專利名稱：動物布魯氏菌抗體膠體金試紙膜檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明公開一種動物布魯氏菌抗體膠體金試紙膜檢測試劑盒，用于布魯氏菌病的診斷，屬于動物疫病診斷技術領域。
背景技術：
布魯氏菌是一種革蘭氏陰性、特異性胞內寄生菌，能感染多種動物和人。目前，根據致病性及宿主的不同將布魯氏菌分成6個種，即羊布魯氏菌、牛布魯氏菌、豬布魯氏菌、沙林鼠布魯氏菌、綿羊布魯氏菌、犬布魯氏菌。其中在世界范圍內廣泛流行的是牛、羊、豬布魯氏菌，對畜牧業危害巨大，更重要的是它們均能引起人的感染，威脅著公眾健康。所以對布魯氏菌病診斷方面的研究一直受到世界各國的關注。傳統的診斷動物布魯氏菌病的血清學診斷方法包括快速滑動凝集試驗(RSAT)、標準試管凝集試驗(SAT)、2-巰基乙醇試管凝集試驗(2ME)、補體結合試驗(CFT)等。它們都存在著以下不足，首先，與其它細菌(如耶爾森氏菌O9、大腸桿菌O157)發生交叉反應現象很難避免；第二，傳統診斷方法費時、費力且易出現假陽性；第三，傳統的診斷方法不能區分布魯氏菌病的病原種型。因此，建立一種簡便、快速、特異的診斷方法，對于動物布魯氏菌病的診斷、檢疫和流行病學調查具有重要的意義。
發明內容
本發明公開一種動物布魯氏菌抗體膠體金試紙膜檢測試劑盒，該試劑盒可以檢測牛、羊、豬布魯氏菌抗體，與傳統的血清學方法比，更簡便、快速、特異。適用于動物布魯氏菌病的診斷、檢疫和流行病學調查。
本發明的解決方案是根據抗原、抗體能特異結合的免疫學原理，利用膠體金免疫層析技術和銀染加強技術，以重組的金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)作為金標蛋白，以高純度的布魯氏菌LPS作為包被抗原，利用羊抗牛IgG為質控線制備膠體金試紙膜。本試驗試劑盒包括膠體金試紙膜，陰、陽性試劑，塑料吸管離心管以及說明書。
試劑盒的具體制作方法用熱酚法和冷酚法提取牛布魯氏菌544A和羊布魯氏菌16M的LPS，經Sephadex G-50層析柱純化后，LPS的含量為1.21～2.31mg/mL，瓊擴試驗表明該抗原能與相應的抗體發生反應，且不發生種內交叉。利用純化的LPS作為檢測線包被抗原，用重組金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)作為金標蛋白，根據膠體金免疫層析法的基本原理組裝成試紙膜。研究結果表明，牛、羊、豬動物布魯氏菌抗體檢測試紙最低檢測蛋白量分別為1μg/mL、2μg/mL，不與大腸桿菌O157，小腸結腸炎耶爾森菌O9、沙門氏菌、胸膜肺炎放線菌的陽性血清發生交叉反應，4℃保存期為12個月。20份布魯氏菌陽性血清用PBS 1∶1稀釋之后，用本實驗組裝的試紙進行檢測，結果19份為陽性，符合率為95％。18份布魯氏菌樣本血清，分別用平板凝集試驗(PAT)和試紙進行檢測，結果陰性、陽性符合率均為100％。
試劑盒由以下結構組成
(1)試紙膜①樣品墊緊密連接于試紙的金標墊，是試紙進行檢測的部分。主要接觸樣品液，利用樣品墊的吸附使液體前進，但液面不能超過樣品墊的MAX線。
②玻璃纖維膜位于樣品墊的上部，是金標蛋白固定的材料。布魯氏菌抗體試紙的玻璃纖維吸附有金標探針，即所謂的金標墊。金標探針是由膠體金標記重組金黃色葡萄菌A蛋白而成，可特異性的吸附布魯氏菌抗體。
③硝酸纖維膜(NC)位于玻璃纖維膜的上部，膜上有檢測線(T)和質控線(C)。布魯氏菌抗體膠體金試紙的T線包被布魯氏菌特異的LPS，C線包被羊抗牛IgG。
④吸水紙位于試紙的最上部，緊連著NC膜。試紙吸附樣品液的動力主要靠吸水紙和樣品墊。
⑤塑料墊板主要起支撐試紙的作用，為硬質塑料板。
(2)陰、陽性試劑①陰性試劑試劑盒使用時，作為陰性對照。
