專利名稱：阿加曲班副產物及合成與分離鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種阿加曲班副產物及合成與分離鑒定方法。
背景技術：
1978年日本Mitsubishi化學公司S.Okamoto等首次報導了阿加曲班(Argatroban，1)水合物抗凝血酶活性US 4 101 653。隨后20多年期間，眾多研究者對Argatroban的生物活性及作為醫藥的價值進行了深入研究。1981年，S.Okamoto在動物體內與肝素進行了比較Okamoto，S.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.101，440(1981)；T.Kumoto等對其立體選擇活性進行了報導Kumada，T.et al.，Thromb.Res.24，285(1981)；1984年，R.Kumao進行了臨床血液透析評價Kikumoto，R.et al.，Biochemistry 23，85(1984)；1986年該作者報導了Argatroban抑制哺乳動物凝血酶活性，可作為治療和預防血栓藥劑和血小板凝聚抑制劑。Argatroban一水合物可作為選擇性抗血栓劑、治療慢性動脈堵塞和腦血栓等JP 61-48829。1992年和1993年，Taparelli和J.A.Jakubowski先后報導了Argatroban抗凝血酶的可逆性Taparelli，C.，Trends Pharmacol.Sci.，1993，14，366，Jakubowski，J.A.et al，Rep.Med.Chem.，1992，27，99；90年代L.R.Buch等多位研究者報導了相關研究Buch，L.R.，Cadiosvasc.Drug Rev.，1991，9，247，Strupcnewski，J.D.et al.，AcademicSan Diego，1991；Vol.26，p299，Brundish，D.et al.，J.Med.Chem.1999；42，4584，Shebuski，R.J.，AcademicSan Diego，1999；Vol.26，p98。1992年日本批準作為非腸道使用抗凝血酶藥劑Hijikata-Okunomiya，A.，et al，Thromb.Hemostasis，1992，18，135。
阿加曲班(2R，4R)-1-{(2S)-5-[(氨基亞氨基甲基)氨基]-1-氧代-2-{[(1，2，3，4-四氫-3-甲基-8-喹啉基)磺酰]氨基}戊基}-4-甲基-2-哌啶甲酸其化學成分是21(R)和21(S)的混合物，通常是64-6536-3US 6 440 417，Bioorganic & Medicine Chemistry Letters，11(2001)，1989-1992，Journal of Pharmaceutical Sciences，Vol.82，No.6，672(1993)，化學式
現報導的Argatroban合成路線都是以硝基-L-精氨酸為起始原料，以哌啶羧酸酯或喹啉磺酰氯縮合先后次序不同，構成兩條主要路線氨基保護法硝基-L-精氨酸的氨基用t-Boc保護，再與哌啶羧酸酯縮合，去t-Boc保護基，與喹啉磺酰氯縮合、酯水解、氧化去硝基得無結晶水Argatroban(圖1，2)EP 8746，US4 258 192，US4 201 863，JP 81-15,267，US6 440 417，特許公報平2-31055，Bioorganic&Medicine Chemistry Letters，11(2001)，1989-1992。
非保護法硝基-L-精氨酸與喹啉磺酰氯縮合后再與哌啶羧酸酯縮合、酯水解、氫化去硝基，亦得無結晶水目標產物(圖3)特許公報平1-35000，EP 823 430。
上述的任何路線必經中間體(2R，4R)-1-[NG-硝基-N2-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-L-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸，氫化還原得Argatroban，同時，都生成一個相同的主要副產物，由于該主要副產物的性質與Argatroban相近，不易分離，提純難度大，使產品Argatroban雜質量很難達標。因此研究該副產物的性質并且予以合成、分離與鑒定具有重要的實用價值。
發明內容
本發明的目的是提供一種阿加曲班副產物及合成與分離鑒定方法。本發明是在研究各種合成路線的基礎上，對阿加曲班的主要副產物進行了合成與分離鑒定，使產品Argatroban雜質量達標。該方法步驟設計合理，操作簡單、條件溫和、收率高。
