專利名稱：肉孢子蟲孢子囊和卵囊分子的診斷方法
技術領域：
本發明屬于寄生蟲病的診斷，特別涉及運用基因診斷畜禽和人體的球蟲與球蟲病方法。
背景技術：
以下內容中術語定義卵囊肉孢子蟲從糞便中檢出的階段。一個卵囊含有倆孢子囊。
孢子囊成熟的孢子囊內含有4個子孢子。
包囊肉孢子蟲寄生于肌肉中，呈梭狀，發育成熟的包囊內含有緩殖子。
肉孢子蟲屬的寄生蟲是專性細胞內寄生原蟲，其生活史為頂復門蟲體典型的生活史，包括裂體生殖、配子生殖和孢子生殖。肉孢子蟲是專性異宿主性寄生蟲，即要分別在中間和終末宿主中發育，才得以完成其生活史，肉孢子蟲廣泛寄生于魚類、爬行類、鳥類和哺乳類。由于許多種肉孢子蟲寄生在貓、犬、家畜家禽和人體，引起肉孢子蟲病。家畜及草食性動物一般做為肉孢子蟲的中間宿主，中間宿主吞食了被孢子囊污染的食物或水而受到感染。無性生殖通常在草食性動物或雜食性動物中間宿主體內完成。無性生殖在動物毛細血管內皮和上皮細胞內進行一代至三代的裂體增殖。最后的一代裂殖體在橫紋肌、中樞神經系統以及心臟的浦肯氏纖維和肌束中形成包囊。肉孢子蟲包囊的大小和形態各異，取決于蟲種。而有性生殖只在肉食性動物，通常為貓、犬和靈長類動物，也包括人體內完成。作為終末宿主的肉食動物捕食或吞食到含有肉孢子蟲包囊的肌肉組織和神經組織而被感染，包囊在胃和小腸被消化，釋出緩殖子，緩殖子積極活動，侵入小腸粘膜，發育為大雌、小雄配子母細胞，進而發育為大、小配子。受精后產生壁包裹合子形成卵囊，卵囊在小腸固有層進行孢子生殖，孢子生殖完成的孢子化卵囊內含有兩個孢子囊，每個孢子囊內又含有4個子孢子。孢子化卵囊壁小于1微米，常易破裂，于是單個游離的孢子囊釋放入腸腔，隨終末宿主糞便排到外界。從終末宿主吞食包囊后到卵囊和孢子囊首次出現在糞便中的時間一般需7-14天。
肉孢子蟲的分類根據主要包括包囊，特別是包囊壁上突起的光鏡和電鏡結構；同工酶；終末宿主和中間宿主的特異性，特別是后者，一般認為肉孢子蟲的中間宿主有很嚴格的特異性，而從終末宿主排出的孢子囊和卵囊形態在蟲種鑒別上沒有意義，因為包囊采集方便，可以直接用于蟲種鑒定，因此，用分子手段研究肉孢子蟲，均以包囊為材料，而卵囊和孢子囊的收集困難，難于鑒定蟲種，所以卵囊和孢子囊的分子標記研究一直滯后于包囊，目前幾乎所有的研究手段都不能夠從卵囊和孢子囊形態鑒別蟲種，尤其比較難于直接從糞便中檢出卵囊和孢子囊并鑒別蟲種。但是，在流行病學調查中需要判斷何種肉孢子蟲感染了終末宿主，而2004年，在Elsheikha HM，Murphy AJ，Mansfield LS.2004.Prevalence of Sarcocystisspecies sporocysts in Northern Virginia opossums(Didelphis virginiana).Parasitol.Res.93(5)427-431.報導了取自剖殺負鼠的小腸上皮粘膜的刮拭物的孢子囊和卵囊，其孢子囊和卵囊的數量大，易于研究。十分明顯的是，該方法不能運用于人體感染性疾病的臨床診斷。2006年，Elsheikha HM，Murphy AJ，Trembley SJ，Mansfield LS，Ghanam MS，el-GarhyMF.2006 Molecular and microscopic techniques for detection of Sarcocystis neuronasporocysts in fecal samples.J Egypt Soc Parasitol.Aug；36(2)713-25.該研究集中于一個蟲種，從實驗感染的動物糞便里收集到的卵囊和孢子囊，并進行PCR擴增，實驗感染動物往往感染量大，可以獲得大量的材料，然而，人體或者動物自然感染后在糞便中的樣本數量極為稀少，且該報導未涉及蟲種鑒定。
發明內容
