專利名稱：堿溶性香菇多糖提取、分離、純化及分子量的測定的制作方法
堿瘠性香恭多llli取、分離、純皿分子量的翻定撥術領域本發明是對現有香菇多糖提取工藝的改進，公開了堿溶性番菇多 糖提取、分離、純化新工藝及分子量測定的新方法。以香菇子實體為 原料進行提取、分離、純化、涉及天然生物反應調節劑的制備及其檢 測方法。
背景技術：
香菇中富含蛋白質、雜多糖和香菇多糖等多種成分，是我國傳統 的中藥材，具有補肝益氣的作用。香菇多糖(英文名Lentinan),其 —級餘構是e-(卜3)葡萄糖為主鏈，0- (1-6)葡萄糖為側鏈的葡 聚糖:，是一種免疫調節型抗腫癯輔助藥物。1965年日本千原吳郎發 現^t抗腫瘤活性后，各國科學家就對香菇多糖進行廣泛研究，發現 香燕多糖不但治療多種免疫缺乏疾病，如慢性病毒性肝炎和由病毒引 起的慢性疾病，還能對多種腫癯有較強的抑制和治療作用。1985年 曰本首先開發成功注射用香菇多糖作為抗腫瘤新藥上市。我國1988 年開始進口日本味之素的香菇多糖，并用于臨床。香菇多糖提取工藝十分復雜，香菇除含有多糖物質外，還含有一 定量蛋白質、膠質、粗纖維及脂肪等成分。目前常采用的方法是沸水 浸提乙醇析出的方法，而這樣提取多糖的純度并不高，仍需經過一系 列后續處理才能使多糖含量達到90%左右。此提取步驟不僅耗費了大量的乙醇。而且得到的香菇多糖含量并不高,遣成后續工藝處理復雜。有關香菇多糖的分子量測定，目前我國均采用GPC凝膠色譜(示差儀)測定a由于所采用的凝膠柱型號各不相同，對分子量的測定誤差很大， 無法準確判斷香菇多糖原料是否合格。為了使香菇多糖原料分子量測定更準確，我們用GPC凝膠色譜儀激光光散射的方法來測定香菇多糖的分子量，該方法是通過香薛多糖粒徑來判斷分子量的大小，再計算 出重均分子量。具有測定分子量簡便、準確率高、無霈對照品，即可 測出香菇多糖樣品的準確分子量。 發明內容本發明目的就是為了尋找一種新的較為易于生產、成本低、目標 明確、檢測方便、可行的堿溶性番菇多糖的提取、分離、純化新工藝 及其分子量測定方法。香菇多糖提取、分離、純化具體過程通過下列步驟實施-千香菇一粉碎一堿提3次(40-50t:) 一濃縮一堿洗—水洗—級 分一低溫千燥一粗品溶解—離心一上淸液上DEAE纖維素純化，離子 交換樹脂柱吸附一過濾一超濾膜濃縮一測分子量一透析，透析物冷 凍干燥 操作工藝l.取干香薛子實體粉碎后，加8—10倍，0.3—lmol/LN幼H溶液、溫 控30-50 r攪拌提取3次。每次3—4小時。合并提取液，濾去不 溶物、濃縮至原液體積8—10分之一。用0.3mol/LNa0H濃縮液洗滌2次再用同樣體積去離子水洗滌2次濃縮液，用茚三酮檢測，基本無 殘余蛋白質,將洗滌后的濃縮液在快速攪拌下加不同含量的乙醇進行 級分，將級分粘稠物低溫干燥，得粗品，將粗品溶解后離心，取上層 清液上DME纖維素柱除雜純化，用0.15TOl/LNaoH洗脫，合并洗脫 液，上離子交換樹脂柱吸附脫色，合并洗脫液，過濾，按設定分子量 膜包分別超濾濃縮，用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，按分 子量范圍，分別透析、凍干得各組份堿溶性香菇多糖。經檢測分子量 為40^80萬Da的堿溶性香菇多糖其外觀、吸濕性、溶解度、比旋度、 熔點、特性粘度、酸堿度、千燥失重、分子量及分子量分布、純度、 含量、紅外吸收光譜(見
圖1、圖2)均與國家標準WS廣(X-032)-2004Z 香茲多糖的規定一致。提取、分離、純化番菇多糖具體實施方式
