幽門螺桿菌尿素酶b亞單位b細胞抗原表位多肽及鑒定方法與應用的制作方法

專利名稱：幽門螺桿菌尿素酶b亞單位b細胞抗原表位多肽及鑒定方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥和基因工程領域，特別是涉及來自幽門螺桿菌(Hp)尿素酶B亞單位蛋白的一個中和性B細胞抗原表位多肽及其編碼的DNA，以及鑒定此中和性B細胞抗原表位的方法與其在醫藥生物技術領域的應用。
背景技術：
1982年澳大利亞學者Warren和Marshall首先從人胃粘膜中分離培養出幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)，他們的發現使得在過去的20多年中，對于潰瘍病的認識和治療發生了很大的變革。2005年10月3日，諾貝爾獎評審委員會宣布，將2005年度諾貝爾生理學和醫學獎授予這兩位澳大利亞科學家，以表彰他們發現了幽門螺桿菌(Hp)以及這種細菌在胃炎和胃潰瘍等疾病中的作用。研究已證實Hp是慢性胃炎、消化性潰瘍及胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因子，與胃癌的發生密切相關，世界衛生組織已經把Hp列為胃癌的I類致病因子。有效的治療和根除Hp感染已成為人們關注的焦點。
Hp是人類感染率最高的慢性致病菌，流行病學調查顯示全世界成年人中有50％攜帶有該菌，因此要克服該致病菌的危害僅僅被動治療是難以實現的，與其他傳染病一樣免疫接種將是預防該菌感染的最有效方法。1991年Czinn et al獲得了免疫接種的第一證據。他們把Hp的粗制抗原加上佐劑霍亂毒素(CT)經口服途徑免疫小鼠，實驗組比對照組產生高得多的局部粘膜IgA反應。隨著研究的深入，人們所利用的Hp抗原包括超聲粉碎抗原，純化尿素酶全酶，尿素酶亞單位，純化的細胞空泡毒素(VacA)，熱休克蛋白等，其中尿素酶已證實為一種有效的保護性抗原而成為疫苗的首選抗原。Hp尿素酶是Hp的最主要的抗原成份，它能夠刺激機體產生強烈的免疫反應。免疫佐劑CT或大腸桿菌毒素能夠引起局部粘膜免疫反應以提高免疫保護效果。目前尿素酶疫苗預防Hp感染已在許多動物模型上獲得成功。
目前臨床主要采用抗生素多聯療法治療Hp感染，雖然可以達到85％的根除率，但存在以下缺點1、藥物療法毒副作用大；2、復雜的聯合用藥導致病人的依從性差；3、藥物不能防止Hp的再感染；4、抗生素治療易產生耐藥性而導致治療失敗；5、對發展中國家病人而言，藥物療法在經濟上也較困難。免疫接種是預防和控制感染性疾病最經濟而有效的方法，鑒于Hp感染的高發病率及其與慢性胃炎、消化性潰瘍以及胃癌、胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤的密切關系，如何通過免疫接種達到防治這些疾病的目的，一直是各國科研人員研究的重點問題。疫苗接種通過有效地調動機體的免疫系統，克服細菌對宿主的免疫逃避來達到預防感染和消除已感染細菌的目的，經濟而簡便，可在人群中大規模運用，并且對耐藥細菌仍然有效，因此研究幽門螺桿菌疫苗具有重要的意義。
動物實驗研究表明，疫苗接種可以減少Hp在胃粘模定植，并減輕胃粘膜的炎癥反應，起到預防和治療Hp感染的作用。目前關于Hp的疫苗研究多是采用全菌疫苗或重組亞單位疫苗及核酸疫苗等，其引發的免疫應答與Hp自然感染時的免疫應答相似。Hp自然感染時體內產生強烈的細胞與體液免疫應答，但是感染仍慢性持續化甚至終身感染，說明機體已經對Hp存在免疫耐受，自然感染時產生的免疫應答不能起到保護作用，因而通過疫苗接種的方式清除Hp就必須在抗原選擇以及表位水平對抗原進行改造，激發更有效的免疫應答。表位疫苗是近年隨分子生物學及免疫學的進展而發展起來的一種新的疫苗形式，可以誘導機體產生特異性的免疫應答，并且其具有低變應原性、生產成本低、副作用輕微、安全性好，是目前疫苗研究的一個新的方向，廣泛應用于病毒、腫瘤、及慢性感染性疾病的免疫預防和治療。并且目前很多多肽疫苗傾向于與T細胞或B細胞表位交聯，從而構建一個嵌合表位疫苗而發揮作用。借鑒表位疫苗在其它慢性感染性疾病中的研究成果，以Hp表位為基礎設計的疫苗有可能打破機體的免疫耐受，達到預防和治療Hp感染的目的。
尿素酶(Urease)是Hp的主要致病因子，對Hp在人胃粘膜定居起著重要作用，在胃部的酸性環境中，一般細菌很難存活，但是Hp的尿素酶能夠水解尿素而釋放氨，在菌體周圍形成一層“氨云”保護Hp抵抗胃酸而在胃粘膜定植，并且釋放的氨能直接損害胃粘膜。尿素酶在Hp菌體中的含量高，占可溶性蛋白的6％，由A和B兩個亞單位組成，其中B亞單位(UreB)為尿素酶活性亞基，在各菌株中相對保守，研究證實UreB具有很強的抗原性，是較好的Hp疫苗的候選抗原。目前關于Hp的表位研究主要是針對尿素酶的B細胞表位開展的，研究發現針對尿素酶B亞單位(UreB)不同表位的單抗可以抑制尿素酶的活性，從而阻斷幽門螺桿菌的感染。近些年來，很多學者通過一些生物信息學軟件來分析一些蛋白的氨基酸序列，預測其T細胞或B細胞表位，但預測的準確率僅有50％左右，因此建立一種準確有效的篩選B細胞表位的方法顯得尤為重要。因此本發明從鑒定Hp的尿素酶B亞單位的B細胞表位入手，研究預防和治療Hp感染的方法。

發明內容
本發明的一個目的在于提供一種幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位(UreB)中和性B細胞抗原表位多肽。
其中上述表位多肽，具有下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1的氨基酸殘基；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基經過一個或數個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有誘導產生幽門螺桿菌尿素酶B亞單位抗原特異性的細胞或體液免疫應答作用的多肽；3)序列表中的SEQ ID NO1的氨基酸序列所對應的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO2所示。
本發明中的一較佳實施例中采用的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位中和性B細胞抗原表位多肽，名稱為U211-225，來源于幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)上第211-225位氨基酸殘基，具有序列表中SEQ ID No1的15個氨基酸殘基序列。
含有本發明表位肽DNA的表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬于本發明的內容。
擴增本發明表位肽DNA中的引物對也為本發明的內容。
本發明的另外一個目的在于提供一種鑒定上述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位B細胞抗原表位多肽的方法，該方法是通過應用生物信息學軟件對Hp的UreB蛋白氨基酸序列進行分析的基礎上，經過綜合考慮各項參數，選擇性的將UreB蛋白分成5段，分別克隆、構建、誘導和表達，通過SDS-PAGE分析和Western blot鑒定，初步確定抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6所針對的抗原表位所在區域，步移合成法合成4條長度為15個氨基酸的表位多肽，以此獲得抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6針對的抗原B細胞抗原表位。
上述方法主要包括以下步驟1)將通過生物信息學軟件分析的Hp的UreB抗原采用截短法分段構建，將重組表達載體導入宿主細胞進行誘導表達，確定單抗6E6所針對的表位范圍；6E6抗體是由本實驗室人員制備，其特征如序列表中SEQ ID NO3所示。
(1)培養幽門螺桿菌(HPNCTC11637)，并抽提其基因組；(2)DNASTAR軟件分析UreB蛋白氨基酸序列，分段構建UreB重組抗原，并分別命名為U12，U13，U47，U15，U16；(3)克隆幽門螺桿菌NCTC11637的U12，U13，U47，U15，U16的編碼基因；(4)構建U12，U13，U47，U15，U16基因的原核細胞表達質粒；(5)測定重組融合基因的序列；
(6)誘導基因重組工程菌表達獲得目的蛋白；(7)免疫印跡分析，初步確定幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6所針對的抗原表位所在區域；2)根據上述步驟1)所確定的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6所針對的抗原表位所在范圍，步移合成表位肽。
3)根據上述步驟2)合成的表位肽，通過表位作圖(間接ELISA和斑點印跡)方法，確定幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6所對應的表位肽。
其中，根據上述步驟2)中步移合成的表位肽，涵蓋了6E6單抗識別的表位范圍，相互重疊5個氨基酸殘基，合成的每條表位肽包含15個氨基酸。
本發明涉及5個來自Hp的UreB抗原，上述這些分段的抗原選自下組具有序列表中SEQ ID NO4、5、6、7、8氨基酸序列的蛋白，經DNASTAR軟件預測分析是具有良好抗原性、疏水性、柔韌性和可及性的蛋白肽段，其具有如下特征1)具有序列表中SEQ ID NO4、5、6、7、8的核苷酸序列。
2)序列表中SEQ ID NO4、5、6、7、8編碼的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO44、55、66、77、88所示。
其中含有本發明分段抗原編碼核苷酸序列的載體，包括裸DNA，以及轉入包含該5段分段抗原核苷酸序列載體的原核或真核表達宿主菌、擴增本發明UreB分段基因中的引物對均屬于本發明內容。
本發明中所述的原核細胞可為大腸桿菌，如E.coliBL21、E.coliM15、E.coliJM109、或E.coliDH5α等。
本發明中所述的真核細胞可為哺乳動物細胞、酵母細胞和植物細胞等，包括COS-7、CHO、BHK-21或Pichia pastoris等。
