專利名稱：一種適用于1型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于禽類免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種適用于1型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集試劑盒的研制及其在1型鴨肝炎病毒抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎(Duck virus Hepatitis，簡(jiǎn)稱DVH)是由鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis virus，簡(jiǎn)稱DHV)引起的雛鴨高度致死、高度傳播性的病毒性傳染病。臨床上以具有明顯神經(jīng)癥狀和肝臟腫大、表面呈斑點(diǎn)樣出血為特征。其主要侵害6周齡以內(nèi)雛鴨，尤以2日至3周的雛鴨最為易感，成年鴨有抵抗力。不同日齡的雛鴨發(fā)病后，死亡率有所不同，有的高達(dá)95％，有的低于15％。耐過的鴨成為僵鴨，生長(zhǎng)和發(fā)育受到障礙嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益。1945年Levinl最先在美國(guó)發(fā)現(xiàn)DVH，其后，在英國(guó)、加拿大、德國(guó)、意大利、印度、法國(guó)陸續(xù)地報(bào)道了本病流行情況。我國(guó)黃均建等首次報(bào)道了上海某鴨場(chǎng)于1958年秋至1962年春本病的暴發(fā)和流行情況，次后，全國(guó)各地都相繼報(bào)道了本病的爆發(fā)與流行。鴨肝炎病毒有1型、2型和3型3個(gè)血清型，1型DHV呈世界分布，2型DHV局限于英格蘭，3型主要局限于美國(guó)。近年來，隨著我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，雖對(duì)種鴨、雛鴨進(jìn)行了免疫預(yù)防，但DVH仍然時(shí)有發(fā)生，并常與病毒、細(xì)菌混合感染，給臨床診斷與防制帶來了很大的困難。在疾病爆發(fā)時(shí)，雛鴨的死亡速度驚人。對(duì)本病最有效的防制方法是用DHV-1疫苗免疫種鴨，使后代雛鴨獲得高水平的母源抗體從而達(dá)到被動(dòng)免疫的目的。另外，雛鴨在1日齡免疫弱毒疫苗，3～7d可產(chǎn)生免疫力，但母源抗體可影響免疫效果，所以在免疫前應(yīng)對(duì)雛鴨母源抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，否則可能導(dǎo)致免疫失敗。建立1型鴨肝炎抗體的血清學(xué)檢測(cè)方法，了解鴨病毒性肝炎抗體的消長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況有利于制定有效的免疫程序。
目前，檢測(cè)1型鴨肝炎病毒抗體方法主要有中和試驗(yàn)(SN)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、免疫熒光試驗(yàn)( IF)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等。中和試驗(yàn)是檢測(cè)1型鴨肝炎病毒抗體最根本、最經(jīng)典的方法也是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法比較煩瑣，需要很有經(jīng)驗(yàn)的人員來操作，而且存在著固有的一些不足之處，比如操作繁瑣、需時(shí)長(zhǎng)，存在生物安全性等問題，不適合基層推廣。瓊脂擴(kuò)散和免疫熒光試驗(yàn)在敏感性和特異性方面都不盡人意，且田間樣本復(fù)雜多變，干擾大，使得這些方法在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用受到一定限制。ELISA雖然相對(duì)容易一些，但仍然需要一定的儀器設(shè)備和操作技能需要時(shí)間也較長(zhǎng)(3-5小時(shí))。乳膠凝集試驗(yàn)(Latex Aagglutination Test，簡(jiǎn)稱LAT)由于其迅速(3分鐘)、簡(jiǎn)單和無須專門的技能和任何特殊儀器設(shè)備而具有巨大的優(yōu)勢(shì)。
提純病毒的方法很多(殷震等編著《動(dòng)物病毒學(xué)》，科學(xué)出版社)，但不同的病毒，由于結(jié)構(gòu)及理化特征不同，其最適提純方法不同。在鴨肝炎病毒的提純方面，眾多的學(xué)者通過不同的方法進(jìn)行提純，但是眾說紛紜，一直以來沒有一種公認(rèn)的可重復(fù)性強(qiáng)的方法。目前由于病原病毒提純困難，難以獲得高濃度高純度的病毒，使得應(yīng)用于臨床的診斷一直存在發(fā)展瓶頸。蔣文燦等，用六種方法提純1型DHVSC株，電鏡觀察比較了提純結(jié)果。以“氯仿去脂一硫酸銨沉淀一蔗糖密度梯度離心法”最佳。(蔣文燦，廖德惠，謝鏡懷.雛鴨病毒性肝炎的研究[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，1989，15(1)9-11.)然而，1990年羅函祿等亦采用此種方法純化病毒并用電鏡觀察確定病毒純化程度，所得結(jié)果與蔣文燦等不一致，病毒粒子大小極不均一，可能是硫酸銨沉淀破壞了病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。且病毒在蔗糖中的浮密度為30％，可能是離心力不同所致。而且蔗糖較難達(dá)到完全脫糖從而易滋生細(xì)菌，影響滅活病毒液在較高溫度下的保存期。而羅函祿等所采用的30％聚乙二醇(PEG)反透析法及II一DEAE纖維素色譜法取得了較好的提純效果(羅函祿，徐汗祥，范文明等.鴨病毒性肝炎的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病，1990，(3)1-3.)。但是，采用的30％聚乙二醇(PEG)反透析法及II一DEAE纖維素色譜法均操作較繁瑣，且穩(wěn)定性差，病毒損耗大等缺點(diǎn)不適合生產(chǎn)化大量純化病毒。趙新柳(ELISA檢測(cè)鴨病毒性肝炎抗體的研究[J]，中國(guó)獸醫(yī)科技，1990，(11)5-6) 曾提出差速超高速離心效果較好。因而，本申請(qǐng)人在此基礎(chǔ)上作出進(jìn)一步的改進(jìn)，提高最超離速度增加病毒收集量，同時(shí)摸索出合適的離心速度組合，提高病毒的純度。此法具有操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，病毒純度高的特點(diǎn)。
