專利名稱：：復合保護劑及其用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬于膠體金免疫檢測試紙產品保藏的輔助劑范圍，特別涉及一種用于氯霉素速測金標試紙條的復合保護劑。
背景技術：
：金免疫層析技術是膠體金標記技術和蛋白質層析技術相結合的以微孔濾膜為載體的快速固相膜免疫分析技術，現已廣泛應用于生物醫學、動植物檢疫、食品安全監督等諸多領域。20世紀90年代以來，膠體金免疫層析快速診斷試紙條(簡稱金標試紙條)的研究發展迅速，大多用于檢測各種病原菌、人體微量蛋白、抗體等生物大分子物質，也有一些用于檢測小分子物質，如濫用藥物、毒品、興奮劑等。此外，金標試紙條以其簡便、快速、準確和無污染的特點，在農產品安全質量監控領域中日益發揮出顯著優勢，它不僅適用于專業人員大規模地對農產品中藥物殘留進行現場監測和篩檢，也適用于農產品行業個體戶、企業乃至家庭進行自檢，可見有著廣闊的應用前景。目前，市售獸藥、農藥殘留檢測的金標試紙條比較少見，究其原因主要有膠體金免疫層析分析作為一種新型的快速診斷技術，用于檢測獸藥、農藥小分子化合物的研究尚且不多；出于商業保密，國內外對金標試紙產品保藏的輔助劑報道也較少；金標試紙條的可靠性和持效性，涉及到膜固相上結合的蛋白質類物質的穩定性問題，這也是該類檢測產品商業化發展的主要瓶頸之一。近些年來，隨著蛋白質制品的穩定性研究逐步深入，國內外報道指出常見的蛋白質保護劑有以下幾類多羥基化合物、糖類、氨基酸、聚合物、異源蛋白質及表面活性劑。這些保護劑對蛋白質的穩定機制比較復雜，目前報道較多的是關于它們在蛋白質冷凍干燥過程中保護作用的機制研究。尤其在干燥及貯藏過程中，環境條件易引起蛋白質變性失活，添加一些輔料可穩定蛋白質結構。用來解釋此干燥保護機制的假說主要有兩種"玻璃態"假說和"水替代"假說，其推論依據都是基于藥液實現了部分或全部玻璃化固定，且輔料分子與蛋白質藥物形成氫鍵，使其在缺水狀態下仍能維持活性結構。一個優良的蛋白質保護劑應具備多種保護特性，如玻璃化溫度高、吸濕性差、結晶率低和不含還原基，但任何單一保護劑都不可能包含所有的保護特性，因此要使用兩種或多種保護劑才能獲得更顯著的保護效果。當前，氯霉素殘留問題仍受到人們的高度重視，研發穩定可靠、靈敏度高的氯霉素速測金標試紙條有著深遠的實際意義。氯霉素屬小分子化合物，采用競爭性金免疫層析法進行診斷，故檢測試紙條上含有的主要生化試劑是結合墊上包被的抗氯霉素單克隆抗體-膠體金標記物(簡稱金標抗體)，硝酸纖維素膜(NC膜)測試帶(T帶)上包被的氯霉素-卵清蛋白偶聯物和質控帶(C帶)上包被的羊抗鼠IgG。這些物質尤其是抗體分子的穩定性，很大程度上決定了試紙條的貨架壽命。抗體屬熱敏性蛋白，其失活速度直接決定于暴露溫度，因而研究穩定蛋白的方法和測量試紙條的貨架壽命，即保持最初活性90%的持續時間，很是重要。對該試紙條添加輔助劑，即是改善上述三類蛋白質的穩定性能，以保護各自在膜固相上的活性結構，從而解決氯霉素金標試紙條的保存期問題。目前現有的氯霉素速測金標試紙條在04'C保存期一般為312個月，尚不能完全滿足生產的需要。關于氯霉素金標試紙條研制的專利已有一些，但都未涉及產品保護劑的內容；其次，在小分子化合物速測金標試紙的同類產品中，尚未對保護劑問題進行報道；再者，國外有學者提出單一保護劑用于大分子物質診斷的金免疫測試條，但對于不同保護劑組合的協作效應沒有指明。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種成本較低、使用方便的復合保護劑，使用該復合保護劑能使氯霉素速測金標試紙條在0-4。C保存期延長至2年以上。為了解決上述技術問題，本發明提供一種復合保護劑，是由糖類、高分子聚合物、蛋白質和防腐劑溶解在緩沖溶液中形成的溶液，糖類、高分子聚合物、蛋白質和防腐劑在所述溶液中的濃度分別是l20g/100mL、0.05~2.0g/100mL、0.1-2g/100mL禾口0.0050.1g/100mL。