專利名稱：：一種快速測定青霉素酰化酶酶活的方法
技術領域：
：本發明涉及酶活的檢測方法。
背景技術：
：為了解決病菌對青霉素等抗生素抗藥性的提高，人們發明了人工半合成青霉素等人工抗生素。自從青霉素酰化酶法水解制取6-APA和7-ADCA取代傳統的化學裂解工藝以來，青霉素酰化酶法成為了目前半合成-內酰胺類抗生素工業中如頭孢霉素和羥氨芐青霉素的主要生產方法，青霉素酰化酶也從此登上了重要的工業舞臺。至今國內工廠在裂解生產中使用的固定化青霉素酰化酶還有一半是進口商品，所以國內研究生產提供青霉素酰化酶是十分重要的。目前世界上用于工業生產的固定化青霉素G酰化酶主要來自大腸桿菌和巨大芽孢桿菌的發酵生產。對它的酶活測定的方法也在不斷地摸索改進中。下面就介紹一下一般青霉素酰化酶的測定方法。最初，人們以原料青霉素作為底物，酶解得到產物脫苯乙酰生成6-氨基青霉垸酸(6-APA)，測定單位時間單位體積6-APA的生成量來得到酶活。為了檢測到6-APA，人們發展了不同的方法如PDAB法等。但馬上都發現了底物青霉素對各種檢測產物6-APA的方法都有不可忽略的干擾，測量前必須抽提掉青霉素。這樣這種酶活測定的方法不僅步驟繁瑣，而且靈敏度很低。90年代，有人發展了熒光檢測法，用熒光胺結合6-APA。此方法可以極大地降低底物青霉素干擾，并同時因為用熒光檢測使靈敏度提高104倍。可是多肽類物質和熒光胺結合影響嚴重，需調節PH至4才能消除影響。這樣使酶活測定環境大大改變，令它的準確性和可靠性降低。事實上在青霉素法使用不久后人們便找到了一種替代青霉素的底物6-硝基-3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)，產物為6-硝基-3-氨基苯甲酸。這種方法不僅解決的底物干擾的問題，而且產物本身是可檢測的淡黃色物質，可在波長405nm下用分光光度計檢測濃度。如此，簡化了測量步驟，并使靈敏度較PDAB法上升了三個數量級以上(約5000倍)。這種方法就是至今仍為主要運用的NIPAB法。NIPAB底物較昂貴，并且它的酶活反應不是以青霉素本身為底物，所以很多研究特別是生產上考慮到節約成本等仍使用青霉素法。要申請的本專利就是基于NIPAB的發展。以下是傳統的NIPAB法，步驟較繁瑣發酵液離心去上清保留沉淀，沉淀細胞用磷酸緩沖液重懸后采用超聲波、高壓或凍融等細胞破碎法破碎細胞，離心取上清。取上述上清液20u1加入980u150mmol/LpH7.5的磷酸緩沖液中，37。C保溫。再加入lml已在37。C下預熱的0.9mg/mlNIPAB溶液，精確反應4min，加入ltrtl乙醇終止反應。取上述已終止的反應液在分光光度計波長405mn下檢測吸光值。酶活力定義在上述反應條件下，1min水解1ymol的NIPAB所需青霉素酰化酶為1個酶活力單位U。酶的菌體比活力定義為每升每ODe。。菌體所具有的酶活力單位。酶活力計算公式106XA405XV0酶活力<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(1)其中t:反應時間(min)p:標準曲線的斜率V:反映體系總體積(ml)樣品光密度讀數于空白樣品光密度讀數差VI:酶液體積(ml)比色皿厚度默認為1,單位為cm上述方法步驟繁瑣，給操作帶來極大不便。通常實驗室中為了快速測定少量樣品會不破細胞直接測酶活，但試驗數據表明無論有毒性的三氯乙酸還是乙醇都難以徹底終止反應。
