專利名稱：一種定量檢測人自身抗體的化學發光配體分析方法
技術領域：
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本發明涉及生物醫學技術領域，是一種用于體外定量檢測人體內自身抗體的化 學發光配體(納米磁顆粒)定量分析方法。
背景技術：
自身免疫性疾病(Autoimmune diseases)是指機體對自身抗原發生免疫反應而 導致自身組織、器官損傷和相應功能障礙所引起的一大類疾病。目前已被公認的自 身免疫疾病至少有30多種。人體的生長、發育和生存有完整的自身免疫耐受機制的 維持，正常的免疫反應有保護性防御作用，即對自身組織、成分不發生免疫反應。 一旦自身耐受的完整性遭到破壞，則機體視自身組織、成分為"異物"，從而發生 自身免疫反應，產生自身抗體。因此人自身抗體是指人體對自身組織、器官、細胞 及細胞成分發生免疫反應而產生的抗體。
正常人體液中可以有低滴度的自身抗體，但不會發生疾病。伹如果自身抗體的 滴度超過一定水平，就可能對身體產生損傷，誘發疾病。自身抗體的產生可能是致 病抗原(細菌、病毒等)與自身成分之間存在某些相同的分子結構出現了與自身抗 原發生交叉反應的免疫應答；也可能是某些感染因素使自身抗原變性，免疫系統對 這些暴露的新抗原產生自身抗體。 一些特定自身抗體的定量檢測對于許多疾病的珍 斷、預防、治療及療效評價都具有十分重要的意義。如甲狀腺過氧化物酶自身抗體 (TPO-Ab)、甲狀腺球蛋白自身抗體(TG-Ab)、甲狀腺微粒體自身抗體(TM-Ab) 和谷氨酸脫羧酶65自身抗體(GAD65-Ab)、胰島細胞自身抗體(ICA)、胰島素自 身抗體(IAA)等，下面以甲狀腺過氧化酶物自身抗體(TPO-Ab)為例作具體說明。
甲狀腺過氧化物酶(TPO)是甲狀腺細胞中的膜結合酶，分子量約為100KDa， 它是三種甲狀腺抗原之一，對甲狀腺荷爾蒙合成有重要作用。TPO自身抗體通過細 胞介導和抗體依賴的細胞毒作用使甲狀腺激素分泌不足造成自身免疫相關的甲狀腺 機能減退，自身免疫性甲狀腺疾病的一個特點就是存在甲狀腺抗原的自身抗體。因 而，TPO自身抗體的檢測有助于確定慢性自身免疫性甲狀腺炎和對甲狀腺功能減退 分型。TPO自身抗體檢測對甲亢也有重要價值，尤其是臨床癥狀有懷疑而 TSH-REZAK⑧檢測陰性的病例。另外對甲狀腺功能正常的甲狀腺腫排除并生的甲狀 腺自身免疫疾病有幫助。
目前國內的自身抗體檢測試劑盒大多采用ELISA技術，如武漢博士德生物工程 有限公司TPO自身抗體檢測試劑盒采用ELISA技術。ELISA方法主要采用TPO抗 原包被微孔板，與TPO自身抗體反應后通過加入酶標記第二抗體和顯色底物進行檢 測，屬于間接法進行定性檢測。該方法無法對自身抗體進行準確定量，因此不能為 自身免疫性疾病的診斷及療效評價提供可靠依據。北京倍愛康生物技術股份有限公 司提供了 一種人甲狀腺過氧化物酶抗體酶聯免疫檢測方法用重組人甲狀腺過氧化 物酶抗原包被免疫磁珠作為固相，使之與自身抗體反應后進行固液分離，然后加入堿性磷酸酶標記的山羊抗人IgG抗體(第二抗體)和底物進行顯色檢測，該方法屬 于ELISA間接法測定。