②陽性試劑試劑盒使用時，作為陽性對照。
(3)塑料吸管主要用于布魯氏菌病樣本的采集。
(4)離心管主要用于分離樣本時離心使用。
(5)說明書主要介紹試劑盒的使用方法。
以下是抗體試紙膜的使用方法[原理]當樣品到達金標墊時，與膠體金標記的SPA進行特異結合，由于毛細管作用樣品將沿著該膜繼續向前移動，至固定有抗原的檢測線(T)區域時，抗原、抗體發生特異性結合，然后樣品繼續移動與質控線(C)上的羊抗牛抗體IgG反應，由于標記物膠體金的作用使T、C線區顯示紅色即陽性反應，從而實現特異性的免疫診斷。如果是陰性反應，只有C線顯色，T線不顯色。
采集血液5mL左右，37℃靜置30min，離心取上清液。經0.25μm～0.45μm的濾器除菌及除去粘稠成分，然后用生理鹽水作1∶1稀釋，作為被檢血清。
取1mL被檢血清加入2mL離心管中，把試紙膜垂直插入液體中，使液體不超過試紙膜下端的MAX控制線，5分鐘內可讀取結果。
陽性白色顯示區上下呈現兩條紅線。
陰性白色顯示區上下呈現一條紅色控制線C。
無效5min內無控制線C出現。
本發明的優點在于不僅能有效檢測動物布魯氏菌的抗體，而且能區分所感染病原體的種類(牛、羊、豬種)，不發生種內交叉反應，與耶爾森菌O9、大腸桿菌O157、沙門氏菌和胸膜肺炎放線桿菌等相近細菌的陽性血清也不發生交叉反應。與常規血清學檢測方法的陰、陽性符合率均為100％。檢測快捷，5分鐘內可報告結果。不需要特殊的儀器設備。
圖1為本發明膠體金試紙結構組裝模式圖。
圖2為本發明檢測試紙膜圖。B檢測陽性結果；C檢測陰性結果。
具體實施例為了便于理解本發明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發明的闡釋而非對本發明的任何形式的限制。
實施例11、動物布魯氏菌LPS的提取與鑒定分別用熱酚法和冷酚法提取了牛布魯氏菌544A和羊布魯氏菌16M的LPS，經Sephadex G-50層析柱純化后，對提純的LPS的純度、免疫學特性進行了鑒定。結果表明，LPS的含量為1.21mg/mL～2.31mg/mL，純度為96.1％～97.2％，只與相應的抗體發生反應，不同菌種的LPS之間不發生交叉反應。
2、膠體金的制備與最適粒徑的選擇利用檸檬酸鈉還原法和鞣酸—枸櫞酸鈉還原法制備20nm、25nm、30nm、40nm膠體金顆粒，電鏡下觀察其分散度和均勻度結果，然后選擇最適膠體金20nm、25nm粒徑進行標記。
實施例21、動物布魯氏菌金標探針最佳標記pH的確定利用膠體金梯度法和O值曲線法，確定膠體金標記SPA的最佳pH值為5.2～6.8。
2、動物布魯氏菌金標探針最佳標記量的確定利用膠體金梯度法和O值曲線法，確定膠體金標記SPA最佳標記用量為20～60μg/mL。
3、金標探針的制備與純化取兩個試管，分別加入5mL 20nm、25nm膠體金；加入30μl～50μl0.2mol/L K2CO3，將pH值調整為5.2～6.8；根據用以標記的膠體金的總量計算出所需要的待標記蛋白質的總量為60μg/ml～90μg/ml，將SPA加入膠體金溶液中應逐滴加入，整個過程大約5min加完。搖勻15min，室溫放置10～15min；分別加入10％BSA至終濃度為1～5％，防止抗體蛋白和膠體金聚合和沉淀。采用差速離心法和凝膠過濾法對標記好的探針進行純化，電鏡下觀察金標探針的質量與分散度。
4、金標探針穩定性試驗影響穩定的因素主要有電解質、溶膠濃度、溫度、非電解質等。選擇不同的穩定劑如BSA、脫脂奶粉、PEG20000以及pH、溫度、適度等因素，得出保持膠體金穩定性的最佳條件。結果選擇最佳穩定劑為BSA，溫度為37℃，pH為5.2～6.8。
