一種檢測禽流感病毒抗原的裝置及檢測方法

專利名稱：一種檢測禽流感病毒抗原的裝置及檢測方法
技術領域：
本發明涉及禽流感病毒抗原快速檢測技術領域，特別是基于抗原抗體反應 檢測禽流感病毒抗原的電化學傳感器及檢測方法。
背景技術：
禽流感病毒(Avian Influenza virus, AIV)是源于禽類，能在極短的時間 內造成大量禽畜死亡，并可致人類死亡的烈性傳染病毒。近幾年來，很多國家 和地區相繼爆發了高致病性禽流感，不但給相關產業造成巨大的經濟損失，也 嚴重威脅到人類健康與安全。禽流感快速檢測是疫病診斷，早期監控，防止疫情擴散，保證食品安全的 最關鍵措施之一。目前，禽流感病毒檢測主要有以下方法瓊脂凝膠擴散試驗(AGP)，免疫熒 光技術(IFTr)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA),酶免疫測定(EIA)技術，PCR及RT-PCR 技術，核酸探針技術，RT-PCR-ELISA技術，熒光RT-PCR技術。瓊脂免疫擴散試驗方法取材方便，操作簡單，但檢測時間長，敏感度低； 免疫熒光技術和ELISA都需要特殊的儀器設備，檢測過程復雜、費用高、檢測時 間長，并且易出現假陽性；PCR檢測過程復雜、時間長，對操作人員專業技術要 求較高、所使用的試劑對人體和環境均有較大的危害。因此，建立一種靈敏、快速、特異性高且經濟的檢測禽流感病毒抗原的技 術成為疫情診斷、早期監控的迫切需要。在病毒檢測領域中，免疫傳感器因其快速、簡便、靈敏受到越來越廣泛的 應用。免疫傳感器是在傳感界面固定抗原或抗體，通過測量由抗原、抗體特異 性結合引起的物理、化學信號的變化，對樣品中抗原或抗體進行定性或定量判定。抗原-抗體結合前后可導致多種信號的改變，如重量、光學、熱學、電化學 等。電化學分析具有能現場檢測，不受樣品顏色、濁度的影響，樣品可以不經 處理，無需分離，所用儀器設備相對簡單等優點，使得電化學免疫傳感檢測成 為一種使用較為廣泛的檢測方法。發明內容本發明的目的在于提供一種靈敏、快速、特異性高且經濟的檢測禽流感病 毒抗原的裝置及檢測方法。本發明的裝置是基于抗原抗體反應檢測禽流感病毒抗原的電化學檢測裝 置，具有靈敏、快速、特異性高等優點，并且價格低，適用于基層或現場檢測 禽流感病毒。本發明的上述目的通過以下技術方案實現一種檢測禽流感病毒抗原的裝置，包括免疫傳感器、電解池和數據采集與 處理系統；免疫傳感器包括印刷在絕緣基板上的工作電極、參比電極和輔助電 極所構成的電極系統；電解池包括檢測底液、攪拌器和溫控器；數據采集與處 理系統包括電化學工作站、計算機和軟件系統；免疫傳感器通過導線與電化學 工作站相連，其特征在于免疫傳感器的工作電極為碳電極，其上涂布有包埋酶 標禽流感抗體的感應膜。本發明裝置的免疫傳感器中，電極系統通過絲網印刷方法印在絕緣基板上， 輔助電極為石墨電極，參比電極為Ag/AgCl電極，工作電極以碳電極為支持電 極，其上修飾有包埋酶標禽流感抗體的感應膜。工作電極可以是多個，能同時
檢測多份樣品。酶標禽流感抗體可以是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氧酶、葡萄 糖氧化酶、青霉素酰化酶或尿素水解酶標記的H5N1型禽流感抗體或其它禽流感抗體；包埋酶標禽流感抗體的膜材料可以是殼聚糖、醋酸纖維素、PVB、 Nafion、 明膠或瓊脂糖的一種或它們的混合物。