檢測羥基自由基的納米銀分光光度法的制作方法

專利名稱：：檢測羥基自由基的納米銀分光光度法的制作方法
技術領域：
：本發明涉及羥基自由基的檢測方法，具體是用納米銀作為羥基自由基的捕獲劑，以分光光度計測定被測體系的吸光度的方法——納米銀分光光度法。
背景技術：
：羥基自由基(OH)是目前己知化學性質最活潑的一種活性氧分子，可以發生電子轉移，奪取氫原子和羥基化等反應，使糖類、氨基酸、蛋白質、核酸和脂類發生氧化。由于，OH的氧化能力強、壽命短、對機體危害大，它與衰老、腫瘤、輻射損傷和細胞吞噬有關；此外，羥自由基清除率是反映藥物抗氧作用的重要指標，因此，在基礎醫學、臨床醫學、預防醫學、藥學等領域，已對自由基開展了大量的研究。此外，在已知的氧化劑中，OH的氧化能力僅次于F2，是一種非選擇性的氧化劑，能很容易的氧化各種有機物和無機物，氧化效率高，反應速度快。因而在大氣化學、天然水體化學和廢水深度氧化等的研究中，涉及許多自由基參與的化學反應，自由基與污染物的轉化和清除密切相關。但是，由于自由基非常活潑，濃度低、存在的壽命短，因此建立一種靈敏快速測定，OH的方法尤為重要。。目前國內外測定羥基自由基的方法主要有電子自旋共振法(ESR)，高效液相色譜法(HPLC)，化學發光法(CL)，光度法，電化學法、熒光法等。其中，ESR法可直接用于檢測和研究具有未成對電子的自由基與過渡金屬離子及其化合物，但由于此方法是利用自旋捕捉劑與短壽命自由基結合生成相對穩定的自由基，即自旋加合物，然后進行ESR測定。由于自旋加合物的壽命仍然很短，只有幾分鐘或幾十分鐘，因此，必須捕捉自由基后立即進行EPR測定，故對樣品的制備及檢測有很大的限制。HPLC法也是一種常用的間接檢測*OH的方法，該方法是必須先選擇合適的化合物捕獲體系中的自由基，使之生成具有一定穩定性，且能被液相色譜檢測的產物，然后用HPLC液相色譜測定，其中，二甲基亞砜(DMSO)捕集自由基測定法所用的DMSO有毒性，能迅速透過皮膚進入體內；而水楊酸捕集自由基HPLC測定法是用電化學檢測器測定OH與水楊酸的生成物2，3-二羥基苯甲酸和2，5-二羥基苯甲酸，其檢測限分別為10和5fmol。HPLC法選擇性較好，能同時檢測幾種自由基，但所用儀器價格昂貴，不易普及推廣。徐向榮等用酵母作發光底物，用化學發光法測定了Fenton反應產生的*0H，用于模擬染料廢水處理中'0H的測定，重現性好，但所用試劑不易獲得，且方法精密度較差。電化學分析法即利用脫氧核糖與Fenton體系產生-OH作用，在酸性條件下經過講解生成丙二醛、丙二醛在于甲醛、氨反應生成電活性產物3，5—二乙酰一1，4一二氫吡啶，通過電化學分析法間接定量羥基自由基的產生量，但此法反應步驟較多且所用醛類試劑危害人體健康。熒光法是利用Fenton反應產生的OH能將Ce"氧化成Ce4+，測定Ce"的熒光強度變化即可間接測定羥自由基的產生量，該方法重現性好、操作簡便快速。此外，還有激光誘導熒光法、化學離子化質譜法、化學擴大法也可用來測定羥基自由基，但不易普及推廣或儀器價格昂貴等。已有的分光光度法如徐向榮等在《化學發光法測定Fenton反應中的羥基自由基及其應用》(環境科學，1998年19巻第2期)用DMSO捕集Fenton反應體系中的'OH，產生的甲基亞磺酸與堅牢藍BB鹽反應，生成的重氮化合物經甲苯:正丁醇(3:1)混合物萃取后，用分光光度法在420nm處進行比色測定，這種方法用來研究羥基自由基的產生與清除準確可靠，有較好的重現性。賈之慎等用水楊酸捕集Fenton反應體系中的OH，生成的2,3-二羥基苯甲酸用乙醚萃取，用鎢酸鈉和亞硝酸鈉顯色，然后用分光光度計測定其510nm處的吸光度，結果顯示吸光度隨水楊酸濃度、F^+濃度及H202的濃度增加而上升，認為這體現了，OH生成的變化規律，這種方法是一般實驗室可采用的簡便實用的方法。此外還有細胞色素C光度法，金鳴等在《鄰二氮菲一F^+氧化法檢測H202/Fe"產生的羥自由基》(生物化學與生物物理進展，1996年第23巻第6期)中的鄰二氮菲一F^+—H202體系分光光度法，分光光度法測定OH不需要昂貴的儀器，簡便、快速，易推廣普及，但測定過程中的干擾因素較多，準確性、靈敏度和選擇性有待提高。
