專利名稱：一種檢測尿液蛋白質指紋圖譜的方法
技術領域：
本發明屬于指紋圖譜的檢測方法，涉及一種檢測尿液蛋白質指紋圖譜的方法，為一種新的非侵入性的檢測方法，用于糖尿病早期腎病的輔助診斷。
背景技術：
糖尿病(DM)是繼心血管、腫瘤之后第三位嚴重危害人類健康的疾病，患病人數正隨著生活水平的提高、人口老齡化、生活方式的改變而迅速增加。截止2003年，全世界糖尿病患者已達1.35億，其中中國有2380萬，預計到2025年DM總人數達到3億。DM的最大危害在其臟器并發癥，其中糖尿病腎病是DM最常見、最重要的并發癥，也是DM患者死亡的主要原因之一。臨床上大約30％～50％的1型DM患者和20％的2型DM患者伴有明顯的腎臟損害，其中約1/3進一步發展為晚期糖尿病腎病和終末期腎功能衰竭(ESRD)。在發達國家和國內一些發達地區，糖尿病腎病是ESRD血液透析病人的首位病因。其確切發病機制至今未明，高糖毒性、腎臟血流動力學改變、脂代謝紊亂、高血壓影響以及吸煙、低出生體重、身材矮小、遺傳、種族、性別、環境等均是糖尿病腎病的危險因素，同時又具有遺傳上的多態性。所以尋找對糖尿病腎病高度特異的生物標記物，用于篩選與其發生發展相關的基因，早期診斷和預防糖尿病腎病，成為目前研究的重要方向。新近出現的蛋白芯片技術是一種全新的蛋白質組學研究手段，該方法克服了傳統蛋白質組學研究方法存在的諸多問題，實現了質譜技術用于臨床檢測的飛躍，為從蛋白分子水平探索研究糖尿病腎病展現又一嶄新前景。
一般認為10年以上病程的糖尿病發生腎臟損害的機會很大。但是新近有研究提出糖尿病腎病與個體的易感基因密切相關，有可能終身不發生，也可能一起病就累及腎臟。目前對其易感基因的研究涉及糖脂代謝相關(如醛糖還原酶基因、葡萄糖轉運蛋白-1基因、載脂蛋白基因)、血流動力學相關(如內皮素-1基因、腎素血管緊張素基因、一氧化氮合酶基因)以及胰島素敏感性、細胞外基質代謝、信號傳導相關基因等方面，但均是特異性不高。而針對這些機制的一些特殊治療，如內皮素抑制劑、醛糖還原酶抑制劑、TGF-β中和抗體等等，在人體均未能得到證實。因而，對DN患者尚缺乏有效的治療手段，即出現臨床蛋白尿后，大部分患者將不可避免地進入終末期腎功能衰竭。然而早期腎病的發展是可以被阻止或延緩的，更早期病變甚至是可以逆轉的，關鍵是做到早期診斷。
臨床上糖尿病腎病分為五期，其中微量白蛋白尿是當前國內、外公認的早期診斷DN指標。微量白蛋白尿是指24h尿白蛋白定量30-300mg(mogensen糖尿病腎病分期法)或隨機尿白蛋白與肌酐比值30-300mg/g.cr。但此時也已是DN III期，而且微量白蛋白尿可能受到其它多種因素，如尿路感染、月經期、劇烈運動、高血壓、心臟病及其他腎病等因素影響。事實上，在出現微量白蛋白尿之前(即I、II高腎小球濾過期)，腎臟已出現病理改變，包括腎小球基膜增厚，細胞外基質增生，與此相應也出現了尿蛋白異常，這些多為一些低濃度的小分子蛋白，用傳統的檢測方法(如免疫法、金標定量滲濾法、磺基水楊酸法、溴酚蘭法)很難檢測到。因此探索和建立一種簡便的，同時靈敏度和特異性均較高的糖尿病最早期腎病生物標記物十分必要。
