專利名稱：層析試條掃描檢測方法及其掃描檢測儀的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種層析試條的檢測方法及其檢測裝置，特別涉及一種應用時間分辨熒光檢測原理的層析試條掃描檢測方法及其掃描檢測儀，用于提高信號檢測的準確性。
背景技術：
層析法是根據物質的理化性質不同而建立的分離分析方法。所有的層析系統都由兩個相組成一是固定相，它或者是固體物質或者是固定于固體物質上的成分；另一是流動相，如水和各種溶媒。當待分離的混合物隨流動相通過固定相時，由于各組份的理化性質存在差異，與兩相發生相互作用(吸附、溶解、結合等)的能力不同，在兩相中的分配(含量對比)不同，而且隨溶媒向前移動，各組份不斷地在兩相中進行再分配。與固定相相互作用力較弱的組份，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，向前移動的速度快。反之，與固定相相互作用越強的組份，向前移動速度越慢。層析法與光學、電學或電化學儀器連用，根據層析峰的位置及峰高或峰面積，可檢測出層析后各組份的濃度或質量，從而可以作定性及定量分析。層析儀與電子計算機聯用，可使操作及數據處理自動化，大大縮短分析時間。
由于層析法具有分辨率高、靈敏度高、選擇性好、速度快等特點，因此適用于雜質多、含量少的復雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析。近年來，層析法已成為生物化學及分子生物學常用的分析手段；作為一種獨具特點的層析檢測方法，免疫層析法或核酸雜交層析法對待測物的分離與檢測依賴于抗體-抗原間或寡核苷酸之間特異的結合反應，目前已廣泛應用于多種不同類型待測物的檢測，如毒品、過敏原、殘留農藥、腫瘤標志物、心臟標志物和微生物病原體核酸的檢測。
免疫層析法或核酸雜交層析法是一種可實現快速檢測的層析分析方式，往往以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使溶液在層析條上泳動，樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的反應物質(如抗體、抗原或寡核苷酸探針)發生特異的結合反應，形成的復合物被富集或截留在層析材料的一定區域(檢測帶)，通過肉眼觀察或儀器檢測對樣本中的待測物進行定性或定量檢測。
膠體金、硒或呈色乳膠微粒是層析分析的常用標記物質，此類標記物多用于定性層析檢測。然而，臨床檢測往往需要準確測定樣本中的待測物濃度，如用于心肌梗塞診斷的CTn-I(心肌肌鈣蛋白I)、用于心臟功能評估的BNP(B型鈉尿肽)，等。福州大學杜民、楊富文等分析了影響金標記免疫層析定量的各種因素(如生化噪聲、光噪聲、電噪聲等)，利用光電檢測系統將納米金免疫層析試條的色譜信號轉換為光譜信號，實現了金標記免疫層析的定量檢測[杜民，楊富文；基于光電檢測與信息處理技術的納米金免疫層析試條定量測試的研究，福州大學博士學位論文，2005/05]，但由于該方法檢測的是納米金產生的色譜信號，不但分析靈敏度較低，而且測量范圍一般小于二個數量級，而臨床上有意義的待測物濃度范圍往往在二個數量級以上，因此，對于高濃度樣本，使用該定量分析體系需要稀釋樣本，這不僅會增加操作步驟，還可能引入實驗誤差。
檢測靈敏度低、測量范圍窄是以納米金等物質為標記的定量/半定量層析分析難以避免的弊端。以熒光物質(如熒光納米微粒)為標記，通過檢測熒光信號尤其是稀土離子螯合物的長壽命熒光信號，將大大改善層析分析的靈敏度和測量范圍，建立綜合性能更優越的快速、定量Point of Care(現場測試)檢測體系。
以稀土離子螯合物長壽命熒光為檢測信號，建立快速、定量Point of Care檢測體系，要求準確測定測試區的熒光信號。一般情況下，固定在層析膜上的捕獲探針(抗體、抗原或寡核苷酸)往往呈條帶狀，且其寬度僅為1-4mm；由于擴散現象，條帶中心與邊沿的捕獲探針濃度存在差異，因此，采用熒光定位檢測方式，要求檢測設備的激發光精確地定位在層析膜捕獲探針條帶上的某一特定位置，否則便難以得到能表征待測物濃度的熒光信號。這對檢測設備的定位系統和層析試條的制作工藝都提出了極高的要求，是研制定量層析分析方法的一個主要障礙。
發明內容
本發明的目的是提供一種掃描檢測方法及其掃描檢測儀以精確地檢測層析試條上測試區的熒光信號，無需對層析試條測試區作準確定位，可消除本底熒光的影響，從而獲得更好的定量檢測結果。
本發明的技術方案為一種層析試條掃描檢測方法，包括以下步驟a、以長壽命熒光物質為標記，掃描檢測儀產生的激發光逐點掃描做固定間距進給運動的層析試條的測試區，測試區內有含有生物物質的樣本；b、在每個測試點，層析試條掃描檢測儀以平行或接近平行于測試區條帶的線狀激發光激發，通過時間分辨熒光檢測的方式檢測層析試條測試點的熒光強度；c、將層析試條的測試區域掃描完成后，得到的測試數值為一密集的測試點的序列測試值，根據測試值序列繪制其擬合曲線；計算測試值曲線波峰的面積確定熒光信號的強度。
