專利名稱：硝酸甘油用藥評估試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種檢測個體對硝酸甘油藥物敏感性的試 劑盒。
背景技術：
硝酸甘油(GTN， glyceryl trinitrate, nitroglycerin)用于治療心絞痛和心力衰竭己有130年的 歷史，舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心絞痛急性發作的常規首選藥方，但其臨床有效性常因人而異。有 的人因它而及時挽救了生命，而有的人服用之后，效果卻不甚明顯。以往國內外醫學界一直認為硝酸甘油 對部分病人療效不佳是因其"耐藥性"所致，但研究結果證實并非如此。近來的研究表明基因突變是影響 硝酸甘油藥物療效的決定性因素。
ALDH2基因是線粒體ALDH的主要編碼基因，定位于12號染色體。ALDH2具有脫氫酶活性，對人體內 乙醛的氧化發揮主要的作用(即與體內代謝酒精的能力直接相關)，我們飲酒后產生的乙醛主要是由ALDH2 參與氧化代謝的。除了上述的脫氫酶活性以外，ALDH2還有酯酶活性，可以催化硝酸甘油水解產生1， 2— 二硝基甘油和亞硝酸鹽。
最新的研究成果表明，ALDH2基因第12個外顯子存在一個G/A多態，即504位的谷氨酸被賴氨酸替代 (Glu504Lys)會影響其酶活性。因此，人體內線粒體乙醛脫氫酶2 (ALDH2)是硝酸甘油的有效代謝一氧 化氮形成的關鍵。如果病人體內的線粒體乙醛脫氫酶2的基因Lys-504發生突變，就會影響線粒體乙醛脫 氫酶2的酯酶活性，使硝酸甘油在體內的生物轉化過程受阻，致一氧化氮減少甚至無法產生一氧化氮，也 就難以有效發揮作用。
值得注意的是，在亞洲人群中，30%-50%的人都攜有Lys-504基因突變，遠遠高于歐美人群。研究還 發現，中國漢族人群中，含服硝酸甘油無效的比例高達25%以上。
因此，在中國人群中對需要含服硝酸甘油藥物的病人進行ALDH2基因的SNP檢測，能提前預知硝酸甘 油藥物對病人是否有效，就能提前做好準備。
發明內容
根據國家生物基因檢測技術應用評估認證中心頒布的《中國人口健康服務基因位點認證規程》，對與 硝酸甘油藥物敏感性相關基因位點的支持文獻、分子生物學機理研究、中國人群適用性等進行綜合分析評 估后，ALDH2基因上rs671號SNP位點通過國家生物基因檢測技術應用評估認證中心認定，可用于檢測評 估硝酸甘油藥物敏感性。
基于ALDH2基因上rs671號SNP位點的多態性可用來評估個體對硝酸甘油藥物敏感性的基礎上，本發 明提供一種檢測個體對硝酸甘油藥物敏感性的試劑盒。
該試劑盒包括
檢測ALDH2基因上rs671號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對。所述的特異性引 物對是指針對ALDH2基因上rs671號SNP而設計，能特異性擴增出包含這個SNP位點DNA片段的引物對。 設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易完成的。特異性引物對可用常規的合成技術進行合成。所述的 特異性熒光探針對是指針對ALDH2基因上rs671號SNP而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這 個SNP位點基因型的T叫man探針對。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成的。
熒光定量PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子 水等)。
本發明試劑盒的組分和含量包括-熒光定量PCR反應套裝 10 X熒光定量PCR反應緩沖液l[U， 25mM dNTP混合液O.lnl，
25mM MgC12溶液0. 6|il， 5units/nl Taq DNA聚合酶0. 025|il， 2(Ml特異性引物對每條引物各0.225^11, IOMM特異性熒光探針對每條探針各0.25^, 去離子水5.325^1。 本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C 。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取
用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應
使用檢測試劑盒，進行1次獨立的熒光定量PCR反應，反應體系為總體積1(^1，包含濃度為20ng^11 的DNA模板2pl、 1^1 10 X熒光定量PCR反應緩沖液、0. lpl 25mM dNTP混合液、0.6^1 25mM MgCh溶液、 0.025^1 (5units/pl) Taq DNA聚合酶、20^M的有義引物和反義引物各0. 225pl、 10nM的帶VIC熒光探 針和帶FAM熒光探針各0. 25^1，去離子水5. 325^1。
在PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50。C、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進行60個循環的95°C 、 30秒， 60°C、 l分鐘。反應結束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟4:基因型分析
根據試劑盒使用說明書標示的基因分型圖示對SNP位點進行基因型分析。
熟悉熒光定量PCR技術的本領域技術人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據不同序列探針VIC和FAM熒光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因型。
實施例2.對人們進行硝酸甘油用藥評估的服務 步驟l: DNA提取
由醫院檢驗科醫師指導被檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮 細胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測
使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的ALDH2基因上rs671號SNP位點進行熒光定量PCR 檢測，確定這個SNP位點的基因型。
步驟3:個體硝酸甘油用藥的評估分析
通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具個體硝酸甘油用藥的評估分析報告單。報告中詳細說明了被 檢測者硝酸甘油用藥的有效性，可供醫師參考調整病人的用藥方式。
權利要求
1.一種檢測個體對硝酸甘油藥物敏感性的試劑盒，其特征在于包括檢測ALDH2基因上rs671號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、PCR反應緩沖液、去離子水等。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對ALDH2基因上rs671 號SNP而設計，能特異性擴增出包含這個SNP位點DNA片段的引物對。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性熒光探針對是指針對ALDH2基因上rs671 號SNP而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這個SNP位點基因型的Taqman探針對。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括10 X熒光定量PCR反應緩沖液lpl， 25mMdNTP混合液0.1pl， 25mM MgC12溶液0. 6^1, 5units/nl Taq DNA聚合酶0. 025nl， 20MM特異性引物對每條引物各0.225^1， IOPM特異性熒光探針對每條探針各0.25^1， 去離子水5.325^1。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-2(TC 。
全文摘要
本發明公開了一種檢測個體對硝酸甘油藥物敏感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測ALDH2基因上rs671號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對、用于熒光定量PCR檢測的常規組件等。通過檢測ALDH2基因上rs671號SNP位點的基因型，來分析評估個體對硝酸甘油藥物敏感性。
文檔編號G01N21/00GK101363801SQ200710044700
公開日2009年2月11日 申請日期2007年8月9日 優先權日2007年8月9日
發明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司