本發明提供一種阿加曲班副產物是(2R，4R)-1-[N2-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-L-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸(化合物3)，其結構是 所述的阿加曲班副產物化合物3的合成與分離鑒定方法步驟包括1)以硝基-L-精氨酸為原料、經叔丁氧酰基(t-Boc)保護與哌啶羧酸酯縮合、去t-Boc保護基、與喹啉磺酰氯縮合和酯水解得中間體2。
2)中間體2再經過鈀碳催化氫化還原或用氯化亞錫還原，得主要產物化合物3。
所說的鈀碳催化氫化還原步驟(1)反應器中依次加入化合物2、三苯基膦、5％的鈀碳和無水乙醇和冰乙酸混合溶劑。化合物2∶三苯基膦∶5％的鈀碳的重量比1∶0.01～0.03∶0.1～0.3；無水乙醇和冰乙酸的體積比3～4∶1。
(2)升溫65-70℃，通入氫氣，保持壓力10MPa，反應20～24小時，HPLC跟蹤反應，至反應物消失為反應終點，停止反應。
(3)過濾除去鈀碳，蒸餾脫溶，用二氯甲烷溶解，飽和碳酸氫鈉調節pH＝7。分出有機層，再用飽和氯化鈉洗滌，靜置，分出有機層，無水硫酸鎂干燥，過濾。
(4)蒸餾脫除二氯甲烷，得產物化合物3；或者所說的用氯化亞錫還原步驟(1)反應器中依次加入化合物2、氯化亞錫和無水乙醇溶劑。化合物2∶氯化亞錫∶無水乙醇溶劑的重量比1∶2～3∶30～40。
(2)20-25℃攪拌反應24小時，HPLC跟蹤反應，化合物2含量不再下降，停止反應。
(3)真空蒸餾脫乙醇，用水和二氯甲烷溶解，水層再用二氯甲烷萃取，合并有機層，水洗、飽和氯化鈉洗、水洗，無水硫酸鎂干燥、過濾。
(4)真空蒸餾脫二氯甲烷，得產物化合物3。
本發明是將混合物經液質聯用分析得知，一組分為Argatroban，分子離子峰507，509，另一組分離子峰為503，505。初步判斷，后者是喹啉環未氫化的產物。用通常的手段，Argatroban和該副產物很難分離，為了得到副產物樣品、進一步鑒定結構，嘗試兩種方法控制還原化合物2、還原脫硝基而喹啉環不氫化得化合物3。一種方法是用氯化亞錫做還原劑、無水乙醇中室溫反應過夜，反應只還原脫硝基得喹啉環未氫化的化合物3，收率約65％。另一方法仍采用鈀碳催化氫化，其它條件與制備Argatroban的氫化條件一致，加入少許三苯基膦，使鈀碳催化劑適度中毒降低催化強度。實驗結果證明，同樣得到化合物3，收率≥80％。
本發明是將化合物2經催化氫化制阿加曲班。通過分離、鑒定和合成，確認其中的副產物為化合物3。化合物3進一步氫化得1，證明氫化2時，首先還原脫硝基，然后喹啉1、2、3、4位氫化得1。跟蹤2的氫化反應，可使3的含量降到允許范圍，成功的解決了分離難的問題。
本發明提供的阿加曲班副產物的合成與分離鑒定方法是在研究各種合成路線的基礎上，對阿加曲班副產物進行了合成與分離鑒定，該方法步驟設計合理，操作簡單、條件溫和、收率高、產物質量好。
圖1硝基精氨酸t-Boc保護后與(2R，4R)哌啶甲酸酯縮合反應路線圖示。
圖2硝基精氨酸t-Boc保護后與反式哌啶羧酸酯縮合、分離、拆分，再與喹啉磺酰氯縮合反應路線圖示。
圖3非保護法反應路線圖示。
具體實施例方式
實例1.
中間體2(化合物2)的制備實例見(US 4 258 192)，反應式見附圖1。
實例2，鈀碳催化氫化法100ml高壓釜中依次加入1g由實例1制備的化合物2、0.02g三苯基膦、0.2g5％的鈀碳、13ml無水乙醇和4ml冰乙酸。控制高壓釜外溫65-70℃，通入氫氣，保持壓力10MPa，HPLC(高效液相色譜)跟蹤反應，反應24小時，停止反應。過濾除去鈀碳，脫溶，用20ml二氯甲烷溶解，飽和碳酸氫鈉調節pH＝7。分出有機層，再用10ml飽和氯化鈉洗滌，靜置，分出有機層，無水硫酸鎂干燥，過濾，脫除二氯甲烷，得白色固體0.75g，為化合物3，收率82％。
化合物3結構鑒定質譜分子離子峰503，505核磁1HNMR(300MHz，DMSO)；δ0.69(d，3H，piperidine-CH3)，2.53(s，3H，ArCH3)，7.6(m，3H， )，7.7(t，1H，ArH)，8.2(d，2H，ArH)，8.3(s，1H，ArH)，8.9(s，1H，ArH)。
1HNMR(300MHz，D2O)；δ7.6(m，3H， )，幾近消失。
HPLC跟蹤分析(1)條件色譜柱Agilent(安捷倫科技有限公司)Extend C18250×4.6mm，5μm流動相甲醇∶水＝45∶55(體積，ml)檢測波長216nm流速1.2ml/min柱溫40℃(2)保留時間分別為R-Argatroban 59.2分鐘S-Argatroban 64.3分鐘化合物3 8.5分鐘合成Argatroban的未知雜質，保留時間為8.5分鐘。