本發明中的用于構建含有Hp尿素酶B亞單位分段抗原編碼DNA的重組表達載體的出發載體可為pET系列、pGEX系列、pMAL系列、pBluescriptSK+的出發載、pTrx、pTrxFus、pQE-30、pCAT3、pβ-gal系列、pcDNA3.1(+/-)、pCMV系列、pCMVScript、pd2EGFP系列、PGL3系列、或pPIC系列等。
本發明中的培養含有本發明的Hp尿素酶B亞單位分段抗原編碼DNA的宿主細胞的培養基和培養條件，均可為培養出發宿主的培養基和培養條件。
本發明的另外一個目的在于提供一種活性成分為上述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位的B細胞抗原表位多肽的嵌合表位疫苗及其制備方法。
上述疫苗為人工合成表位肽與載體蛋白偶聯后制備的嵌合表位疫苗，該嵌合表位疫苗包含序列表中的SEQ ID No1的氨基酸殘基序列和載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)。
上述嵌合表位疫苗的構建方法，采用上述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位B細胞抗原表位多肽與載體蛋白進行化學偶聯，主要步驟如下1)人工合成編碼6E6單克隆抗體識別的抗原表位氨基酸序列，以下用epi表示此表位的氨基酸序列；2)構建Epitope-BSA共價偶聯物；3)將偶聯物在緩沖液中透析，除去未偶聯上的小分子多肽，以便得到純的偶聯蛋白；4)此偶聯物即為二價的嵌合表位疫苗。
本發明的表位疫苗也可以以基因工程重組的方法獲得，也可以是裸DNA疫苗，或者是將表位肽及其表位疫苗通過重組到其他載體上獲得，如減毒沙門氏菌，痘病毒載體，病毒樣顆粒。
需要的時候，在上述疫苗中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體等。
本發明的嵌合表位疫苗中包含的表位氨基酸殘基數目的增減、額外的表位的添加以及表位疫苗中包含的表位的串連拷貝數的增加等都屬于本發明的范圍。
本發明的表位疫苗具有良好的免疫原性，在小鼠動物模型中可以誘導產生針對此B細胞表位的特異性體液免疫應答，即產生針對B細胞表位的抗體。
本發明還涉及采用血清學分析方法鑒定臨床感染幽門螺桿菌患者血清中是否有針對此幽門螺桿菌尿素酶B亞單位B細胞表位多肽的抗體。經動物試驗證實，此B細胞表位具有較強的抗原性，產生的抗血清不僅具有中和尿素酶活性的效應，并且還能與不同Hp天然菌株的尿素酶B亞單位蛋白發生特異性抗原抗體反應。
本發明還有一個目的，在于提供一種用于預防或治療幽門螺桿菌感染的藥物，該藥物的活性成分為上述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位B細胞抗原表位多肽。
本發明中B細胞表位作為活性成分制成的疫苗或藥物，可以起到清除幽門螺桿菌感染的作用，在醫藥領域具有廣闊的應用前景。
本發明的主要優點在于用生物信息學軟件分析加實驗鑒定的方法快速，準確，經濟，避免大量合成表位多肽，減少費用。獲得了具有中和Hp尿素酶活性的6E6單克隆抗體對應的抗原表位，可安全有效的引起針對Hp的體液免疫應答。獲得此B細胞表位肽不僅對Hp發病機制的研究，而且對疫苗以及治療制劑的研制均有重要的意義。此外獲得一種基于表位肽和載體蛋白偶聯的嵌合表位疫苗，動物實驗中顯示了良好的免疫原性，特異性好，具有良好的應用前景。
為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。


圖1為本發明的目的基因U12，U13，U47，U15和U16的PCR克隆擴增。
泳道1為核酸(DNA)分子量標準(Marker)，泳道2為目的基因U12的PCR擴增產物(900bp)；泳道3為目的基因U13的PCR擴增產物(300bp)；泳道4為目的基因U47的PCR擴增產物(420bp)；泳道5為目的基因U15的PCR擴增產物(690bp)；泳道6為目的基因U16的PCR擴增產物(780bp)。
結果表明目的基因U12，U13，U47，U15，U16的PCR克隆擴增效果良好。
圖2是U12，U13，U47，U15，U16重組表達質粒的酶切鑒定。
泳道1為7000bp核酸(DNA)分子量標準(Marker)；泳道2為1500bp核酸(DNA)分子量標準(Marker)；泳道3為pET-11c空載體質粒BamHI單酶切產物(5675bp)；泳道4為重組質粒pET11c-U12 NdeI和BamHI雙酶切鑒定產物(900bp)；泳道5為重組質粒pET11c-U13 NdeI和BamHI雙酶切鑒定產物(600bp)；泳道6為重組質粒pET11c-U47 NdeI和BamHI雙酶切鑒定產物(420bp)；泳道7為重組質粒pET11c-U15 NdeI和BamHI雙酶切鑒定產物(690bp)；泳道8為重組質粒pET11c-U16 NdeI和BamHI雙酶切鑒定產物(780bp)。
圖3是U12，U13，U47，U15，U16基因重組菌IPTG誘導表達SDS-PAGE電泳圖。
泳道1為蛋白質分子量標準(Marker)；泳道2為空載體菌誘導前0hr；泳道3為空載體菌誘導4hr；泳道4為基因重組菌U12誘導4hr；
泳道5為基因重組菌U13誘導4hr；泳道6為基因重組菌U47誘導4hr；泳道7為基因重組菌U15誘導4hr；泳道8為基因重組菌U16誘導4hr；圖4基因重組菌與單克隆抗體6E6免疫印跡圖。
泳道1為本室構建的UreB414與mAb6E6蛋白印跡分析；泳道2為不相關蛋白BSA(牛血清白蛋白)與mAb6E6蛋白印跡分析；泳道3為重組UreB全蛋白與mAb6E6蛋白印跡分析；泳道4為空載體菌pET11c與mAb6E6蛋白印跡分析；泳道5為基因重組工程菌pET11c-U16與mAb6E6蛋白印跡分析；泳道6為基因重組工程菌pET11c-U15與mAb6E6蛋白印跡分析；泳道7為基因重組工程菌pET11c-U47與mAb6E6蛋白印跡分析；泳道8為基因重組工程菌pET11c-U13與mAb6E6蛋白印跡分析；泳道9為基因重組工程菌pET11c-U12與mAb6E6蛋白印跡分析；泳道10為蛋白質分子量標準(Marker)。
圖5mAb 6E6與合成肽表位作圖。
圖6(B)斑點印跡1泳道為合成多肽U201-215aa與mAb 6E6的斑點印跡分析；2泳道為合成多肽U206-220aa與mAb 6E6的斑點印跡分析；3泳道為合成多肽U211-225aa與mAb 6E6的斑點印跡分析；4泳道為合成多肽U216-230aa與mAb 6E6的斑點印跡分析；5泳道為基因重組蛋白UreB(陽性對照)與mAb 6E6的斑點印跡分析；6泳道為BSA(陰性對照)與mAb 6E6的斑點印跡分析。
圖7合成表位的拮抗試驗。
圖8表位肽，表位肽與BSA偶聯的表位疫苗免疫動物后抗血清效價測定圖。
圖9抗血清與不同Hp菌株尿素酶B亞單位蛋白的Western blot分析1泳道為Hp菌株NCTC11637尿素酶B亞單位蛋白與抗血清的免疫印跡分析；2泳道為Hp菌株26695尿素酶B亞單位蛋白與抗血清的免疫印跡分析；
3泳道為Hp菌株SS1尿素酶B亞單位蛋白與抗血清的免疫印跡分析；4泳道為Hp臨床分離菌株9806尿素酶B亞單位蛋白與抗血清的免疫印跡分析；5泳道為Hp純化重組尿素酶B亞單位蛋白與抗血清的免疫印跡分析；6泳道為陰性對照牛血清白蛋白與抗血清的免疫印跡分析；圖10顯示的是單克隆抗體6E6抑制幽門螺桿菌尿素酶活性的時間依賴曲線。
圖11合成表位U211-225的血清學試驗。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，應理解的是，這些實施例僅用于說明本發明而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下對本發明制備方法的簡單改進，及對本發明表位肽的利用都屬于本發明要求保護的范圍。
本發明的思路如下最初的研究以本教研室已經制備的抗幽門螺桿菌重組尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6為基礎，以BALB/c小鼠為動物模型，制備了在BALB/c小鼠的動物模型上研究Hp的表位嵌合疫苗。本發明應用生物信息學軟件DNASTAR分析Hp尿素酶B亞單位的氨基酸序列，盡量保證不破壞其高抗原性和高親水性區域，采用截短方法分段構建了UreB抗原，分別命名為U12，U13，U47，U15，U16，并以基因重組工程菌誘導表達和免疫印跡分析，初步確定單克隆抗體6E6所對應的抗原表位所在區域。采用步移合成法，合成表位多肽，通過表位作圖，確定單克隆抗體6E6具體對應的表位氨基酸序列。通過拮抗試驗，檢測表位能否抑制單克隆抗體中和尿素酶的活性。本發明人還收集了臨床感染Hp患者的血清，觀察了此B細胞表位肽對人產生的抗體作用，發現B細胞表位肽也可以和人的抗體發生陽性反應。因此本發明的B細胞表位肽可以用來研制人或小鼠用的Hp表位疫苗，并可以用來開發預防或治療Hp感染的多肽藥物。
材料的準備1、重組幽門螺桿菌Hp尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6為本發明單位制備。申請號200510057034.52、實驗動物BALB/c小鼠6-8周齡，SPF級，雌性，體重18-22g，購自第三軍醫大學實驗動物中心。
3、合成多肽用二甲亞砜(DMSO)溶解成5mg/ml的濃度，-70℃保存，臨用時用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成0.5mg/ml。
4、弗氏佐劑弗氏完全佐劑石蠟油(1份)+羊毛脂(1份)+滅活卡介苗1支，弗氏不完全佐劑石蠟油(1份)+羊毛脂(1份)5、LB液體培養基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加蒸餾水至1000ml，調整pH至7.4，高壓蒸氣滅菌。
6、LB固體培養基1.5g瓊脂粉加入100ml LB培養液中，高壓蒸氣滅菌后(15磅20min)傾倒平板。
7、DNA電泳緩沖液(50×TAE)Tris 242g，冰乙酸57.1ml，Na2EDTA·2H2O 37.2g，加水至1000ml即可，應用濃度為1×TAE。
