專利名稱：一種檢測少兒哮喘遺傳易感性的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域，更具體的，本發明涉及一種檢測少兒哮喘遺傳易感性的試劑盒， 通過同時檢測與少兒哮喘遺傳易感性密切相關的編碼具有凝血酶敏感蛋白基序12的解離素-金屬蛋白酶 (ADAMTS12)、 E74樣因子5 (ELF5)、白介素-17 (IL-17)和受體型蛋白酪氨酸磷酸酶D (PTPRD)四種基 因的單核苷酸多態性位點基因型來評估少兒哮喘遺傳易感性。
背景技術：
過敏性哮喘(asthma)在我國是兒童常見病，臨床上表現為反復發作的喘息、氣促、胸悶和/或咳嗽 等癥狀，多在夜間或凌晨發作。我國患病率約1%，過敏性哮喘占哮喘癥的60%。過敏性哮喘患者常常有 家族史，但近些年該病發病率持續上升，這和環境惡化有密切關系。大氣污染、煙塵、運動、冷空氣刺激、 精神刺激以及社會、家庭、心理等因素均可誘發哮喘，過敏原如花粉、屋塵、塵螨、動物毛屑、霉菌及職 業性抗原等的大量吸入，食物、化學制品、藥品等經胃腸道、皮膚接觸或注射均可引發哮喘。過敏性哮喘 反復發作嚴重兒童的生長發育、生活、學習，當前已經引起社會和醫療界的廣泛關注。
過敏性哮喘病因復雜，包括遺傳和環境因素，IgE介導的肥大細胞被激活所致的I型超敏反應是發病 的重要因素，但不能解釋全部病因。發病有家族性，提示遺傳因素與發病相關。目前已經明確許多基因參 與發病。總IgE及特異性IgE (slgE)的產生及氣道的高反應性均為特定基因控制。研究提示，常染色體 llq、 12q、 13 q上有控制IgE的反應性的基因，過敏性哮喘與第11染色體上D11S97的DNA多態性有關。
目前，經證實并且機理研究清楚的已知編碼具有凝血酶敏感蛋白基序12的解離素-金屬蛋白酶 (ADAMTS12)、 E74樣因子5 (ELF5)、白介素-17 (IL-17)和受體型蛋白酪氨酸磷酸酶D (PTPRD)的四種 基因與過敏性哮喘的遺傳易感性有密切關系。
根據國家生物基因檢測技術應用評估認證中心頒布的《中國人口健康服務基因位點認證規程》，對以 上基因位點的支持文獻、分子生物學機理研究、中國人群適用性等進行綜合分析評估并遞交認定申請后， ADAMTS12基因上的rs545861號SNP位點、ELF5基因上的rs3901901號SNP位點、IL-17基因上的rs8193036 號SNP位點、PTPRD基因上的rs2279776號SNP位點、rs2175595號SNP位點和rsl0815925號SNP位點通 過了家生物基因檢測技術應用評估認證中心的認定，可以用來評估少兒哮喘遺傳易感性。
發明內容
基于ADAMTS12基因上的rs545861號SNP位點、ELF5基因上的rs3901901號SNP位點、IL-17基因上 的rs8193036號SNP位點、PTPRD基因上的rs2279776號SNP位點、rs2175595號SNP位點和rs腿5925 號SNP位點多態性可用來評估少兒哮喘遺傳易感性的基礎上，本發明提供一種檢測少兒哮喘遺傳易感性的 試劑盒。
該試劑盒包括
檢測ADAMTS12基因上的rs545861號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測ELF5基因上的rs3901901號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測IL-17基因上的rs8193036號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測PTPRD基因上的rs2279776號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測PTPRD基因上的rs2175595號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測PTPRD基因上的rsl0815925號SNP多態性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 熒光定量PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應緩沖液、去離子水等)。
本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對ADAMTS12基因上的rs545861號SNP位點、ELF5基因上的 rs3901901號SNP位點、IL-17基因上的rs8193036號SNP位點、PTPRD基因上的rs2279776號SNP位點、 rs2175595號SNP位點和rsl0815925號SNP位點而設計，能特異性擴增出包含這6個SNP位點的DNA片段 的引物對。設計這類引物對是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 1
和2、 3和4、 5和6、 7和8、 9和10、 11和12所示序列的引物對。特異性引物對可用常規的合成技術進 行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的引物不限于這六對引物。