本發明還包括一種檢測禽流感病毒抗原的方法，包括以下步驟1) 待測樣本滴于本發明裝置的免疫傳感器工作電極表面，2(TC孵育10分 鐘；2) 免疫傳感器置于電解池中，電解池的檢測底液為含有0.4 mmol/LH202 的1 mmol/L硫堇(Thionine，俗稱勞氏紫)醋酸鹽緩沖液，PH值為6.5;3) 設定適宜的掃描參數，對工作電極施加電壓，檢測輔助電極與工作電 極間的電流值；4) 測定獲得的電流信息輸入數據采集與處理系統；5) 信息處理結果輸出。檢測樣本可以是死禽樣本或活禽樣本。死禽樣本一般采集腸內容物或泄殖 腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及內臟組織(氣管、肺、氣囊、腸、脾臟、腎、 腦、肝臟和心臟等)；活禽樣本可采集氣管拭子、泄殖腔拭子。由于采集棉拭子 時幼禽容易受傷，所以還可取糞便。對于泄殖腔拭子和糞便，用過濾器過濾除菌，上清液作為樣本。內臟樣本 應無菌取樣。
本發明中檢測方法原理在電化學反應體系中，酶催化底物H202生成相應 的酶促反應物H20，酶由還原態變為氧化態；此時氧化態的酶催化電子媒介體 硫堇由還原態變為氧化態，而酶自身則由氧化態變為還原態；氧化態的電子媒 介體在電極表面得到電子后又變為還原態，同時產生響應電流。采用常用的循環伏安法(Cyclic voltammetry， CV)作為免疫傳感器表征和定 性判定的方法。當被檢測物中含有禽流感病毒抗原時，抗原與包埋在工作電極 上的酶標禽流感病毒抗體發生反應，生成抗原抗體復合物；當免疫傳感器放置 于電解池中時，抗原抗體復合物在空間上阻礙了硫堇向酶的活性中心靠近，導 致酶的催化能力下降，使響應曲線中還原峰電流較免疫反應前顯著降低。根據 響應曲線峰值的變化即可判斷待測物是否含有禽流感病毒抗原。本發明中檢測禽流感病毒抗原的免疫傳感器，將免疫技術與電化學檢測 相結合，是一種電流型的酶免疫傳感器。它將酶的化學放大功能與免疫傳感器 的特異性相結合，融合二者的優點，使其同時具備免疫反應的特異性和電化學 分析的靈敏性，能準確地進行低含量物質的檢測。本發明的檢測方法是一種新的快速檢測禽流感病毒的方法，具有靈敏、快 速、特異性高等優點，并且價格低，適用于基層或現場檢測禽流感病毒。為進一步說明本發明的特點和效果，以下結合附圖對本發明作進一步描述。


圖1是本發明裝置的免疫傳感器一種實施方式的正面示意圖；圖2是本發明裝置的免疫傳感器在不同溶液中的電流響應曲線；其中，1——橡膠樹脂板；2——工作電極；3——一輔助電極；4--一參比電極
具體實施方式
實施例l:本發明檢測禽流感病毒抗原的裝置，由免疫傳感器、電解池和數 據采集與處理系統組成。免疫傳感器包括工作電極2、參比電極4和輔助電極3，各電極采用絲網印 刷方法印在橡膠樹脂板1上，輔助電極3為石墨電極，參比電極4為Ag/AgCl 電極，工作電極2以碳電極為支持電極，其上涂布有包埋標記辣根過氧化物酶 的抗H5N1型禽流感病毒抗體(HRP-anti-AIV)的殼聚糖感應膜。電解池包括檢測底液、攪拌器和溫控器，檢測底液為含有0.4 mmol/LH202 的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為6,5。數據采集與處理系統包括電化學工作站、計算機和軟件系統。免疫傳感器通過導線與電化學工作站相連，電化學工作站將電流信號傳送 至計算機。免疫傳感器的制備1) 采用絲網印刷在橡膠樹脂板1上印刷出如圖1所示的參比電極4、輔 助電極3和工作電極2的支持電極。輔助電極為石墨電極，參比電極為Ag/AgCl 電極，工作電極的支持電極為碳電極。工作電極為4個，兩邊對稱排列；2) 將1%殼聚糖凝膠與標記辣根過氧化物酶的抗H5N1型禽流感病毒抗體溶液等體積充分混合；混合液4 'C放置12小時；取3pL混合液滴涂于工作 電極2表面，并于室溫下放置5 6小時，使之干燥成膜；3) 將干燥后的傳感器浸泡于4 'C下的PBS溶液，用二次蒸餾水沖洗傳感器表面，除去物理吸附的多余抗體;制得的傳感器于PBS溶液(O.Ol mol/LpH 7.4)中在4。C下保存備用。