從上個(gè)世紀(jì)中葉聚苯乙烯乳膠顆粒開始用做凝集試驗(yàn)的材料以來，由于其所具有的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，如操作簡(jiǎn)便，不需要特殊的儀器，肉眼判斷，也不需要對(duì)操作過程進(jìn)行培訓(xùn)；時(shí)間短，一般在2分鐘之內(nèi)可以出結(jié)果；價(jià)格低廉，檢測(cè)單份樣品比其它血清學(xué)、病原學(xué)方法便宜得多；適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等，在臨床檢驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。其意義有①傳染性疾病的診斷細(xì)菌、真菌、寄生蟲、立克次體、病毒的感染檢測(cè)；②自身免疫病診斷如抗核抗體、類風(fēng)濕因子等檢測(cè)；傳統(tǒng)的乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)是以惰性聚苯乙烯膠乳顆粒作為載體，吸附特定的抗原或抗體，當(dāng)遇到相應(yīng)的抗體和抗原成份時(shí)，會(huì)形成肉眼可見的凝集顆粒。在應(yīng)用乳膠凝集技術(shù)建立病原學(xué)檢測(cè)方法時(shí)，一般是將特異性抗體致敏到乳膠顆粒表面，普通聚苯乙烯膠乳和抗體的結(jié)合為無選擇性的物理靜電吸附，致敏物(抗原或抗體)容易從乳膠顆粒上脫落或者變性失活，導(dǎo)致致敏好的乳膠試劑保存期短，難以適合產(chǎn)品開發(fā)的需要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是獲得一種1型鴨肝炎病毒抗體的乳膠凝集檢測(cè)試劑盒的特異性抗原。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是組裝一種適用于檢測(cè)1型鴨肝炎病毒抗體的乳膠凝集試劑盒。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是1型鴨肝炎病毒抗體的乳膠凝集試劑盒在檢測(cè)中的應(yīng)用，其中包括乳膠凝集卡在制備1型鴨肝炎病毒抗體的乳膠凝集試劑盒中的應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的 申請(qǐng)人:制備了一種適用于1型鴨肝炎病毒抗體檢測(cè)的乳膠凝集試劑盒，它包含盒體和設(shè)在盒體內(nèi)的核心試劑，它還包括陽(yáng)性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品、樣品管、刻度樣品吸管、刻度乳膠吸管和觀察結(jié)果用的載體，所述的核心試劑是由鴨肝炎種毒AV21111純化并滅活的I型鴨肝炎弱毒致敏聚苯乙烯乳膠得到乳膠抗原，所述的陽(yáng)性對(duì)照樣品是1型鴨肝炎強(qiáng)毒抗血清，所述的陰性對(duì)照樣品是無1型鴨肝炎母源抗體的1日齡雛鴨血清，所述的載體是帶有凹窩的紙質(zhì)乳膠凝集卡。該乳膠凝集卡用油墨印制，其凹窩為圓形，窩底為黑色，凹窩周圍為白色。
一種1型鴨肝炎病毒抗體檢測(cè)的乳膠凝集試劑盒的制備方法，其步驟在于 1)將1型鴨肝炎病毒種毒株AV21111進(jìn)行增殖與純化，得到核心試劑的抗原； 2)將步驟1)的抗原致敏乳膠顆粒，得到致敏乳膠； 3)制備I型鴨肝炎病毒抗體陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清； 4)制作用于承載樣品和觀察結(jié)果的紙質(zhì)的乳膠凝集卡。
其中純化1型鴨肝炎病毒的方法是 1)將I型鴨肝炎弱毒株AV21111無菌接種于雞胚尿囊腔內(nèi)，蠟封，并置于37.8℃孵化箱中培養(yǎng)，剔除24h內(nèi)死亡的雞胚，無菌收取24小時(shí)后死亡的雞胚尿囊液備用； 2)在步驟1)的雞胚尿囊液中加入1％的福爾馬林溶液置于4℃滅活12h以上，先經(jīng)5000rpm離心30min，取上清，反復(fù)凍融3次，10000rpm離心30分鐘，取上清，15000rpm離心30分鐘，取上清，60000rpm離心2h，去上清，按體積比取步驟1)的尿囊液體積的1/24的磷酸鹽緩沖液(0.02M、pH7.2)洗滌沉淀，重懸得到純化的I型鴨肝炎弱毒； 3)利用掃描電鏡或核酸蛋白測(cè)定儀鑒定步驟2)的I型鴨肝炎弱毒純度。
本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒能直接對(duì)樣本中的1型鴨肝炎病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)。若樣本中含有1型鴨肝炎病毒抗體，則乳膠試劑在30秒內(nèi)出現(xiàn)明顯均勻一致的凝集，即可判為陽(yáng)性結(jié)果；若樣本中不含有1型鴨肝炎病毒抗體，則乳膠試劑在3分鐘內(nèi)液滴仍然呈原有的均勻乳狀，即可判為陰性結(jié)果。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn) 1、本發(fā)明的試劑盒能直接對(duì)1型鴨肝炎病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)樣品范圍寬包括抗1型鴨肝炎的完整型IgY、缺失型IgY和IgM均能檢測(cè)到； 2、本發(fā)明的試劑盒適用于對(duì)1型鴨肝炎病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)，而對(duì)其它病原所引起的抗體具有特異性。