實施例1:取合格的干香菇原料8公斤，粉碎后，置于帶夾套的反應鍋中。 加入0.5mol/LNaoH的堿溶液80公斤加熱至40 t ，保溫攪拌4小時, 過濾，殘渣再用上述方法提取2次。合并全部溶液，濃縮至原體積的 十分之一，再加人0. 3mol/LNa0H 2倍于濃縮液的堿液濃縮洗滌2次， 再用同樣體積去離子水濃縮洗滌2次，洗滌后的濃縮液用茚三酮檢測 反應不顯藍紫色。將洗滌后的濃縮液在快速攪拌下用50-70%的乙醇 進行級分，繼續攪拌15分鐘后靜置4小時，沉淀產生、傾去上清液, 沉淀物再用80-90%的酒精溶解攪拌15分鐘后靜置4小時,沉淀產生，沉淀物在50"低溫干燥得無蛋白殘留堿溶性番菇多糖粗品400克。將香菇多糖粗品按1: 100比例溶于0.15mol/L的堿溶液中溶解。 溶解后離心，取上清液，上DEAE纖維素柱除雜化，上離子交換樹脂 柱吸附脫色，洗脫液過濾后分別用5-30萬分子量膜包依次濃縮至最 小體積，用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，將不同級別分子 量的濃縮液分別裝入透析袋，用去離子水透析48小時后凍干，得含 量為9挑以上。重均分子量為10萬一,萬Da的各組份香菇多糖共 20克。實施例2:取合格的干香菇原料10公斤，粉碎后，置于帶夾套的反應鍋中。 加入0.5mol/LnaoH的堿溶液100公斤加熱至40匸，保溫攪拌4小 時，過濾，殘渣再用上述方法提取2次。合并全部溶液，濃縮至原體 積的十分之一，再加人0.3mol/L Na0H 2倍于濃縮液的堿液濃縮洗滌 2次，再用同樣體積去離子水濃縮洗絳2次，洗滌后的濃縮液用茚三 酮檢測反應不顯藍紫色。將詵滌后的濃縮液在快速攪拌下用50-70% 的乙醇進行級分，繼續攪拌15分鐘后靜置4小時，沉淀產生、傾去 上清液，沉淀物再用80-90%的酒精溶解攜拌15分鐘后靜置4小時， 沉淀產生，沉淀物在50TC低溫干燥得無蛋白殘留璩溶fe香菇多糖粗 品500克。將番菇多糖粗品按i: 100比例溶于0.15mol/L的堿溶液中溶解。 溶解后離心，取上清液，上腿AE纖維素柱除雜化，上離子交換樹脂柱吸附脫色，洗脫液過濾后分別用5-30萬分子量膜包依次濃縮至最 小體積，用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，將不同級別分子 量的濃縮液分別裝入透析袋，用去離子水透析48小時后凍干，得含量為雜%以上。重均分子量為10萬一IOO萬Da的各組份眷菇多糖共 25克。實施例3:取合格的千香菇原料13公斤，粉碎后，置于帶夾套的反應鍋中， 加入0.5mol/LimoH的堿溶液130公斤加熱至40 保溫攪拌4小 時，過濾，殘渣再用上述方法提取2次，合并全部溶液，濃縮至原體 積的十分之一，再加人0.3mol/L NaOH 2倍于濃縮液的堿液濃縮洗滌 2次，再用同樣體積去離子水濃縮洗滌2次，洗滌后的濃縮液用茚三 醣檢測反應不顯藍紫色。將洗滌后的濃縮液在快速攬拌下用50-70% 的乙醇進行級分，繼續攪拌15分鐘后靜置4小時，沉淀產生、傾去 上清液，沉淀物再用80-90%的酒精溶解攪拌15分鐘后靜置4小時， 沉淀產生，沉淀物在501C低溫千燥得無蛋白殘留堿溶性香菇多糖粗 品650克。將香菇多糖粗品按1: 100比例溶于0.15moi/L的堿溶液中溶解。 溶解后離心，取上清液，上DEAE纖維素柱除雜化，上離子交換樹脂 柱吸附脫色，洗脫液過濾后分別用5-30萬分子量膜包依次濃縮至最 小體積，用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，將不同級別分子量的濃縮液分別裝入透析袋，用去離子水透析48小時后凍干，得含 量為98%以上。重均分子量為10萬一IOO萬Da的各組份香菇多糖共 32克。實施例4:取合格的千香菇原料12公斤，粉碎后，置于帶夾套的反應鍋中。 