5、包被抗原最佳噴膜濃度的選擇對NC膜上T線及C線設置幾個抗原濃度梯度選擇出最優的一組作為金標濃度(T線)和包被濃度(C線)。對包被的條件進行優化，如緩沖液、T及C線寬度、噴膜速度。結果緩沖液選擇Tris堿，噴膜濃度為0.8～1.0mg/ml，噴膜速度為0.75μl/cm。
6、試紙膜的組裝參見圖1所示，戴上手套，將包被LPS的硝酸纖維膜(NC)組裝到塑料墊板上，要求其下邊緣一定要對齊模具上的黑色標記線，并小心抹平膜面。將3.5cm寬的吸水紙緊靠模具上邊緣組裝到塑料墊板上，并小心抹平。將5mm×31cm的金標玻璃纖維膜緊靠標尺下邊緣組裝到塑料墊板上，并小心抹平。將1.9cm寬的樣品墊緊靠模具下邊緣組裝到粘性底板上，并小心抹平。用切條機切成4.0mm寬的試紙，在裝配區將切好的試紙合并0.5g干燥劑一包放入包裝袋內。
測試例圖2為本發明檢測試紙膜圖，經對18份布魯氏菌樣本血清，分別用本發明試紙進行檢測，結果陰性、陽性符合率均為100％。B檢測陽性結果；C檢測陰性結果。
權利要求
1.一種動物布魯氏菌抗體膠體金試紙膜檢測試劑盒的制作方法，以重組的金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)作為金標蛋白，以高純度的布魯氏菌LPS作為包被抗原，利用羊抗牛IgG為質控線制備膠體金試紙膜。
2.權利要求1所述試劑盒的制作方法，包括以下步驟用熱酚法和冷酚法提取牛布魯氏菌544A和羊布魯氏菌16M的LPS，經Sephadex G-50層析柱純化后，LPS的含量為1.21mg/mL～2.31mg/mL，純度為96.1～97.2％，利用純化的LPS作為檢測線包被抗原，用重組金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)作為金標蛋白(T線)，羊抗牛抗體IgG為質控抗體(C線)，根據膠體金免疫層析技術組裝成試紙膜。
3.權利要求1或2所述方法制備的試劑盒，由以下結構組成(1)試紙膜①樣品墊緊密連接于試紙的金標墊，是試紙進行檢測的部分；②玻璃纖維膜位于樣品墊的上部固定金標蛋白，玻璃纖維吸附有金標探針，金標探針是由膠體金標記重組金黃色葡萄菌A蛋白而成，可特異性的吸附血液中的布魯氏菌抗體樣本；③硝酸纖維膜(NC)位于玻璃纖維膜的上部，膜上有檢測線(T)和質控線(C)，布魯氏菌抗體膠體金試紙膜的T線包被布魯氏菌特異的LPS，C線包被羊抗牛IgG；④吸水紙位于試紙的最上部，緊連著NC膜。試紙吸附樣品液的動力主要靠吸水紙和樣品墊；⑤塑料墊板主要起支撐試紙的作用，為硬質塑料板；(2)陰、陽性試劑①陰性試劑試劑盒使用時，作為陰性對照；②陽性試劑試劑盒使用時，作為陽性對照。
全文摘要
本發明公開一種動物布魯氏菌抗體膠體金試紙膜檢測試劑盒，根據抗原抗體能特異結合的免疫學基本原理，利用膠體金免疫層析技術和銀染加強技術，以重組的金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)作為金標抗體，以高純度的布魯氏菌LPS作為包被抗原，利用羊抗牛IgG為質控線制備膠體金試紙條。本發明能夠準確區分動物布魯氏菌病種型，可同時檢測牛、羊、豬種動物布魯氏菌病，且不發生交叉反應，假陽性率低，與常規分離培養的陰、陽性符合率為100％。檢測快捷，5分鐘內便可得出結果，不需要復雜的檢測儀器為輔助，解決基層單位和普通獸醫工作者對動物布魯氏菌病的普查和病例檢測難的問題，特別適合基層醫務和獸醫工作者使用。
文檔編號G01N33/558GK101055273SQ200710055740
公開日2007年10月17日 申請日期2007年6月8日 優先權日2007年6月8日
發明者王興龍, 李曉艷, 唐景峰, 梅建軍 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所