本發明采用酶促化學發光免疫分析技術及自創的葡萄球菌蛋白A包被納米磁顆 粒配體技術，利用葡萄球菌蛋白A能與人和小鼠體內的免疫球蛋白IgG的Fc結合 位點發生反應的共同特性，用辣根過氧化物酶標記的抗原分別與標準品中的單克隆 抗體以及樣品中的人血清自身抗體結合形成抗原-抗體免疫復合物。然后在包被于納 米磁顆粒表面的蛋白A作用下形成三明治式復合體系，用單克隆抗體標準品建立標 準曲線，建立配體法化學發光免疫定量分析方法，用于自身免疫性疾病的診斷及治 療效果的觀察。本方法屬于直接法定量檢測，可以準確定量檢測自身抗體的濃度。 本方法中作為標準品的單克隆抗體與血清樣品中的自身抗體并不進入同一反應體 系，只是利用了它們具有與蛋白A特異性結合的共性進行對照，因此不會發生交叉 反應，所以檢測效果具有特異性強、靈敏度及準確度高等優點，且不會出現假陰性 或假陽性現象。
發明內容
本發明的目的在于建立一種人血清中自身抗體的快速、準確的定量檢測技術平 臺，可用于多種自身抗體的定量檢測。
一種定量檢測人自身抗體的化學發光配體分析方法，將化學發光免疫定量檢測 CLIA技術與納米磁顆粒配體技術相結合，是一種基于配體檢測原理的直接測定方 法，其核心在于巧妙地利用葡萄球菌蛋白A (SPA)能與人和小鼠體內的免疫球蛋 白IgG的Fc結合位點發生反應的共同特性，用自創SPA包被納米磁顆粒配體技術 建立自身抗體的化學發光配體定量免疫分析方法。下面以甲狀腺過氧化酶物 (Thyroid peroxidase, TPO)自身抗體(TPO-Ab)的定量檢測為例作具體說明。
首先將蛋白A包被于納米磁顆粒表面，利用高親和力、高特異性的單克隆抗體 配制標準品(用以建立標準曲線)，用相對過量的標記抗原(高度純化的TPO-HRP) 分別與標準品中的TPO單克隆抗體及血清樣品中的TPO自身抗體結合形成免疫復 合體。該復合體在包被于納米磁性顆粒表面的蛋白A的作用下，形成三明治式復合 體系，因為蛋白A會被(TPO-Ab)-TPO-HRP免疫復合體的Fc部分結合。其中蛋白 A部分包被于納米磁性顆粒表面上，從而形成一個固相，以磁板進行固液相分離。
吸去含有未結合標記物的上清液并洗珠后，加入增強型化學發光底物工作液， 工作液中的發光底物魯米諾在辣根過氧化物酶(HRP)的催化和發光啟動試劑 (NaOH+H202)作用下發光。魯米諾的最大發射光波長為425nm,由于魯米諾體系的 發光為閃光型且信號較弱，因此我們使用四苯硼鈉和肉桂酸作為聯合增強劑以增強 發光信號。發光強度依賴于免疫反應中辣根過氧化物酶的濃度。反應20min后測定 其相對發光值RLU，用TPO單克隆抗體配制的標準品建立標準曲線，可從標準曲 線上查出病人TPO自身抗體的濃度值。
樣品或標準品中TPO-Ab濃度越高則標記物特異性結合越多，因此所檢測到的 發光強度也越強，即其相對發光值RLU是與TPO-Ab濃度成正比的。在樣品中沒有TPO-Ab的情況下無免疫體系形成，因為酶標記物僅結合TPO-Ab,而不結合蛋白A。 本方法中作為標準品的單克隆抗體與血清樣品中的自身抗體并不進入同一反應 體系，只是利用了它們具有與SPA特異結合的共性進行對照，因此不會發生交叉反 應，所以檢測效果具有特異性強、靈敏度及準確度高等優點，且不會出現假陰性或 假陽性現象。本方法成功地解決了自身抗體無法準確定量檢測的難題，是未來標記 免疫分析技術發展的新方向。
定量檢測人自身抗體的化學發光配體分析方法，以TPO自身抗體為例，其研制 方法如下
1) 試劑盒組成成分
TPO-Ab化學發光配體定量免疫分析診斷試劑盒的主要組分為標記物一一
TPO-HRP,標準品——TPO單克隆抗體，配體試劑——SPA-納米磁顆粒，增強型化 學發光底物工作液——A液和B液，洗滌液；
2) 試劑盒各組分的制備
(1) 辣根過氧化物酶HRP標記抗原TPO的制備在過碘酸鈉的作用下，用HRP 標記TPO形成TPO-HRP:采用透析法和HPLC進行二次純化；