3、本發(fā)明設(shè)計(jì)了紙質(zhì)凝集卡，改進(jìn)了以往使用玻片凝集的缺點(diǎn)即對(duì)比度不足、反光性強(qiáng)結(jié)果難判斷，成本高，承載樣本量小等缺陷。本發(fā)明的凝集卡具有以下優(yōu)點(diǎn)①由于采用黑色背景加強(qiáng)了對(duì)比度利于對(duì)結(jié)果的判斷，同時(shí)白色紙質(zhì)背景利于標(biāo)記；②本發(fā)明的凝集卡即能檢測(cè)15個(gè)樣本，樣本承載量大，且可根據(jù)樣品量隨意裁剪。③由于采用紙質(zhì)降低了成本，質(zhì)輕便于運(yùn)輸，且可回收利用促進(jìn)了環(huán)保。④凝集卡通過克服張力處理，使得乳膠及樣品混合液能相當(dāng)均勻地鋪滿整孔，從而更有利于結(jié)果判斷。⑤凝集卡作了凹窩處理，使不同樣品檢測(cè)液不會(huì)混淆。⑥凝集卡凹窩直徑是依據(jù)本發(fā)明試劑盒反應(yīng)體系而確定的，因而能使乳膠與樣品的混液恰好鋪滿整個(gè)圓形凹窩而又不會(huì)因鋪涂面積過大而蒸發(fā)過快。⑦凝集卡采用油墨進(jìn)行印刷從而克服了乳膠及樣品水份滲漏的缺陷。
3、本發(fā)明的檢測(cè)方法不需要任何特殊儀器、設(shè)備，具有檢測(cè)成本低的特點(diǎn)。試劑盒操作簡(jiǎn)便，不需由專業(yè)人員操作。本發(fā)明的試劑盒保存期長(zhǎng)，在4℃條件下放置半年不會(huì)影響其敏感性。
圖1是本發(fā)明總體技術(shù)路線圖； 圖2經(jīng)純化后的1型鴨肝炎弱毒株病毒在80萬(wàn)倍電鏡下的均勻度及形態(tài)。
圖3經(jīng)純化的病毒液經(jīng)10％SDS-PAGE分離后所形成的條帶。
圖4本發(fā)明乳膠凝集卡外觀(a、正面b、背面)。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 I型鴨肝炎弱毒的增殖與純化 1、I型鴨肝炎弱毒病毒的增殖 將1型鴨肝炎弱毒株(AV21111，購(gòu)自北京農(nóng)業(yè)部中國(guó)獸藥監(jiān)察所)的凍干粉，用滅菌生理鹽水按體積比為1∶1000進(jìn)行稀釋，同時(shí)加入終濃度為5％青霉素、鏈霉素作用1小時(shí)，無菌操作接種于雞胚尿囊腔(0.1mL/胚)。然后蠟封并置于37.8℃孵化箱中培養(yǎng)。每天照蛋2次。剔除24h內(nèi)死亡雞胚。無菌收取24小時(shí)后死亡的雞胚尿囊液備用。
2、I型鴨肝炎弱毒病毒的純化 在上述收集的雞胚尿囊液中加入1％的福爾馬林溶液置于4℃滅活12h以上。先經(jīng)5000rpm離心30min，取上清，反復(fù)凍3次，10000rpm離心30分鐘取上清，15000rpm離心30分鐘取上清，60000rpm離心2h去上清并用原尿囊液體積的1/24的的磷酸鹽緩沖液(0.02M、pH7.2，配方見下所述)洗滌，沉淀重懸即得純化的1型鴨肝炎弱毒。
3、I型鴨肝炎弱毒病毒純度鑒定 ①電鏡觀察取上述重懸的病毒液50ul作負(fù)染電鏡觀察。結(jié)果見附圖3。
②10％SDS-PAGE膠電泳參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(布魯克著，金中雁譯，科學(xué)出版社)10％SDS-PAGE膠(5％Acrylamide)取上述重懸的病毒液及60000rpm離心2h后之上清各1μL放入EP管中，分別用磷酸鹽緩沖液(0.02M、pH7.2)作10倍稀釋。并分別加入10μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液，蓋上打孔，放入沸水中煮3min，然后上樣到10％SDS-PAGE膠中并Marker(香港昊柏生物科技有限公司H-015)，接上電源調(diào)至80V開始電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至分離膠時(shí)將電壓調(diào)至120V，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至分離膠末端時(shí)停止電泳。染色1h、用脫色液脫色過夜、換脫色液再脫色1h，結(jié)果見附圖3。
③經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀(eppendorf)測(cè)得上述重懸的10％病毒液的蛋白濃度為864.09μg/mL，即重懸的病毒液蛋白濃度為8640.9μg/mL。
實(shí)施例2 I型鴨肝炎弱毒病毒抗乳膠凝集檢測(cè)的建立 ①乳膠前處理取6ml，10％聚苯乙烯乳膠放入EP管A中，加入21ml，磷酸鹽緩沖液(pH7.2，0.01M)。稱取胰酶0.3g溶于3mL，磷酸鹽緩沖液(pH7.2，0.01M)。，然后加入EP管A中水浴(56℃)作用18h，中間搖勻5-6次后用碳酸鹽緩沖(pH9.6，0.1M)液洗3遍，并用碳酸鹽緩沖液(pH9.6，0.1M)重懸到30ml即成2％乳膠可置于4℃?zhèn)溆谩?br>