發明內容:本發明的目的是提供一種新的納米銀為捕獲劑的檢測羥基自由基的納米銀分光光度法。這種方法簡單、靈敏度高、穩定性好、檢測費用低，且所用試劑安全無毒。本發明通過以下步驟實現對羥基自由基的檢測(1)取定量的納米銀，與已知濃度的含有或可產生羥基自由基的被測物混勻，用水定容后形成被測體系；(2)將被測體系轉移至比色皿，使用分光光度計于460nm處測定其吸光度A',(3)取納米銀作空白對照，測定吸光度A。；(4)求得AA二A。-A;(5)依照不同濃度的被測體系中羥基自由基的濃度C與AA值的對應關系，作出標準曲線；(6)按上述(1)(4)的方法，測得某未知濃度被測體系的AA，依據(5)的標準曲線計算出未知濃度被測體系中羥基自由基的濃度。為了與目前的分光光度計的檢測范圍和靈敏度相適應，確保和提高檢測的準確度，本發明將被測體系中納米銀的濃度規定為0.0040.04mmol/L。本發明在被測體系形成后需在5min后將被測體系移入比色皿測定吸光度，這樣能提高測定方法的穩定性，保證檢測結果的可靠性和準確性。納米銀是一種新型功能材料，存在表面等離子共振吸收，共振散射效應，已用于共振散射光譜分析，并獲得了較好的效果。其在殺菌消毒等方面的應用也取得了很大的成功。納米銀制備簡單，可利用微波高壓快速制得納米銀微粒，然后采用高速離心法純化。本發明發現Fenton反應產生的羥基自由基可以氧化納米銀微粒而使其成為銀離子，導致體系的吸光度降低，據此建立了測定羥基自由基的納米銀分光光度法——以納米銀為羥基自由基捕獲劑，采用分光光度計測定體系的吸光度。Ag+*OH—Ag++OH—銀雖然是重金屬，但本發明的方法中，用量極少，且本發明只使用納米銀這一種試劑，因此，不會增加檢測費用。銀性質穩定，不容易與其它一般物質發生反應，所以能避免檢測過程中各種干擾，表現出高度選擇性，減少檢測誤差，確保數據的穩定和檢測結果的可靠，而且銀安全無毒，也不對環境產生污染。本發明發現羥基自由基對納米銀的氧化反應靈敏，不可逆、速度快，從而使得檢測過程快速，所得結果穩定，方法的重現性好、靈敏度高，檢出限可達0.25nmol/L(H202)，超出現有的分光光度法。納米銀分光光度法與一般的分光光度法一樣，所用的分光光度計是一種傳統的檢測儀器，品種型號很多，價格便宜，操作簡單，被普遍使用，一般實驗人員在一般的實驗室中即可完成對羥基自由基的檢測。本發明將被測體系中納米銀的濃度規定為0.0040.04mmol/L，使得吸光度的數值及其變化均能被目前的分光光度計可靠地檢測出來，從而確保和提高了檢測準確性。考慮到氧化反應的時間因素，本發明規定需在被測體系形成后5min之后再進行檢測，預留出氧化反應過程所需要的時間，等待體系反應停止，狀態穩定，這樣的檢測結果才是可靠的、準確的。根據本發明的試驗，液相納米銀僅在460nm處產生一個表面等離子體共振吸收峰，所以本發明的檢測羥基自由基的納米銀分光光度法選取460nm作為檢測波長，這樣就保證了檢測結果的最大程度的可靠。總之，本發明的檢測羥基自由基的納米銀分光光度法，不使用昂貴的儀器設備，不需要種類繁多的試劑，也不需要嚴格的檢測條件和環境，由一般的實驗員在很普通的實驗室中即可快速簡單地完成檢測，而且數據穩定，結果可靠，靈敏度高，重現性好，非常適宜于測定羥基自由基，可應用于抗氧化研究中檢測離體實驗體系中的羥基自由基的氧化、清除效應，特別是對于篩選抗氧化劑具有重要的應用價值。本發明的方法也可用于快速簡單靈敏地檢測臭氧濃度和其它自由基。圖1是本發明的一個實施例的標準曲線；圖2是納米銀的吸收光譜圖。其中曲線1:pH4.0—0.12mmol/LFeSO4—0.016mmol/LAg;曲線2:pH4.0—0.12mmol/LFeSO4—0.016mmol/LAg—1.25umol/LH202;曲線3:pH4.0—0.12mmol/LFeSO4—0.016mmol/LAg—2.5timol/LH2O2;曲線4:pH4.0—0.12mmol/LFeSO4—0.016mmol/LAg—5.0ymol/LH202。具體實施例方式下面的實施方式描述了在酸性條件下，F,催化H202產生羥基自由基，羥基自由基具有較強的氧化性，可將銀納米微粒氧化為銀離子，吸光度降低，據此建立的測定羥基自由基的方法。