SELDI-TOF-MS技術是最近幾年才發展起來的一種新的蛋白質組學研究方法。以這一技術為基礎開發的系列蛋白質芯片可以非特異性的結合被測樣本中的各種蛋白質，當在質譜儀中受激光轟擊時，各種結合的蛋白質會被激發而形成氣化離子，由于不同質荷比的離子在電場中飛行的時間長短不一，因此接收裝置可根據蛋白質質荷比的不同及量的多寡直觀地用位置、強弱不同的峰表現出來，進而形成相應圖譜，用于分析、判別。這一方法具有樣品用量小、操作簡便、靈敏度高、高通量等優點，可檢測到fmol(10-15mol)數量級的微量蛋白質，并且樣本不需進行精細的分離，粗樣本就可直接點樣。對照分析患者和正常人的質譜圖，可發現和捕獲新的特異性疾病相關蛋白及其特征。然而，通過這一方法獲得的數據是海量的，必需要運用生物信息學手段來分析處理。人工神經網絡(ANNs)和支持向量機(SVMs)是近年來開發和應用最廣泛的生物信息學算法，也已成熟用于蛋白芯片的研究。目前，用SELDI蛋白芯片技術獲得有意義成果的數量已經日益凸現，在篩選腫瘤標記物、多囊卵巢綜合征和系統性紅斑狼瘡的研究中都有多項報道，有的已應用臨床，但在糖尿病的研究中只有很少報道。本研究采用SELDI-TOF-MS芯片技術，進行糖尿病患者的尿液蛋白質質譜檢測，以往多數糖尿病蛋白芯片研究都著眼于患者的血清及相關組織，對于尿液蛋白質質譜的研究甚少。尿蛋白的60％來自血漿蛋白，40％來自腎臟及其它泌尿生殖組織，因此不僅能反映腎臟的病變，還能體現機體的代謝異常。有學者用毛細血管電泳(CE)聯合質譜技術發現1型糖尿病的尿液中有1000余種蛋白，分子量為800D-66.5KD。而在2型糖尿病親屬的尿液中發現分子量100KD的蛋白，與胰島素抵抗有關。尿液樣本獲取方便，芯片高通量、大樣本的特點也適宜疾病篩查，在臨床上有很大的潛在應用價值。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測尿液蛋白質指紋圖譜的方法，通過以下步驟實現(1)尿白蛋白準備根據測定的尿白蛋白分為四組，A組健康對照組，B組尿白蛋白＜30mg/g.cr，C組30≤尿白蛋白≤300mg/g.cr，D組尿白蛋白＞300mg/g.cr，分裝凍存于-80℃低溫冰箱中；(2)數據收集和處理采用PBS-II型表面增強激光解析-電離時間飛行質譜儀(SELDI-TOF-MS)進行質譜數據收集，其中激光強度150，檢測敏感度6，收集數據的質荷比范圍為1000～100000，收集位置20～80，平均每點收集20次，收集總點數為140次，采用H4(疏水性)蛋白質芯片、去離子水，基質SPA(sinapinic acid，芥子酸)；(3)對獲得的質譜數據進行檢測采用人工神經網絡(Artificial neuralnetworks，ANN)前饋式反向傳算法的方法進行質譜數據的分析，該蛋白質指紋圖譜由4個質荷比(M/Z)位于5281.1、4139.0、5898.5和4453.5的蛋白質或多肽(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修飾前或修飾后)所組成。對尿白蛋白質荷比峰值進行ROC(Receiver operating characteristic接受者工作特征)分析。
本發明應用SELDI-TOF-MS，對糖尿病患者和正常對照組的尿液蛋白質做篩選，在捕獲到的1000余種蛋白質中大部分沒有差異，利用Biomarker Wizard初步聚類，產生200個左右有差異的質荷比峰值。提示SELDI-TOF-MS芯片可有效避免血液中正常濾過的和腎臟及其它泌尿組織正常分泌的蛋白的干擾，捕獲到尿液中的微量蛋白，通過蛋白質芯片的檢測可以從糖尿病患者的尿液中找到與疾病相關的微量差異性蛋白。