加入0.5mol/LnaoH的堿溶液120公斤加熱至40 1C,保溫攪拌4小 時，過濾，殘渣再用上述方法提取2次。合并全部溶液，濃縮至原體 積的十分之一，再加人0.3mol/L NaOH 2倍于濃縮液的堿液濃縮洗滌 2次，再用同樣體積去離子水濃縮洗滌2次，洗滌后的濃縮液用茚三 酮檢測反應不顯籃紫色。將洗滌后的濃縮液在快速攏拌下用50-70% 的乙醇進行級分，繼續攪拌15分鐘后靜置4小時，沉淀產生、傾去 上清液，沉淀物再用80-90%的酒精溶解攪拌15分鐘后靜置4小時，沉淀產生，沉淀物在sot:低溫干燥得無蛋白殘留堿溶性香菇多糖粗品600克。將香菇多糖粗品按1: 100比例溶于O. i5啦l/L的堿溶液中溶解。 溶解后離心，取上清液，上DEAE纖維素柱除雜化，上離子交換樹脂 柱吸附脫色，洗脫液過濾后分別用5-30萬分子量膜包依次濃縮至最 小體積，用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，將不同級別分子 量的濃縮液分別裝入透析袋，用去離子水透析48小矽后凍干，得含 量為98%以上。重均分子量為10萬一IOO萬Da的各組份香菇多糖共 30克。番翁多糖分子量測定方法通過下列步驟實施豕操作工藝1. 流動相的處理采用純度較高的鹽水溶液作為流動相(使用其它 有機溶劑作為流動相處理方法相同)，將溶液過濾并超聲脫氣至少3(teiri,加入凝膠滲透色譜儀的流動相瓶中待用S2. 配制樣品用流動相作溶劑，將香菇多糖用流動相溶解，并稀釋至約.lmg/mL。3. 基線平衡分別將示差折光檢測器多角度靜態激光光散射儀、機械 泵、柱溫箱及其控制單元的電源打開，并打開儀器操作軟件 ASTRA4.90.08調節柱溫30-35^,調節機械泵，使流動相的流速緩慢 升至lmL/班in。通過示差折光控制面板上的TAB鍵選中Purge鍵，按 ENTER鍵使之處于Purge ON的狀態，流動相同時沖洗參比池和樣品 池，開機后，至少讓儀器平衡2h,待兩個檢測器基線穩定后再進行 測定。4. 香菇多糖分子量的測定打開軟件Collect菜單，并進一步打開其 中的Sample set子菜單選擇Edit進行編輯，分別輸入香菇多糖樣品 與保存的文件名、保存目錄、采集時間、流動相流速及樣品的dn/dc 值、編輯完畢,按OK鍵。將樣品通過過濾頭注入進樣閥中,打開Inject 菜單選擇Sample Set即打開數據采幾窗口，連著按兩次OK按鈕，將 進樣閥的控制閥扳至Inject軟件自動開始采集數據。在設定的時間 內采集完數據。將采集到數據的文件打開，選擇Vi柳菜單中的BaseWne選項，分別拖拽鼠標設定示差折光檢測器和多角靜態激光 光散射儀第十一角度檢測器的信號基線，然后選擇Options菜單中的 Autobaseline對其它角度的光散射信號自動設定基線，基線設定完 畢后，選擇View菜單中的Peaks項，通過鼠標選定色譜峰區域，點 擊Reports菜單的Suraary,看所得到的分子量及分子量結果，更詳 細的結果可以通過mstrbution菜單來査看。GPC激光光散射凝膠滲 透色譜儀的結構(見圖3) 香雍多糖重均分子量測定方法具體實施方式
實鱅樹l 操作工藝-配制0.鄉Nacl水溶液作為流動相，過濾并超聲脫氣至少3toin，加 入凝膠滲透色譜儀的流動相瓶中待用。用流動相作溶劑，將香菇多糖 樣品A用流動相溶解，并稀釋至約lmg/mL。分別將示差折光檢測器 多角度靜態激光光散射儀、機械泵、柱溫箱及其控制單元的電源打開， 并打開儀器操作軟件ASTRA4.恥.08調節柱溫30-35'C ，調節機械泵, 使癱動相的流速緩慢升至1mL/min。