一種用于除草劑高通量的96孔板篩選方法

專利名稱：一種用于除草劑高通量的96孔板篩選方法
一種用于除草劑高通量的96孔板篩選方法(一) 技術領域 本發明涉及一種用于除草劑高通量的96孔板篩選方法。(二) 背景4支術農藥在我國乃至全世界的農林業生產以及衛生害蟲控制方面起著重 要作用，但隨著環境和消費安全的呼聲日益提高，以及有害生物抗藥性 的產生使農藥使用壽命縮短，使得新農藥的創制與開發越來越迫切，也越 來越困難。據統計， 一個高效、低毒、環境友好型新農藥的成功開發，目 前需要合成篩選80000個化合物，耗資上億美元。這對藥物開發中化合物 的合成與篩選都提出了新的挑戰。以常規的溫室生測方法在短時間內篩選 大量的化合物是非常困難的，微型篩選法不僅僅測試規模大大縮小，而且 農藥用量少、篩選速度也非常快。用代表性植物測試，如藻類、浮萍等。 將一定劑量的化合物及藻類或浮萍分別加入三角瓶中，混勻。在控制條件 下振蕩培養。測定培養前后混合液的光密度值，如果光密度值不變甚至減 少，表明藻類不生長，化合物有除草活性。也可通過生長抑制率求出EC50, 以判斷化合物活性大小。還可以培養藻類細胞，通過化合物對藻類細胞的 抑制作用判斷其活性大小。隨著科學技術的進一步發展，對藥物開發中化 合物的合成與篩選則提出了更高的要求，為了進一步降低成本，在最初的 合成中得到用于篩選的化合物通常都在微克的數量級，因此需要一種更為 微型的篩選方法，以替代現有的三角瓶法。目前已有96孔板法應用于除草劑活性篩選的報道，采用固體培養基, 植入雜草種子，通過測定雜草鮮重和抹高，來對除草劑活性進行分析。而
對于藻類細胞，由于其微生物特性，受外界因素影響而發生性狀改變的幾率較大，因此還未見有運用96孔板法、采用液體培養基對藻類細胞進行 培養分析的相關報道。
發明內容本發明則是為了提供一種用于除草劑高通量的96孔板篩選方法，以 替代傳統的三角瓶法。為達到發明目的本發明采用的技術方案是一種用于除草劑高通量的96孔板篩選方法，所述方法如下采用適 用于小球藻的培養基，將指數生長期的小球藻接種于96孔板中，初始接 種d、球藻個數范圍為7 ~ 8x 105個/mL,接種后往各孔加入具有濃度梯度的 除草劑，每個濃度設置2 5個平行樣，同時設置空白樣對照；培養條件 溫度25士0.2。C，光照2000Lx，持續光照，用保鮮膜封口，不加營養液， 每天對藻液充氣4 5次，共培養72~144h，每天測試樣品在630nm處的 吸光度，根據吸光度和除草劑濃度間的關系，推算除草劑對小球藻的 EC5()。實驗中發現，若培養過程中不對藻液進行充氣，則藻細胞易沉淀在 孔壁上，影響吸光度測量的準確性；而通過每天對藻液充氣4~5次的處 理，則可明顯改善這一問題，藻細胞生長狀態良好，分布均勻，且不易沉 淀。數據處理、分析方法在上述條件下振蕩培養，以培養液為參比，用 血球計數板在顯孩t鏡下直接計lt并在最大吸收波長630nm測定吸光值，試 驗設3個重復，建立藻細胞濃度和吸光度的線性回歸關系。抑制率直接采 用(對照樣品吸光度一處理樣品吸光度)/對照樣品吸光度計算，并建立 抑制率(P)和濃度的自然對數(lnC)的線性回歸關系，并求解抑制率
為50%的濃度值(EC50)。所述小J求藻優選為普通小3求藻(C7 /o 〃a vw/gani )。 所述適用于小球藻的培養基為常見可用于小球藻培養的培養基,如水 生四號培養基、HA-SK培養基等，優選為水生四號培養基。所述水生四 號培養基可使用市購產品，也可按如下組成配制(NH4)2S04, 0.20g; Ca3(P04)2， 0.03g; MgS04.7H20, 0.08g; NaHC03 ， O.lOg; KC1, 0.025g; 1。/0(質量濃度)FeCl3 , 0.15mL; 土i襄浸出液，0.50mL;水補足至1000mL。 