發明內容本發明的主要目的就是為微生物發酵生產的青霉素酰化酶提供簡便快捷的酶活測定方法。本發明針對原來的NIPAB方法步驟繁瑣的問題，從即可簡化步驟，又不影響檢測效果的角度出發，提供了一種新的快速測定青霉素酰化酶酶活的方法，包括下列步驟-a)取青霉素酰化酶基因工程菌發酵液用pH7.4—7.8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液稀釋10-50倍；h)用pH7.4—7.8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液配制NIPAB溶液；c)取步驟a獲得的稀釋液與步驟b獲得的NIPAB溶液先后加入酶標板，控制反應體系中NIPAB的量為過量；d)在37°C，用酶標儀振動混勻下，在405nm處動態曲線方式連續檢測吸光度4一5分鐘，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標獲得動態反應曲線；e)動態曲線減去空白板與空白樣后線性回歸得斜率k與截距b。f)計算酶活酶活力(U/L)=_，其中酶活力單位為U/L。pXV,其中p:標準曲線的斜率V。反映體系總體積，單位為mlV1:酶液體積，單位為ml上述酶活力計算公式由酶活力基本計算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>酶活力<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(1)變換而來，其中，A4。5/t就是單位時間內吸光值的變化，即酶標儀數據處理得到的k。上述步驟a中，取青霉素酰化酶基因工程菌發酵液用磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液稀釋時，高密度罐發酵一般稀釋50倍，搖瓶發酵按生長密度一般為10-50倍；優選的，上述步驟a和b中所述緩沖液為pH7.5的磷酸鹽緩沖液。優選的，上述步驟d用酶標儀連續檢測中，相鄰兩次檢測的時間間隔為0.5分鐘。上述步驟c中需控制反應體系中NIPAB的量為過量的原因是酶量一定時，酶反應隨著底物濃度不斷增加到一定程度將表現為0級反應，即酶反應速率不再受底物濃度的影響。因此在底物遠遠過量的情況下，酶反應速率對酶濃度呈線性關系。一般而言，以反應液的總體積為基礎計，當發酵酶液被稀釋約50倍時，NIPAB的濃度在0.65mg/inl以上即可保證達到整個反應過程中為過量，0.9mg/ml大約為室溫下去離子水作溶劑的飽和濃度。根據本發明公開的內容并結合現有技術，所屬
技術領域：
的人員可以靈活地控制酶液的稀釋倍數、NIPAB溶液的濃度以及兩者混合的比例，從而達到確保NIPAB過量的目的。當然，為了方便控制，可如優選的實施例那樣，步驟b中，配制NIPAB溶液的濃度為0.9mg/ml;步驟c中，將步驟a獲得的稀釋液與步驟b獲得的NIPAB溶液以等體積的量先后加入酶標板。此外，本發明還進行了溫度對酶活檢測數值影響的研究，給出了室溫檢測時的校正系數，以使檢測更為方便。其中，當上述步驟d為在室溫下，用酶標儀進行檢測時，步驟f計算酶活酶活的公式就調整為106XkXV0X1.2酶活力二pXVj其中酶活力單位為U/Lp:標準曲線的斜率V。反映體系總體積，單位為mlVl:酶液體積，單位為ml。由于本發明最大的特點在于不終止酶反應，而是測定一個動態反應曲線，因此命名為動態法測青霉素酰化酶酶活。本發明從即簡化操作步驟又保證準確性的角度出發來考慮新的青霉素酰化酶酶活檢測方法，具體思路及原理如下省去最為繁瑣的破碎細胞步驟，這是因為NIPAB可以出入酶所在的周質空間，細胞不破碎也不會影響NIPAB與酶的反應。特別對于不久前出現的直接固定化周質空間中含有青霉素酰化酶的細胞來生產半合成抗生素的技術來說，有重要的意義。此外，由于在實際檢測過程中樣品往往需要冰箱保存，凍融對細胞破損嚴重，簡單的離心提取對測得的酶活損失影響很大，因此也考慮省去了離心等不必要的操作步驟。本發明中，動態法是解決簡化步驟后保證(甚至提高)測量準確性的關鍵。采用動態法來測定酶活是由于經研究發現，如不破碎細胞而仍采用終止法，由于乙醇對進出細胞終止反應的效果很不理想，特別是在高密度大規模培養條件下的發酵液，4min精確計時的反應時間就根本無法保證。