專利名稱：一種奶牛亞臨床酮病診斷試紙的制作方法
技術領域：
本發明屬于獸醫臨床檢驗學領域，所檢測物質為奶牛乳汁中的D-(-)-3-羥基丁酸及其鹽，適用于集約化奶牛養殖場奶牛亞臨床酮病的監測。
背景技術：
酮體是脂肪酸代謝過程中的產物，酮體的生產量的大小反映了脂 肪氧化代謝的強度。正常情況下，血液中酮體濃度相對恒定，這是因 為肝中產生的酮體可在肝外組織迅速利用，尤其是腎臟和心肌具有較 強的使乙酰乙酸氧化的酶系，其次是大腦。肌肉組織也是利用酮體的 重要組織。對于不能利用脂肪酸的腦組織來說，利用酮體作為能源具 有重要意義。但在某些生理或病理情況下，如因饑餓將糖原耗盡后， 食物中糖供給不足時，或因患病而缺乏氧化糖的能力時，脂肪動員加 速，肝臟中酮體生成增加，超過了肝外組織氧化的能力。又因糖代謝 減少，丙酮酸缺乏，可與乙酰輔酶A縮合成檸檬酸的草酰乙酸減少， 更減少酮體的去路使酮體積聚于血內成為酮血癥。血內酮體過多，由 尿排出，又形成酮尿。酮體為酸性物質，若超過血液的緩沖能力時， 就可引起酮癥酸中毒。奶牛養殖業已成為我國畜牧業的支柱產業。酮病是奶牛主要的群 發性高發性疾病之一，我國奶牛酮病發病率為15-30%，且呈逐年上
升趨勢。大量研究表明，奶牛酮病與圍產期奶牛的許多疾病有關，如 胎衣不下、子宮內膜炎、皺胃變位、生產癱瘓等。按是否出現臨床癥 狀可將酮病分為臨床酮病和亞臨床酮病。臨床酮病具有典型的臨床癥 狀，如食欲驟減、呼出氣體有酮味、產奶量下降或出現神經癥狀等，不難做出診斷。亞臨床酮病無明顯的臨床癥狀，發病率10-20倍于臨 床酮病，且容易引發臨床酮病，給奶牛養殖業造成的經濟損失尤為巨 大。奶牛亞臨床酮病的診斷主要依靠檢測體內酮體含量，其中乙酰乙 酸占20%; D-(-)-3-羥丁酸占78。/。；丙酮占2%。酮體的三種成分中^ 酰乙酸含量較低，易揮發，且奶牛酮病后期乙酰乙酸的含量反而降低， 與酮病的發生和發展并不是正相關；丙酮含量最低，性狀不是很穩定； D-(-)-3-羥丁酸占含量最高且與疾病的發生發展成正相關；故丙酮和 乙酰乙酸都不適合于作為奶牛亞臨床酮病的早期診斷指標，以 D-(-)-3-羥丁酸作為奶牛亞臨床酮病的早期診斷指標最為合理。只有 實施有效的早期診斷，從而進行合理的防治，方能減少由此病所導致 的巨大損失。目前，奶牛酮體的定量檢測方法有水楊醛比色法、改良式水楊醛 比色法、高效液相色譜法、D-(-)-3-羥丁酸酶法分析試劑盒、氣相色 譜法，存在的主要缺點為需要昂貴的儀器和標準化的實驗室、操作繁 瑣、檢測成本高、花費時間長；定性檢測方法有酮粉法，存在的主要 缺點為操作過程復雜、敏感性和特異性較低。因此，這些方法均不適 合集約化奶牛養殖場用于對奶牛的亞臨床酮病的監測
發明內容
本發明提供一種奶牛亞臨床酮病診斷試紙，以解決對奶牛的亞臨 床酮病的檢測過程存在的操作繁瑣、檢測成本高、花費時間長、敏感 性和特異性較低的問題。本發明采取的技術方案是包括支持墊和固定于其上的測試墊， 其特征在于該試紙的測試墊包括如下試劑脫氫酶D- (-) -3-羥丁酸脫氫酶，2270U/mg， 50mg 畫mg;輔酶:煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，300mg 500mg; 黃遞酶，35U/mg~45U/mg， 500 1000mg; 顯色劑NBT， 100mg 200mg; TrisBase，分子量121.14, 1.21g; 草酸，分子量126， 126mg; 海藻糖，分子量383， 4 6g; 蒸餾水100ml。本發明的技術方案中測試墊還包括氯化鈉，300mg 600mg。 本發明試紙的制備方法是按該配方配制100mL反應液，用1M的鹽酸調pH值至8.5，取 薄型中速定量濾紙，完全浸入該溶液中，2分鐘后取出，于37"C恒溫 干燥箱內懸掛干燥45分鐘。本發明試紙的制備方法還包括將濾紙裁剪成3x3cm的紙片， 粘貼于3x6cm聚乙烯塑料薄板上，裝入棕色瓶內，加入干燥劑，密 閉保存。