本發明目的是改變在分子手段研究肉孢子蟲中均以包囊為材料的一般方法，針對內孢子蟲卵囊和孢子囊階段在形態上相似，體積微小，從糞便排出的數量極為稀少，蟲種鑒別十分困難，而此階段的鑒定又極具重要價值和急需的現狀，提供靈敏度和特異性高、臨床檢測方便、從分子形態鑒別肉孢子蟲孢子囊和卵囊蟲種的基因診斷方法。
本發明通過以下步驟和內容實現1)取少量的糞便加入適量37％ZnSO4硫酸鋅漂浮液離心管中，離心后靜置；2)用吸管吸取或用接種環沾取離心管中最上層的浮液數滴移在載玻片上，以)100倍的顯微鏡檢查，用清潔紙片從玻片或者離心管中粘起孢子囊和卵囊放入另一只離心管低溫保存；3)包含具有表1為引物，PCR擴增所覆蓋的肉孢子蟲孢子囊和卵囊的18SrRNA基因區段1500-2000bp核苷酸或其任何一部份核苷酸片段，或作為引物用于PCR擴增，或作為探針用于雜交反應，或制備基因芯片或微陣列，或者用于酶切分析；表1用于肉孢子蟲18S rRNA基因的PCR和測序引物
*根據Holmdahl(1994)的梭狀肉孢子蟲系列位置定位4)對各蟲種的特異性的擴增片段，用選自表2中限制性內切酶和反應條件進行酶切反應，酶切反應的體積為10-20ul，結果用凝膠檢測，表2.用于肉孢子蟲18S rRNA基因酶切分析的酶及其酶切條件
或者用表1的引物作為測序引物檢測核苷酸序列。
所述的引物選自表3，通過PCR擴增引物所覆蓋的肉孢子蟲卵囊不同專一靶區域DNA片段，表3用于肉孢子蟲18S rRNA基因的PCR和測序引物
*根據Holmdahl(1994)的梭狀肉孢子蟲系列位置定位。
所述的引物在PCR擴增優化反應條件中，擴增肉孢子蟲基因的引物的組合及條件如表4表4.用于肉孢子蟲18S rRNA基因的PCR和測序引物的組合及條件
注長時間預變性，即預變性97℃，5分鐘后置于冰上，才加1.25U的DNA聚合酶。所述的引物用于肉孢子蟲18S rRNA基因的PCR和測序引物進一步為表5所列引物表5用于肉孢子蟲18S rRNA基因的PCR和測序引物
在巢式PCR反應中，第一次PCR引物組合為18S 2L、18S 2H，第二次PCR引物組合為18S2L、18S 3H。
所述的酶切反應的限制性內切酶進一步為表6之一種或幾種組合表6.用于肉孢子蟲18S rRNA基因酶切分析的酶及其酶切條件
本發明具有的效果是人肉樣肉孢子蟲(S.hominis-like)，梭狀肉孢子蟲(S.fusiformis)肉孢子蟲可以獲得7個卵囊的肉孢子蟲，對于卵囊的總DNA 18SrRNA基因的PCR-RFLP或18SrRNA基因的PCR-測序分析，能夠鑒別出蟲種。其它如豬人肉孢子蟲(S.suihominis)、米氏肉孢子蟲(S.miescheriana)、人肉孢子蟲(S.hominis)、毛狀肉孢子蟲(S.hirsuta)、黃牛枯氏肉孢子蟲(S.cruzi)、萊氏內孢子蟲(S.levinei)、毛狀樣肉孢子蟲(S.hirsuta-like)、人肉樣肉孢子蟲(S.hominis-like)、水牛枯氏肉孢子蟲(S.cruzi-like)、梭狀肉孢子蟲(S.fusiformis)及其本屬的其他肉孢子蟲，根據前期工作的積累應該具有同樣效果。
本發明應用濃集法檢查肉孢子蟲孢子囊，能夠收集糞便中數量極為稀少、容易漏檢的卵囊和孢子囊；PCR擴增引物與目前報導不同而能夠覆蓋肉孢子蟲卵囊所有基因片斷，并將鑒定各蟲種的特異性的限制性內切酶用于肉孢子蟲卵囊的診斷及其蟲種鑒定，從而，提供了卵囊和孢子囊收集、鑒定的全新方法，取得了實質性突破，在細胞分子生物學水平上達到了從孢子囊和卵囊階段鑒別蟲種的目的，具有重要的公共衛生學意義和經濟價值。
圖1為以18S2L3H為引物幾種肉孢子蟲卵囊酶酶切反應的膠圖。
具體實施例方式