作為本發明的復合保護劑的改進糖類為蔗糖和海藻糖中的至少一種，高分子聚合物為聚乙烯吡咯烷酮(PVP，40000)、聚乙二醇(PEG，20000)和吐溫(Tween20)中的至少一種，蛋白質為牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)中的至少一種，防腐劑為疊氮鈉和硫柳汞中的至少一種。作為本發明的復合保護劑的進一步改進，是由蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙二醇、吐溫、牛血清白蛋白和疊氮鈉溶解在緩沖溶液中形成的溶液，蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙二醇、吐溫、牛血清白蛋白和疊氮鈉在溶液中的濃度分別是210g/100mL、1~5g/100mL、00.5g/100mL、0~0.3g/100mL、0.05~0.2g/100mL、0.5~2g/100mL和0.01~0.1g/100mL。作為本發明的復合保護劑的進一步改進，是由蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐溫、牛血清白蛋白和硫柳汞溶解在緩沖溶液中形成的溶液，蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐溫、牛血清白蛋白和硫柳汞在溶液中的濃度分別是210g/100mL、1~5g/100mL、0~0.5g/100mL、0~0.3g/100mL、0.05~0.2g/100mL、0.5-2g/100mL和0.01~0.1g/100mL。作為本發明的復合保護劑的進一步改進，緩沖溶液為由磷酸二氫鉀(KH2P04)、無水磷酸氫鈉(NaHP04)、氯化鈉(NaCl)和氯化鉀(KC1)溶解在蒸餾水中形成的磷酸鹽緩沖液(PBS)，磷酸二氫鉀、無水磷酸氫鈉、氯化鈉和氯化鉀在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度分別是0.27g/L、1.14g/L、8.00g/L和0.20g/L。本發明還提供了上述復合保護劑的用途用于保護氯霉素速測金標試紙條。具體制作方法如下1)、將一定量的金標抗體溶解在一定量的復合保護劑中形成溶液，在結合墊上噴灑該溶液、或者將結合墊浸漬于溶液中，要求能使結合墊浸透溶液；再將上述浸透溶液的結合墊真空冷凍干燥、或晾干、或低溫(不超過60'C)烘干，以達到保護固定在結合墊上的金標抗體的目的；2)、將人工抗原和二抗溶解在緩沖溶液中，劃線于NC膜上后晾干或低溫(不超過6(TC)烘干后，通過層析的方法使復合保護劑均勻分布于NC膜上，再晾干或低溫(不超過6(TC)烘干(lh)，以達到保護固定在膜上的人工抗原和二抗的目的。3)將上述結合墊及NC膜等切條組裝成試紙條。為了證明本發明的復合保護劑具有保護氯霉素速測金標試紙條的功能，發明人對上述經復合保護劑處理后的試紙條作了如下驗證實驗將上述試紙條分別置于37。C和6CTC下干燥貯存一定的時間，考査試紙條的有效顏色信號及檢測靈敏度。結果表明，經本發明的復合保護劑處理后的氯霉素金標試紙條能保持有效顏色信號分別達30天和10天，且檢測靈敏度不變。因此，可據此推算該試紙條在0~4'C保存期至少為2年。在上述同樣的實驗條件下，常規的氯霉素金標試紙條(即沒有經過復合保護劑處理的)能保持有效顏色信號分別只有3天和1天；在相應的30天或10天后檢測，試紙條已經完全失效。因此，本發明的復合保護劑用于氯霉素速測金標試紙條，能實現對氯霉素金標試紙條上的抗原、抗體的保護，可有效地延長試紙條在04'C干燥條件下的保存期。