本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是指針對ADAMTS12基因上的rs545861號SNP位點、ELF5基因上 的rs3901901號SNP位點、IL-17基因上的rs8193036號SNP位點、PTPRD基因上的rs2279776號SNP位 點、rs2175595號SNP位點和rsl0815925號SNP位點而設計，能通過熒光定量PCR技術特異性檢測出這六 個SNP位點基因型的Taqraan探針對。設計這類探針是本領域技術人員能夠輕易完成的。優選地，試劑盒 中包含具有SEQ ID NO: 13和14、 15和16、 17和18、 19和20、 21和22、 23和24所示序列的Taqman 探針對。特異性熒光探針對可用常規的探針合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的特 異性熒光T叫man探針對不限于這六對探針，所有可用于熒光定量PCR法檢測本發明中所述用來評估少兒 哮喘遺傳易感性的六個SNP位點的探針均在本發明范圍內。
本發明試劑盒的組分和含量包括
6nl 10 X熒光定量PCR反應緩沖液，
0. 6nl 25mM dNTP混合液，
3.6nl 25mM MgCl2溶液，
0. 15nl (5units/Vl) Taq DNA聚合酶，
20nM特異性引物對每條引物各0.225nl，
10nM特異性熒光探針對每條探針各0. 25^1，
去離子水31. 95nl。
本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取
用硅膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應
使用檢測少兒哮喘遺傳易感性的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和熒光探針對:
有義引物l: 5， - CAATCCTGTGTTTGTTAGTTGTGCTAT —3， (SEQ ID NO: 1)
反義引物l: 5， -GATTTGCACAGCAAATTGAGTTAGA -3' (SEQ ID NO: 2)
有義引物2: 5， - TCATTMCCTCGTTCCMCATGTM -3， (SEQ ID NO: 3)
反義引物2: 5， - CGGACTCCAGTGAGCCATMTT -3， (SEQ ID NO: 4)
有義引物3: 5， - CCATCATGTCTCCTCTCCTTTCTAGT -3' (SEQ ID NO: 5)
反義引物3: 5， - TGTTCCMCCCTGCATGCT -3' (SEQ ID NO: 6)
有義引物4: 5， -GGAGAGATCCCTGTGTTGCMTAT -3， (SEQ ID NO: 7)
反義引物4: 5， - CAGGCTGTTTCCTCTTGTGATGT -3， (SEQ ID NO: 8)
有義引物5: 5， - GCTTTGCTAAGTGGCATTCTAGAGT -3， (SEQ ID NO: 9)
反義引物5: 5' -GGGATGAAAAACGGCACATT -3， (SEQ ID NO: 10)
有義引物6: 5， - CATTTACAAAGCTAGAGACAGMTGCA -3， (SEQ ID NO: 11)
反義引物6: 5， -GTAGMTATGTAGGAGATCAGCTGTTTGA-3' (SEQ ID NO: 12)
帶VIC熒光基團探針l: 5， - TCTGTAGMGTTCAGCC -3， (SEQ ID NO: 13)
帶FAM熒光基團探針l: 5' -CTGTAGGAGTTCAGC -3' (SEQ ID NO: 14)
帶VIC熒光基團探針2: 5， - AMGCCTTCTTGCTGC -3， (SEQ ID NO: 15)
帶FAM熒光基團探針2: 5， - AMGCCTCCTTGCTG -3， (SEQ ID NO: 16)(SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 19)
(SEQ ID NO: 20) -3， (SEQ ID NO: 21) -3'(SEQ ID NO: 22)
帶VIC熒光基團探針3: 5' -CTCCATCTTCATCACCT -3' 帶FAM熒光基團探針3: 5' - TCCATCTCCATTCACC -3， 帶VIC熒光基團探針4: 5' -CCTATAGCCATCTATG -3' 帶FAM熒光基團探針4: 5， -TCCTATACCCATCTATG -3' 帶VIC熒光基團探針5: 5， - CTTCCTATCTTATCTCTTTAT 帶FAM熒光基團探針5: 5， - CTTCCTATCTAATCTCTTTAT 帶VIC熒光基團探針6: 5' - CAATTTTAGAGGTAGTTCCA -3， (SEQ ID NO: 23) 帶FAM熒光基團探針6: 5， -CMTTTTACAGGTAGTTCC -3， (SEQ ID NO: 24)
有義引物1，反義引物1、帶VIC熒光基團探針1、帶FAM熒光基團探針1特異地針對檢測ADAMTS12 基因上的rs545861號SNP位點多態性；
有義引物2，反義引物2、帶VIC熒光基團探針2、帶FAM熒光基團探針2特異地針對檢測ELF5基因 上的rs3901901號SNP位點多態性；
有義引物3,反義引物3、帶VIC熒光基團探針3、帶FAM熒光基團探針3特異地針對檢測IL-17基因 上的rs8193036號SNP位點多態性；
有義引物4，反義引物4、帶VIC熒光基團探針4、帶FAM熒光基團探針4特異地針對檢測PTPRD基因 上的rs2279776號SNP位點多態性；
有義引物5，反義引物5、帶VIC熒光基團探針5、帶FAM熒光基團探針5特異地針對檢測PTPRD基因 上的rs2175595號SNP位點多態性；
有義引物6，反義引物6、帶VIC熒光基團探針6、帶FAM熒光基團探針6特異地針對檢測PTPRD基因 上的rsl0815925號SNP位點多態性；