8、EB溶液EB貯存液(10mg/ml)，0.2g EB溶解于20ml H2O中，混勻后于4℃避光保存。
9、EB染色液10μl EB貯存液，100ml 1×TAE緩沖液10、PBS緩沖液(pH7.2)Na2HPO414mmol，NaH2PO46mmol，NaCl29g，加蒸餾水到1L11、NdeI、BamHI 中國大連Takara公司12、DNA maker 中國鼎國公司13、質粒抽提試劑盒 Omega公司14、考馬斯亮蘭R-250快速染色系統(參考《精編分子生物學實驗指南》)。染色液0.29g考馬斯亮蘭R-250溶于250ml下述脫色液中。脫色液250ml 95％乙醇和80ml冰乙酸，加雙蒸水至1000ml。
15、TE buffer(pH 8.0)10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA16、ELISA試劑的配制1)包被液0.05mmol/L碳酸鹽緩沖液pH9.6Na2CO31.6g，NaHCO32.9g，NaN30.2g，加蒸餾水至1000ml2)抗體稀釋液10mmol/L PBS(pH7.3)；0.05％Tween-20；0.5％BSA3)封閉液10mmol/L PBS(pH7.3)；2.0％BSA4)洗滌液10mmol/L PBS(pH7.3)；0.05％Tween-205)底物液0.1mmol/LNa2HPO45.12ml；0.05mmol/L檸檬酸4.86ml；OPD 4mg；30％H2O25μl；加水至100ml。
17、偶聯試劑的配制
1)硼酸鹽緩沖液0.1mol/L，pH8.518.55g硼酸，2850mlH2O，10mol/LNAOH調校至pH8.5，最后補水至3L；0.1mol/L，pH100.618g硼酸，95mlH2O，10mol/LNAOH調校至pH10，最后補水至100ml；2)用pH10的硼酸鹽緩沖液配制0.3％的戊二醛30ul戊二醛溶液溶于10mlpH10的硼酸鹽緩沖液；3)1mol/L甘氨酸18、Western blot試劑的配制1)TBS緩沖液100mmol/L Tris.cl，pH7.5，0.9％NaCl；2)TTBS0.1％(V/V)Tween20溶于TBS緩沖液中，于4℃保存備用；3)麗春紅染液0.5g麗春紅(Ponceans)融解于1ml冰醋酸中，加水至100ml，臨用時配制；4)電轉液在500ml去離子水中加入3.03gTris堿和14.41g甘氨酸，再加入200ml甲醇，并補水至1L，溶液pH值約為8.3-8.4；如果用PVDF膜，甲醇濃度應降至15％，如果用尼龍膜，可不加甲醇；實施例1、幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)5個分段抗原U12，U13，U47，U15，U16編碼基因的克隆1、HP的培養將HP菌株NCTC11637接種于20mlHP專用液體培養基上，于37℃，含5％O2，85％N2，10％CO2的微需氧條件下培養24小時。
2、幽門螺桿菌(Hp)NCTC11637基因組DNA的制備(按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作)1)取細菌培養液1-5ml.10000rpm離心1分鐘，盡量吸盡上清。
2)向菌體沉淀中加入200ul緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮。
3)向管中加入20ul蛋白酶K(20mg/ml)溶液，混勻。
4)加入220ul緩沖液GB，振蕩15秒，70℃放置10分鐘，溶液變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。
5)加220ul無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。
6)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入500ul去蛋白液GD(已加入無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液GW(已加入無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，吸附柱放入收集管中。
9)向吸附柱CB3中加入500ul漂洗液GD，12000rpm離心30秒，倒掉廢液。
10)吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去處除。將吸附柱CB3置于室溫或50℃溫箱放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液體。
11)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200ul經65-70℃水浴預熱的洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心30秒。
12)離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘。此時得到的溶液即為HP基因組DNA溶液。
3、采用PCR方法自Hp基因組擴增U12，U13，U47，U15，U16的編碼基因。
1)運用DNASTAR軟件分析UreB蛋白序列，確定分段位點，為保證不破壞UreB的高親水性和抗原性區域，分段位點分別為UreB蛋白的200aa，230aa，250aa，260aa，300aa，390aa位置處。
2)引物設計合成如下(下劃線示酶切位點)根據GeneBank公布的UreB(ACCESSION NCTC11637)基因序列和引物合成原則設計引物，引入酶切位點，引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7的具體序列如序列表中SEQ ID NO9、10、11、12、13、14、15所示。其中P1和P4作為上游引物引入NdeI酶切位點，P2，P3，P5，P6，P7作為下游引物引入BamHI酶切位點。
3)目的基因的PCR擴增以幽門螺桿菌HP基因組DNA為模板，以P1和P2，P1和P3，P4和P7，P1和P5，P1和P6分別擴增U12，U13，U47，U15，U16基因片段，采用如下的PCR體系和程序在500ul微量離心管中加入下列試劑模板DNA 2ul10×PCR緩沖液5uldNTPs(10mmol/L) 4ul
氯化鎂4ul上、下游引物(0.025mmol/L)各1ulTaq DNA聚合酶(5U/ul) 1ul加去離子水至終體積50ul混合后加入礦物油3滴反應條件94℃預變性5分鐘后，94℃，30秒；55℃ 30秒；72℃ 65秒；30個循環周期，然后72℃延伸10分鐘。
4)PCR產物的克隆采用TA克隆方法克隆PCR產物，方法見文獻(于永利，麻彤輝，楊貴貞TA克隆及雙鏈DNA測序，介紹一種快速克隆及分析PCR產物的方法，中國免疫學雜志，1994，10(1)5)。
5)PCR產物的序列分析將TA克隆轉化菌株送至上海英俊公司，按常規方法(J.Sambrook，分子克隆，冷泉港實驗室出版社1989聚丙烯酰胺凝膠電泳1.21-1.32)提取質粒，采用雙脫氧末端終止法，對插入片段進行序列測定。
PCR擴增結果如圖1所示，表明目的基因U12，U13，U47，U15，U16的PCR克隆擴增效果良好，分別擴增出了900bp，600bp，420bp，690bp和780bp大小的目的片段。
實施例2幽門螺桿菌HP尿素酶的U12，U13，U47，U15，U16表達質粒的構建及高效表達工程菌的構建及篩選1、重組質粒的構建將U12，U13，U47，U15，U16基因擴增(PCR)產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳、膠回收純化后與載體pMD-18T連接，轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒，分別用NdeI和BamHI雙酶切，1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
將含U12，U13，U47，U15，U16目的基因的pMD-18T載體及pET-28a(+)用NdeI和BamHI雙酶切，酶切產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳、目的片段膠回收純化后，用T4連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒，NdeI和BamHI雙酶切，1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
酶切鑒定結果如圖2所示，酶切片段大小與設計基本一致，初步證明重組質粒構建成功。
有關操作具體步驟如下1)質粒DNA抽提(使用Omega公司質粒抽提試劑盒)(1)挑取平板上分隔良好的菌落轉種于帶相應抗生素的LB培養液中，37℃搖床培養過夜。
(2)取4ml菌液于5mL離心管中，12000g離心2分鐘，留取沉淀。
(3)每管加250μl Solution I懸浮，充分混勻。
(4)加入250μl Solution II，輕柔顛倒混勻4-6次。
(5)加入350μl Solution III，輕柔顛倒混勻4-6次。
(6)4℃、12000g離心10分鐘，將上清移至分離柱中。
(7)12000g離心1分鐘，傾倒收集管中的廢液。
(8)加入500μl Hb buffer于分離柱中，12000g離心1分鐘，傾倒收集管中的廢液。
(9)加入750μl DNA wash buffer(加入無水乙醇)，12000g離心1分鐘，重復一次。空柱離心12000g，2分鐘。
(10)室溫放置5-10分鐘，使乙醇完全揮發。
(11)將分離柱置于另一干凈1.5ml的Ep管中并加入50μl的ddH2O(55℃預溫)，12000g離心1分鐘。收集洗脫液即為抽提的質粒，取一定量的洗脫液進行電泳，其余置于-2℃保存備用。
2)瓊脂糖凝膠電泳1.0％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，120-150mA，電泳20-40分鐘。