復合保護劑中的防腐劑具有阻止霉菌等微生物的滋長的功能。本發明的復合保護劑可望在獸藥、農藥小分子化合物的膠體金免疫層析快速檢測及產品開發中得到推廣應用。具體實施方式實施例l、一種復合保護劑，按照以下步驟制得-(1)、PBS緩沖溶液的配制KH2P04:0.27g、無水NaHP(V.1.14g、NaCl:8.00g禾HKCl:0.20g，以蒸餾水溶解并定容至1L。(2)、復合保護劑的配制蔗糖10.00g，海藻糖5.00g，PEG(20000):0.05g，BSA:l.OOg，Tween-20:0.05g，疊氮鈉O.Olg，以PBS緩沖溶液溶解并定容至100mL。將上述復合保護劑用于保護氯霉素速測金標試紙條，具體制作方法如下(1)氯霉素金標抗體的處理取5mL經處理的膠體金液，加入250(ig氯霉素單克隆抗體，混勻，多次離心、洗滌純化后，分離得到金標抗體沉淀物。取復合保護劑lmL，重懸該氯霉素金標抗體，得到金標抗體濃縮液。將預先處理好的結合墊浸漬在上述金標抗體濃縮液中，再將上述浸透溶液的結合墊迅速真空冷凍干燥后備用；(2)NC膜的處理將人工抗原和二抗溶解在緩沖溶液中，劃線于NC膜上后晾干或低溫(不超過60'C)烘干；將上述劃有T線(人工抗原)和C線(二抗)的NC膜黏附在PVC背襯底板上，在T帶和C帶上分別包被好氯霉素半抗原--卵清蛋白偶聯物(或氯霉素半抗原一牛血清蛋白偶聯物)和羊抗鼠IgG后，晾干，再將NC膜的T端浸入復合保護劑中(NC膜浸入液體中不超過2mm)，通過層析的方法使復合保護劑均勻分布于NC膜上，待膜上層析液的上沿超過膜的C線后，取出NC膜，晾干或低溫(不高于60。C)下烘干(lh)。(3)試紙條的組裝將上述結合墊、預先處理好的樣品墊、吸水墊等按常規金標試紙條的組裝方法粘貼于NC膜的PVC襯板上，切成2-3mm的條狀，即制備得到氯霉素金標試紙條。將制備得到的氯霉素金標試紙條，進行如下加速貯存試驗，具體如下將本發明的氯霉素金標試紙條置于37'C和6(TC下恒溫干燥貯存；同時，以新制備的未經本發明復合保護劑處理的金標試紙條作為對照。間隔一定的時間后測定試紙條的活性(以顯色程度及檢測靈敏度表示)，結果見表l、表2。表l、氯霉素金標試紙條加速貯存試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注顯色線紅色深淺用"*"多少表示強弱，"/"表示幾乎不顯紅色，另外C線不顯紅色表示試紙條失效。表2、氯霉素金標試紙條檢測靈敏度試驗試紙條氯霉素標準溶液濃度(ng/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注氯霉素標準溶液濃度分別為0，1，2，4，8ng/mL，以PBS緩沖溶液配制。檢測結果陰性(用"-"表示)T帶顏色與C帶顏色接近；陽性(用"+"多少表示強弱)T帶顏色明顯淺于C帶顏色，強陽性為T帶不顯紅色。通過加速貯存試驗說明，經添加復合保護劑的氯霉素金標試紙條在37'C和6(TC下分別恒溫干燥存放30天和10天后，仍能保持原來的活性，顯色基本不變，且氯霉素金標試紙條的檢測靈敏度試驗前后沒有變化。未經保護劑處理的的試紙條，在37'C和6(TC下分別恒溫干燥存放3天和1天，顯色變弱，30天和10天后已經失效。實施例2、一種復合保護劑，按照以下步驟制得-(1)、PBS緩沖溶液的配制KH2P04:0.27g，無水NaHP04:1.14g，NaCl:8.00g，KC1:0.20g，以蒸餾水溶解并定容至1L。(2)、復合保護劑的配制蔗糖5.00g，海藻糖2.00g，BSA:0.50g，PVP(40000):0.25g，Tween-20:0.05g，疊氮鈉O.Olg，以PBS緩沖溶液溶解并定容至100mL。將上述復合保護劑用于保護氯霉素速測金標試紙條，具體制作方法同實施例1。將制備得到氯霉素金標試紙條，進行加速貯存試驗，試驗方式同實施例1。