6個SNP位點分別進行6次獨立的熒光定量PCR反應，每個反應的體系為總體積10nl，包含濃度為 20ng/pl的DNA模板2pl、 lpl 10 X熒光定量PCR反應緩沖液、0. lpl 25mM dNTP混合液、0. 6pl 25mM MgCl2 溶液、0.025nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20pM的有義引物和反義引物各0. 225^1、 10nM的帶VIC 熒光探針和帶FAM熒光探針各0. 25^1,去離子水5. 325^1 。
在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50'C、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進行60個循環的 95°C、 30秒，60°C、 l分鐘。反應結束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟3: SNP基因型分析 '
熟悉熒光定量PCR技術的本領域技術人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據不同序列探針VIC和FAM熒光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因型。
實施例2.對人們進行少兒哮喘遺傳易感性檢測的服務 步驟l: DNA提取
由醫院檢驗科醫師指導被檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用硅膠吸附法進行口腔上皮 細胞的DM抽提。
步驟2:基因分型檢測
使用本發明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的ADAMTS12基因上的rs545861號SNP位點、ELF5 基因上的rs3901901號SNP位點、IL-17基因上的rs8193036號SNP位點、PTPRD基因上的rs2279776號 SNP位點、rs2175595號SNP位點和rsl0815925號SNP位點分別進行熒光定量PCR檢湖!l，確定這六個SNP 位點的基因型。
步驟3:少兒哮喘遺傳易感性的分析
通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具少兒哮喘遺傳易感性的分析報告單。報告中詳細說明了被檢 測者少兒哮喘遺傳易感性的高低，并由醫師向被檢者詳細說明和解讀少兒哮喘遺傳易感性分析報告單。
序歹lj表
<110>上海主健生物工程有限公司
<120> —種檢測少兒哮喘遺傳易感性的試劑盒
<腸24
<210〉 1 <211> 27 <212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
〈223〉引物 〈400〉 1
CAATCCTGTG TTTGTTAGTT GTGCTAT
27
<210〉 2 <211〉 25 <212>腿 <213>人工序列
〈220〉
<223>引物 <400> 2
GATTTGCACA GCAAATTGAG TTAGA 25
<210> 3 〈211〉 25 〈212> DNA <213〉人工序列
<220〉
<223>引物 <400> 3
TCATTAACCT CGTTCCAACA TGTAA 25
〈210〉 4 〈211〉 22 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220>
<223>引物 〈400〉 4
CGGACTCCAG TGAGCCATAA TT 22
<210> 5 <211〉 26 <212>腿 〈213>人工序列
〈220〉
<223>引物 <400> 5
CCATCATGTC TCCTCTCCTT TCTAGT 26
<210〉 6 〈211〉 19 〈212〉腿 〈213〉人工序列
<220>
<223>引物 〈400〉 6
TGTTCCAACC CTGCATGCT 19
<210> 7 〈211> 24 <212>腿 〈213〉人工序列
<220〉
〈223>引物 〈400〉 7
GGAGAGATCC CTGTGTTGCA ATAT 24
〈210〉 8 〈211〉 23 <212〉腿 〈213>人工序列
<220>
<223>引物 <400> 8
CAGGCTGTTT CCTCTTGTGA TGT 23
<210> 9 <211> 25 〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉
<223>引物 <400> 9
GCTTTGCTAA GTGGCATTCT AGAGT 25
〈210> 10 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
<223〉引物 〈400〉 10
GGGATGAAAA ACGGCACATT 20
<210> 11 <211〉 27 〈212> DNA <213〉人工序列
〈220>
<223>引物 〈400〉 11
CATTTACAAA GCTAGAGACA GAATGCA
<210> 12 <211> 29 〈212〉引物 <213>人工序列
<220>
〈223〉探針 〈400> 12
GTAGAATATG TAGGAGATCA GCTGTTTGA
27
29
〈210> <211> 〈212〉 <213〉
13 17 DNA
人工序列
<220>
<223〉探針 <400〉 13
TCTGTAGAAG TTCAGCC 17
<210> <211〉 <212> 〈213>
14
15 腿
人工序列
<220〉
<223>探針 <400> 14
CTGTAGGAGT TCAGC 15
〈210> 〈211〉 <212> 〈213〉
15