50×TAE儲存液配方2.0mol/L Tris base，1.0mol/L NaAc，1.0mol/L Na2EDTA；用冰醋酸調節pH至8.3。
3)質粒DNA雙酶切鑒定反應用NdeI和BamHI雙酶切鑒定，酶切體系如下質粒 6μl，NdeI 0.5μl，BamHI0.5μl，10×buffer(K)1μl，ddH2O 2μl，混勻，37℃水浴1小時，1.0％的瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切結果。
4)瓊脂糖電泳膠的目的DNA回收純化(使用Omega公司膠回收試劑盒)(1)在紫外燈下觀察并切下瓊脂糖凝膠上的目的DNA電泳帶，移入1.5mlEP管中；(2)加入700ul DNA binding buffer，65℃水浴使凝膠完全融化并保持溶液pH值在5.0-6.0之間；
(3)將溶膠液移入分離管中，12000g離心1分鐘，棄去收集管中的液體；(4)加入500ul Washing buffer，12000g離心1分鐘，棄去收集管中的液體，并重復洗滌一次；(5)12000g空離心1分鐘，分離管移置另一干凈1.5ml EP管，加入一定體積的TE buffer洗脫，65℃孵育10分鐘，12000g離心1分鐘；(6)取一定量洗脫液電泳，UVP紫外掃描儀檢測回收純化結果；5)連接反應(使用Takara公司連接試劑盒)通過紫外分光光度計檢測目的DNA片段和載體片段的濃度，根據外源片段與載體摩爾數比一般為1∶2-10的原則，設計連接反應體系如下目的DNA 1ul質粒載體1-2ulLigation solution 5ulddH2O 2-3μl總體積 10ul反應條件16℃連接12-16小時。
6)感受態細菌的制備(CaCl2法)(1)無菌接種環蘸取-70℃凍存的細菌保種液，三線法劃線接種于LB平板，37℃培養12～16小時。
(2)挑取單個菌落接種于5ml LB培養液中，37℃搖床過夜培養。
(3)將過夜培養的BL21按1％比例轉種至10ml LB培養基中，37℃搖床培養至OD600為0.2～0.4時，取4ml菌液轉移到5ml離心管中，冰浴10分鐘，(4)5000轉離心10分鐘，棄上清。
(5)加入1mL冰預冷的0.1M CaCl2重懸沉淀，冰水浴1小時。5000轉離心10分鐘，棄上清。加入100μl冰預冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀，冰水浴1小時，備用。
7)連接產物轉化(1)取感受態菌液100μl，加入連接反應產物10μl，對照管中不加連接產物；冰水浴45分鐘，42℃水浴熱休克90秒，迅速放置冰水浴2分鐘。
(2)加100μl LB培養液，37℃搖床培養復蘇1小時。
(3)以8000g離心10分鐘，吸棄100μl上清后混勻沉淀，各取50μl涂布Amp+-LB平板，37℃孵箱培養過夜。
2、高效表達重組蛋白工程菌的構建及篩選將分別含U12，U13，U47，U15，U16基因的重組質粒pET-11c(+)轉化大腸桿菌BL21并提取質粒進行酶切鑒定。基因工程大腸桿菌BL21的感受態菌制備、轉化及重組菌的質粒抽提酶切鑒定同前。
取鑒定無誤的重組菌接種于3ml含Amp+的LB培養液中，3℃搖床培養過夜。次日，將過夜培養的重組工程菌按1％的比例轉種于20ml含Amp+的LB培養液中，3℃搖床培養2.5小時，以終濃度為1mmol/L的IPTG誘導4小時，SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達形式和表達量，篩選高效表達菌株。
誘導表達鑒定結果如圖3所示，表明基因重組菌經過誘導后，分別在分子量33KDa，22KDa，15KDa，26KDa，29KDa處有增加的蛋白表達條帶，與目的蛋白分子量大小一致。
實施例3抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6抗原識別表位的初步鑒定1、采用免疫印跡試驗鑒定6E6單克隆抗體識別的表位所在區域。
Western blot具體操作步驟如下1)SDS-PAGE電泳取已經處理的樣品重組菌pET11c-U12，pET11c-U13，pET11c-U47，pET11c-U15和pET11c-U16，以空載體工程菌pET11c和不相關蛋白為陰性對照，以純化的重組蛋白UreB為陽性對照，并設定蛋白質分子量標準，在5％濃縮膠，15％分離膠上進行垂直SDS-PAGE，先行60V電泳，待樣品跑過濃縮膠后，加壓至120V，2-3小時，直至樣品跑到分離膠底部。
2)轉膜(1)電泳結束后，在SDS電泳所用的盒中，倒入電轉液，將海綿放入浸濕后擠干水，把海綿放入夾子中，取濾紙6張浸潤，同時將NC膜也浸泡于電轉液中10分鐘。
(2)將浸潤的濾紙放置夾板的海綿上，每邊3張，用玻璃棒擠干，不留氣泡。
(3)把NC膜放在電泳后的玻片上，將膠切下，使之貼在NC膜上，然后把NC膜輕輕放在濾紙上，膠在NC膜上，擠干水，不留氣泡，做成三明治狀，所有紙的邊緣與夾板邊緣對齊。
(4)把三明治插入電轉槽中，膠朝陰，NC膜朝陽，加入電轉液至NC膜的位置。
(5)加電壓60V，電轉3小時。(電轉過程中由于電壓過高需加冰袋冰浴)3)染色轉膜結束后，取出NC膜，用配制的麗春紅染色1分鐘，至Marker條帶清晰顯現，用清水終止顯色反應，然后用鉛筆標出每一條Marker條帶，最后將NC膜置于平皿中，TTBS洗滌3次，每次5分鐘。
4)封閉0.5g BSA加入10mlTTBS中(即按5％比例)配成封閉液，將NC膜洗干凈后加入封閉液，封保鮮膜，放在搖床上，封閉1小時，然后放4℃冰箱封閉過夜。
5)免疫印跡(1)棄去封閉液，用洗滌液TTBS漂洗膜4次，每次10-15分鐘。
(2)清洗干凈后，加入以洗液1∶2000稀釋的6E6單抗腹水，3℃，150rpm，輕輕振搖反應1小時。
(3)棄去一抗，TTBS漂洗膜4次，每次10-15分鐘。
(4)清洗干凈后，加入以洗液1∶20000稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG，3℃，150rpm，輕輕振搖反應1小時。
(5)棄去酶標二抗，TTBS漂洗膜4次，每次10-15分鐘。
(6)加入DAB顯色液(10mlTTBS中加4mgDAB，5ulH2O2)，輕搖至顯色，蒸餾水漂洗終止反應。
Western blot結果見圖4，免疫印跡結果顯示抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6與陽性對照重組UreB全蛋白，基因重組工程菌pET11c-U12，pET11c-U15和pET11c-U16與發生了抗原抗體特異性結合反應，而與基因重組工程菌UreB414，pET11c-U13和pET11c-U47不發生抗原抗體特異性結合反應，與陰性對照BSA和空載體菌亦不發生特異性結合反應，說明了單克隆抗體6E6所針對的抗原表位位于UreB蛋白200-230aa內。
實施例4步移合成表位多肽以精確定位6E6單克隆抗體所針對的抗原表位1)表位肽的合成針對實施例4中所確定的6E6單抗識別表位位于UreB蛋白的200-230aa之間，采用步移合成法先后重疊5個氨基酸分4段合成表位多肽(送北京中科亞光生物有限公司合成)，分別命名為U201-215aa，U206-220aa，U211-225aa，U216-230aa，純度為85％以上，合成量為10mg，合成的具體序列如序列表中SEQ ID NO16、17、1、18所示。
2)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法確定6E6單抗表位將合成的4條表位多肽分別包被ELISA板，以檢測6E6單抗所針對的表位。具體操作步驟如下
(1)酶標板的預處理將新購酶標板用雙蒸水浸泡過夜，晾干后備用。
(2)用包被液將抗原稀釋為合適的濃度合成表位多肽為10μg/ml。
(3)包被酶標板加100μl/孔上述抗原液，4℃過夜，洗滌液洗滌5遍，空干。
(4)封閉加封閉液300μl/孔，4℃過夜，洗滌5遍，空干，密封4℃保存備用。
(5)抗體稀釋6E6單抗腹水按1∶1000倍稀釋。
(6)取包被好4條表位肽的酶標板，加入依次稀釋抗體100μl/孔，37℃水浴30分鐘，洗滌4遍，空干。
(7)加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體工作液(1∶20000稀釋)100μl/孔，37℃水浴30分鐘，洗滌4遍，空干。
(8)加底物顯色液100μl/孔，室溫避光反應5～10分鐘。
(9)加終止液2M/L H2SO450μl/孔，立即在酶標儀上以492nm波長測定OD值。
(10)結果判斷6E6抗體與4條表位肽結合反應，OD值最大的，且大于或等于陰性對照(正常小鼠血清1∶100倍稀釋)的2.1倍時視為6E6單抗所針對的抗原表位。
反應結果如圖5所示，表明單克隆抗體6E6與合成表位肽U211-225aa發生了特異性結合反應，說明單抗所對應表位為U211-225aa。
3)斑點印跡方法(Dot blot)確定6E6單抗表位(1)將合成的4條含有15個氨基酸殘基的表位多肽U201-215，U206-220，U211-225，U216-230分別以4μg的量點到NC膜上，同時以純化重組的UreB蛋白作為陽性對照，以牛血清白蛋白作為陰性對照，點樣量均為4μg；(2)將點好樣的NC膜置于室溫內風干30分鐘；(3)用含有5％BSA的封閉液于37℃條件下封閉2小時；(4)TTBS清洗膜4次，加入1∶1000稀釋的單克隆抗體6E6，37℃條件下搖床孵育1小時；(5)TTBS清洗膜4次，加入1∶10000稀釋的羊抗鼠IgG(HRP標記)，37℃條件下搖床孵育1小時；(6)TTBS清洗膜4次，加入DAB顯色液(10mlTTBS中加4mg DAB，5ul H2O2)，輕搖至顯色，蒸餾水漂洗終止反應。
反應結果如圖6所示，結果與ELISA一致，mAb 6E6與合成表位肽U211-225和UreB全蛋白發生了特異性結合反應，而與合成多肽U201-215，U211-220，U216-230不發生特異性結合反應，與陰性對照BSA亦不發生反應，說明mAb 6E6所針對的抗原表位為U211-225。