(2) 特異性單克隆抗體的制備通過細胞融合雜交瘤技術制備TPO單克隆抗體 (TPO-Ab)，將其作為繪制參照曲線的標準品；
(3 )葡萄球菌蛋白A(SPA) —納米磁顆粒制備將SPA通過碳二亞胺包被于有機石丄 烷化磁性納米粒子表面； (4)增強化學發光底物工作液的優化配制以魯米諾為發光底物，采用四苯硼鈉、
肉桂酸和魯米諾按一定比例配制作為增強型化學發光底物工作液以提高發光強度；
3) TPO-Ab化學發光配體(納米磁顆粒)定量分析方法及臨床檢測標準的建立
(1) 建立人血清中TPO-Ab的化學發光配體(納米磁顆粒)定量分析方法，并制定該 試劑盒的實驗操作方法及質量控制標準；
(2) TPO-Ab化學發光配體定量分析診斷試劑盒的小試及部分臨床實驗
采集臨床標本，用本試劑盒測定受檢者血清中TPO-Ab的準確含量，大量臨床 試驗結果顯示，其臨床符合率》95%;因此，本試劑盒的TPO-Ab臨床測定值，可 為自身免疫性甲狀腺疾病診斷、早期干預治療、正確用藥及療效評價提供可靠依據；
4) 建立一個成熟、靈敏、高效的自身抗體化學發光配體(納米磁顆粒)定量檢測技 術平臺，可利用本方法開發大量的人自身抗體系列化學發光配體(納米磁顆粒)定 量分析診斷試劑盒，形成一個全新的自身抗體化學發光配體(納米磁顆粒)定量檢 測試劑盒的研發和生產體系。
定量檢測人自身抗體的化學發光配體分析方法，以TPO自身抗體為例，本試劑
盒的實驗操作程序如下
(1) 將實驗所需試劑及樣本放置室溫，平衡至少30分鐘以上才可進行操作；
(2) 取一塊微孔板進行編號，所有實驗均做雙孔重復；
(3) 取各個濃度的標準品、質控血清和樣品25-20(^1加入相應編號的孔中；
(4) 每孔均各加入50~200pl TPO-HRP;(5) 倒置充分混勻SPA-納米磁顆粒，每孔均各加入25 150plSPA-納米磁顆粒；
(6) 充分混勻，室溫振蕩1 4小時；
(7) 將其放在磁板上吸附磁顆粒，吸去上清液；
(8) 去除磁板，每孔均各加入200~1000nl洗板液；
(9) 振蕩4 15秒后，將其放在磁板上吸附磁顆粒，吸去上清液；
(10) 重復一遍步驟8、 9;
(11) 每孔各加入發光增強A液100-300^1;
(12) 每孔加各入發光增強B液100~300pl;
(13) 用化學發光儀測定每孔的發光強度；
(14) 從標準曲線上讀取樣品及質控血清的濃度。
圖1 SPA結合率圖
圖2 TPO-Ab化學發光配體(納米磁顆粒)定量分析原理示意圖
具體實施例方式
本方法的內容，通過以下實施例作具體說明 TPO自身抗體化學發光配體(納米磁顆粒)定量分析方法的建立 (一)試劑盒各組分的制備
TPO-Ab化學發光配體定量分析診斷試劑盒主要組分為標記物(TPO-HRP), 標準品(TPO單抗)，配體試劑(SPA-納米磁顆粒)，增強型化學發光工作液，洗滌 液。 _ 1、標記抗原(TPO-HRP)的制備及檢測 a、制備采用過碘酸鈉酶法標記技術制備TPO-HRP:
(1)稱取TPO 2.0mg放入5ml玻璃瓶內，加入l.Oml ( 0.05mol/L， pH7.5 )碳酸 鹽緩沖液溶解，4'C儲存備用；
(2 )稱取10.0mg的HRP放入一只16xl00mm玻璃試管內，加入l.Oml去離子水， 振蕩，待其完全溶解后，取出0.74ml放入另一只16xl00mm玻璃試管內，加入 0.lmol/L的NaI04溶液0.2ml (NaI04溶液必須新鮮配制)，用膠塞將玻璃試管口塞 緊，室溫下避光反應2小時；
(3)取出已溶解好的TPO抗原(步驟l)加入至得自步驟(2)的混合液中，室 溫下避光反應3小時；