通過示差折光控制面板上的TAB 鍵選中Purge鍵，按ENTER鍵使之處于Purge ON的狀態，流動相同 時沖洗參比池和樣品池，開機后，讓儀器平衡2h,待兩個檢測器基 線穩定后，再打開軟件Collect菜單,并進一步打開其中的Sampleset 子菜單選擇Edit進行編輯，分別輸入香菇多糖樣品A與保存的文件 名、保存目錄、釆集時間、流動相流速及樣品的dn/dc值、編輯完畢,按OK鍵。將樣品A通過過濾頭注入進祥閥中，打開Iniect菜單選擇 Sample Set即打開數據采集窗口，連著按兩次OK按鈕，將進樣閥的 控制閥扳至Iniect軟件自動開始采集數據。在設定的時間內采集完 數據,將采集到數據的文件打開,選擇View菜單中的Baseline選頂， 分別拖拽鼠標設定示差折光檢測器和多角靜態激光光散射儀第十一 角度檢淵器的信號基線，然后選擇Options菜單中的Autobaseline 對其它角度的光散射信號自動設定基線，基線設定完畢后，選擇Vieir 菜單中的Peaks項，通過鼠標選定色譜峰區域，點擊R印orts菜單的 Sumary,對所有的級分進行加和計算得到香菇多糖樣品A數均分子 量為47萬，重均分子量為74萬，Z均分子量為94萬(見圖4)a 實鵬2操作工藝配制0.9% feci水溶液作為流動相，過濾并超聲脫氣至少30min,加 入凝膠滲透色譜儀的流動相瓶中待用。用流動相作溶劑，將香菇多糖 樣品B用流動相溶解，并稀釋至約lmg/iBL。分別將示差折光檢測器 多角度靜態激光光散射儀、機械泵、柱溫箱及其控制單元的電源打開, 并打開儀器操作軟件ASTRA4.90.08調節柱溫30-35'C ，調節機械泵, 使流動相的流速緩慢升至1raL/miri。通過示差折光控制面板上的TAB 鍵選中Purge鍵，按ENTER鍵使之處于Purge ON的狀態，流動相同 時沖洗參比池和樣品池，開機后，讓儀器平衡2h,待兩個檢測器基 線穩定后,再打開軟件Collect菜單,并進一歩打開其中的Sample set子菜單選擇Edit進行編輯，分別輸入香菇多糖樣品B與保存的文件 名、保存目錄、采集時間、流動相流速及樣品的dn/dc值、編輯完畢， 按OK鍵。將樣品B通過過濾頭注入進樣閥中，打開IMect菜單選擇 SanpleSet即打開數據采集窗口，連著按兩次OK按鈕，將進樣閥的 控制閥扳至Iniect軟件自動開始采集數據。在設定的時間內采集完 數據a將采集到數據的文件打開,選擇View菜單中的Baseline選項， 分別拖拽鼠標設定示差折光檢測器和多角靜態激光光散射儀第十一 角度檢測器的信號基線，然后選擇Options菜單中的Autobaseline 對其它角度的光散射信號自動設定基線，基線設定完畢后，選擇Vi柳 菜單中的Peaks項，通過鼠標選定色譜峰區域，點擊feports菜單的 SuraaWT，對所有的級分進行加和計算得到香菇多糖樣品B數均分子 量為41萬，重均分子量為66萬，Z均分子量為110萬(見圖5)。 實施倒3操作工藝配制0.擲Nacl水溶液作為流動相，過濾并超聲脫氣至少30min,加 入凝膠滲透色譜儀的流動相瓶中待用。用流動相作溶劑，將香菇多糖 樣品C用流動相溶解，并稀釋至約l呢/mL。分別將示差折光檢測器 多角度靜態激光光散射儀、機械泵、柱溫箱及其控制單元的電源打開, 并打開儀器操作軟件ASTRA4.90.08調節柱溫30-351,調節機械泵， 使流動相的流速緩慢升至lmL/ndri。通過示差折光控制面板上的TAB 鍵逸中Purge鍵，按ENTER鍵使之處于Purge ON的狀態，流動相時沖洗參比池和樣品池，開機后，讓儀器平衡2h,待兩個檢測器基 線穩定后，再打開軟件Collect菜單,并進一歩打開其中的S,leset 子菜單選擇Edit進行編輯，分別輸入香燕多糖樣品C與保存的文件 名、保存目錄、采集時間、流動相流速及樣品的dn/dc值、編輯完畢, 按0K鍵。