并且試驗發現培養基成分、細胞組織碎片等對吸光度數值影響極大，終點法下任何樣品液預處理步驟的省略都將對酶活值得測量帶來不可忽率的偏差。而采用"動態法"后，就可以省略終點法中大部分不必要的純化預處理過程，不僅使雜質影響消失，還提高了酶活測量值的可靠性。采用動態法測酶活省略了樣品處理過程，對測量過程卻更復雜了。而酶標儀的功能對解決青霉素酰化酶活測量上遇到的問題十分適合。因此本發明中進一步采用動態法結合酶標儀從而實現了簡化檢測步驟，提高檢測準確度的目的。研究發現，使用酶標儀試驗在原本終點法的4一5分鐘內，酶活曲線線性關系良好，可用線性回歸計算得曲線斜率值，從而計算獲得酶活。改進后方案比傳統的NIPAB法更適用于高密度發酵生產的使用酶標儀動態曲線法測青霉素酰化酶酶活下表為本發明與以往檢測青霉素酰化酶酶活方法的總結和比較:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>總體來說，本發明的方法步驟簡單，準確度高，節約成本，且適合檢測高密度發酵生產的青霉素酰化酶酶活，具有很好的推廣價值。圖h實施例2的動態曲線圖圖2:實施例6動態法測溫度對酶活的影響圖圖3:實施例6終點法測溫度對酶活的影響圖具體實施例方式實施例l標準曲線的繪制和斜率p值的確定。NIPAB法在波長405nm下檢測的是它的酶解產物緒BA(5-氨基_6-硝基苯甲酸)的吸光值，因此先繪制標樣ANBA的標準曲線。標準曲線是以ANBA的濃度(mol/L)為橫坐標，A.,05為縱坐標的曲線，為線性，可得出它的斜率P。實驗步驟-a)取ANBA標準品用50mmol/LPH7.5磷酸鉀鹽緩沖液分別稀釋到10mmol/L、20mmol/L、40,1/L、50,1/L、60,1/L和80腦1/L。b)以上每種濃度分別置適量于一試管中，共有1——6號試管空白管為0號，為50mmol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液。c)上述0——6號管置于37。C恒溫。然后用721分光光度計或酶標儀在405nm波長下檢測吸光值，記錄。d)以ANBA濃度(mol/L)為橫坐標，吸光值為縱坐標作圖，并線性回歸求得相關數據。實驗結果獲得P值為8976。實施例2構建大腸桿菌青霉素酰化酶基因工程菌DH5a/pKKFPGA(構建方法由《糞產堿桿菌青霉素G酰化酶在大腸桿菌中組成型表達及分離純化》，《生物工程學報》20巻第5期，736~740公開)，其宿主菌是DH5a(supE44，△lacU169(*80lacZ△M15)，hsdR17，recAl，endAl'gyrA96，thi-1,reAl)。質粒pKKCAII，Pkk235衍生質粒，不含laciq等位基因，表達為組成型。采用不同條件高密度培養上述大腸桿菌青霉素酰化酶基因工程菌進行對照。重組大腸桿菌霉素酰化酶基因工程菌的發酵周期為48h，發酵溫度28'C，500ml搖瓶發酵220rpm。不同條件分別為發酵培養基中含有0.5mMCu"、含有0.5m顧i+以及不含有這兩種離子的三種條件。分別用不破碎細胞并不離心操作下的終態酶活測量方法和用酶標儀動態曲線測量法測酶活比較。(注數據值只用注意縱向比較，即不同方法間的差異，u即為U/L)1.不破碎細胞并不離心操作下的終態酶活測量方法測酶活試驗步驟a)取不同條件下青霉素酰化酶發酵液9個樣品，編號為1一9號；b)1—9號樣品分別用50mmol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液稀釋50倍；c)取上述步驟獲得的9個混合液各lml以及作空白管的pH7.5磷酸鉀鹽緩沖液lml分別置于10個10ml試管中放在37。