(一)肉孢子蟲孢子囊和卵囊分子的診斷方法實施例一酶切分析1(PCR-RFLP)1.1.糞便檢查和收集孢子囊和卵囊，包括制備37％ZnSO4硫酸鋅漂浮液(ZuSO4·7Rz03319加蒸餾水1000ml)，取糞1g加入37％ZnSO4硫酸鋅漂浮液100ml，加入15ml離心管中。置離心管下離。用吸管吸取離心管中最上層的浮液數滴移在載玻片上，以150倍的顯微鏡檢查。用清潔紙片粘起見到的孢子囊和卵囊。將紙片放入1.5ml離心管，-20℃保存。
1.2.通過PCR擴增獲得目的DNA片段1.2.1PCR擴增條件1.2.1.1每50ul反應體積，具有10×Buffer 5ul，dNTPs 2ul，BSA 2ul，引物12ul、引物22ul，Taq酶1.25U，總DNA 2ul，余量為去離子水。
1.2.1.2在PCR反應條件中，有的引物需要長時間預變性，即預變性97度，5分鐘后置于冰上，加1.25U的DNA聚合酶，有的引物則不需要此步驟，如下表2。
表2.擴增肉孢子蟲基因的引物的組合及其擴增條件
用于酶切的反應產物來源于巢式PCR反應產物，第一次PCR18s 2L、18s 2H，第二次PCR 18s 2L、18s 3H為引物組合為下表。
表.擴增肉孢子蟲基因的引物的組合及其擴增條件
1.3.PCR反應的目的片段用于限制性內切酶消化反應。
酶切反應原料的體積為10-20ul，其中含有2ul的酶反應10×Buffer，適量DNA和5U酶，余量用雙蒸水補足。將上述反應原料混勻，根據不同酶的最適反應溫度條件，放入相應溫箱，放置一定的時間。如下表3表3.用于肉孢子蟲18S rRNA基因酶切分析的酶及其酶切條件
1.4.PCR擴增獲得目的DNA片段用于酶切限制性內切酶消化反應結果由不同種獲得的分子量不同大小的DNA片段，如下表劃分成不同的型
以18S2L3H為引物幾種肉孢子蟲卵囊酶酶切反應的膠圖為附圖1。
實施例二酶切分析2(PCR-RFLP)2.1糞便檢查和收集孢子囊和卵囊，包括制備37％ZnSO4硫酸鋅漂浮液(ZuSO4·7Hz03319加蒸餾水1000ml)，取糞1g加入37％ZnSO4硫酸鋅漂浮液100ml，加入15ml離心管中。置離心管下離。用吸管吸取離心管中最上層的浮液數滴移在載玻片上，以130倍的顯微鏡檢查。用清潔紙片粘起見到的孢子囊和卵囊。將紙片放入1.5ml離心管，-20℃保存。
2.2通過PCR擴增獲得目的DNA片段2.2.1PCR擴增條件2.2.1.1每50ul反應體積，具有10×Buffer 5ul，dNTPs 2ul，BSA 2ul，引物12ul、引物22ul，Taq酶1.25U，總DNA 2ul，余量為去離子水。
用于酶切的反應產物來源于巢式PCR反應產物，第一次PCR18s 2L、18s 2H，第二次PCR 18s 3L、18s 3H為引物組合為表//。其中，長時間預變性，即預變性97度，5分鐘后置于冰上，加1.25U的DNA聚合酶。用發明內容表5的引物組合，按下表的條件擴增。
表//.擴增肉孢子蟲基因的引物的組合及其擴增條件
2.3限制性內切酶消化反應，PCR反應的目的片段用于酶切。
酶切反應原料的體積為10-20ul，其中含有2ul的酶反應10×Buffer，適量DNA和5U酶，余量用雙蒸水補足。將上述反應原料混勻，根據不同酶的最適反應溫度條件，放入相應溫箱，放置一定的時間。如下表6表6.用于肉孢子蟲18S rRNA基因酶切分析的酶及其酶切條件
實施例三用表1用于肉孢子蟲18S rRNA基因研究的PCR和測序的引物，進行測序。
3.1糞便檢查和收集孢子囊和卵囊，包括制備37％ZnSO4硫酸鋅漂浮液(ZuSO4·7Hz03319加蒸餾水1000ml)，取糞1g加入37％ZnSO4硫酸鋅漂浮液100ml，加入15ml離心管中。置離心管下離。用吸管吸取離心管中最上層的浮液數滴移在載玻片上，以200倍的顯微鏡檢查。用清潔紙片粘起見到的孢子囊和卵囊。將紙片放入1.5ml離心管，-20度保存。
3.2通過PCR擴增獲得目的DNA片段3.2.1PCR擴增條件3.2.1.1每50ul反應體積，具有10×Buffer 5ul，dNTPs 2ul，BSA 2ul，引物12ul、引物22ul，Taq酶1.25U，總DNA 2ul，余量為去離子水。