將樣品C通過過濾頭注入進樣閥中，打開Iniect菜單選擇 S卿leSet即打開數據采集窗口，連著按兩次OK按鈕，將進樣閥的 控制腳扳至Iniect軟件自動開始采集數據。在設定的時間內采集完 數據,將采集到數據的文件打開,選擇View菜單中的Baseline選項, 分別拖拽鼠標設定示差折光檢測器和多角靜態激光光散射儀第十--角度檢糊器的信號基線，然后選擇Options菜單中的Autobaseli亂、 對其它角度的光散射信號自動設定基線，基線設定完畢后，逸擇Vieir 菜單中的Pedes項，通過鼠標選定色譜峰區域，點擊R印orts菜單的 Sumiary,對所有的級分進行加和計算得到香菇多糖樣品C數均分子 量為50萬，重均分子量為66萬，Z均分子量為挑萬(見圖6)。
權利要求
1. 堿溶性香菇多糖提取、分離、純化新工藝及分子量的測定方法，其特征在于取干香菇子實體粉碎后，加水加熱浸提、過濾、濃縮、洗滌、級分、低溫干燥、溶解、離心、DEAE纖維素除雜純化、離子交換樹脂柱吸附脫色、過濾、超濾、濃縮，用GPC凝膠色譜儀測定分子量，按測定分子量的范圍透析、凍干即得本發明產物。
2、 根據權利要求1所述的浸提方法，其特征在于所用的堿為NaOH、 K0H、 NaHC0a、 K線、線。提取堿溶性香菇多糖的堿液濃度為 0. 3-lmol/L NaOH。溫度范圍在30-60°C 。
3、 根據權利要求1所述分離方法，其特征在于離心機的轉數為每 分鐘4000-16000轉。洗滌應采用0. 1-0. 5mol/Na0H。 二次洗滌應采 用去離子水。
4、 根據權利要求1所述分離方法，其特征在于中空纖維超濾器的 膜包分子量為1-30萬Da。
5、 根據權利要求1所述純化方法，其特征在于低溫干燥，溫度為45-55 。C。
6、 根據權利要求1所述純化方法，其特征在于纖維素柱采用DEAE 纖維素A25.A50 (二乙胺基乙基纖維素)。陰離子樹脂采用717,陽離 子樹脂采用732。
7、 根據權利要求1所述純化分離方法，其特征在于洗脫堿液的濃度 為0.1-0. 8mol/L。
8. 根據權利要求1所述分子量測定方法，其特征在于釆用wyatt DAWN EOS型多角度激光光散射凝膠色譜儀測定分子量。G P C激光 光散射凝膠色譜儀測定分子量的固定相采用Shodex水系廣普線性凝 膠柱。
9. 根據權利要求1所述分子量測定方法，其特征在于采用waters 515 高效液相機械泵和wyatt optiiad DSP型示差折光檢測器作為分子量 測定的配套儀器。
10. 根據權利要求1所述分子量測定方法，其特征在于以 0. 5—l%Nacl水溶液為流動相，流速lmL/min，用于分子量的測定。
全文摘要
本發明公開了10-100萬Da堿溶性香菇多糖提取、分離、純化新工藝及分子量測定的方法，以香菇子實體為原料，通過粉碎、堿水浸提、過濾、濃縮、洗滌、級分、低溫干燥得粗品、粗品溶解、離心、DEAE纖維素柱除雜純化、離子交換樹脂吸附脫色、過濾通過不同分子量的膜包超濾濃縮。采用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，按測定分子量的范圍，再分別裝入透析袋透析、凍干得分子量為10-100萬Da含量為98％以上的各組分堿溶性香菇多糖。本方法工藝先進、產品質量穩定、純度高、目標明確、易工業化生產。
文檔編號G01N30/00GK101261203SQ20071005164
公開日2008年9月10日 申請日期2007年3月9日 優先權日2007年3月9日
發明者周曉海, 王務鼎, 王衛健, 胡榮大, 金文準 申請人:金文準;王務鼎;王衛健;周曉海;胡榮大