具體的，所述方法如下采用水生四號培養基，將處于指數生長期的 普通小球藻接種于96孔板中，普通小球藻初始濃度為7 8xl(^個/m,接 種后加入精吡氟禾草靈，濃度梯度為0、 0.05、 0.1、 0.25、 0.5、 1、 5mg/L， 每個濃度設置4個平行樣，培養條件溫度25士0.2。C,光照2000Lx,持 續光照，用保鮮膜封口，不加營養液，每天用排槍對96孔板中的藻液充 氣4 5次，共培養72h,每天用Bio-Rad680型酶標儀測試其在630nm處 吸光度，根據吸光度和藻生物量間的關系，推算除草劑對藻的EC50，結 果取其平均值。本發明的有益效果主要體現在大為縮小了篩選過程中的除草劑使用 量，且操作簡便、快速，靈敏度高。

圖1為96孔板法抑制率與Ln(C)擬合曲線(精吡氟禾草靈)；當P-50。/。時，C=1.35mg/L (P為抑制率，C為除草劑濃度，下同)；圖2為三角瓶法抑制率與Ln(C)擬合曲線(精吡氟禾草靈)；當P-50。/。時，C=1.58mg/L;圖3為96孔板法抑制率與Ln(C)擬合曲線(氯氟吡氧乙酸)；當P-50。/。時， C=0.60mg/L;
圖4為三角瓶法抑制率與Ln(C)擬合曲線(氯氟吡氧乙酸)；當P-50。/。時， C=0.66mg/L;圖5為96孔板法抑制率與Ln(C)擬合曲線(乙草胺)；當P:50。/。時， C=0.33mg/L;圖6為三角瓶法抑制率與Ln(C)擬合曲線(乙草胺)；當P-50。/。時， C=0.45mg/L;圖7為96孔板法抑制率與Ln(C)擬合曲線(精喹禾靈)；當P=50°/Wt, C=2.10mg/L;圖8為三角瓶法抑制率與Ln(C)擬合曲線(精喹禾靈)；當P:50。/。時， C=1.91mg/L。 具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護范圍 并不僅限于此實施例1:采用水生四號培養基，在普通小球藻(C/7/0w〃avw/gan^購自中國 科學院水生生物研究所，下同)的指數生長期試驗，小球藻接種于250pL96 孔板中，總體積為200pL,初始接種小球藻個數范圍為7 8xl0MVmL。 接種后對其進行一定濃度梯度的除草劑精吡氟禾草靈(購自江蘇洽益農化 有限公司)處理，濃度梯度為O, 0.05， 0.1, 0.25， 0.5， 1, 5mg/L,每個 濃度設置4個平行樣。光照培養條件溫度(25士0.2) 。C，光照2000Lx, 持續光照，用保鮮膜封口，試驗期間不加營養液，每天用排槍對96孔板中 的藻液充氣4-5次，共培養72h，每天用Bio-Rad680型酶標儀測試其在 630nm處吸光度，根據吸光度和藻生物量間的關系，推算除草劑對藻的EC50,結果取其平均值。同時用ISO推薦的標準的三角瓶法測定除草劑對藻的ECso，三角瓶法 測定過程如下普通小球藻接種于三角瓶中，總體積為75mL，初始接種 小球藻個數范圍為7 ~ 8xl()S個/mL。接種后對其進行一定濃度梯度的除草 劑精吡氟禾草靈處理，濃度梯度為O, 0.05, 0.1， 0.25, 0.5， 1, 5mg/L, 每個濃度設置4個平行樣，結果取其平均值。光照培養條件溫度 (25士0.2)。C，光照2000Lx,持續光照，用紗布封口，試-瞼期間不加營養 液，每天手動振蕩4-5次，共培養72h,每天用分光光度計測定藻液在690nm 處的吸光度，根據吸光度和除草劑濃度間的關系，推算除草劑對藻的EQo。 在上述條件下振蕩培養，以培養液為參比，用血球計數板在顯微鏡下 直接計數并在最大吸收波長630nm測定吸光值，試-3t沒3個重復，建立 藻細胞濃度和吸光度的線性回歸關系(見表l):表1 細胞濃度和吸光度的線性回歸關系測定方法線性方程R2P三角瓶法Y=109.56X+5.660.98720.001796孔板法Y=78.38X+7.780.96270扁9抑制率(P)與除草劑濃度的自然對數(Ln(C))的擬合曲線見圖1、 圖2。測定結果用96孔板法計算出的精吡氟禾草靈對小球藻的ECso為 1.35 mg/L,用三角瓶法計算出的精吡氟禾草靈對小球藻的EC50為 1.58mg/L。實施例2:采用水生四號培養基，在普通小球藻(C/2/ow〃avw/gan、購自中國