16 DNA
人工序列
<220>
〈223>探針 〈400> 15
AAAGCCTTCT TGCTGC 16
〈210〉 <211> <212> 〈213〉
16 15 腿
人工序列
<220>
<223>探針 <400〉 16
AAAGCCTCCT TGCTG 15 <210〉 17
<211> 17 〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉
<223>探針 簡> 17
CTCCATCTTC ATCACCT 17
<210> <211> <212> <213〉
18 16 腿
人工序列
<220〉
〈223>探針 〈400〉 18
TCCATCTCCA TTCACC 16
<210〉 19 〈211〉 16 <212> DNA 〈213〉人工序列
<220〉
<223>探針 ■> 19
CCTATAGCCA TCTATG 16
<210〉 20 <211> 17 〈212〉腿 <213〉人工序列
<220〉
<223>.探針 ■〉 20
TCCTATACCC ATCTATG 17
<210> 21 <211> 21 <212>纖 <213>人工序列 <220〉
<223〉探針 ■〉 21
CTTCCTATCT TATCTCTTTA T 21
〈210〉 〈211〉 〈212〉 <213>
22 21 醒
人工序列
<220〉
<223>探針 <400> 22
CTTCCTATCT AATCTCTTTA T 21
〈210〉 〈211> <212> <213>
23 20 腿
人工序列
<220〉
<223>探針 <400〉 23
CAATTTTAGA GGTAGTTCCA 20
<210> <211〉 <212〉 <213>
24 19 腿
人工序列
<220>
<223>探針 〈400〉 24
CAATTTTACA GGTAGTTCC 19
權利要求
1.一種檢測少兒哮喘遺傳易感性的試劑盒，其特征在于包括同時檢測ADAMTS12基因上的rs545861號SNP位點、ELF5基因上的rs3901901號SNP位點、IL-17基因上的rs8193036號SNP位點、PTPRD基因上的rs2279776號SNP位點、rs2175595號SNP位點和rs10815925號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液、去離子水。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對ADAMTS12基因上的 rs545861號SNP位點、ELF5基因上的rs3901901號SNP位點、IL-17基因上的rs8193036號SNP位點、PTPRD 基因上的rs2279776號SNP位點、rs2175595號SNP位點和rsl0815925號SNP位點而設計，能特異性擴增 出包含這6個SNP位點的DNA片段的引物對。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針對是指針對ADMTS12基因上 的rs545861號SNP位點、ELF5基因上的rs3901901號SNP位點、IL-17基因上的rs8193036號SNP位點、 PTPRD基因上的rs2279776號SNP位點、rs2175595號SNP位點和rsl0815925號SNP位點而設計，能通過 熒光定量PCR技術特異性檢測出這六個SNP位點基因型的Taqman探針對。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對選自具有SEQIDNO: l和2、 3 和4、 5和6、 7和8、 9和10、 11和12所示序列的引物對。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ ID NO: 13和 14、 15和16、 17和18、 19和20、 21和22、 23和24所示序列的Taqman探針對。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括6nl 10 X熒光定量PCR反 應緩沖液、0.6^1 25mM dNTP混合液、3.6^1 25mM MgCl2溶液、0. 15pl (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM特異性引物對每條引物各0. 225nl、 10nM特異性熒光探針對每條探針各0. 25pl、去離子水31. 95pl。 本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20'C 。
全文摘要
本發明公開了一種檢測少兒哮喘遺傳易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測與少兒哮喘遺傳易感性密切相關的編碼具有凝血酶敏感蛋白基序12的解離素-金屬蛋白酶(ADAMTS12)、E74樣因子5(ELF5)、白介素-17(IL-17)和受體型蛋白酪氨酸磷酸酶D(PTPRD)四種基因上六個SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、用于熒光定量PCR檢測的常規組件等。本發明的試劑盒通過同時檢測與少兒哮喘遺傳易感性密切相關的單核苷酸多態性位點基因型來評估少兒哮喘遺傳易感性。
文檔編號G01N33/50GK101354345SQ20071004428
公開日2009年1月28日 申請日期2007年7月27日 優先權日2007年7月27日
發明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司