實施例2:檢測禽流感病毒抗原的方法1) 樣本采集和處理無菌條件下取死禽肝臟，放入滅菌的玻璃研磨器，用PBS配成100 g/L的懸液，加入1/10體積的抗生素，將處理過的樣本移至離心管內，3 000r/min離 心10分鐘，取上清液作為樣本。檢測前將樣品用0.3 0.5%福爾馬林滅活。采集或處理的樣本在2"C 8i:條件下保存應不超過24 h;如果需長期保 存，需放置-7(TC條件，但應避免反復凍融(最多凍融3次)。2) 將實施例1中所述的免疫傳感器放入電解池，電解池的檢測底液為含有 0.4mmol/LH202的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為6.5。3) 設定掃描速率為O.l V/s，對工作電極施加電壓，測得輔助電極與工作電 極間的電流值Ipl。4) 將待測樣本滴于本發明免疫傳感器的工作電極2表面，2(TC下孵育 10分鐘，使樣本中的抗原與免疫傳感器工作電極2表面的抗體產生免疫反應。5) 將免疫傳感器放入電解池，電解池的檢測底液為含有0.4 mmol/L H202 的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為6.5。6) 設定掃描速率為0.1 V/s，對工作電極施加電壓，檢測輔助電極和工作電 極間的電流值Ip2。6) 將上述測定獲得的電流信息輸入數據采集與處理系統；采用常用 的循環伏安法作為免疫傳感器表征和定性判定的方法。7) 處理信息結果輸出。為了更好的說明檢測結果，樣品檢測前，先將同一免疫傳感器分別于0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液，1.0 mmol/L硫堇+ 0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液，0.4 mmol/L H202 + 1.0 mmol/L硫堇+ 0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液中檢測響應 電流，以比較免疫傳感器在不同溶液中產生的響應電流變化。如圖2所示，為本發明裝置的免疫傳感器在不同溶液中的電流響應曲線圖。其中曲線a為免疫傳感器在0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液中的電流響應曲 線；可以看出免疫傳感器無明顯的電流響應，只顯示出一個較小的背景電流；曲線b為免疫傳感器在1.0 mmol/L硫堇+ 0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液中 的電流響應曲線；免疫傳感器出現一對穩定的硫堇氧化還原峰。曲線c為免疫傳感器在0.4 mmol/L H202 + 1.0 mmol/L硫堇+ 0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液中的電流響應曲線；當醋酸硫堇溶液中加入底物^02后，免 疫傳感器還原峰電流顯著增大，氧化峰電流明顯減小，且還原峰電位略微負移。曲線d為免疫傳感器與檢測樣本反應后在0.4 mmol/L H202 + 1.0 mmol/L硫 堇+ 0.1 mol/L pH 6.5醋酸緩沖溶液中的電流響應曲線。