本發明的反應原理D-(-)-羥丁酸脫氫酶D-(-)-3-hydroxybutyrate+ NAD+ -acetoacetate + NADH + fT黃遞酶NADH + NBT- NAD十+fo醒zan依據上述反應原理，制作干燥試紙條。D-(-)-3-羥丁酸或其鹽在 D一(+3-羥丁酸脫氫酶的催化下與NAD反應生成乙酰乙酸和NADH， 最適PH為8.5，生成的NADH在黃遞酶的催化下與NBT作用生成 藍黑色的不溶于水的甲月替(formazan)，依據生成的顯色物質的顏 色強度制作標準比色卡，半定量的測定D-(-)-3-羥丁酸或其鹽的含量。 NBT是一種染色強度較高的染料，目前已大量的應用于免疫組 織化學、細胞活性測定等，對光不敏感，故將其作為制作干燥試紙條 的顯色劑。D-(-)-3-羥丁酸脫氫酶是專一性催化D-(-)-3-羥丁酸的酶。 黃遞酶起傳遞氫離子的作用，比較其它同類的酶，該酶性質穩定，對 光敏感性較低，符合試紙條制作要求。D-(-)-3-羥丁酸脫氫酶和黃遞 酶目前均可以大量表達純化，容易買到。海藻糖是由特殊雙糖分子構 成的非還原性糖，特性非常穩定，能夠在高溫、高寒、干燥失水等惡 劣的條件下在細胞表面形成特殊的保護膜，有效的保護酶蛋白的分子 結構不被破壞，從而維持酶蛋白的活性，可有效保證試紙的檢測和保 存穩定性，否則難以商品化推廣應用。奶牛乳汁中的乳酸脫氫酶可競 爭性地與試紙所含NAD發生反應，加入草酸可去除這一干擾因素，
提高檢測結果的準確性。配制的不同濃度的D-(-)-3-羥丁酸標準溶液，滴加數滴于制作好 的試紙條上，依據反應后試紙條產生不同的顏色，制作試紙條標準比 色卡。在實際使用時，將與被檢乳樣反應后的試紙條與標準比色卡對 照，從而得出檢測結果。所用的試紙可用普通的濾紙，也可用其它適 合的吸濕膜等。試紙條的支墊部分可用聚乙烯薄板，也可用其它適合 的硬質材料，但所用材料要無吸濕性。本發明使用方便、經濟實用、敏感性和特異性高、穩定性好的奶 牛亞臨床酮病診斷試紙，試紙用于對奶牛乳汁中D-(-)-3-羥丁酸和 D-(-)-3-羥丁酸鹽的檢測。
附圖是本發明的結構示意圖。
具體實施方式
試劑D- (-) -3-羥丁酸脫氫酶，2270U/mg，廠家Asahi kasei pharma corporation,日本；顯色劑為NBT，分子式QoHsolSbOs . 2C1，分子量為817.60 817.65,別名硝基四氮唑藍、硝基藍四氮唑、四唑氮藍、氮藍四唑、 硝基藍四唑、四唑硝基藍、硝基氯化四氮唑藍、氯化硝基四氮唑藍； 廠家sigma;TrisBase， 分子量121.14， 廠家sigma;黃遞酶，35U/mg~45U/mg，廠家Asahi kasei pharma corporation,
日本；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，廠家sigma; 草酸，分子量126， 126mg，北京化工廠；海藻糖，分子量383 383.3， 4 6g，廠家北京舒伯偉化工儀器有限責任公司；蒸餾水100ml。 實施例1試紙的制作包括支持墊2和固定于其上的測試墊1，該試紙的測試墊包括如下試劑D- (-) -3-羥丁酸脫氫酶，2270U/mg， 50mg; 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，300 mg; 顯色劑為NBT， 100 mg; 黃遞酶，35U/mg， 500 mg; TrisBase，分子量121.14， 1.21g; 草酸，分子量126， 126mg; 海藻糖，分子量383.3， 4g; 蒸餾水100ml。按該配方配制100mL反應液，用1M的鹽酸調pH值至8.5，取 薄型中速定量濾紙，完全浸入該溶液中，2分鐘后取出，于37GC恒 溫干燥箱內懸掛干燥45分鐘，然后將濾紙裁剪成3"cM的紙片，粘 貼于3x6cM聚乙烯塑料薄板上，裝入棕色瓶內，加入干燥劑，密閉 保存。