主要反應式如下，Fe2++H202~~Fe3++OH-+OH(1)Fe3++H202Fe2++H02'+1^(2)(Ag)n+-OH~~Ag++OKT(3)羥基自由基的測定方法的描述如下在5mL的具塞刻度試管中，依次加入pH3.06.0HAc-NaAc緩沖溶液0.1~1.0mL和0.2~1.0mL的濃度為2.0mmol/L的FeS04溶液以及一定量的&02溶液(取標定過的儲備液稀釋)，然后再加入0.1-1.0mL濃度為0.20mmol/L的納米銀微粒，用水稀釋到刻度，混勻，5~10min后將溶液轉移到比色皿，測定其460nm波長處的A，不加^02溶液做空白，測定其吸光度A()，求得AA-A()-A，以AA與形成被測體系時加入的過氧化氫量所成的濃度C作出標準曲線。由反應原理可知，羥基自由基的濃度與過氧化氫濃度成正比，為研究方便，這里用過氧化氫濃度代替羥基自由基的濃度。當然這里過氧化氫的用量應能全部反應完全，全部轉化成羥基自由基，且羥基自由基又全部用來氧化銀納米微粒。實施例配制11202溶液取30。/。H2O2l.0ml，加水稀釋成250ml，混勻；取此溶液用高錳酸鉀溶液標定其濃度為0.0395mol/L;臨用前取適量，用水稀釋成54.0pnol/L的H202溶液。在5mL的具塞刻度試管中，依次加入0.10mLpH4.0HAc-NaAc緩沖溶液和0.30mL的濃度為2.0mmol/L的FeS04溶液以及46.3|jL、92.5pL、185(iL、37(VL、555pL、740(iL上述已配制好的濃度為54.0^mol/L的Hz02溶液，然后再加入0.40mL濃度為0.20mmol/L的納米銀微粒，用水稀釋到刻度，混勻，5min后將溶液轉移到比色皿,置于UV1900PC型分光光度計(上海亞研電子公司)測定其460nm波長處的A，不加&02溶液做空白，測定其吸光度J。，求得A」=為"。有關數據見表一。表一<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表一得出標準曲線如圖1。圖1表明隨吸光度的變化值隨著過氧化氫濃度C的增大呈線性關系，線性范圍為0.508.0pmol/L，回歸方程為AJ柳nf0.0424C+0.002，相關系數為0.9997，檢出限為0.25umol/L。取上述配制好的H202溶液55(V1，按上述的方法測出A、A。、AA，重復三次，結果如表二。表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>依據圖1的標準曲線，可知被測體系中原有的11202溶液為5.925|imol/L，產生的羥基自由基的濃度平均值亦為5.925pmol/L，檢測結果的RSD=1.0%。權利要求1.檢測羥基自由基的納米銀分光光度法，含有下述步驟(1)取定量的納米銀，與已知濃度的含有或可產生羥基自由基的被測物混勻，用水定容后形成被測體系；(2)將被測體系轉移至比色皿，使用分光光度計于460nm處測定其吸光度A；(3)取納米銀作空白對照，測定吸光度A0；(4)求得ΔA＝A0-A；(5)依照不同濃度的被測體系中羥基自由基的濃度C與ΔA值的對應關系，作出標準曲線；(6)按上述(1)～(4)的方法，測得某未知濃度被測體系的ΔA，依據(5)的標準曲線計算出未知濃度被測體系中羥基自由基的濃度。2.根據權利要求1的方法，其特征在于被測體系中納米銀的濃度為。.004~0.04咖ol/L。3.根據權利要求1或2的方法，其特征在于被測體系形成后，需在5min后移入比色皿測定吸光度。全文摘要本發明的納米銀分光光度法是用納米銀作為羥基自由基的捕獲劑，以分光光度計測定被測體系的吸光度的方法。通過以下步驟檢測羥基自由基(1)取定量的納米銀，與已知濃度的含有或可產生羥基自由基的被測物混勻，用水定容后形成被測體系；(2)將被測體系轉移至比色皿，使用分光光度計于460nm處測定其吸光度A；(3)取納米銀作空白對照，測定吸光度A₀；(4)求得ΔA＝A₀-A；(5)依照不同濃度的被測體系中羥基自由基的濃度C與ΔA值的對應關系，作出標準曲線；(6)按上述(1)～(4)的方法，測得某未知濃度被測體系的ΔA，依據(5)的標準曲線計算出未知濃度被測體系中羥基自由基的濃度。這種方法簡單、靈敏度高、穩定性好、檢測費用低，且所用試劑安全無毒。文檔編號G01N21/17GK101158638SQ20071005056公開日2008年4月9日申請日期2007年11月15日優先權日2007年11月15日發明者劉慶業,梁愛惠,王素梅,蔣治良申請人:廣西師范大學