(4 )加入濃度為5mg/ml的用O.lmmol NaOH溶解的NaBH4溶液(NaBH4必須新 鮮配制)，室溫下避光反應0.5小時；
(5 )將上述反應液裝入透析袋中，用0.01 mol/LPBS pH7.5緩沖液進行透析，4°C 放置過夜；
(6)更換透析液后再繼續透析，4t:放置過夜；
(7 )收集反應液加入等體積的含10%BSA的O.Olmol/LPBS pH7.5緩沖液；
8(8 )用高壓液相色譜法進行二次純化，收集蛋白峰1.47ml并于-20'C下冷凍保存。 b、 HRP標記抗原的純度檢測用紫外分光光度法測得HRP濃度為0.78mg/ml， TPO 濃度為1.35mg/ml。
因此其摩爾濃度之比為HRP:TPO( 0.78+40000) : ( 1.35+100000)=1.44:1.00。 結合物中酶總量=0.78mg/mlx 1.47ml = 1.15 mg 酶結合率(％) =(1.15 mg〃.4 mg) x 100%= 15.54% 抗原標記率(1.35mg/mlx 1.47ml )/2.0 mgxl00%=99.23%
"酶標抗原的活性檢測
用瓊脂擴散法使酶標抗原與TPO單克隆抗體形成沉淀線，經PBS漂洗1天， 再以蒸餾水浸泡l小時，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，結果出現較強的顏 色反應，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結合物既有酶活性，也有抗體活 性。結合物在顯色后，瓊擴滴度達1:26，表明酶標抗原性能良好。 d、酶標抗原工作濃度的確定
用O.Olmol/LPBS緩沖液(pH=7.5)將酶標抗原分別按1:500、 1:750、 1:1000、 1:1500和1:2000、 1:2500、 1:3000、 1:4000和1:5000的倍數稀釋，以CLIA方法 進行方陣滴定，結果顯示當稀釋度為1:3000時反應模式最好，也說明酶標抗原具有 良好的酶活性及抗原活性。因此確定酶標抗原的工作濃度為 1.35mg/ml+300(^0.45嗎/ml。
2、 TPO單克隆抗體的制備及性能檢測 (O抗原提純與動物免疫
甲狀腺過氧化物酶(TPO)加完全福氏佐劑并經充分乳化，選擇與所用骨髓瘤細 胞同源的BALB/c健康小鼠進行動物免疫。末次免疫后3 4天，分離融合后的脾細 胞。
(2) 骨髓瘤細胞及飼養細胞的制備
采用Sp2/0骨髓瘤細胞株進行培養，在融合前先用含8-氮鳥嘌呤的培養基作適 應培養，在細胞融合的前一天用新鮮培養基調細胞濃度為2xl0S/ml，次日一般即為 對數生長期細胞。采用小鼠腹腔細胞為飼養細胞(feedercell)。
(3) 細胞融合
將骨髓瘤細胞與脾細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。其后用培養液稀釋 PEG,消除PEG的作用。將融合后的細胞適當稀釋，分置培養板孔中培養。
(4) 有限稀釋法篩選陽性細胞株 篩選陽性株選用的骨髓瘤細胞為HAT敏感細胞株。融合細胞呈克隆生長，經有
限稀釋后吸取培養上清，用ELISA檢測抗體含量。篩選出高抗體分泌孔，將孔中細 胞再進行克隆化，然后進行抗原特異的ELISA測定，選擇高分泌特異性細胞株進行 擴大培養或凍存。
(5) 單克隆抗體的制備和凍存
抗體制備采用小鼠腹腔接種法，選用BALB/c小鼠或其親代小鼠進行腹腔注射。 通常在接種一周后即有明顯的腹水產生。選出陽性細胞株并及早凍存。(6) 單克隆抗體的純化