實施例5 6E6單抗所對應的表位U211-215aa與BSA的偶聯用以制備嵌合表位疫苗由于單個表位分子量較小，屬于半抗原，免疫原性較差，所以欲將其與載體蛋白BSA偶聯，從而增強其免疫原性，可以引發特異性抗原抗體反應。本實驗采用戊二醛將合成肽表位通過化學偶聯法偶聯到擔體蛋白質上。具體操作如下1)將2mg的載體蛋白BSA溶于2ml pH10的硼酸鹽緩沖液中，置于15ml的玻璃試管中，溫和振搖，然后加入2umol的合成肽表位；2)緩慢加入2ml的0.3％戊二醛溶液，于室溫下振搖，使其反應2h(溶液將變成黃色)；3)加入0.5ml的1mol/L的甘氨酸以封閉未反應的戊二醛，使其反應30min；4)將表位與BSA的偶聯物對2L硼酸緩沖液(pH8.5)在4℃透析過夜，更換硼酸緩沖液后繼續透析4h，然后分裝于EP管中，貯存于-20℃備用。
實施例6抗體拮抗試驗1)將培養的幽門螺桿菌(11637標準菌株)約104重懸于25μl培養基中；2)單克隆抗體6E6分別以5μg，10μg，15μg，20μg，25μg等劑量與10μg表位肽U211-225aa混合后，與幽門螺桿菌于37℃共孵育1小時；3)加入快速尿素酶顯色試劑，反應30分鐘后，檢測550nm處吸光值；4)同時做單克隆抗體和不相關蛋白BSA與幽門螺桿菌反應的對照；試驗結果如圖7所示，單克隆抗體6E6單獨與幽門螺桿菌共孵育時，其中和尿素酶的能力明顯高于單克隆抗體6E6與表位肽混合組，說明表位肽競爭抑制了單抗中和尿素酶的活性。
實施例7 6E6單抗表位，表位-BSA嵌合表位疫苗的免疫效應觀察1、福林(folin)-酚試劑法(也稱Lowry法)測定表位-BSA偶聯蛋白濃度1)Lowry蛋白濃度檢測試劑(由本校生化教研室提供)，2)樣品準備首先將表位-BSA偶聯蛋白樣品2倍、5倍、10倍稀釋，于試管中每管加入500μl；標準管加入標準品(牛血清白蛋白250μg/ml)500μl，空白管加雙蒸水500μl；均做復管；3)加入甲試劑(有甲試劑A與甲試劑B 50∶1的比例混合而成)每管2.5ml，混勻室溫放置10分鐘；4)加入乙試劑，每管250μl，室溫放置30分鐘；5)紫外分光光度計檢測波長650nm處的吸光度，以空白管調零。
6)結果繪制標準曲線，獲得標準曲線的回歸方程，將樣品值待入公式計算樣品，取復管的均值為最后濃度。
結果標準曲線方程Y＝0.0021X+0.0056表位-BSA偶聯蛋白濃度為0.6mg/ml。
2、動物免疫2.1分組分為三組，如下表動物分組

2.2免疫動物雌性Balb/c小鼠，8周齡。
2.3免疫程序首次采用抗原加完全福氏佐劑(CFA)免疫，然后于第2、4周采用相同抗原加不完全福氏佐劑(IFA)加強免疫，于免疫3次后第七天取小鼠的血液上清檢測特異性抗體效價的改變。
3、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測抗體的產生采用合成表位肽包被ELISA板檢測表位疫苗免疫的血清中的抗體。步驟如下1)酶標板的預處理將新購酶標板用雙蒸水浸泡過夜，晾干后備用。
2)用包被液將抗原稀釋為合適的濃度合成表位肽包被濃度為10μg/ml。
3)包被酶標板加100μl孔上述抗原液，4℃過夜，洗滌液洗滌5遍，空干。
4)封閉加封閉液300μl/孔，4℃過夜，洗滌5遍，空干，密封4℃保存備用。
5)采血及稀釋小鼠眼眶取血，離心取上清用抗體稀釋液按1∶100，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，1∶32000，1∶64000，1∶128000梯度進行被比稀釋。
6)取包被好的酶標板，加入依次稀釋血清100μl/孔，37℃水浴30分鐘，洗滌4遍，空干。
7)加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體工作液(1∶20000稀釋)100μl/孔，37℃水浴30分鐘，洗滌4遍，空干。
8)加底物顯色液100μl/孔，室溫避光反應5～10分鐘。
9)加終止液50μl/孔，立即在酶標儀上以492nm波長測定OD值10)結果判斷OD值大于或等于陰性對照(小鼠免疫前血清1∶100倍稀釋)的2.1倍時視為抗體陽性。
結果如圖8所示，表位-BSA嵌合表位疫苗免疫組的血清能夠與表位合成肽反應，而單表位免疫對照組和PBS對照組基本不與表位合成肽反應。說明本發明構建的嵌合表位疫苗誘導小鼠產生的抗體能夠特異性識別表位合成肽蛋白，并且本發明也證實了牛血清白蛋白是一個很好的載體蛋白，能夠增強表位的免疫原性誘導產生針對表位的特異性抗體。
4、抗血清與不同天然Hp菌株尿素酶B亞單位蛋白的Western blot分析1)幽門螺桿菌國際標準菌株NCTC11637、SS1、26695來源于中國生物制品檢定所，Hp9806來源于中國CDC臨床分離株。
2)在補充有50g/L去纖維蛋白牛血的腦心滴注瓊脂培養基上分步劃線培養不同幽門螺桿菌菌株，平板在微需氧環境中37℃培養2-3d，得到典型菌落。用L棒刮下菌落，懸浮在PBS中。10000×g 4℃離心10分鐘，收集細胞，再懸浮于PBS中重復3次，洗滌細胞，以此獲得幽門螺桿菌細胞懸液。
3)將幽門螺桿菌細胞懸液處理后，行SDS-PAGE電泳，轉膜，然后與表位疫苗免疫小鼠后抗血清進行免疫印跡分析，以純化的重組UreB全蛋白作為陽性對照，同時以大腸桿菌DH5α作為陰性對照，抗血清按1∶200倍稀釋。(具體操作步驟同實施例3)結果如圖9所示，抗血清與重組ureB蛋白發生了陽性反應，并且與4株天然Hp菌株的UreB蛋白發生了特異性抗原抗體反應，而與大腸桿菌DH5α未見陽性反應發生，說明由表位疫苗免疫BALB/c小鼠制備的抗血清能夠識別天然的UreB蛋白，并且與標準菌株、人分離株和動物分離株均發生反應，進一步說明我們制備的表位疫苗是一個有效的疫苗，能夠引發特異性體液免疫應答，同時也說明本發明中鑒定的表位肽是一個優勢抗原表位，可作為疫苗的候選分子。
5、抗血清的中和尿素酶活性試驗1)以幽門螺桿菌國際標準菌株NCTC11637作為反應菌株。
2)菌株的培養同上述試驗操作。
3)將培養的幽門螺桿菌以220V超聲破碎30，間隔30秒，以此獲得含有尿素酶的細胞碎片。
4)將含有尿素酶的細胞碎片(50ul)與抗血清(50ul)在96孔板4℃反應過夜。次日加入含有500mmol/L尿素和0.2g/L酚紅的50mmol/L(pH6.8)的磷酸鹽緩沖液100ul/孔。23℃共孵育4小時后，以分光光度計550nm比色，顏色變化率以曲線的線性分布來表示。試驗結果如圖10所示，與對照組相比，抗血清對尿素酶有顯著的抑制作用。
實施例8臨床感染幽門螺桿菌(Hp)標本的檢測為了證實本發明的Hp中和性抗原表位在幽門螺桿菌感染中的作用，發明人收集江蘇省贛榆地區的57份幽門螺桿菌感染病人血清和10份正常人血清，將表位肽包被ELISA板，檢測臨床感染HP血清中是否有針對此表位的特異性抗體。具體操作如下1)將合成表位U211-225aa，重組UreB純化蛋白，表位與BSA偶聯蛋白分別包被96孔板，包被濃度分別為5μg/ml，10μg/ml，10μg/ml，4℃過夜；2)封閉加1％BSA封閉液300μl/孔，4℃過夜，洗滌5遍，空干，密封4℃保存備用。
3)抗體稀釋幽門螺桿菌感染的57份人抗血清，10份正常人血清作為陰性對照，標準的人感染HP血清作為陽性對照，分別按照1∶100稀釋。
4)取包被好6條抗原的酶標板，依次加入稀釋的抗血清100μl/孔，37℃水浴30分鐘，洗滌4遍，空干。
5)加辣根過氧化物酶標記的小鼠抗人IgG抗體工作液(1∶20000稀釋)100μl/孔，37℃水浴30分鐘，洗滌4遍，空干。
6)加底物顯色液100μl/孔，室溫避光反應5～10分鐘。
7)加終止液2M/L H2SO450μl/孔，立即在酶標儀上以492nm波長測定OD值。
8)結果判斷HP感染人抗血清與表位U211-225aa，重組UreB純化蛋白，表位-BSA嵌合表位疫苗的結合反應，OD值最大的，且大于或等于陰性對照(正常人血清1∶100倍稀釋)的2.1倍時視為抗原抗體反應陽性。
反應結果如圖11所示，重組UreB蛋白與57份幽門螺桿菌感染患者血清均發生了陽性反應，表位肽U211-225aa和表位-BSA嵌合表位疫苗與37份幽門螺桿菌感染患者血清均發生了陽性反應，而表位U211-225aa，重組UreB純化蛋白和表位-BSA嵌合表位疫苗與10份正常人血清均不發生反應(數據未示出)，說明本發明的表位肽在幽門螺桿菌致病中發揮著重要作用，是幽門螺桿菌的一個優勢表位，為多價表位疫苗和診斷試劑的研制奠定了基礎。
根據以上試驗可證明，本發明利用分段截短法構建分段抗原以及表位作圖確定了單抗所針對的抗原表位。本發明確定的B細胞表位能夠競爭抑制單克隆抗體6E6中和幽門螺桿菌尿素酶的活性。本發明中的嵌合表位疫苗利用本發明的B細胞表位多肽與載體蛋白BSA偶聯，經動物實驗驗證具有良好免疫原性，能夠誘導機體的特異性體液免疫應答，并且產生的抗血清能夠部分中和尿素酶的活性以及能夠和不同天然幽門螺桿菌菌株的尿素酶發生反應，表明本發明的表位疫苗的構建策略是成功的。
本發明的嵌合表位疫苗是本發明的表位多肽在疫苗研制中的一種應用的實施舉例，而不是本發明表位多肽在疫苗研制領域應用的限制，其他利用本發明表位多肽的氨基酸序列或DNA序列或不同于本發明中表位多肽對應的DNA序列，但是由于遺傳密碼的兼并性，編碼的氨基酸序列與本發明表位多肽的氨基酸序列相同的核苷酸序列的疫苗也屬于本發明的保護范圍；本發明的表位多肽具有抗HP感染的作用，用來研制預防性或治療性多肽藥物或免疫制劑。
此外，這里提供的實施方案應看作是舉例說明而非限制性的，在閱讀了本發明的上述內容之后，本領域技術人員在不違反前面充分闡述的本發明的實質或范圍條件下，可對本發明的實施方案做各種改動或修飾多肽，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表SEQ ID NO1<110>中國人民解放軍第三軍醫大學<120>幽門螺桿菌尿素酶B亞單位B細胞抗原表位多肽及其鑒定方法與應用<130>
<160>23<210>1<211>15<212>PRT<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)<220>