具體結果見表3、表4。表3氯霉素金標試紙條加速!fc存試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注顯色線紅色深淺用"*"多少表示強弱，"/"表示幾乎不顯紅色。另外c線不顯紅色表示試紙條失效。表4氯霉素金標試紙條檢測靈敏度試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注氯霉素標準溶液濃度分別為0，1，2，4，8ng/mL，以PBS緩沖溶液配制。檢測結果陰性(用"-"表示)T帶顏色與C帶顏色接近；陽性(用"+"多少表示強弱)T帶顏色明顯淺于C帶顏色，強陽性為T帶不顯紅色。通過加速貯存試驗說明，經添加復合保護劑的氯霉素金標試紙條在37'C和60'C下分別恒溫干燥存放30天和IO天后，仍能保持原來的活性，顯色基本不變，且氯霉素金標試紙條的檢測靈敏度試驗前后沒有變化。未經保護劑處理的的試紙條，在37'C和6(TC下分別恒溫千燥存放3天和1天，顯色變弱，30天和IO天后己經失效。實施例3、一種復合保護劑，按照以下步驟制得(1)、PBS緩沖溶液的配制KH2P04:0.27g，無水NaHP04:1.14g，NaCl:8.00g，KC1:0.20g，以蒸餾水溶解并定容至1L。(2)、復合保護劑的配制蔗糖10.00g，BSA:0.25g，PVP(40000):0.10g，PEG(20000):0.05g，Tween-20:0.2g，疊氮鈉0.005g，以PBS緩沖溶液溶解并定容至100mL。將上述復合保護劑用于保護氯霉素速測金標試紙條，具體制作方法同實施例1。將制備得到氯霉素金標試紙條，進行加速貯存試驗，試驗方式同實施例1。具體結果見表5、表6。表5氯霉素金標試紙條加速貯存試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注顯色線紅色深淺用"*"多少表示強弱，"/"表示幾乎不顯紅色。另外c線不顯紅色表示試紙條失效。表6氯霉素金標試紙條檢測靈敏度試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注氯霉素標準溶液濃度分別為0，1，2，4，8ng/mL，以PBS緩沖溶液配制。檢測結果陰性(用"-"表示)T帶顏色與C帶顏色接近；陽性(用"+"多少表示強弱)T帶顏色明顯淺于C帶顏色，強陽性為T帶不顯紅色。通過加速貯存試驗說明，經添加復合保護劑的氯霉素金標試紙條在37"C和6(TC下分別恒溫干燥存放30天和IO天后，仍能保持原來的活性，顯色基本不變，且氯霉素金標試紙條的檢測靈敏度試驗前后沒有變化。未經保護劑處理的的試紙條，在37'C和6(TC下分別恒溫干燥存放3天和1天，顯色變弱，30天和10天后己經失效。實施例4、一種復合保護劑，按照以下步驟制得(1)、PBS緩沖溶液的配制同實施例l。(2)、復合保護劑的配制蔗糖2.00g，海藻糖3.00g,BSA:2g,PVP(40000):0.5g，PEG(20000):0.3g，Tween-20:0.lg，硫柳汞O.lg，以PBS緩沖溶液溶解并定容至100mL。將上述復合保護劑用于保護氯霉素速測金標試紙條，具體制作方法同實施例l。實施例5、一種復合保護劑，按照以下步驟制得(1)、PBS緩沖溶液的配制同實施例l。(2)、復合保護劑的配制蔗糖l.OOg，PVP(40000):2g，OVA:O.lg，硫柳汞0.05g，以PBS緩沖溶液溶解并定容至100mL。將上述復合保護劑用于保護氯霉素速測金標試紙條，具體制作方法同實施例l。實施例6、一種復合保護劑，按照以下步驟制得(1)、PBS緩沖溶液的配制同實施例1。(2)、復合保護劑的配制海藻糖20.00g，Tween-20:0.05g，BSA:1.5g，硫賴P滎O.lg，以PBS緩沖溶液溶解并定容至100mL。