用葡萄球菌蛋白A親和層析柱純化單克隆抗體，回收率達90%以上。洗脫液中 的抗體濃度用紫外光吸收法粗測。經低pH洗脫液洗脫后在收集管內預置中和液或 速加中和液，以保持純化抗體的活性。
(7) 單克隆抗體的性能檢測 我們對單克隆抗體的滴度、純度及特異性和親和力等進行了全面鑒定,其主要技
術指標如下-
TPO單克隆抗體主要技術指標
ELISA滴度1: (1.21X105)
檢測靈敏度<4.93pg/mL
交叉反應率<0. 1%
親和常數5.16xl0，1
滴度檢測以TPO為檢測抗原，通過間接ELISA法測定抗體滴度，其滴度(于 1.0mg/ml) =1: (1.12x105)。
純度檢測經提取純化后用非還原SDS-PAGE法檢測單抗純度，結果在160 kD 左右有一條清晰的條譜帶，經蛋白A親和層析其純度達95%以上。
特異性抗TPO單抗的特異性良好，不與人血清A蛋A結合反應，來自ANA、 DNA以及風濕因子的干擾很小，交叉反應率<0.1%。
親和力檢測根據Beatty等人所建立的方法，以5、 2.5、 1.25和0.625pg/ml 4 個濃度TPO稀釋液依次包被微孔板,通過作圖法取其最大OD值一半(即OD的50%) 處對應的抗體濃度。代入公式K= (n - 1) /2 ( nAb，-Ab)計算親和常數,式中Ab和Ab' 分別表示當抗原濃度為Ag和Ag，時，產生半數吸光值的抗體濃度(mol/L)，i^Ag/Ag'。 求其平均數得親和常K-5.16xlO^M—1。 3 、 SPA—納米磁顆粒的制備
(1) SPA—納米磁顆粒的制備我們對納米磁顆粒與SPA的反應比例進行了一系列 探討試驗。具體制備方法如下
① 取5 mg有機硅垸化磁性粒子，用重蒸水洗1 - 2次；
② 用0.02mol/LpH5.6-6.2的PBS洗一次；
③ 用0.02mol/LpH5.6-6.2的PBS調整總體積約為10ml;
④ 加一定量SPA放在搖床上進行勻化10—20分鐘，SPA的具體質量根據納米 磁顆粒與SPA的反應質量比而定；
加入碳二亞胺(EDC )約5. Omg;
◎室溫反應，放在搖床上進行勻化10小時；
⑦ 用0.1mol/LpH7.4PBS+0.1。/。BSA洗滌三次；
⑧ 用重蒸水洗3次；
⑨ 用0.lmoI/L pH7.4PBS洗3次；
⑩ 用0.05mol/LTris+0.004mol/LEDTApH7.5緩沖液洗3次； 用0.05mol/L Tris+0.004mol/L EDTA pH 7.5緩沖液定容為1.0mg/ml， 2-4°C
保存，待用。
(2) SPA結合量的測定SPA結合量一般以每毫升或每克有機硅烷化納米磁顆粒偶 聯SPA的量表示，其數值可用作決定親和吸附劑實際用量的參數，采用直接測定法 測定結合量。
將納米磁顆粒與SPA按不同比例進行包被反應，測定SPA的結合率。測定結果 顯示，當磁顆粒與SPA的比例至1:50時，SPA的結合量近乎飽和，因此，我們所 采用的磁顆粒與SPA的比例為1:50。
SPA結合率測定結果
納米磁顆粒/SPA1:51:101:201:501:751:100
SPA結合率(。/。)25.6438.1347.1862.7163.7664.97
4、 增強型化學發光底物工作液的配制
(1) 配制0.05 mol/L pH 9.0的Tris-HCl緩沖液
(2) A液在上述Tris-HCl緩沖液中加入4.58mmol/L魯米諾。
(3) B液在上述Tris-HCl緩沖液中加入以下物質
① 0.81 mmol/L四苯硼鈉；
② 0.38 mmol/L肉桂酸；.