<230>源自幽門螺桿菌尿素酶B亞單位的表位多肽<400>1Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp Gly15 10 15SEQ ID NO2<210>2<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>根據大腸桿菌的優勢密碼子合成的編碼表位肽的核苷酸序列<400>2ATT GAA GCC GGT GCG ATT GGT TTT AAA ATC CAC GAA GAC TGG GGAIle Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp Gly15 10 15SEQ ID NO3<210>3<213>抗幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6<310>CN1687134<311>2005.04.25<312>2005.10.26SEQ ID NO4<210>4<211>900
<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原U12基因人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(900)<400>4ATGAAAAAGA TTAGCAGAAA AGAATATGTT TCTATGTATG GCCCTACTAC AGGCGATAAA 60GTGAGATTGG GCGATACAGA TTTGATCGCT GAAGTAGAAC ATGACTACAC CATTTATGGC 120GAAGAGCTAA AATTTGGTGG CGGTAAAACT TTAAGAGAAG GCATGAGCCA ATCCAACAAC 180CCCAGCAAAG AAGAACTGGA TTTAATCATC ACTAACGCTT TAATCGTGGA TTACACCGGT 240ATTTATAAAG CGGATATTGG TATTAAAGAT GGCAAAATCG CTGGCATTGG CAAAGGCGGT 300AACAAAGACA TGCAAGATGG CGTTAAAAAC AATCTTAGCG TGGGTCCTGC TACTGAAGCC 360TTAGCTGGTG AAGGTTTGAT CGTAACTGCT GGCGGTATTG ACACACACAT CCACTTCATC 420TCCCCCCAAC AAATCCCTAC AGCTTTTGCA AGCGGTGTAA CAACTATGAT TGGTGGCGGA 480ACTGGCCCTG CTGATGGCAC TAACGCAACC ACTATCACTC CAGGCAGAAG AAATTTAAAA 540TGGATGCTCA GAGCGGCTGA AGAATATTCT ATGAACTTAG GTTTCTTAGC TAAAGGTAAC 600ACTTCTAACG ATGCGAGCTT AGCCGATCAA ATTGAAGCCG GTGCGATTGG TTTTAAAATC 660CACGAAGACT GGGGAACAAC TCCTTCTGCA ATCAACCATG CGTTAGATGT TGCGGACAAA 720TACGATGTGC AAGTCGCTAT CCACACAGAC ACTCTGAATG AAGCCGGTTG TGTAGAAGAC 780ACTATGGCAG CCATTGCCGG ACGCACTATG CACACTTTCC ACACTGAAGG TGCTGGTGGT 840GGACACGCTC CTGATATTAT TAAAGTGGCC GGCGAACACA ACATTCTGCC CGCTTCCTAG 900SEQ ID NO44<210>44<211>300<212>PRT<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原U12氨基酸序列<220>
<221>INIT_MET<212>(1)...(299)<400>44MetLysLysIleSer ArgLysGluTyrVal SerMetTyrGlyPro 15ThrThrGlyAspLys ValArgLeuGlyAsp ThrAspLeuIleAla 30GluValGluHisAsp TyrThrIleTyrGly GluGluLeuLysPhe 45GlyGlyGlyLysThr LeuArgGluGlyMet SerGlnSerAsnAsn 60ProSerLysGluGlu LeuAspLeuIleIle ThrAsnAlaLeuIle 75ValAspTyrThrGly IleTyrLysAlaAsp IleGlyIleLysAsp 90GlyLysIleAlaGly IleGlyLysGlyGly AsnLysAspMetGln 105AspGlyValLysAsn AsnLeuSerValGly ProAlaThrGluAla 120LeuAlaGlyGluGly LeuIleValThrAla GlyGlyIleAspThr 135HisIleHisPheIle SerProGlnGlnIle ProThrAlaPheAla 150SerGlyValThrThr MetIleGlyGlyGly ThrGlyProAlaAsp 165
GlyThrAsnAlaThr ThrIleThrProGly ArgArgAsnLeuLys 180TrpMetLeuArgAla AlaGluGluTyrSer MetAsnLeuGlyPhe 195LeuAlaLysGlyAsn ThrSerAsnAspAla SerLeuAlaAspGln 210IleGluAlaGlyAla IleGlyPheLysIle HisGluAspTrpGly 225ThrThrProSerAla IleAsnHisAlaLeu AspValAlaAspLys 240TyrAspValGlnVal AlaIleHisThrAsp ThrLeuAsnGluAla 255GlyCysValGluAsp ThrMetAlaAlaIle AlaGlyArgThrMet 270HisThrPheHisThr GluGlyAlaGlyGly GlyHisAlaProAsp 285IleIleLysValAla GlyGluHisAsnIle LeuProAlaSer 299SEQ ID NO5<210>5<211>600<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原U13基因人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(600)<400>5ATGAAAAAGA TTAGCAGAAA AGAATATGTT TCTATGTATG GCCCTACTAC AGGCGATAAA 60GTGAGATTGG GCGATACAGA TTTGATCGCT GAAGTAGAAC ATGACTACAC CATTTATGGC 120GAAGAGCTAA AATTTGGTGG CGGTAAAACT TTAAGAGAAG GCATGAGCCA ATCCAACAAC 180CCCAGCAAAG AAGAACTGGA TTTAATCATC ACTAACGCTT TAATCGTGGA TTACACCGGT 240ATTTATAAAG CGGATATTGG TATTAAAGAT GGCAAAATCG CTGGCATTGG CAAAGGCGGT 300AACAAAGACA TGCAAGATGG CGTTAAAAAC AATCTTAGCG TGGGTCCTGC TACTGAAGCC 360TTAGCTGGTG AAGGTTTGAT CGTAACTGCT GGCGGTATTG ACACACACAT CCACTTCATC 420TCCCCCCAAC AAATCCCTAC AGCTTTTGCA AGCGGTGTAA CAACTATGAT TGGTGGCGGA 480ACTGGCCCTG CTGATGGCAC TAACGCAACC ACTATCACTC CAGGCAGAAG AAATTTAAAA 540TGGATGCTCA GAGCGGCTGA AGAATATTCT ATGAACTTAG GTTTCTTAGC TAAAGGTTAG 600SEQ ID NO55<210>55<211>200<212>PRT<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原U13氨基酸序列<220>
<221>INIT_MET<212>(1)...(199)<400>55MetLysLysIleSer ArgLysGluTyrVal SerMetTyrGlyPro 15ThrThrGlyAspLys ValArgLeuGlyAsp ThrAspLeuIleAla 30GluValGluHisAsp TyrThrIleTyrGly GluGluLeuLysPhe 45