涂布有包埋HRP-anti-AIV的殼聚糖膜的工作電極與含有AIV抗原的樣本溶 液溫育后，電流響應曲線中還原峰電流顯著降低，表明溶液中的AIV抗原與固 定在工作電極表面的HRP-anti-AIV發生特異性的抗原抗體免疫反應，生成的 AIV免疫復合物在空間上阻礙了硫堇向辣根過氧化物酶的活性中心靠近，導致 辣根過氧化物酶的催化能力下降，從而使得響應曲線中還原峰電流顯著降低。以K-(Ipl-Ip2)/Iplxl00。/。(既免疫反應前后催化電流的降低率)作為判 斷樣品中是否含有AIV抗原的依據。當K》25。/。時為陽性，表示被測樣本中含 有AIV抗原；當K〈25。/。時為陰性，表示被測樣本中不含AIV抗原。本實施例中，K=(0.6609uA—0.3264 uA)/0.6609uAxl00°/。 =50.62o/o， >25%， 表明被測樣本中含有AIV抗原。 當認識到，以上的實施例僅是用來 說明本發明，而并非作為對本發明的限定，只要在本發明的實質范圍內，對以 上所述實施例的變化、變型都將落在本發明權利要求書的范圍內。
權利要求
1.一種檢測禽流感病毒抗原的裝置，包括免疫傳感器、電解池和數據采集與處理系統；免疫傳感器包括印刷在絕緣基板上的工作電極、參比電極和輔助電極所構成的電極系統；電解池包括檢測底液、攪拌器和溫控器；數據采集與處理系統包括電化學工作站、計算機和軟件系統；免疫傳感器通過導線與電化學工作站相連，其特征在于免疫傳感器的工作電極為碳電極，其上涂布有包埋酶標禽流感抗體的感應膜。
2. 如權利要求1所述的檢測禽流感病毒抗原的裝置，其特征在于所述的禽流 感抗體為H5N1型禽流感抗體。
3. 如權利要求1所述的檢測禽流感病毒抗原的裝置，其特征在于所述的酶標 禽流感抗體為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氧酶、葡萄糖氧化酶、青 霉素酰化酶或尿素水解酶標記的禽流感抗體。
4. 如權利要求l所述的檢測禽流感病毒抗原的裝置，其特征在于所述的包埋 酶標禽流感抗體的膜材料為殼聚糖、醋酸纖維素、PVB、 Nafion、明膠或瓊脂糖。
5. 如權利要求1所述的檢測禽流感病毒抗原的裝置，其特征在于所述的工作 電極為4 10個。
6. —種檢測禽流感病毒抗原的方法，包括以下步驟1) 待測樣本滴于如權利要求1所述免疫傳感器的工作電極表面，2(TC孵育10分鐘；2) 免疫傳感器置于電解池中，電解池的檢測底液為含有0.4 mmol/LH202 的1 mmol/L硫堇醋酸鹽緩沖液，PH值為6.5;3) 設定適宜的掃描參數，對工作電極施加電壓，檢測輔助電極與工作電 極間的電流值；4) 測定獲得的電流信息輸入數據采集與處理系統；5) 信息處理結果輸出。
7.如權利要求6所述的檢測禽流感病毒抗原的方法，其特征在于數據采集與 處理系統采用循環伏安法作為免疫電極表征和定性判定的方法。
全文摘要
本發明公開了一種靈敏、快速、特異性高且經濟的檢測禽流感病毒抗原的裝置。本發明裝置包括免疫傳感器、電解池和數據采集與處理系統；免疫傳感器包括印刷在絕緣基板上的工作電極、參比電極和輔助電極所構成的電極系統；電解池包括檢測底液、攪拌器和溫控器；數據采集與處理系統包括電化學工作站、計算機和軟件系統；免疫傳感器通過導線與電化學工作站相連；免疫傳感器的工作電極為碳電極，其上涂布有包埋酶標禽流感抗體的感應膜。本發明還公開了一種使用該裝置檢測禽流感病毒抗原的方法。
文檔編號G01N33/569GK101149384SQ20071007154
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月30日 優先權日2007年9月30日
發明者吳淑春, 趙廣英 申請人:浙江工商大學