進一步分析發現，(1)糖尿病患者無蛋白尿和微量白蛋白尿組(B和C組)比較篩選出18種差異蛋白中有14種的M/Z＜10000，通過P值評價每個峰，有5種蛋白比Alb(白蛋白)的差異更有顯著性，說明在糖尿病腎病早期尿液中存在的蛋白以小分子蛋白為主，而且尚存在比Alb更有特異性甚至更早出現的蛋白。目前傳統的檢測方法能檢出的尿蛋白如Alb(分子量69KD)、轉鐵蛋白(77KD)、a1-微球蛋白(26KD)、B2-微球蛋白(11.8KD)、NAG酶(130-150KD)等都是大分子蛋白。因此進一步優化篩選并純化、分析和鑒定這些小分子蛋白有助于尋找糖尿病腎病的極早期診斷標志物并深入探求其病因。(2)B、C、D組三組比較得到的差異蛋白中Alb和轉鐵蛋白的差異最明顯，表明III期及以上的糖尿病腎病蛋白尿中大分子蛋白明顯增多，Alb對此有很好的診斷敏感性和特異性。而16種隨著Alb的升高而降低的M/Z的均值中15種小于10000，說明這些表達下調，可能對腎臟有保護作用的蛋白絕大多數是小分子蛋白。
本發明的有益之處是通過檢測尿液蛋白質指紋圖譜，提供一種新的非侵入性的檢測方法，從而為糖尿病腎病早期發現、進一步尋找早期糖尿病腎病的特異性生物標記、為糖尿病腎病的病機探索和開發新的治療方法提供思路。
圖1為ANN示意圖。
圖2為糖尿病與健康者尿液蛋白質質譜圖。
圖3為4個M/Z峰的ROC曲線下的面積結果。
具體實施例方式
本發明將結合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。
實施例1.樣本和臨床資料106例糖尿病者的尿液標本來自浙江大學醫學院附屬第二醫院內分泌科住院患者，50例正常對照的尿液標本取自本院體檢的自愿健康人群。糖尿病診斷標準依據1999年WHO分型診斷標準。其中1型14例，2型92例；年齡10-82歲，平均58歲。男性57例，女性46例。所有患者病情基本穩定，無急性并發癥及嚴重肝功能損害，并除外全身或泌尿道感染、心力衰竭、發熱、妊娠、結締組織病及其他原發性腎小球或腎小管間質性疾病。同時收集年齡、性別、分型、體重指數(BMI)、血壓、尿微量白蛋白(白蛋白)等臨床相關資料。50例健康對照與糖尿病組性別、年齡相匹配。
2.研究對象分組入選者根據尿白蛋白分為四個組，A組健康對照組50例；B組尿白蛋白＜30mg/g.cr，45例；C組30＜尿白蛋白＜300mg/g.cr，35例；D組尿白蛋白＞300mg/g.cr，26例。
以上樣本全部留取清晨中段尿5-10ml，以2000rpm(900g)離心5min后取上清液10-100ul分裝凍存于-80℃低溫冰箱中。
3.儀器與試劑PBS-II型表面增強激光解析-電離時間飛行質譜儀(SELDI-TOF-MS)、H4(疏水性)蛋白質芯片及相應分析軟件Proteinchip Software 3.0由美國Ciphergen Biosystems公司研制。基質SPA(sinap inic acid芥子酸)購自美國Sigma公司。尿白蛋白測定采用免疫散射比濁儀由法國生物梅里埃公司生產。
4.技術路線取已制備的尿液標本在冰浴中解凍后14000rpm離心5min，取5ul上清加至已裝好H4芯片的Bioprocessor(美國Ciphergen公司)中，濕盒中室溫孵育30min，然后甩去孔中的殘留液體，再用去離子水5ul洗滌芯片上斑點3次，每次1分鐘，待樣品風干后，每孔點加基質SPA0.5ul/次共兩次。上機檢測及數據收集。