②將上述2％乳膠用碳酸鹽緩沖液稀釋(pH9.6，0.1M)至1％，與適量的純化后的1型鴨肝炎弱毒致敏一定時(shí)間后用磷酸鹽緩沖液(pH7.2，0.01M，加入0.05％吐溫)洗滌2次。再用無吐溫磷酸鹽緩沖液(pH7.2，0.01M)洗滌1次并重懸至60mL得1％致敏乳膠。其具體步驟如下 1、最佳致敏1病毒量的確定 在1mL 1％乳膠中，分別加入不同量的1型鴨肝炎弱毒液，1型鴨肝炎弱毒液可根據(jù)離心需要進(jìn)行稀釋。從50μg、100μg、150μg遞增至350μg，收集上清，經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀(eppendorf 8.5mm)測(cè)定上清中剩余的病毒蛋白量，計(jì)算病毒的結(jié)合效率，計(jì)算公式如下 病毒的結(jié)合效率(％)＝(病毒的初始加入量-剩余的病毒量)/病毒的初始加入量×100％ 經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在1mL濃度為1％的乳膠中，當(dāng)加入的病毒蛋白量為300μg時(shí)，結(jié)合效率達(dá)到最大，此時(shí)乳膠檢測(cè)的靈敏度最高，穩(wěn)定性最好，故選擇該加入量為病毒致敏的最佳量。具體結(jié)果見表1 表1 1型鴨肝炎弱毒不同加入量對(duì)的結(jié)合效率的影響 注本表所指病毒為1型鴨肝炎弱毒 2、最佳致敏時(shí)間的選擇 在1mL1％乳膠中，加入300μg病毒，在室溫作用不同的時(shí)間(0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h)，作用完后收集上清，經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀(eppendorf eppendorf 8.5mm)測(cè)定上清中剩余的病毒蛋白量，計(jì)算病毒的結(jié)合效率，計(jì)算公式如下 病毒的結(jié)合效率(％)＝(病毒的初始加入量-剩余的病毒量)/病毒的初始加入量×100％ 結(jié)合到乳膠上的病毒量＝病毒的初始加入量-剩余的病毒量 經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)結(jié)合時(shí)間達(dá)到2.5h時(shí)，結(jié)合到乳膠微球上的病毒量基本上不再變化，此時(shí)結(jié)合效率達(dá)到最大，所以選用2.5h作為最佳致敏時(shí)間。具體結(jié)果見表2 表2 1型鴨肝炎弱毒不同致敏時(shí)間對(duì)結(jié)合效率的影響 注本表所指病毒為1型鴨肝炎弱毒 3、偶聯(lián)反應(yīng)溫度的選擇 不同致敏溫度影響到乳膠對(duì)1型鴨肝炎弱毒的結(jié)合效率，故選取37℃、25℃、4℃分別進(jìn)行試驗(yàn)。病毒結(jié)合率計(jì)算公式同上。
經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，當(dāng)溫度在37℃時(shí)結(jié)合效率最大，故選用37℃作為最佳致敏時(shí)間。具體結(jié)果見表3 表3 1型鴨肝炎弱毒不同致敏溫度對(duì)結(jié)合效率的影響 注本表所指病毒為1型鴨肝炎弱毒 4、致敏加樣方式的選擇 采用以上確定的最佳致敏病毒量，最佳致敏時(shí)間，最佳致敏溫度，對(duì)不同的致敏的加樣方式進(jìn)行對(duì)比，病毒結(jié)合率計(jì)算公式同上。經(jīng)試驗(yàn)得出最佳的致敏方式為，采用磁力攪拌器先放入1％空白乳膠再將1型鴨肝炎弱毒逐滴緩緩加入為最佳致敏方式。具體結(jié)果見表4 表4 不同致敏方式對(duì)結(jié)合效率的影響 實(shí)施例3 I型鴨肝炎病毒抗體陽(yáng)性、陰性對(duì)照血清的制備 1動(dòng)物準(zhǔn)備引進(jìn)無母源抗體1日齡雛鴨20只，隔離飼養(yǎng)3周，第三周翅靜脈采取5ml/羽的鴨血制備陰性血清，并以0.05％強(qiáng)力霉素飲水，預(yù)防細(xì)菌感染，觀察一周，表現(xiàn)正常時(shí)便可以接種。
2接種分組A8只接I型鴨肝炎鄭株強(qiáng)毒肝勻漿(中科院武漢病毒所惠贈(zèng)本室保藏)，B12只接I型鴨肝炎弱毒株尿囊液。
3弱毒尿囊液處理將采取的尿囊液取80ml反復(fù)凍融三次，作5000轉(zhuǎn)離心20min，取上清液加等體積氯仿強(qiáng)烈振蕩30min，5000轉(zhuǎn)離心20min取上清用等體積氯仿按上述步驟，重復(fù)抽提二次，取上清用蔗糖濃縮為8ml。
4強(qiáng)毒肝懸液的的制備無菌采取病鴨的肝臟組織，稱重，剪碎并用滅菌玻璃勻漿器制備組織勻漿，按1∶10(質(zhì)量/體積比)加入生理鹽水(含青霉素、鏈霉素各20U/ml)。將勻漿液轉(zhuǎn)到離心管中，8000r/min離心5min，取其中間清亮部分再8000r/min離心20min重復(fù)一次。離心后棄去上層脂肪和下層沉淀，抽取中間清亮的液體，反復(fù)凍存三次，再次離心取上清置-20℃?zhèn)溆谩?br>
5接種取出處理好的弱毒尿囊液及強(qiáng)毒肝懸液，加入1％甲醛過夜滅活，并加入2-5％的雙抗作用1小時(shí)，與弗氏不完全佐劑乳化后，以0.2ml/羽頸部皮下注射，隔10天再免一次共免4次，取血清測(cè)效價(jià)。
6鴨抗DHV高免血清中和效價(jià)的測(cè)定完成免疫程序后，先取少量血清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。
①測(cè)病毒LD50將弱毒病毒原液按10倍遞增稀釋，選擇102、103、101、105、106、107個(gè)稀釋度分別接種9日齡的雞胚，每胚0.1ml，每個(gè)稀釋度作為一組，每組5個(gè)蛋，另設(shè)對(duì)照5個(gè)。接種后觀察一周內(nèi)的死亡數(shù)和生存數(shù)。按Reed-Muech法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表5 表5 AC21111弱毒株LD50的測(cè)定 經(jīng)計(jì)算得LD50為10-5 278。
注表5用的弱毒株AC21111購(gòu)自北京中國(guó)動(dòng)物監(jiān)督所，傳代C21-1-1。