C水浴鍋中恒溫；d)把足量(15m1-20ml)用50腿ol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液配制好的0.9mg/mlNIPAB溶液同樣置于37t水浴鍋中預熱；e)準備好后開始計時，快速依次在1—9號試管以及空白管里各加入lml步驟d)處理的NIPAB溶液；f)精確計時到4分鐘時，快速依次在1—9號試管及空白管里各加入lml90X(質量百分比)乙醇來終止反應；g)終止后立刻用721分光光度計在405nm下依次測得1—9號及空白管的吸光值，樣品管減去空白管值即為公式(1)中所需A405，計算得酶活。得到最終酶活數據如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.酶標儀動態曲線測量法測酶活實驗設備ThermoLabsystems公司的MultiskanMK3型酶標儀實驗步驟-a)按使用說明對酶標儀進行參數設置，設置孵育時間為1分鐘，孵育溫度37'C。孵育后設為振蕩步驟，采用動態檢測，檢測時間間隔設為0.5分鐘，連續檢測4分鐘；b)取1—9號發酵液用50rmnol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液稀釋50倍；c)取步驟a獲得的混合液與作空白管的pH7.5磷酸鉀鹽緩沖液各lOOu1預熱至37。C后依次加入96孔酶標板；d)在加樣的IO個孔內快速加入已經在37t:預熱的用50mmol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液配制的0.9mg/mlNIPAB各100y1;e)后把96孔板放入儀器，開始反應并自動測量，結束后獲得以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標的動態反應曲線；f)動態曲線減去空白板掃描值后線性回歸得斜率k與截距b，用公式(1)計算得酶活值。表1是酶標儀測得原始數據表,動態曲線參見圖1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>圖1以"1組"為例，線性回歸得到公式顯示于上方。表2是用公式(1)計算最終得到的酶活數據表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.不破碎細胞并不離心操作下的終態酶活測量方法和用酶標儀動態曲線測量法測酶活比較動態法總酶活總低于不破碎細胞并不離心操作下的終點法，這主要由于終點法中，乙醇在規定4min內無法徹底終止反應以及非酶反應對吸光度的影響造成。截距酶活定義為反應時間為O時的酶活值，不隨時間變化而變化。之所以在反應時間為0時也會出現酶活是由于非酶反應因素影響吸光值，從而在代入用吸光值推算酶活的公式后會獲得對應的酶活值。從實驗中可以發現，樣品不做預處理特別是酶活低時非酶反應因素對產物所在波長的吸光值影響巨大，他們不隨時間變化而變化。本方法中，截距酶活的存在并不會影響酶活值的準確性。實施例3利用動態法測青霉素酰化酶酶活來研究測量中對吸光值產生影響的因素首先對所有會對吸光值產生影響的因素對應的酶活值進行設定可溶性培養基中胞外的酶其為某種機制少量分泌到胞外的酶，還有細胞凍融等原因破碎，到培養基中的酶，其酶活設為ul;可溶性培養基其酶活設為ua。去上清物質胞內酶其酶活設為U2;菌體及不可溶培養基其酶活設為ub。按上述描述，在動態法測量中，酶活u的數值為ul+u2，截距酶活的數值為ua+ub同實施例2中的樣品1—9號，各取10ml，離心機3000rpml0分鐘后去除上清液，小心洗滌后用pH7.5磷酸鉀鹽緩沖液重懸，如是三次。再用實施例2中動態法的操作步驟用酶標儀進行測量，結果如表3:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>上表中胞內酶活即u2，去上清截距酶活即為ub。