科學院水生生物研究所)的指數生長期試驗，小球藻接種于250pL96孔 板中，總體積為200pL,初始接種小球藻個數范圍為7-8xl()S個/mL。接 種后對其進行一定濃度梯度的除草劑氯氟吡氧乙酸(購自浙江捷馬化工有 限7>司)處理，濃度梯度為0, 0.05， 0.1, 0.25, 0.5, 1， 5mg/L，每個濃 度設置4個平行樣。光照培養條件溫度(25士0.2) 。C，光照2000Lx, 持續光照，用保鮮膜封口，試驗期間不加營養液，每天用排槍對96孔板 中的藻液充氣4-5次，共培養72h，每天用Bio-Rad 680型酶標儀測試其 在630nm處吸光度，根據吸光度和藻生物量間的關系，推算除草劑對藻 的EC50。三角瓶法步驟同實施例1。抑制率(P)與除草劑濃度的自然對數 (Ln(C))的擬合曲線見圖3、圖4。測定結果用96孔板法計算出的氯氟吡氧乙酸對小球藻的ECs。為 0.60mg/L,用三角瓶法計算出的氯氟吡氧乙酸對小球藻的EC50為 0.66mg/L。實施例3:采用水生四號培養基，在普通小球藻(C72/o^〃a vw/gan's，購自中國 科學院水生生物研究所)的指數生長期試驗，小球藻接種于250pL96孔板 中，總體積為200(iL,初始接種小球藻個數范圍為7 8xl()S個/mL。接種 后對其進行一定濃度梯度的除草劑乙草胺(購自杭州慶豐農化有限公司) 處理，濃度梯度為O, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5， lmg/L,每個濃度設置4個平 行樣，同時設置空白樣對照。光照培養條件溫度(25±0.2 )。C ，光照2000Lx， 持續光照，用保鮮膜封口，試驗期間不加營養液，每天用排槍對96孔板中 的藻液充氣4-5次，共培養72h,每天用Bio-Rad680型酶標儀測試其在630nm處吸光度，根據吸光度和藻生物量間的關系，推算除草劑對藻的 EC50。同時用ISO推薦的標準的三角瓶法測定除草劑對藻的EC50,三角瓶法 測定過程如下小球藻接種于三角瓶中，總體積為75mL,初始接種小球藻 個數范圍為7 ~ 8xl()S個/mL。接種后對其進行一定濃度梯度的除草劑乙草 胺處理，濃度梯度為0， 0.05, 0.1, 0.25， 0.5, 1, 5mg/L,每個濃度i殳置 4個平行樣，結果取其平均值。光照培養條件溫度(25士0.2) °C,光照 2000Lx，持續光照，用紗布封口，試驗期間不加營養液，每天手動振蕩 4-5次，共培養72h,每天用分光光度計測定藻液在690nm處的吸光度，根 據吸光度和除草劑濃度間的關系，推算除草劑對藻的EC50。抑制率(P)與除草劑濃度的自然對數(Ln(C))的擬合曲線見圖5、圖6。測定結果用96孔板法計算出的乙草胺對小球藻的ECs()為0.33mg/L, 用三角瓶法計算出的氯氟吡氧乙酸對小球藻的ECso為0.45mg/L。實施例4:釆用水生四號培養基，在普通小球藻(C7z/ow〃avw/gw/s,購自中國 科學院水生生物研究所)的指數生長期試驗，小球藻接種于250jxL96孔板 中，總體積為200^iL,初始接種小球藻個數范圍為7 8xl()S個/mL。接種 后對其進行一定濃度梯度的除草劑精喹禾靈(購自江蘇豐山集團有限公 司)處理，濃度梯度為O, 0.1， 0.25， 0.5, 1, 5mg/L,每個濃度設置4個 平行樣，同時設置空白樣對照。光照培養條件溫度(25±0.2 ) 。C,光照 2000Lx，持續光照，用保鮮膜封口，試驗期間不加營養液，每天用排槍 對96孔板中的藻液充氣4-5次，共培養72h，每天用Bio-Rad680型酶標儀測