將上述復合保護劑用于保護氯霉素速測金標試紙條，具體制作方法同實施例l。將上述實施例46按照實施例1的方式進行加速貯存試驗。通過加速貯存試驗說明，經添加復合保護劑的氯霉素金標試紙條在37'C和6(TC下分別恒溫干燥存放30天和10天后，仍能保持原來的活性，顯色基本不變，且氯霉素金標試紙條的檢測靈敏度試驗前后沒有變化。未經保護劑處理的的試紙條，在37。C和60。C下分別恒溫干燥存放30天和10天后已經失效。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。權利要求1、一種復合保護劑，其特征為是由糖類、高分子聚合物、蛋白質和防腐劑溶解在緩沖溶液中形成的溶液，糖類、高分子聚合物、蛋白質和防腐劑在所述溶液中的濃度分別是1～20g/100mL、0.05～2.0g/100mL、0.1～2g/100mL和0.005～0.1g/100mL。2、根據權利要求l所述的復合保護劑，其特征是所述糖類為蔗糖和海藻糖中的至少一種，高分子聚合物為聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和吐溫中的至少一種，蛋白質為牛血清蛋白和卵清蛋白中的至少一種，防腐劑為疊氮鈉和柳硫汞中的至少一種。3、根據權利要求2所述的復合保護劑，其特征為是由蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐溫、牛血清白蛋白和疊氮鈉溶解在緩沖溶液中形成的溶液，蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐溫、牛血清白蛋白和疊氮鈉在所述溶液中的濃度分別是210g/100mL、0~5g/100mL、00.5g/100mL、0~0.3g/100mL、0.05~0.2g/100mL、0.252g/100mL和0.005~0.1g/100mL。4、根據權利要求2所述的復合保護劑，其特征為是由蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐溫、牛血清白蛋白和柳硫汞溶解在緩沖溶液中形成的溶液，蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、吐溫、牛血清白蛋白和柳硫汞在所述溶液中的濃度分別是210g/100mL、0~5g/100mL、0~0.5g/100mL、0~0.3g/100mL、0.05~0.2g/100mL、0.252g/100mL和0.005~0.1g/100mL。5、根據權利要求3或4所述的復合保護劑，其特征是所述緩沖溶液為由磷酸二氫鉀、無水磷酸氫鈉、氯化鈉和氯化鉀溶解在蒸餾水中形成的磷酸鹽緩沖液，磷酸二氫鉀、無水磷酸氫鈉、氯化鈉和氯化鉀在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度分別是0.27g/L、1.14g/L、8.00g/L和0.20g/L。6、如權利要求15中任意一種復合保護劑的用途，其特征在于用于保護氯霉素速測金標試紙條。全文摘要本發明公開了一種復合保護劑，是由糖類、高分子聚合物、蛋白質和防腐劑溶解在緩沖溶液中形成的溶液，糖類、高分子聚合物、蛋白質和防腐劑在溶液中的濃度分別是1～20g/100mL、0.05～2.0g/100mL、0.1～2g/100mL和0.005～0.1g/100mL。本發明的復合保護劑用于保護氯霉素速測金標試紙條，能使試紙條在0～4℃的保存期延長至2年以上。文檔編號G01N33/53GK101118238SQ20071007101公開日2008年2月6日申請日期2007年8月29日優先權日2007年8月29日發明者朱國念,挺楊,王姝婷,王美英,郭逸蓉申請人:浙江大學;寧波市農業科學研究院