5.數據收集和處理(1)利用all-in-one蛋白質芯片校正PBS-II型SELDI-TOF-MS系統，使蛋白質分子量誤差小于0.1％。然后，將結合好蛋白質的H4蛋白芯片進行質譜閱讀儀分析。使用的分析參數為激光強度150，檢測敏感度6，收集數據的質荷比范圍為1000～100000，收集位置20～80，平均每點收集20次，收集總點數為140次，所有的樣本用相同的參數。以質控蛋白芯片做重復性檢測，其峰值大小及其強度的變異系數(CVs)均控制在0.05％和15％以下，具有很好的重復性。
(2)所有原始數據先用Proteinchip Software 3.0做校正(總離子強度及分子量的均一化)。對位于1000～100000的質荷比(m/z)，用BiomarkerWizard軟件(美國Ciphergen公司)進行2次噪音過濾，設置初始噪音過濾值為5，第二次噪音過濾值為2，蛋白質荷比峰在10％以上的樣本中同時存在，且同一蛋白質荷比峰在不同的樣本中的偏差小于0.3％。
(3)得到初步篩選結果后，對初步篩選出來的質荷比峰做糖尿病與正常對照的成組比較，以及糖尿病組根據尿白蛋白進行分組比較。
6.生物信息學分析用ANN(Artificial neural networks人工神經網絡)軟件(STATISTICNeural Networks 4.0)進一步分析糖尿病無腎病組和早期腎病組(即B和C組)的檢測數據，建立ANN模型，并用測試集進行盲法檢驗，計算診斷模型的臨床檢測確診率。所用ANN采用前饋式反向傳算法，分設3層輸入層4個神經元，1個隱含層含8個神經元，輸出層含1個神經元(見圖一)。設定無腎病組目標輸出值為0，當輸出值在0與0.5之間時，歸入該組；糖尿病早期腎病患者的目標輸出值為1，當輸出值在0.5和1之間時，歸入該組。所有的樣本隨機劃分，2/3樣本作為訓練和驗證組，1/3樣本作為盲法測試組，采用留一法交叉驗證，使訓練樣本盡可能地產生各種組合的訓練集和驗證集，以最大限度減少誤差。從P值最小的蛋白質荷比峰開始逐個增加質荷比數，且分別訓練ANN，篩選出預測準確率最高的蛋白質荷比峰組合，用以建立ANN模型。
7.統計學方法各組檢測數據用均數±標準差(x±s)表示，組間比較用t檢驗，并按照P值大小排列蛋白質荷比峰，P值＜0.05為差異有顯著意義。四格表法評價蛋白質質譜模型對糖尿病早期腎病的診斷價值，并對尿白蛋白質荷比峰值進行ROC(Receiver operating characteristic接受者工作特征)曲線分析。
1.糖尿病組和健康人對照組尿液蛋白質峰譜比較全部芯片在PBS-II型SELDI-TOF-MS進行數據的讀取，結果顯示在優化范圍1000-100000內，芯片共捕獲1000余種蛋白質，健康人和糖尿病患者尿液的蛋白質荷比峰值圖譜有明顯不同。利用Biomarker Wizard初步聚類和峰值分析后，共產生200個左右不同質荷比(M/Z)的峰值圖譜。其M/Z值最低為1008.5.最高為79942.3。包括α1-微球蛋白(M/Z23587.2)、白蛋白(M/Z66696.8)等已知蛋白和多種未知蛋白(M/Z5898.5Da，5281.1Da，4453.5Da，和4139.0Da)，結果參見圖二，其中A、B、C、D、E、F為糖尿病患者和正常人在質荷比為66696.8Da，23587.2Da，，5898.5Da，5281.1Da，4453.5Da，和4139.0Da的蛋白質質譜圖的比較，上三曲線為糖尿病患者；下三曲線為健康對照者。