②中和指數(shù)測(cè)定將20只免疫后的鴨的血清各取1mL血清混和后用滅菌生理鹽水作倍比稀釋從1∶4到1∶128(即5個(gè)稀釋度)，同時(shí)將經(jīng)毒價(jià)滴定的病毒稀釋成每個(gè)單位劑量含100LD50；兩者分別等量混合并加入2-5％的青霉素、鏈霉素雙抗37℃水浴1小時(shí)，然后接種于9日齡雞胚尿囊腔內(nèi)，每胚0.1ml，每個(gè)血清滴度接種5只雞胚，另設(shè)病毒對(duì)照、血清對(duì)照和生理鹽水對(duì)照各5個(gè)，24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚棄去不計(jì).記錄7天內(nèi)的雞胚死亡情況，計(jì)算血清的中和效價(jià)。接毒后70h病毒對(duì)照組全部死亡，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束血清對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組均存活，其它實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表6 表6 鴨肝炎陽(yáng)性血清中和效價(jià)測(cè)定 可見該血清混合物的中和效價(jià)恰好為1∶32。
7、多克隆抗體(抗血清)的提取及保存用輸液管從鴨頸靜脈放血，收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后析出血清置4℃下使血凝塊收縮，離心，4000rpm，10min。在無菌條件，吸出血清加入0.01％硫柳汞，分裝小瓶(0.05～0.2ml)，置-20℃以下低溫保存。亦可將抗血清冷凍干燥后保存。
8、陰性血清制備方法 以5mL一次性注射器抽取5mL血/只，血清的提取保存方法同陽(yáng)性血清提取法。
實(shí)施例4 I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒的敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和反應(yīng)體系試驗(yàn) 1、敏感性試驗(yàn) 將I型鴨肝炎病毒陽(yáng)性血消倍比稀釋，分別用致敏好的乳膠診斷試劑檢測(cè)，可見該試劑盒可檢測(cè)至1∶256的滴度。結(jié)果見表7 表7 本發(fā)明試劑盒的敏感性試驗(yàn) 注“++++”全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明，30秒以內(nèi)發(fā)生凝集；“+++”大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁30秒到1分鐘內(nèi)發(fā)生凝集；“++”約50％乳膠凝集，但顆粒較細(xì)，液體較混濁1-2分鐘內(nèi)發(fā)生凝集；“+”有少許凝集2-3分鐘內(nèi)發(fā)生凝集，液體呈混濁；“-”液滴呈原有的均勻乳狀超過3分鐘不凝集。
2、特異性試驗(yàn) 將致敏好的乳膠試劑與I型鴨肝炎病毒陽(yáng)性血清反應(yīng)呈強(qiáng)陽(yáng)性，與鴨的主要的疾病的病原抗血清如鴨瘟病毒抗體陽(yáng)性血清、鴨疫里氏桿菌抗體陽(yáng)性血清、鴨鏈球菌抗體陽(yáng)性血清等均不反應(yīng)，達(dá)到了較好的特異性。結(jié)果見表8 表8 特異性試驗(yàn)(n＝5) 3、反應(yīng)體系試驗(yàn) 由于樣品通常來源于雛鴨，因而節(jié)約樣品極其重要，故在整個(gè)反應(yīng)體系的確定過程中在保證反應(yīng)分辨率的前提下申請(qǐng)人優(yōu)先考慮較少的樣品量。申請(qǐng)人將1％致敏乳膠加入量周定在40μL。樣品加入量倍比遞增，通過反應(yīng)結(jié)果來確定樣品的加入量。通過實(shí)驗(yàn)將反應(yīng)體系確定為1％致敏乳膠40μL，血清樣品2μL。具體實(shí)驗(yàn)如下表。
反應(yīng)體系試驗(yàn) 實(shí)施例5 I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒的重復(fù)性試驗(yàn) 1、批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 制備6批I型鴨肝炎抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒(乳膠批號(hào)分別為070313-14、070403-04、070424-24、070427-28、070628-29、070701-02)對(duì)每批次的致敏乳膠均取六個(gè)分裝號(hào)，同時(shí)均作其盒內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品、鴨瘟抗體陽(yáng)性血清和里氏桿菌抗體陽(yáng)性血清檢測(cè)，觀察其敏感性、特異性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，其敏感性、特異性和穩(wěn)定性沒有變化，說明本乳膠凝集方法的批內(nèi)重復(fù)性良好。