ii)身高增長速度低于年齡的25％；(iii)根據Tanner-Whitehouse度量法，與實齡相比骨齡延遲至少為兩年；和/或(iv)沒有產生上述標準(i)～(iii)包含的癥狀的其它已知疾病。
17.權利要求16的篩選方法，包括(a)從個體中獲得第一份試驗樣本；并且(b)將第一份試驗樣本中的GH1基因或其編碼的氨基酸序列或其中的片段與可從第二份試驗樣本中得到的GH1變體的相應基因、或其編碼的氨基酸序列或其片段進行比較，該第二份試驗樣本取自符合所述標準的個體。
18.權利要求15-17任一項中的篩選方法，其中通過標記的DNA樣本(來自個體的cDNA或基因組DNA)與固定在固相支持物上的突變特異性寡核苷酸探針微陣列雜交，來同時篩選多種已知或所有可能的突變。
19.一種篩選方法，用于篩選疑為GH功能障礙的個體，該篩選方法包括步驟(a)從個體中獲得含有人GH1基因編碼的氨基酸序列的試驗樣本；和(b)分析試驗樣本中否存在GH變體，其中GH變體選自權利要求11-14任一項中的變體。
20.權利要求19中的篩選方法，其中分析步驟(b)選自下面一種或多種傳統的蛋白質測序方法(如質譜，微陣列分析，高溫測序等等)，和/或基于抗體的檢測方法(如ELISA)。
21.一種分離的、純化的或重組的核酸序列，該序列選自(a)包含編碼權利要求11-14任一項中的GH變體的序列；(b)與序列(a)基本同源或在嚴謹條件下可與序列(a)發生雜交的序列；或(c)若非遺傳密碼的簡并性則與序列(a)或(b)基本同源或在嚴謹條件下可與序列(a)或(b)發生雜交的序列；或(d)(a)或(b)或(c)中的任一序列的特異性寡核苷酸。
22.包含權利要求21中的核酸序列的載體。
23.包含權利要求22中的載體的宿主細胞，如細菌宿主細胞。
24.制備權利要求11-14任一項中的GH變體的方法，該方法包括i)培養權利要求23中的宿主細胞；和ii)從培養基中回收所產生的GH變體。
25.氨基酸序列，其由權利要求21-24任一項中限定的序列、載體或細胞編碼或在培養基中表達。
26.一種組合物，其包括根據權利要求11-14任一項中的GH變體，及其藥物可接受的載體。
27.根據權利要求11-14中任一項所述的GH變體在治療、診斷或檢測方法中的應用。
28.根據權利要求27的應用，其選自下述一種或多種確定結合缺陷；確定垂體貯存缺陷；確定對疾病的易感性，如糖尿病，肥胖或感染；治療與催乳的，致糖尿病的，脂肪分解的和蛋白質合成代謝的作用相關的肢端肥大癥或巨人癥疾病；與鈉和水的潴留相關的疾病；代謝綜合癥；情緒與睡眠紊亂；以及GH功能障礙的診斷。
29.權利要求27的應用，其為一種或多種權利要求11-14任一項中的變體在蛋白質治療中的應用。
30.權利要求11-14中任一項的GH變體在制備藥劑、診斷組合物或試劑盒或檢測試劑盒中的應用。
31.如權利要求11中所述的GH1變體，在治療、診斷或檢測方法中的應用。
32.權利要求31的應用，其為一種或多種如權利要求11中所述的GH1變體在基因治療中的應用。
33.如權利要求11中所述的GH1變體在制備藥劑、診斷組合物或試劑盒或檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種檢測方法，用于檢測iGHI中可有效作為個體GH功能障礙指示物的變異，包括步驟將從個體中獲得的、含有人GHI基因核酸序列的試驗樣本，與已知的人GHI基因標準序列進行比較。試驗樣本序列與標準序列間的差異，指示存在可有效作為個體GH功能障礙指示物的變異(下文稱作“GHI變體”)。試驗樣本從具有如下標準的個體中獲得(i)生長衰退，定義為一種生長模式[通過一系列身高測量來繪制，Brook CDG(Ed)臨床兒科內分泌學(ClinicalPaediatric Endocrinology)第三版，第9章，p141(1995，BlackwellScience)]，即在標準身高記錄紙上進行繪圖時[Tanner等人，Arch DisChild 45755－762，1970]，預示該個體成年身高處于根據個體父母身高所估計的個體目標成年身高的范圍之外。本發明還涉及由此檢測到的突變，以及這些突變在篩選生長激素紊亂患者方面和在制造適于治療此類紊亂的變體蛋白質方面的應用。
文檔編號G01N33/566GK101058832SQ20071008568
公開日2007年10月24日 申請日期2001年5月14日 優先權日2000年5月12日
發明者D·N·庫奧博, A·M·普洛克特, J·格雷戈里, D·S·米拉 申請人:加的夫大學學院咨詢有限公司