試其在630nm處吸光度，根據吸光度和藻生物量間的關系，推算除草劑對 藻的ECso。同時用ISO推薦的標準的三角瓶法測定除草劑對藻的EC50,三角瓶法 測定過程如下小球藻接種于三角瓶中，總體積為75mL,初始接種小球藻 個數范圍為7 ~ 8xl()S個/mL。接種后對其進行一定濃度梯度的除草劑精喹 禾靈處理，濃度梯度為0， 0.05, 0.1, 0.25， 0.5, 1, 5mg/L,每個濃度設 置4個平行樣，結果取其平均值。光照培養條件溫度(25士0.2) 。C，光 照2000Lx，持續光照，用紗布封口，試驗期間不加營養液，每天手動振 蕩4-5次，共培養72h，每天用分光光度計測定藻液在690nm處的吸光度， 根據吸光度和除草劑濃度間的關系，推算除草劑對藻的EC50。抑制率(P)與除草劑濃度的自然對數(Ln(C))的擬合曲線見圖7、圖8。測定結果用96孔板法計算出的精喹禾靈對小球藻的EC50為 2.10mg/L,用三角瓶法計算出的精喹禾靈對小球藻的EC5o為1.91mg/L。
權利要求
1.一種用于除草劑高通量的96孔板篩選方法，所述方法如下采用適用于小球藻的培養基，將指數生長期的小球藻接種于96孔板中，初始接種小球藻個數范圍為7～8×105個/mL，接種后往各孔加入具有濃度梯度的除草劑，每個濃度設置2～5個平行樣，同時設置空白樣對照；培養條件溫度25±0.2℃，光照2000Lx，持續光照，用保鮮膜封口，不加營養液，每天對藻液充氣4～5次，共培養72～144h，每天測試樣品在630nm處的吸光度，根據吸光度和除草劑濃度間的關系，推算除草劑對小球藻的EC50。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述小球藻為普通小球藻
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述適用于小球藻的培養基為 水生四號培養基。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下采用水生四號 培養基，將處于指數生長期的普通小球藻接種于96孔板中，普通小球 藻初始濃度為7 8xl()S個/m,接種后加入精吡氟禾草靈，濃度梯度為 0、 0.05、 0.1、 0.25、 0.5、 1、 5mg/L,每個濃度設置4個平行樣，培養 條件溫度25士0.2。C,光照2000Lx,持續光照，用保鮮膜封口，不加 營養液，每天用排槍對96孔板中的藻液充氣4 5次，共培養72h，每 天用Bio-Rad 680型酶標儀測試其在630nm處吸光度，根據吸光度和除 草劑濃度間的關系，推算除草劑對藻的EC50,結果取其平均值。
全文摘要
本發明提供了一種用于除草劑高通量的96孔板篩選方法，所述方法如下采用適用于小球藻的培養基，將指數生長期的小球藻接種于96孔板中，初始接種小球藻個數范圍為7～8×10⁵個/mL，接種后往各孔加入具有濃度梯度的除草劑，每個濃度設置2～5個平行樣，同時設置空白樣對照；培養條件溫度25±0.2℃，光照2000Lx，持續光照，用保鮮膜封口，不加營養液，每天對藻液充氣4～5次，共培養72～144h，每天測試樣品在630nm處的吸光度，根據吸光度和除草劑濃度間的關系，推算除草劑對小球藻的EC₅₀。本發明相比三角瓶法的有益效果主要體現在大為縮小了篩選過程中的除草劑使用量，且操作簡便、快速，靈敏度高。
文檔編號G01N21/17GK101126712SQ20071007120
公開日2008年2月20日 申請日期2007年9月6日 優先權日2007年9月6日
發明者嚴航貞, 劉維屏, 璟 葉, 張安平, 聶利賓, 蔣凌峰 申請人:浙江工業大學