實施例2試紙的制作D- (-) -3-羥丁酸脫氫酶，2270U/mg， 75mg;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，400mg;顯色劑為NBT, 150 mg;黃遞酶，38U/mg， 750mg;TrisBase，分子量121.14， 1.21g;草酸，分子量126， 126mg;海藻糖，分子量383.3， 5g;蒸餾水100ml。制作方法同實施例1。 實施例3試紙的制作D- (-) -3-羥丁酸脫氫酶，2270U/mg， 100mg;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，500mg;顯色劑為NBT， 200mg;黃遞酶，45U/mg， 1000mg;TrisBase，分子量121.14， 1.21g;草酸，分子量126， 126mg;海藻糖，分子量383.3， 6g;蒸餾水100ml。制作方法同實施例1。 實施例4試紙的制作D陽(-)-3-羥丁酸脫氫酶，2270U/mg， 55 mg;
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，350 mg; 顯色劑為NBT， 110 mg; 黃遞酶，38U/mg， 550mg; TrisBase，分子量121.14， 1.21g; 氯化鈉，300 mg; 草酸，分子量126， 126mg; 海藻糖，分子量383.3， 5g; 蒸餾水100ml。按該配方配制100mL反應液，用1M的鹽酸調pH值至8.5，取 薄型中速定量濾紙，完全浸入該溶液中，2分鐘后取出，于37GC恒 溫千燥箱內懸掛干燥45分鐘，然后將濾紙裁剪成3x3cM的紙片，粘 貼于3x6cM聚乙烯塑料薄板上，裝入棕色瓶內，加入干燥劑，密閉 保存。實施例5試紙的制作D- (-) -3-羥丁酸脫氫酶，2270U/mg， 80 mg;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，400 mg;顯色劑為NBT， 150 mg;黃遞酶，40U/mg， 800mg;TrisBase，分子量121.14， 1.21g;氯化鈉，450 mg;草酸，分子量126， 126mg;海藻糖，分子量383.3， 5g;
蒸餾水lOOml。制作方法同實施例4。 實施例6試紙的制作D- (-) -3-羥丁酸脫氫酶，2270U/mg， 90mg;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，450mg;顯色劑為NBT， 180mg;黃遞酶，42U/mg， 900mg;TrisBase，分子量121.14， 1.21g;氯化鈉，600 mg;草酸，分子量126， 126mg;海藻糖，分子量383.3， 5g;蒸餾水100ml。制作方法同實施例4。 實施例7標準比色卡的制作酉己制濃度為50,ol/L、腦jimmol/L、 200|i mol/L、 500,ol/L、 lOOOpmol/L的D- (-) -3-羥丁酸標準溶液，與D- (-) -3-羥丁酸診斷 試紙反應后用數碼相機拍照，制成標準比色卡。上述濃度由紫色到藍紫色，再到藍黑色，顏色逐漸加深。根據相 關研究報導，奶牛乳汁中的D- (-) -3-羥丁酸含量大于200p mol/L時， 可初步認定其患有亞臨床酮病，而奶牛乳汁中的D- (-) -3-羥丁酸含 量為50pmol/L、 100pmmol/L對應的結果為正常奶牛，含量為 100|immol/L 200|a mol/L為疑似病牛，500pmol/L以上的為嚴重病牛。