其檢測(cè)結(jié)果見表9、10、11、12、13、14所示 表9 本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(試劑盒批號(hào)070313-14) 表10 本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(試劑盒批號(hào)070403-04) 表11 本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(試劑盒批號(hào)070424-24) 表12 本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(試劑盒批號(hào)070427-28) 表13 本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(試劑盒批號(hào)070628-29) 表14 本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(試劑盒批號(hào)070701-02) 2、批間重復(fù)性試驗(yàn) 隨機(jī)抽取在不同時(shí)間制備6批1型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒每批各一個(gè)(乳膠分裝批號(hào)分別為070313-148、070403-047、070424-243、070427-282、070628-291、070701-029)，對(duì)同一份陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、鴨瘟抗體陽(yáng)性血清和里氏桿菌抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，觀察其敏感性、特異性和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，其敏感性、特異性和穩(wěn)定性沒有變化，說明本LAT方法的批間重復(fù)性良好如表15所示。
表15 本發(fā)明試劑盒的批間重復(fù)試驗(yàn) 實(shí)施例6 I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒的保存期試驗(yàn) 1、高溫對(duì)本發(fā)明試劑盒的破壞作用(37℃下貯存3天) 將6個(gè)不同批次的I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒(乳膠分裝批號(hào)分別為070313-141、070403-041、070424-241、070427-281、070628-291、070701-021)于37℃下貯存3天后，與保存在4℃貯存的同批試劑盒同時(shí)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)陰性、陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果(如表16所示)表明高溫(37℃貯存3天)對(duì)試劑盒的破壞作用不足于破壞其穩(wěn)定性。
表16 高溫(37℃作用3天)對(duì)本發(fā)明試劑盒的破壞作用 2、試劑盒的保存期實(shí)驗(yàn)(4℃) 將同一批致敏的乳膠試劑分裝成小份，分別在4℃和室溫下保存1至9個(gè)月，每月定期進(jìn)行凝集試驗(yàn)，分別與陽(yáng)性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品、鴨瘟抗體陽(yáng)性血清和里氏桿菌抗體陽(yáng)性血清反應(yīng)，觀察其敏感性、特異性和穩(wěn)定性，以確定乳膠試劑的保存期。在本試驗(yàn)中，申請(qǐng)人制備了三個(gè)批次的乳膠診斷試劑(批號(hào)070313-141、070403-04、070424-24)，同時(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)。通過本試驗(yàn)，乳膠試劑經(jīng)4℃保存4個(gè)月以上其特異性，穩(wěn)定性、敏感性均不發(fā)生改變。結(jié)果見表17，18，19 注表17、18、19所述時(shí)間均為2007年。
表17 本發(fā)明的乳膠診斷試劑保存期試驗(yàn)(批號(hào)070313-141) 表18 本發(fā)明的乳膠診斷試劑保存期試驗(yàn)(批號(hào)070403-04) 表19 本發(fā)明的乳膠診斷試劑保存期試驗(yàn)(批號(hào)070424-24) 實(shí)施例7 I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒與中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的比較試驗(yàn) 1、中和試驗(yàn)及結(jié)果制陽(yáng)性血清后對(duì)20只鴨的混和血清作中和試驗(yàn)結(jié)果見上述實(shí)例3。
2、I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒使用I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒對(duì)用于中和試驗(yàn)的混和血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)每一份血清進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè)，結(jié)果如下表20 表20 本發(fā)明的試劑盒對(duì)20只免疫鴨的檢測(cè)結(jié)果 實(shí)施例8 I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集試驗(yàn)與間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的比較 1、敏感性比較 將本發(fā)明的試劑盒陽(yáng)性對(duì)照樣品做倍比稀釋后同時(shí)用發(fā)明的試劑盒和I型鴨肝炎病毒抗體間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果(表21)表明I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒和比ELISA敏感性略差。這是由于這兩種方法本身存在的差異所決定的。ELISA由于使用酶標(biāo)二抗及酶標(biāo)儀進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)因而敏感較乳膠的肉眼觀察高是合理的，當(dāng)然敏感性的提高同時(shí)也使得ELISA得出假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果也相應(yīng)提高。故而該差異不影響本發(fā)明的試劑盒的應(yīng)用。