GlyGlyGlyLysThr LeuArgGluGlyMet SerGlnSerAsnAsn 60ProSerLysGluGlu LeuAspLeuIleIle ThrAsnAlaLeuIle 75ValAspTyrThrGly IleTyrLysAlaAsp IleGlyIleLysAsp 90GlyLysIleAlaGly IleGlyLysGlyGly AsnLysAspMetGln 105AspGlyValLysAsn AsnLeuSerValGly ProAlaThrGluAla 120LeuAlaGlyGluGly LeuIleValThrAla GlyGlyIleAspThr 135HisIleHisPheIle SerProGlnGlnIle ProThrAlaPheAla 150SerGlyValThrThr MetIleGlyGlyGly ThrGlyProAlaAsp 165GlyThrAsnAlaThr ThrIleThrProGly ArgArgAsnLeuLys 180TrpMetLeuArgAla AlaGluGluTyrSer MetAsnLeuGlyPhe 195LeuAlaLysGly 199SEQ ID NO6<210>6<211>420<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原U13基因人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(420)<400>6ATGACTCTGA ATGAAGCCGG TTGTGTAGAA GACACTATGG CAGCCATTGC CGGACGCACT 60ATGCACACTT TCCACACTGA AGGTGCTGGT GGTGGACACG CTCCTGATAT TATTAAAGTG 120GCCGGCGAAC ACAACATTCT GCCCGCTTCC ACTAACCCCA CTATCCCTTT CACCGTGAAT 180ACAGAAGCAG AACACATGGA CATGCTTATG GTGTGCCACC ACTTGGATAA AAGCATTAAA 240GAAGATGTTC AGTTCGTTGA TTCAAGGATC CGCCCTCAAA CCATTGCGGC TGAAGACACT 300TTGCATGACG TGGGGATTTT CTCAATCACC AGTTCTGACT CTCAAGCTAT GGGTCGTGTG 360GGTGAAGTTA TCACCAGAAC TTGGCAAACA GCTGACAAAA ACAAAAAAGA ATTTGGCTAG 420SEQ ID NO66<210>66<211>140<212>PRT<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原U13氨基酸序列<220>
<221>INIT_MET<212>(1)...(139)MetThrLeuAsnGlu AlaGlyCysValGlu AspThrMetAlaAla 15IleAlaGlyArgThr MetHisThrPheHis ThrGluGlyAlaGly 30GlyGlyHisAlaPro AspIleIleLysVal AlaGlyGluHisAsn 45IleLeuProAlaSer ThrAsnProThrIle ProPheThrValAsn 60ThrGluAlaGluHis MetAspMetLeuMet ValCysHisHisLeu 75
AspLysSerIleLys GluAspValGlnPhe ValAspSerArgIle 90ArgProGlnThrIle AlaAlaGluAspThr LeuHisAspValGly 105IlePheSerIleThr SerSerAspSerGln AlaMetGlyArgVal 120GlyGluValIleThr ArgThrTrpGlnThr AlaAspLysAsnLys 135LysGluPheGly 139SEQ ID NO7<210>7<211>690<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原U15基因人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(690)<400>7ATGAAAAAGA TTAGCAGAAA AGAATATGTT TCTATGTATG GCCCTACTAC AGGCGATAAA 60GTGAGATTGG GCGATACAGA TTTGATCGCT GAAGTAGAAC ATGACTACAC CATTTATGGC 120GAAGAGCTAA AATTTGGTGG CGGTAAAACT TTAAGAGAAG GCATGAGCCA ATCCAACAAC 180CCCAGCAAAG AAGAACTGGA TTTAATCATC ACTAACGCTT TAATCGTGGA TTACACCGGT 240ATTTATAAAG CGGATATTGG TATTAAAGAT GGCAAAATCG CTGGCATTGG CAAAGGCGGT 300AACAAAGACA TGCAAGATGG CGTTAAAAAC AATCTTAGCG TGGGTCCTGC TACTGAAGCC 360TTAGCTGGTG AAGGTTTGAT CGTAACTGCT GGCGGTATTG ACACACACAT CCACTTCATC 420TCCCCCCAAC AAATCCCTAC AGCTTTTGCA AGCGGTGTAA CAACTATGAT TGGTGGCGGA 480ACTGGCCCTG CTGATGGCAC TAACGCAACC ACTATCACTC CAGGCAGAAG AAATTTAAAA 540TGGATGCTCA GAGCGGCTGA AGAATATTCT ATGAACTTAG GTTTCTTAGC TAAAGGTAAC 600ACTTCTAACG ATGCGAGCTT AGCCGATCAA ATTGAAGCCG GTGCGATTGG TTTTAAAATC 660CACGAAGACT GGGGAACAAC TCCTTCTTAG 690SEQ ID NO77<210>77<211>230<212>PRT<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pyli)尿素酶B亞單位截短抗原U15氨基酸序列<220>
<221>INIT_MET<212>(1)...(229)<400>77MetLysLysIleSer ArgLysGluTyrVal SerMetTyrGlyPro 15ThrThrGlyAspLys ValArgLeuGlyAsp ThrAspLeuIleAla 30GluValGluHisAsp TyrThrIleTyrGly GluGluLeuLysPhe 45GlyGlyGlyLysThr LeuArgGluGlyMet SerGlnSerAsnAsn 60ProSerLysGluGlu LeuAspLeuIleIle ThrAsnAlaLeuIle 75
ValAspTyrThrGly IleTyrLysAlaAsp IleGlyIleLysAsp 90GlyLysIleAlaGly IleGlyLysGlyGly AsnLysAspMetGln 105AspGlyValLysAsn AsnLeuSerValGly ProAlaThrGluAla 120LeuAlaGlyGluGly LeuIleValThrAla GlyGlyIleAspThr 135HisIleHisPheIle SerProGlnGlnIle ProThrAlaPheAla 150SerGlyValThrThr MetIleGlyGlyGly ThrGlyProAlaAsp 165GlyThrAsnAlaThr ThrIleThrProGly ArgArgAsnLeuLys 180TrpMetLeuArgAla AlaGluGluTyrSer MetAsnLeuGlyPhe 195LeuAlaLysGlyAsn ThrSerAsnAspAla SerLeuAlaAspGln 210IleGluAlaGlyAla IleGlyPheLysIle HisGluAspTrpGly 225ThrThrProSer 229SEQ ID NO8<210>8<211>780<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原U16基因人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(780)<400>8ATGAAAAAGA TTAGCAGAAA AGAATATGTT TCTATGTATG GCCCTACTAC AGGCGATAAA 60GTGAGATTGG GCGATACAGA TTTGATCGCT GAAGTAGAAC ATGACTACAC CATTTATGGC 120GAAGAGCTAA AATTTGGTGG CGGTAAAACT TTAAGAGAAG GCATGAGCCA ATCCAACAAC 180CCCAGCAAAG AAGAACTGGA TTTAATCATC ACTAACGCTT TAATCGTGGA TTACACCGGT 240ATTTATAAAG CGGATATTGG TATTAAAGAT GGCAAAATCG CTGGCATTGG CAAAGGCGGT 300AACAAAGACA TGCAAGATGG CGTTAAAAAC AATCTTAGCG TGGGTCCTGC TACTGAAGCC 360TTAGCTGGTG AAGGTTTGAT CGTAACTGCT GGCGGTATTG ACACACACAT CCACTTCATC 420TCCCCCCAAC AAATCCCTAC AGCTTTTGCA AGCGGTGTAA CAACTATGAT TGGTGGCGGA 480ACTGGCCCTG CTGATGGCAC TAACGCAACC ACTATCACTC CAGGCAGAAG AAATTTAAAA 540TGGATGCTCA GAGCGGCTGA AGAATATTCT ATGAACTTAG GTTTCTTAGC TAAAGGTAAC 600ACTTCTAACG ATGCGAGCTT AGCCGATCAA ATTGAAGCCG GTGCGATTGG TTTTAAAATC 660CACGAAGACT GGGGAACAAC TCCTTCTGCA ATCAACCATG CGTTAGATGT TGCGGACAAA 720TACGATGTGC AAGTCGCTAT CCACACAGAC ACTCTGAATG AAGCCGGTTG TGTAGAATAG 780SEQ ID NO88<210>88<211>260<212>PRT<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原U16氨基酸序列<220>
<221>INIT_MET