這樣結合表2，計算可得:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>上述試驗結果表明，酶大部分在周至空間中，會有一些由于凍融破壁等原因到胞外。菌體等不溶物質對波長405nm淺黃色的吸光值影響最大，培養基等的影響也很大，它們在低酶活時(如搖瓶短時培養及組成型培養等情況)比酶反應產物對吸光的貢獻更大。實施例4不離心去除雜質及不破碎細胞的簡略終點法中乙醇終止效果的研究以下實驗是對于不離心去除雜質及不破碎細胞的簡略終點法中乙醇終止效果的研究。同一個樣品在不同乙醇濃度的終止下終止效果隨時間的變化。實驗步驟基本同實例2，變化處與結果于表5列出表5<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結果顯示不同濃度的乙醇的終止效果有差別，且隨時間波動較明顯。開始時由于不能終止反應酶活上升，終止時間過長后由于溫度等環境因素顯著變化以及產物分解等原因酶活有所下降。可以看出乙醇終止效果不良會帶來顯著誤差，且大批量樣品測量時手動終止反應將很難精確控制時間。但比較實例3可以發現乙醇終止效果不良相對于雜質影響程度要小許多，因此傳統終態法在離心去除雜質的少量樣品測量中可以將誤差降到很低。實施例5傳統方法與新動態法的比較本實例為傳統方法與新動態法的比較，結果顯示新法在省略大部分繁瑣的樣品處理過程后仍保持著很高的精確度，完全克服了雜質干擾。某一批培養的發酵液樣品分別采用如下傳統和動態法兩種不同的處理、測量方法進行測量。傳統法中的破碎細胞本實例中使用兩種方法凍融法結合溶菌酶處理，超聲波破碎。傳統法步驟a)取發酵液10ml離心6000rpm15min，去上清保留沉淀；b)沉淀細胞用50mmol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液重懸后采用超聲波、凍融等細胞破碎法破碎細胞，離心6000rpm15min取上清；c)取上述上清液20u1加入980y150mmol/LpH7.5的磷酸鉀鹽緩沖液中，37°C保溫。再加入lml已在37。C下預熱的0.9mg/mlNIPAB溶液，精確反應4min，加入lml乙醇終止反應；d)空白管用lml50mmol/LpH7.5磷酸鉀鹽緩沖液代替稀釋的發酵液，其他操作相同；e)取上述已終止的反應液在分光光度計波長405nm下檢測吸光值。按上述步驟得到超聲波與凍融法破碎細胞處理的樣品的吸光值分別為0.024、0.030，按公式計算的酶活為100u和125u。動態法步驟同實例2。此外，把前述傳統法樣品處理方法處理的樣品也使用酶標儀動態測量計算，結果一并列出，如下表。酶標儀所得動態曲線數據處理同實例2。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>不同于傳統方法，本實例把破碎后離心操作所得的上清與沉淀組分都測定了酶活，同列于上表。此表顯示的酶活與前傳統法現實的酶活吻合:傳統法略低于動態法，可能緣于處理過程中的產物損失；破碎可能不夠徹底，離心沉淀中仍有少量酶活；超聲波破碎酶活稍低，可能是因為特定的操作損失產物如超聲波產生的高溫；截距酶活顯著，特別是不溶物沉淀，與前述實例中的情況相符。本實例驗證了新動態法與傳統方法的測量結果相符，是可靠的。實施例6溫度對酶活檢測方法的影響試驗由于溫控、振動設備等不是酶標儀的必需配件，屬于附件，所以很多酶標儀并不具有溫控等裝置。其中溫控對酶反應測酶活非常重要的，酶反應速率受溫度顯著影響。考慮到這個，用酶標儀在不同的溫度下測酶活探究規律。將青霉素酰化酶基因工程菌(同實施例2)發酵培養。5L罐發酵，裝液量1L，接種量10%。通氣量0.5VVM，培養溫度28。C，溶氧保持在30%以上。發酵周期為72h，此為48h取樣。取三個平行樣編號為a、b、c，分別在21。C、27°C、32°C、37°C、42。C和47。