③ 7.56mmol/L過氧化氫。
5、 洗滌液的配制
① TrisBase 6.05g/L;
② NaCl 8.55/L;
③ Tween-20 0.5ml/L;
④ 用HCl調pH至7.8士0丄 (三)試劑盒實驗操作方法及步驟
建立TPO-Ab化學發光配體定量分析方法，采取的實驗操作步驟如下
(1) 將實驗所需試劑及樣本放置室溫，平衡至少30分鐘以上才可進行操作；
(2) 取一塊微孔板進行編號，所有實驗均做雙孔重復；
(3) 取各個濃度的標準品、質控血清和樣品25 200nl加入相應編號的孔中；
(4) 每孔均各加入50~200pl TPO-HRP;
(5) 倒置充分混勻SPA-納米磁顆粒，每孔均各加入25 150plSPA-納米磁顆粒;
(6) 充分混勻，室溫振蕩1 4小時；
(7) 將其放在磁板上吸附磁顆粒，吸去上清液；
(8) 去除磁板，每孔均各加入20(M000nl洗板液;
(9) 振蕩4 15秒后，將其放在磁板上吸附磁顆粒，吸去上清液；
(10) 重復一遍步驟8、 9;
(11) 每孔各加入發光增強A液100-30(^1;(12) 每孔加各入發光增強B液100~300pl;
(13) 用化學發光儀測定每孔的發光強度；
(14) 從標準曲線上讀取樣品及質控血清的濃度。
本試劑盒靈敏度可達0.1U/mL，且無明顯交叉反應，準確度達95-105%，標準 曲線滿足臨床標本所需的測量范圍為0. l-2000U/mL，臨床符合率>95%。
1、自身免疫性甲狀腺疾病及對照組TPO-Ab檢測結果比較
組別例數檢出例數檢出率
甲亢組14313896.50%
甲低組13212695.45%
正常人組11700
2、臨床結果分析統計
甲幾甲低備注
靈敏度(真陽性率)96.50%95.45%
特異度(真陽性率)100%100%
假陽性率0%0%
假陰性率3.50%4.55%
粗一致性(Crude agreement)98.08%97.59%
調整一致性(adjusted agreement)98.10%97.64%
約登指數(youden's index)0.96500.9545
陽性試驗的預示值100%100%
陰性試驗的預示值95.90%95.12%
用本試劑盒測定受檢者血清中TPO-Ab的含量，正常人血清中TPO-Ab檢出率 為0;甲亢患者組TPO-Ab檢出率為96.50%;甲低患者組TPO抗體檢出率為95.45%。 因此，本試劑盒的TPO-Ab臨床測定結果，具有靈敏度及準確度高，特異性強，檢 測結果準確可靠等優點，可為自身免疫性甲狀腺疾的病早期診斷、早期干預治療、 正確用藥及療效評價提供可靠依據，對自身免疫性甲狀腺疾的治療具有十分重要的 意義。
權利要求
1、一種定量檢測人自身抗體的化學發光配體分析方法，其特征在于將化學發光免疫定量檢測CLIA技術與納米磁顆粒配體技術相結合，是一種基于配體檢測原理的直接檢測方法，其核心在于巧妙地利用葡萄球菌蛋白A(SPA)能與人和小鼠體內的免疫球蛋白IgG的FC位點發生反應的共同特性，用自創的SPA包被納米磁顆粒配體技術建立自身抗體的化學發光配體定量分析方法。