<212>(1)...(259)<400>88MetLysLysIleSer ArgLysGluTyrVal SerMetTyrGlyPro 15ThrThrGlyAspLys ValArgLeuGlyAsp ThrAspLeuIleAla 30GluValGluHisAsp TyrThrIleTyrGly GluGluLeuLysPhe 45GlyGlyGlyLysThr LeuArgGluGlyMet SerGlnSerAsnAsn 60ProSerLysGluGlu LeuAspLeuIleIle ThrAsnAlaLeuIle 75ValAspTyrThrGly IleTyrLysAlaAsp IleGlyIleLysAsp 90GlyLysIleAlaGly IleGlyLysGlyGly AsnLysAspMetGln 105AspGlyValLysAsn AsnLeuSerValGly ProAlaThrGluAla 120LeuAlaGlyGluGly LeuIleValThrAla GlyGlyIleAspThr 135HisIleHisPheIle SerProGlnGlnIle ProThrAlaPheAla 150SerGlyValThrThr MetIleGlyGlyGly ThrGlyProAlaAsp 165GlyThrAsnAlaThr ThrIleThrProGly ArgArgAsnLeuLys 180TrpMetLeuArgAla AlaGluGluTyrSer MetAsnLeuGlyPhe 195LeuAlaLysGlyAsn ThrSerAsnAspAla SerLeuAlaAspGln 210IleGluAlaGlyAla IleGlyPheLysIle HisGluAspTrpGly 225ThrThrProSerAla IleAsnHisAlaLeu AspValAlaAspLys 240TyrAspValGlnVal AlaIleHisThrAsp ThrLeuAsnGluAla 255GlyCysValGlu 259SEQ ID NO9<210>9<211>28<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原引物P1人工序列<400>9CGCCATATGA AAAAGATTAG CAGAAAAG1 10 20SEQ ID NO10<210>10<211>27<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原引物P2人工序列<400>10CGCGGATCCC TAGGAAGCGG GCAGAAT1 10 20SEQ ID NO11<210>11<211>30
<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原引物P3人工序列<400>11GGCGGATCCC TAACCTTTAG CTAAGAAACC1 10 20 30SEQ ID NO12<210>12<211>24<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原引物P4人工序列<400>12CATATGACAC TTTGAATGAA GCCG110 20SEQ ID NO13<210>13<211>27<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原引物P5人工序列<400>13GCCGGATCCC TATGCAGAAG GAGTTGT11020SEQ ID NO14<210>14<211>27<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原引物P6人工序列<400>14CGCGGATCCC TAGTCTTCTA CACAACC1 10 20SEQ ID NO15<210>15<211>29<212>DNA<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亞單位截短抗原引物P7人工序列<400>15GGATCCAAAT TCTTTTTTGT TTTTGTCAG
1 10 20SEQ ID NO16<210>16<211>15<212>PRT<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)<220>
<230>源自幽門螺桿菌尿素酶B亞單位的多肽<400>16Thr Ser Asn Asp Ala Ser Leu Ala Asp Glu Ile Glu Ala Gly Ala1 5 10 15SEQ ID NO17<210>17<211>15<212>PRT<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)<220>
<230>源自幽門螺桿菌尿素酶B亞單位的多肽<400>17Ser Leu Ala Asp Glu Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile15 10 15SEQ ID NO18<210>18<211>15<212>PRT<213>幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)<220>
<230>源自幽門螺桿菌尿素酶B亞單位的多肽<400>18Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp Gly Thr Thr Pro Ser Ala15 10 1權利要求
1.一種幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)中和性B細胞抗原表位多肽，其特征在于具有下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO1的氨基酸殘基；2)將序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基經過一個或數個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有誘導產生幽門螺桿菌尿素酶B亞單位抗原特異性的細胞或體液免疫應答作用的多肽。
2.根據權利要求1所述的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位中和性B細胞抗原表位多肽，其特征在于所述B細胞抗原表位多肽具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列。
3.根據權利要求1所述的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位中和性B細胞抗原表位多肽，其特征在于所述B細胞抗原表位多肽是由抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6所識別。
4.一種鑒定權利要求1所述的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位B細胞抗原表位多肽的方法，主要包括以下步驟(1)將通過生物信息學軟件分析的Hp的UreB抗原采用截短法分段構建，將重組表達載體導入宿主細胞進行誘導表達，通過免疫印跡分析，確定單抗6E6所針對的表位范圍；(2)根據上述步驟(1)所確定的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6所針對的抗原表位所在范圍，步移合成表位肽。(3)根據上述步驟(2)得到的表位肽，通過表位作圖方法，確定幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6所對應的表位肽。
5.根據權利要求4所述的鑒定幽門螺桿菌尿素酶B亞單位B細胞抗原表位多肽的方法，其特征在于UreB抗原截短后的抗原具有序列表中SEQ ID NO4、5、6、7、8的核甘酸序列或具有與序列表中SEQ ID NO4、5、6、7、8具有相同編碼產物的核苷酸序列。
6.根據權利要求4所述的鑒定幽門螺桿菌尿素酶B亞單位B細胞抗原表位多肽的方法，其特征在于，上述步驟(2)得到的表位肽，涵蓋了6E6單抗識別的表位范圍，相互重疊5個氨基酸殘基，合成的每條表位肽包含15個氨基酸。
7.一種嵌合表位疫苗，其特征在于其活性成分為權利要求1或2所述的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位的B細胞抗原表位多肽。
8.根據權利要求7所述的嵌合表位疫苗，其特征在于其活性成分為權利要求2所述的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位B細胞抗原表位多肽。
9.一種嵌合表位疫苗的構建方法，其特征在于將權利要求2所述的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位B細胞抗原表位多肽與載體蛋白進行化學偶聯。
10.一種用于預防或治療幽門螺桿菌感染的藥物，其特征在于其活性成分為權利要求1或2所述的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位B細胞抗原表位多肽。
全文摘要
本發明提供了一個來自幽門螺桿菌尿素酶B亞單位的中和性B細胞抗原表位多肽及其鑒定方法，確定了抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位單克隆抗體6E6所對應的抗原表位，并且證實此B細胞表位為單克隆抗體6E6所識別的特異性抗原表位；本發明還提供了包含此B細胞表位及載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)的嵌合表位疫苗及其制備方法，此B細胞表位具有較強的抗原性。本發明的B細胞表位作為活性成分制成的疫苗或藥物，可以起到預防或清除幽門螺桿菌感染的作用，在醫藥領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號G01N33/573GK101033468SQ20071007817
公開日2007年9月12日 申請日期2007年2月5日 優先權日2007年2月5日
發明者毛旭虎, 鄒全明, 李海俠, 吳亞男, 石云, 羅萍, 張衛軍, 余抒, 陳洪章, 郭剛, 童文德, 吳超, 周維英, 魯東水, 劉開云 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學