C下測酶活，步驟通實施例2中的動態法的試驗步驟。所得數據以溫度rc)為橫坐標、酶活(U/L)為總坐標作圖，如圖2可以看出指數型曲線在37'C前接近線性，變化幅度較小，從室溫到37'C增長小于并接近20%的酶活值。后又用某一批發酵培養得到的發酵液樣品，用終點法使用恒溫水浴鍋控溫，分別在17°C、22°C、27°C、32°C、37°C、42°C、47'C和52"C下721分光光度計測酶活。所得數據用公式(1)算得酶活，同樣以溫度(°C)為橫坐標、酶活(U/L)為總坐標作圖，得圖3。溫度對酶反應速率的影響研究用終態一點法和動態法的得到的結論是相符的，酶的最適溫度在45。C左右。而在37。C前保持著近似線性關系，從室溫到37^酶活上升20%。據此獲得室溫檢測的酶活與37'C下測得酶活的校正系數酶活(37'C)=1.2x室溫酶活。參考上述實驗，對于沒有溫控裝置的酶標儀，在實驗室于室溫下測得的酶活值可以乘上1.2這個校正系數，對于室溫以外的溫度也可以乘上相應的系數以減小誤差。對于15'C及以下的低溫和37°C以上高溫校正系數不適用乘以校正系數的方法。權利要求1.一種快速測定青霉素酰化酶酶活的方法，包括下列步驟a)取青霉素酰化酶基因工程菌發酵液用pH7.4-7.8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液稀釋適當倍數；b)用pH7.4-7.8的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液配制NIPAB溶液；c)取步驟a獲得的稀釋液與步驟b獲得的NIPAB溶液先后加入酶標板，控制反應體系中NIPAB的量為過量；d)在37℃，用酶標儀振動混勻下，在405nm處動態曲線方式連續檢測吸光度4-5分鐘，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標獲得動態反應曲線；e)動態曲線減去空白板與空白樣后線性回歸得斜率k與截距b；f)計算酶活其中酶活力單位為U/Lp標準曲線的斜率V0反映體系總體積，單位為mlV1酶液體積，單位為ml。2.如權利要求1所述快速測定青霉素酰化酶酶活的方法，其特征在于，步驟a和b中所述緩沖液為pH7.5的磷酸鹽緩沖液。3.如權利要求l所述快速測定青霉素酰化酶酶活的方法，其特征在于，步驟b中所述NIPAB溶液的濃度為0.9mg/ml，步驟c中所述步驟a獲得的混合液與步驟b獲得的溶液以等體積的量先后加入酶標板。4.如權利要求1所述快速測定青霉素酰化酶酶活的方法，其特征在于，所述步驟d為在室溫下，用酶標儀振動混勻下，在405nm處動態曲線方式連續檢測吸光度4一5分鐘，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標獲得動態反應曲線；所述步驟f中，計算酶活的公式為106XkXV0X1.2酶活力=。<formula>seeoriginaldocumentpage2</formula>5.如權利要求1或2或3所述快速測定青霉素酰化酶酶活的方法，其特征在于，步驟d中，用酶標儀動力學檢測時，相鄰兩次檢測的時間間隔為0.5分鐘。全文摘要本發明涉及酶活的檢測方法，公開了一種快速測定青霉素酰化酶酶活的方法，在不破碎細胞的情況下使用酶標儀采用動態法檢測酶活，獲得動態反應曲線，用動態曲線線性回歸后獲得的斜率及截距計算酶活。此外，還對溫度對酶活測定的影響作了簡單研究，并設置了修正系數方便于室溫的快速測定。本發明的方法步驟簡單，準確度高，節約成本，且適合檢測高密度發酵生產的青霉素酰化酶酶活，具有很好的推廣價值。文檔編號G01N33/543GK101201356SQ20071004811公開日2008年6月18日申請日期2007年11月13日優先權日2007年11月13日發明者炬儲,莊英萍,張嗣良,施曉疌,王永紅,袁中一申請人:華東理工大學