2、 根據權利要求1所述的一種定量檢測人自身抗體的化學發光配體分析方法，以 TPO自身抗體為例，其特征在于首先將葡萄球菌蛋白A包被于納米磁顆粒表面； 利用自己制備的高親和力、高特異性的TPO單克隆抗體配制標準品以建立標準曲'線，讓標準品中的TPO單抗和血清樣品中的自身抗體分別與相對過量的酶標抗原 TPO-HRP反應形成(TPO-Ab)-TPO-HRP免疫復合體，用蛋白A包被的納米磁顆粒 作為配體進行固液分離，因為蛋白A會被(TPO-Ab)-TPO-HRP免疫復合體的Fc部 分結合，從而形成一個固相，以磁板方法分離；通過辣根過氧化物酶(HRP)催化 的酶促化學發光反應進行發光檢測；根據標準品的發光值建立標準曲線，可從標準 曲線上查出病人血清樣品中TPO自身抗體的濃度值。
3、 根據權利要求2所述的一種定量檢測人自身抗體的化學發光配體分析方法，其特 征在于作為標準品的單克隆抗體與血清樣品中的自身抗體并不進入同一個體系， 只是利用了它們具有與蛋白A特異結合的共性進行對照，因此不會發生交叉反應， 檢測結果準確可靠，不會出現測量結果偏低的假陰性現象，解決了自身抗體檢測無 法準確定量的難題。
4、根據權利要求2或3所述的一種定量檢測人自身抗體的化學發光配體分析方法， 以TPO自身抗體為例，其特征在于研制方法為1) 試劑盒組成成分TPO-Ab化學發光配體定量免疫分析診斷試劑盒主要組分為標記物一一 TPO-HRP,標準品——TPO單克隆抗體，配體試劑——SPA-納米磁顆粒，增強型化 學發光底物工作液——A液和B液，洗滌液；2) 試劑盒各組分的制備(1) 辣根過氧化物酶HRP標記TPO抗原的制備在過碘酸鈉的作用下，用HRP 標記TPO形成TPO-HRP，采用透析法和HPLC進行二次純化；(2) 特異性單克隆抗體的制備通過細胞融合雜交瘤技術制備TPO單克隆抗體 (TPO-Ab)，將其作為繪制參照曲線的標準品；'(3 )葡萄球菌蛋白A(SPA) —納米磁顆粒制備將SPA通過碳二亞胺包被于有機硅 '垸化磁性納米粒子表面； (4)增強化學發光底物工作液的優化配制以魯米諾為發光底物，采用四苯硼鈉、 肉桂酸和魯米諾按一定比例配制作為增強型化學發光底物工作液以提高發光強度；3) TPO-Ab化學發光配體(納米磁顆粒)定量分析方法及臨床檢測標準的建立(1) 建立人血清中TPO-Ab的化學發光配體(納米磁顆粒)定量分析方法，并制定該 試劑盒的實驗操作方法及質量控制標準；(2) TPO-Ab化學發光配體定量分析診斷試劑盒的小試及部分臨床實驗采集臨床標本，用本試劑盒測定受檢者血清中TPO-Ab的準確含量，大量臨床 試驗結果顯示，其臨床符合率》95%;因此，本試劑盒的TPO-Ab臨床測定值，可 為自身免疫性甲狀腺疾病診斷、早期干預治療、正確用藥及療效評價提供可靠依據；4) 建立一個成熟、靈敏、高效的自身抗體化學發光配體(納米磁顆粒)定量檢測技 術平臺，可利用本方法開發大量的系列人自身抗體化學發光配體(納米磁顆粒)定 量分析診斷試劑盒，形成一個全新、高效的人自身抗體化學發光配體(納米磁顆粒) 定量檢測試劑盒的研發和生產體系。