2.按微量白蛋白尿分組比較(1)對這A、B、C、D四組尿液蛋白質質譜數據均數進行比較，A與B的差異不顯著，只得到5種表達有顯著差異蛋白質，P值位于0.01-0.0468，M/Z值均小于10000。
(2)B、C和D組比較得到73種差異蛋白，M/Z值最低為2197.3；最高為79613.1。而P值＜0.01的有35種，其中8種的M/Z均值隨著尿白蛋白的升高而升高，16種隨著尿白蛋白的升高而降低。白蛋白(M/Z66696.8)和轉鐵蛋白(M/Z79613.1)的差異最明顯，P值分別為9.1E-09和4.35E-08。
(3)再進行B與C的比較發現18種差異蛋白，白蛋白的P值為0.016，而P值比其小的尚有5種，且這5種蛋白的M/Z值均小于10000。
3.蛋白質質譜在糖尿病早期腎病中的診斷價值(1)以53份樣本(30例無腎病組和23例早期腎病組)作為訓練集，留一法交叉驗證，建立ANN并篩選出預測準確率最高的5281.1、4139.0、5898.5和4453.5m/z的4個蛋白質荷比峰。用此預測模型對27份樣本進行盲法測試。結果見表1表1
(2)經過ROC曲線統計分析，得到尿白蛋白質荷比峰值在糖尿病早期腎病診斷中的ROC曲線，同時該曲線下面積為0.8476，與AUC＝0.5比較，差異有統計學意義，結果參見圖三，圖中ROC曲線下面積＝0.8476。
權利要求
1.一種檢測尿液蛋白質指紋圖譜的方法，其特征是通過以下步驟實現(1)尿白蛋白準備根據測定的尿白蛋白分為四組，A組健康對照組，B組尿白蛋白＜30mg/g.cr，C組30≤尿白蛋白≤300mg/g.cr，D組尿白蛋白＞300mg/g.cr，分裝凍存于-80℃低溫冰箱中；(2)數據收集和處理采用PBS-II型表面增強激光解析-電離時間飛行質譜儀進行質譜數據收集，其中激光強度150，檢測敏感度6，收集數據的質荷比范圍為1000～100000，收集位置20～80，平均每點收集20次，收集總點數為140次，并采用H4蛋白質芯片、去離子水、芥子酸基質；(3)對獲得的質譜數據進行檢測是依據由4個質荷比位于5281.1、4139.0、5898.5和4453.5的蛋白質或多肽組成的質譜模型，并利用人工神經網絡分析獲得檢測結果。
2.根據權利要求1所述的一種檢測尿液蛋白質指紋圖譜的方法，其特征是采用人工神經網絡前饋式反向傳算法的方法進行質譜數據的分析。
全文摘要
本發明提供一種檢測尿液蛋白質指紋圖譜的方法，該尿液蛋白質指紋圖譜由4個質荷比(M/Z)位于5281.1、4139.0、5898.5和4453.5的蛋白質或多肽(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修飾前或修飾后)所組成，采用人工神經網絡(Artificial neural networks，ANN)前饋式反向傳算法的方法進行質譜數據的分析。本發明通過檢測尿液蛋白質指紋圖譜，提供一種新的非侵入性的檢測方法，從而為糖尿病腎病早期發現、為進一步尋找早期糖尿病腎病的特異性生物標記、為糖尿病腎病的病機探索和開發新的治療方法提供思路。
文檔編號G01N30/02GK101074943SQ20071006909
公開日2007年11月21日 申請日期2007年6月12日 優先權日2007年6月12日
發明者陳益定, 谷衛, 鄒麗霞, 單鵬飛, 何曉雯 申請人:浙江大學