通過質譜、核磁鑒定和HPLC對比，證明Argatroban中未知雜質就是化合物3。當合成的化合物3進一步鈀碳氫化，跟蹤反應，當3完全消失停止氫化，得最終產物Argatroban。實驗證明合成Argatroban時化合物3含量高的原因是氫化不徹底。跟蹤反應，強化氫化，可以使中間體3含量降到允許范圍，解決了化合物3分離難，即Argatroban純化難的一個關鍵問題。
實例3.氯化亞錫法100ml四口瓶中加入1g由實例1制備的化合物2、2.4g氯化亞錫和40ml無水乙醇，20-25℃攪拌反應24小時，HPLC跟蹤反應，化合物2含量不再下降，停止反應。真空脫除乙醇，加水和二氯甲烷，水層再用二氯甲烷萃取，合并有機層，水洗、飽和氯化鈉洗、水洗，無水硫酸鎂干燥、過濾、脫溶，得0.6g化合物3。收率65％。HPLC保留時間為8.5分鐘。
實例4.Argatroban的制備100ml高壓釜中加入1g化合物2、0.2g5％的鈀碳、13ml無水乙醇和4ml冰乙酸，控制外溫65-70℃，通氫壓力10MPa，HPLC跟蹤反應，反應24小時。提純方法同實例2。HPLC歸一法分析保留時間分別為R-Argatroban 59.2分鐘含量48.8％S-Argatroban 64.3分鐘含量44.9％化合物3 8.5分鐘 含量6.3％。
權利要求
1.一種阿加曲班副產物，其特征在于它是化合物3(2R，4R)-1-[N2-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-L-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸，其結構是
2.權利要求1所述的阿加曲班副產物化合物3的合成與分離鑒定方法，其特征是包括下述步驟1)以硝基-L-精氨酸為原料、經叔丁氧酰基(t-Boc)保護與哌啶羧酸酯縮合、去t-Boc保護基、與喹啉磺酰氯縮合和酯水解得中間體2(2R，4R)-1-[NG-硝基-N2-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-L-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸；2)中間體2再經過鈀碳催化氫化還原或用氯化亞錫還原，得主要產物化合物3；所說的鈀碳催化氫化還原步驟(1)反應器中依次加入化合物2、三苯基膦、5％的鈀碳和無水乙醇和冰乙酸混合溶劑；(2)升溫65-70℃，通入氫氣，保持壓力10MPa，反應20～24小時，HPLC監測，至反應物消失為反應終點，停止反應；(3)過濾除去鈀碳，蒸餾脫溶，用二氯甲烷溶解，飽和碳酸氫鈉調節pH＝7，分出有機層，再用飽和氯化鈉洗滌，靜置，分出有機層，無水硫酸鎂干燥，過濾；(4)蒸餾脫除二氯甲烷，得產物化合物3；或者所說的用氯化亞錫還原步驟(1)反應器中依次加入化合物2、氯化亞錫和無水乙醇溶劑；(2)20-25℃攪拌反應24小時，高效液相色譜(HPLC)跟蹤反應，化合物2含量不再下降，停止反應；(3)真空蒸餾脫乙醇，用水和二氯甲烷溶解，水層再用二氯甲烷萃取，合并有機層，水洗、飽和氯化鈉洗、水洗，無水硫酸鎂干燥、過濾；(4)真空蒸餾脫二氯甲烷，得產物化合物3。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征是所述的化合物2∶三苯基膦∶5％的鈀碳的重量比1∶0.01～0.03∶0.1～0.3；無水乙醇和冰乙酸的體積比3～4∶1。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征是所述的化合物2∶氯化亞錫∶無水乙醇溶劑的重量比1∶2～3∶30～40。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征是所述的高效液相色譜跟蹤分析(1)條件色譜柱Agilent Extend C18250×4.6mm，5μm流動相甲醇∶水＝45∶55(體積，ml)檢測波長216nm流速1.2ml/min柱溫40℃(2)保留時間分別為R-Argatroban 59.2分鐘S-Argatroban 64.3分鐘化合物3 8.5分鐘。
全文摘要
本發明涉及阿加曲班副產物及合成與分離鑒定方法。經催化氫化制阿加曲班時，同時生成一個分離困難的副產物，本發明通過分離、鑒定和合成，確認該副產物為化合物3。化合物3進一步氫化得阿加曲班1，證明氫化中間產物時，首先還原脫硝基，然后喹啉1、2、3、4位氫化得1。跟蹤中間產物的氫化反應，可使化合物3的含量降到允許范圍，成功的解決了化合物3分離難、即阿加曲班純化難的問題。
文檔編號G01N30/00GK101033223SQ20071005691
公開日2007年9月12日 申請日期2007年3月14日 優先權日2007年3月14日
發明者宋洪海 申請人:天津市煒杰科技有限公司