5、 根據權利要求2或3所述的一種定量檢測人自身抗體的化學發光配體分析方法， 以TPO自身抗體為例，其特征在于本試劑盒的實驗操作程序為(1) 將實驗所需試劑及樣本放置室溫，平衡至少30分鐘以上才可進行操作；(2) 取一塊微孔板進行編號，所有實驗均做雙孔重復；(3) 取各個濃度的標準品、質控血清和樣品2S 200nl加入相應編號的孔中；(4) 每孔均各加入50 200^ilTPO-HRP;(5) 倒置充分混勻SPA-納米磁顆粒，每孔均各加入25 150nlSPA-納米磁顆粒；(6) 充分混勻，室溫振蕩1 4小時；(7) 將其放在磁板上吸附磁顆粒，吸去上清液；(8) 去除磁板，每孔均各加入200-1000^1洗板液；(9) 振蕩4 15秒后，將其放在磁板上吸附磁顆粒，吸去上清液；(10) 重復一遍步驟8、 9;^ 11)每孔各加入發光增強A液100~300W;(12) 每孔加各入發光增強B液100~300nl;(13) 用化學發光儀測定每孔的發光強度；(14) 從標準曲線上讀取樣品及質控血清的濃度。
6、 根據權利要求4所述的一種定量檢測人自身抗體的化學發光配體分析方法，以TPO自身抗體為例，其特征在于本試劑盒的實驗操作程序為(1) 將實驗所需試劑及樣本放置室溫，平衡至少30分鐘以上才可進行操作；(2) 取一塊微孔板進行編號，所有實驗均做雙孔重復；(3) 取各個濃度的標準品、質控血清和樣品25 200pl加入相應編號的孔中；(4) 每孔均各加入50-200^1 TPO-HRP:(5) 倒置充分混勻SPA-納米磁顆粒，每孔均各加入25 150plSPA-納米磁顆粒；(6) 充分混勻，室溫振蕩1 4小時；(7) 將其放在磁板上吸附磁顆粒，吸去上清液；(8) 去除磁板，每孔均各加入200 1000nl洗板液；(9) 振蕩4 15秒后，將其放在磁板上吸附磁顆粒，吸去上清液;(10) 重復一遍步驟8、 9;(11) 每孔各加入發光增強A液100~300pl;(12) 每孔加各入發光增強B液100~30(^1;(13) 用化學發光儀測定每孔的發光強度；(14) 從標準曲線上讀取樣品及質控血清的濃度。
全文摘要
一種定量檢測人自身抗體的化學發光配體分析方法，屬于生物醫學技術領域。本方法巧妙利用葡萄球菌蛋白A(SPA)能與人和小鼠體內IgG的Fc位點發生反應的共性，利用高親和力、高特異性的單克隆抗體配制標準品以建立標準曲線，使單克隆抗體和樣品中的自身抗體分別與酶標記抗原反應，用SPA包被的納米磁顆粒作為配體進行固液分離，通過辣根過氧化物酶(HRP)催化的酶促化學發光反應進行發光檢測，建立人自身抗體的化學發光配體定量分析方法。本發明適用于所有自身抗體的定量檢測，解決了大多數自身抗體無法準確定量檢測的難題，同時避免了交叉反應，也不會出現假陰性或假陽性現象。
文檔編號G01N33/58GK101470117SQ20071006021
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月26日 優先權日2007年12月26日
發明者潘學繼, 王立凱 申請人:天津市協和醫藥科技有限公司