實施例8試紙條評價1 、靈敏度測試配制Opmol/L、 50nmol/L、 100|imol/L、 150|imol/L、 200pmol/L、 300pmol/L 、 400jimol/L 、 500pmol/L 、 600pmol/L 、 700pmol/L 、 800pmol/L、 900nmol/L、 1000|amol/L的D-(-)-3-羥丁酸溶液，用試紙 檢測其濃度，分析測試結果，濃度為50pmol/L、 100Hmmol/L、 200p mol/L、 500pmol/L、 1000pmol/L的D-(-)-3-羥丁酸溶液的測試結果與 標準比色卡所示的顏色相同，濃度為150)amol/L的溶液的測試結果顯 示其位于10(Vmmol/L、 200pmol/L溶液之間，濃度為300pmol/L、 400pmol/L的溶液的測試結果顯示其位于200n mol/L、 500pmol/L的 溶液之間，濃度為600|imol/L、 700|amol/L、 800pmol/L、 900|amol/L 的溶液的測試結果顯示其位于500pmol/L、 1000|imol/L的溶液之間、 且顏色隨著濃度的升高而逐漸加深。該測試結果顯示，該試紙的靈敏 度能夠滿足要求，檢測出奶牛是否得了亞臨床酮病。符合設計要求。2 、特異性測試取D-(-)-3-羥丁酸、乙酰乙酸、3 —羥基戊酸、丙酮、3 —氧代戊 酸和己酸測定，分別配制成不同濃度的溶液，使用試紙測試，檢測結 果所制作的試紙與乙酰乙酸、3 —羥基戊酸、丙酮、3—氧代戊酸和己 酸均不發生反應，特異性較高。 3、 穩定性測試將試紙分別置于4'C 、常溫、37。C條件下密封保存，每隔15天 取出，觀察外觀性狀,并測試標準D-(-)-3-羥丁酸溶液，測試結果表明
試紙的有效期可達到15個月，完全符合國家相關產品認證標準。4、臨床應用性研究根據我們的試驗需要，選擇飼養管理較差的牛群，隨機取200頭 泌乳奶牛的乳樣，先使用酶催化動力學方法測定D-(-)-3-羥丁酸含量, 再用試紙條檢測其乳中D-(-)-3-羥丁酸含量，測試結果表明該試紙檢 測的敏感性可達到88%，完全可以推廣應用到實際生產應用中，具 有經濟價值和現實意義。
權利要求
1.一種奶牛亞臨床酮病診斷試紙，包括支持墊和固定于其上的測試墊，其特征在于該試紙的測試墊包括如下試劑脫氫酶D-(-)-3-羥丁酸脫氫酶，2270U/mg，50mg～100mg；輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，300mg～500mg；黃遞酶，35U/mg～45U/mg，500～1000mg；顯色劑NBT，100mg～200mg；Tris Base，分子量121.14，1.21g；草酸，分子量126，126mg；海藻糖，分子量383，4～6g；蒸餾水100ml。
2、 根據權利要求1所述的奶牛亞臨床酮病診斷試紙，其特征在 于測試墊還包括氯化鈉，300mg 600mg。
3、 一種如權利要求1或2所述的奶牛亞臨床酮病診斷試紙的制 作方法，其特征在于按該配方配制100mL反應液，用1M的鹽酸 調pH值至8.5，取薄型中速定量濾紙，完全浸入該溶液中，2分鐘后 取出，于37"C恒溫干燥箱內懸掛干燥45分鐘。
4、 如權利要求3所述的奶牛亞臨床酮病診斷試紙的制作方法， 其特征在于還包括將濾紙裁剪成3x3cm的紙片，粘貼于3x6cm聚 乙烯塑料薄板上，裝入棕色瓶內，加入干燥劑，密閉保存。
全文摘要
本發明涉及一種奶牛亞臨床酮病診斷試紙，屬于獸醫臨床檢驗學領域。包括支持墊和固定于其上的測試墊，其特征在于該試紙的測試墊包括如下試劑D-(-)-3-羥丁酸脫氫酶，2270U/mg，50mg～100mg；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，300mg～500mg；黃遞酶，35U/mg～45U/mg，500～1000mg；NBT，100mg～200mg；Tris Base，分子量121.14，1.21g；草酸，分子量126，126mg；海藻糖，分子量383，4～6g；蒸餾水100ml。本發明使用方便、經濟實用、敏感性和特異性高、穩定性好的奶牛亞臨床酮病診斷試紙，試紙用于對奶牛乳汁中D-(-)-3-羥丁酸和D-(-)-3-羥丁酸鹽的檢測。
文檔編號G01N21/78GK101118237SQ20071005603
公開日2008年2月6日 申請日期2007年9月5日 優先權日2007年9月5日
發明者劉國文, 周昌芳, 宋文學, 才 張, 張乃生, 張加力, 張志剛, 李小兵, 哲 王, 逄曉陽 申請人:吉林大學