表21 敏感性比較結(jié)果 2、特異性比較 使用本發(fā)明的試劑盒試劑盒和ELISA同時(shí)檢測(cè)與鴨的主要的疾病的病原抗血清如鴨瘟病毒抗體陽(yáng)性血清、鴨疫里氏桿菌抗體陽(yáng)性血清、鴨鏈球菌抗體陽(yáng)性血清等，檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)出乳膠具有更好的特異性。這可能因?yàn)槿槟z不使用二抗的原因。結(jié)果見表22 表22 特異性檢測(cè)結(jié)果 3、符合率比較 使用本發(fā)明的試劑盒和ELISA同時(shí)檢測(cè)結(jié)果見表23 表23本發(fā)明的乳膠凝集試驗(yàn)與間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的符合率比較結(jié)果(單位羽份) 符合率＝(相同的陽(yáng)性樣品數(shù)+相同的陰性樣品數(shù)/總數(shù))×100％ 實(shí)施例9 乳膠凝集卡設(shè)計(jì)及前處理 本發(fā)明的乳膠凝集卡每卡包括15個(gè)樣品凹窩，樣品窩底為黑色，窩型為圓形，窩周為白色(見附圖4)。每個(gè)試劑盒包括兩張乳膠凝集卡共30個(gè)樣品凹窩，可檢樣品28份(另外兩窩則用于作陽(yáng)性和陰性對(duì)照)。
本發(fā)明的乳膠凝集卡是由印刷廠印制的帶有凹窩的紙質(zhì)的凝集卡(武漢市洪山區(qū)壕溝種子印務(wù)承制)。
乳膠凝集卡是本發(fā)明試劑盒的一個(gè)顯著特色。眾所周知，在傳統(tǒng)的凝集試驗(yàn)中常采用玻片作載體，如果玻片不干凈便會(huì)造成乳膠液滴表面張力過大不易涂開從而影響判定。在未經(jīng)處理的紙質(zhì)凝集卡上由于需要采用油質(zhì)印刷，故而同樣存在表面張力過大的問題。為克服該問題申請(qǐng)人通過不同的溶劑進(jìn)行處理驗(yàn)證，以75％灑精棉球擦拭效果最好，致敏乳膠與樣品的混和液能均勻地鋪滿整個(gè)圓孔便于觀察結(jié)。具體制備方法如表24 表23 乳膠凝集卡乳膠表面張力試驗(yàn) 實(shí)施例10 I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒的盲樣檢測(cè) 為驗(yàn)證本發(fā)明的試劑盒在結(jié)果判斷過程中不同人可能造成的差異。本人邀請(qǐng)10位從來沒做過乳膠凝集試驗(yàn)的人在說明書的指導(dǎo)下對(duì)本發(fā)明的試劑盒試驗(yàn)過的已知具有不同I型鴨肝炎病毒抗體滴度的4個(gè)血清樣本進(jìn)行試驗(yàn)，并要求他們將自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果從強(qiáng)陽(yáng)性到陰性按其強(qiáng)弱進(jìn)行排序。該實(shí)驗(yàn)是在不同地點(diǎn)，不同時(shí)間，不同實(shí)驗(yàn)者，并且10位實(shí)驗(yàn)者事先不知道別人實(shí)驗(yàn)結(jié)果情況下獨(dú)立完成的。結(jié)果表明，所有10位實(shí)驗(yàn)者與本人的排序完全一致。因而證明該試劑盒具有可重復(fù)性、敏感性好、結(jié)果分辨率強(qiáng)，易于判斷且對(duì)于不同的人的差別不大的優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例11 I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒的組裝 1、I型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集檢測(cè)試劑盒包括 1)乳膠抗原1管 (1.2ml/管) 2)陽(yáng)性對(duì)照1管 (0.05ml/管) 3)陰性對(duì)照1管 (0.05ml/管) 4)樣品管 30管 (200μL空管) 5)樣品定量吸管30支 (定量線2μL) 6)乳膠定量吸管1支 (定量線40μL) 7)乳膠凝集卡 2塊 (30樣個(gè)品孔) 實(shí)施例12 本發(fā)明試劑盒的使用方法 1、樣品制備 1)雛鴨血清樣品提取方法小跖骨內(nèi)側(cè)用酒精棉球消毒，然后用7號(hào)針頭刺破鴨小跖骨靜脈讓血流進(jìn)樣品管中，約1-2滴然后用干棉花止血。收集的血液置于室溫下1h左右，血液凝固析出血清后置4℃下使血凝塊收縮。
2)20日齡以上鴨血清樣品提取方法。翅膀內(nèi)側(cè)酒精棉球消毒，貴要靜脈采血置于樣品管中，約1-2滴然后用干棉花止血。收集的血液置于室溫下1h左右，血液凝固析出血清后置4℃下使血凝塊收縮。
2、檢測(cè) 用乳膠定量吸管吸取乳膠到定量線(40μL)滴于凝集板上的黑色凹孔內(nèi)，用樣品定量吸管從樣品管中小心吸取血清至定量線(2μL)，注意別吸到血凝塊，滴于凝集板上的乳膠滴中，攪拌混勻使乳膠及樣品混合液鋪滿整個(gè)黑色圓孔，搖動(dòng)30秒后觀察結(jié)果。
3、結(jié)果判定 1)對(duì)照試驗(yàn)30秒內(nèi)出現(xiàn)如下結(jié)果，試驗(yàn)方可成立陽(yáng)性對(duì)照與乳膠診斷試劑作用出現(xiàn)明顯均勻一致的凝集，陰性對(duì)照與乳膠診斷試劑不凝集。
2)“++++”全部乳膠凝集，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明，30秒以內(nèi)發(fā)生凝集；“+++”大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁30秒到1分鐘內(nèi)發(fā)生凝集；“++”約50％乳膠凝集，但顆粒較細(xì)，液體較混濁1-2分鐘內(nèi)發(fā)生凝集；“+”有少許凝集2-3分鐘內(nèi)發(fā)生凝集，液體呈混濁；“-”液滴呈原有的均勻乳狀超過3分鐘不凝集。“++++”“+++”視為強(qiáng)陽(yáng)性，“++”“+”視為弱陽(yáng)性，“-”視為陰性。
盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)施例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
附錄本發(fā)明的緩沖液的配制 0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，用雙蒸水定容至1000ml。
0.02M pH7.2的磷酸鹽緩沖液NaCl 8.0g，Na2HPO4.12H2O 1.41g，KH2PO4 0.14g，用雙蒸水定容至1000ml。
0.1M pH9.6的碳酸鹽緩沖液Na2CO3 3.18g，NaHCO3 5.86g，用雙蒸水定容至1000ml。
2×SDS-PAGE上樣緩沖液0.5M pH6.8 Tris堿2.0mL，10％SDS 4.0mL，甘油2.0mL，1％溴酚藍(lán)0.05mL，雙蒸水 定容至10mL，DTT 0.154g(用時(shí)現(xiàn)加)。
脫色液醋酸3mL，甘油10mL，雙蒸水87mL。
權(quán)利要求
1、一種適用于1型鴨肝炎病毒抗體檢測(cè)的乳膠凝集試劑盒，它包含盒體和設(shè)在盒體內(nèi)的核心試劑，它還包括陽(yáng)性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品、樣品管、刻度樣品吸管、刻度乳膠吸管和觀察結(jié)果用的載體，其特征在于，所述的核心試劑是由鴨肝炎種毒AV21111純化并滅活的I型鴨肝炎弱毒致敏聚苯乙烯乳膠得到乳膠抗原，所述的陽(yáng)性對(duì)照樣品是1型鴨肝炎強(qiáng)毒抗血清，所述的陰性對(duì)照樣品是無1型鴨肝炎母源抗體的1日齡雛鴨血清，所述的載體是帶有凹窩的紙質(zhì)乳膠凝集卡。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的乳膠凝集卡凹窩為圓形，窩底為黑色，凹窩周圍為白色。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的乳膠凝集卡用油墨印制。
4、權(quán)利要求1所述的1型鴨肝炎病毒抗體檢測(cè)的乳膠凝集試劑盒的制備方法，其步驟在于
1)將1型鴨肝炎病毒種毒株AV21111進(jìn)行增殖與純化，得到乳膠抗原；
2)將步驟1)的乳膠抗原致敏乳膠顆粒，得到致敏乳膠；
3)制備I型鴨肝炎病毒抗體陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清；
4)制作用于承載樣品和觀察結(jié)果的紙質(zhì)的乳膠凝集卡。
5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中純化1型鴨肝炎病毒的方法是
1)將I型鴨肝炎弱毒株AV21111無菌接種于雞胚尿囊腔內(nèi)，蠟封，并置于37.8℃孵化箱中培養(yǎng)，剔除24h內(nèi)死亡的雞胚，無菌收取24小時(shí)后死亡的雞胚尿囊液備用；
2)在步驟1)的雞胚尿囊液中加入1％的福爾馬林溶液置于4℃滅活12h以上，先經(jīng)5000rpm離心30min，取上清，反復(fù)凍融3次，10000rpm離心30分鐘，取上清，15000rpm離心30分鐘，取上清，60000rpm離心2h，去上清，按體積比取步驟1)的尿囊液體積的1/24的磷酸鹽緩沖液(0.02M、pH7.2)洗滌沉淀，重懸得到純化的I型鴨肝炎弱毒；
3)利用掃描電鏡或核酸蛋白測(cè)定儀鑒定步驟2)的I型鴨肝炎弱毒純度。
6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟4)所述的乳膠凝集卡帶有圓形凹窩，窩底為黑色，凹窩周圍為白色。
7、權(quán)利要求1、2或3所述的乳膠凝集卡在制備乳膠凝集檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于禽類免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于1型鴨肝炎病毒抗體乳膠凝集試劑盒及其在1型鴨肝炎病毒抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明的試劑盒，包含盒體和設(shè)在盒體內(nèi)的核心試劑，陽(yáng)性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品、樣品管、刻度樣品吸管、刻度乳膠吸管和觀察結(jié)果用的載體，其特征在于，所述的核心試劑是由鴨肝炎種毒AV21111純化并滅活的1型鴨肝炎弱毒致敏聚苯乙烯乳膠得到乳膠抗原，所述的陽(yáng)性對(duì)照樣品是1型鴨肝炎強(qiáng)毒抗血清，陰性對(duì)照樣品是無1型鴨肝炎母源抗體的1日齡雛鴨血清。所述的載體是帶有凹窩的紙質(zhì)乳膠凝集卡。本發(fā)明還公開了該試劑盒的制備方法及應(yīng)用。該試劑盒能特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便和診斷快速等顯著優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK101101297SQ20071005282
公開日2008年1月9日 申請(qǐng)日期2007年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月24日
發(fā)明者胡薛英, 彭婉芬, 程國(guó)富, 谷長(zhǎng)勤, 張萬(wàn)坡 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)