3.2.1.2在PCR反應條件中，長時間預變性同1.2.1.2，并與上述發明內容中表2相同。
表2.幾種擴增肉孢子蟲基因的引物的組合及其擴增條件
3.3PCR反應的結果，目的片段純化后，測序。
PCR擴增的目的片段-人肉孢子蟲28h7ho株18SrRNA基因部分序列核苷酸測序結果人肉孢子蟲28h7ho株18SrRNA基因部分序列1 tggataaccg tggtaattct atggctaata catgcgcaaa tactatatct ttacgatata61 gtagtgttta ttagatacag aaccaacacg ctcctttttg ggggtgtcaa aattaggtga
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權利要求
1.肉孢子蟲孢子囊和卵囊分子診斷方法，包括以下步驟和內容1)取1-2g的糞便加入適量37％ZnSO4硫酸鋅漂浮液離心管中，離心后靜置；2)用吸管吸取或用接種環沾取離心管中最上層的浮液數滴移在載玻片上，以大于100倍的顯微鏡檢查，用清潔紙片從玻片或者離心管中粘起孢子囊和卵囊放入另一只離心管低溫保存；3)包含其有表1為引物，PCR擴增所覆蓋的肉孢子蟲孢子囊和卵囊的18SrRNA基因區段1500-2000bp核苷酸或其任何一部份核苷酸片段，或作為引物用于PCR擴增，或作為探針用于雜交反應，或制備基因芯片或微陣列；表1用于肉孢子蟲18SrRNA基因的PCR和測序引物
*根據Holmdahl(1994)的梭狀肉孢子蟲系列位置定位4)對各蟲種的特異性的擴增片段，或做酶切分析，或用表1的引物作為測序引物檢測核苷酸序列，進行酶切分析時，用選自表2中限制性內切酶和反應條件進行酶切反應，酶切反應的體積為10-20ul，結果用凝膠檢測，表2.用于肉孢子蟲18SrRNA基因酶切分析的酶及其酶切條件
2.根據權利要求1所述的肉孢子蟲孢子囊和卵囊分子診斷方法，其特征在于用選自表3的引物，道過PCR擴增引物所覆蓋的肉孢子蟲卵囊不同專一靶區域DNA片段，表3用于肉孢子蟲18S rRNA基因的PCR和測序引物
*根據Holmdahl(1994)的梭狀肉孢子蟲系列位置定位。
3.根據權利要求1所述的肉孢子蟲孢子囊和卵囊分子診斷方法，其特征在于PCR擴增優化反應條件中，擴增肉孢子蟲基因的引物的組合及條件如表4表4.用于肉孢子蟲18S rRNA基因的PCR和測序引物的組合及條件
注長時間預變性，即預變性97℃，5分鐘后置于冰上，才加1.25U的DNA聚合酶。
4.根據權利要求1所述的肉孢子蟲孢子囊和卵囊分子診斷方法，其特征在于用于肉孢子蟲18S rRNA基因的PCR和測序引物進一步為表5所列引物的組合表5用于肉孢子蟲18S rRNA基因的PCR和測序引物
。
5.根據權利要求4所述的內孢子蟲孢子囊和卵囊分子診斷方法，其特征在于在巢式PCR反應中，第一次PCR引物組合為18S 2L、18S 2H，第二次PCR引物組合為18S 2L、18S 3H。
6.根據權利要求1、2、3、4或5所述的肉孢子蟲孢子囊和卵囊分子診斷方法，其特征在于酶切反應的限制性內切酶進一步為表6之一種或幾種組合表6.用于肉孢子蟲18S rRNA基因酶切分析的酶及其酶切條件
。
全文摘要
肉孢子蟲孢子囊和卵囊分子的診斷方法，屬于寄生蟲病的診斷，涉及基因診斷畜禽和人體的球蟲與球蟲病。本發明目的是改變以包囊檢測肉孢子蟲的一般方法，提供基因診斷方法。包括取少量糞便加入37％ZnSO
文檔編號G01N33/50GK101092646SQ20071006568
公開日2007年12月26日 申請日期2007年2月15日 優先權日2007年2月15日
發明者楊照青, 向征, 左仰賢, 張亞平, 陳新文, 周本江, 雷霖 申請人:昆明醫學院