所述的長壽命熒光物質指稀土離子螯合物或包含有稀土離子螯合物的高分子熒光納米微粒。所述的樣本包括全血、血清或血漿、尿液或其他體液，或經稀釋的上述樣品。所述的樣本中生物物質指可通過層析方式檢測的大分子蛋白質、小分子半抗原、核酸或寡核苷酸。
一種掃描檢測儀，由光學系統、層析試條驅動系統、信號檢測和控制系統構成，光學系統、層析試條驅動系統分別連接信號檢測和控制系統，并由其中單片機MCU控制，光學系統包括氙燈光源、紫外透鏡組、紫外濾光片、分束器、透鏡組、濾光片、光電倍增管、紫外透鏡和紫外光電管，分束器設置系統中部，在分束器右方由內向外設有紫外透鏡組和氙燈光源，在紫外透鏡組的透鏡間設置有紫外濾光片，在分束器的左方由內向外設有紫外透鏡和紫外光電管，在分束器上方由內向外設有透鏡組和光電倍增管，在透鏡組的透鏡間設置有濾光片。層析試條驅動系統包括功率放大器、高精度步進電機、X位移和光電開關，四個元器件依次串接，功率放大器和光電開關還連接單片機MCU；信號檢測和控制系統包括單片機MCU，MCU分別連接RAM、EPROM、鍵盤、LCD、PRINTER及電源，通電后光源產生的激發光掃描樣品，通過依次串接光電倍增管PMT、前置放大器、信號放大及甄別器、A/D轉換電路將檢測到信號輸入單片機MCU，不掃描樣品的激發光信號則通過串接的光電二極管PT、信號放大及甄別器輸入單片機MCU。
本發明的有益效果是1)基于時間分辨熒光檢測原理，可降低本底干擾熒光對測試的影響；2)可避免激發位置偏差對檢測結果的影響，大大降低層析試條研制/生產對材料和組裝工藝的要求，為實現準確的定量層析分析提供了前提；3)層析試條上未固定捕獲探針的空白部分在掃描檢測過程中被多次激發、檢測，其平均熒光強度更真實地反映了層析試條的本底熒光信號；扣除該本底熒光信號后，各測試區條帶的熒光強度能更準確地表征待測物質的濃度；4)該方法涉及的層析試條掃描檢測儀可自動調節激發光強度，保證每次檢測時激發光強度的一致性，而無需任何校正措施。
圖1是驗證熒光掃描檢測方式準確性的AFP(甲肽蛋白)層析試條結構示意圖，其結構與常規金標層析試條相似，主要區別在于使用的標記物是125I和熒光納米微粒雙重標記的抗AFP單克隆抗體；層析試條由吸收墊、包被有抗AFP單克隆抗體(捕獲探針)的NC(硝酸纖維素)膜、標記物墊、樣品墊組成，按序組裝后固定于檢測卡外殼中。
圖中1-吸收墊，2-測試區，3-NC膜，4-標記物墊，5-樣品墊。
圖2為本發明掃描檢測儀的光學系統原理圖。
圖中1-氙燈光源，2-紫外透鏡組，3-紫外濾光片，4-分束器，5-測試樣品，6-透鏡組，7-濾光片，8-光電倍增管，9-紫外透鏡，10-紫外光電管。
圖3為本發明掃描檢測儀的結構框圖。
圖4為層析試條的典型掃描檢測曲線圖。X軸為測試點序列，各測試點間距為0.1mm，Y軸為測試熒光值，A、B、C、D、E、F曲線分別對應實施實例中AFP中A-F六個濃度標準品的測試曲線。
圖5為層析試條檢測AFP中A-F六個濃度的標準品，以掃描檢測獲得的熒光信號與放射性強度的相關性示意圖；由掃描檢測獲得的熒光信號對放射性強度作圖，以origin-6.0軟件評估熒光信號對放射性強度之間的相關性，相關性以相關系數r表示。
具體實施例方式下述實例描述了本發明的一個特殊例子，用以說明本發明的應用效果，該實例不代表本發明的所有可能性，本發明不局限于該實例所涉及的待測物質類型、所用材料或其它條件參數，因為任何具備本領域相關經驗的人都可以使用類似本發明的方法研制和生產層析檢測試條，這些修改并不脫離本發明所涵蓋的范圍。
1.時間分辨熒光檢測原理時間分辨熒光檢測大多采用稀土離子螯合物為熒光生成物質。根據自旋對稱性匹配的要求，有機分子吸收光能后，電子躍遷發生在自旋相同的電子振動能級之間；另外，電子躍遷還要滿足軌道對稱性匹配的要求。分子吸收光能后電子被激發到與激發光光能相應的單重激發態，高能級的單重激發態壽命很短(10-10～10-6s)，一般很快地以非輻射方式遷移到低能級單重激發態，然后以輻射方式降至基態并發出一個熒光光子。由于分子勢能面的交叉，也可引發電子在單重激發態與三重激發態之間的躍遷(系統間能量傳遞)；當此分子作為配體與某一稀土離子絡合，而且稀土離子的振動激發態能級低于配體激發三重態能級時，能量便可通過一分子內能量傳遞過程傳遞給稀土離子，使稀土離子激發并發出稀土離子的特征熒光。
基于上述機理，稀土離子螯合物被激發后產生的熒光有很長的壽命(如100-5000μs)，因此可使用時間分辨方式，待短壽命的雜質熒光(一般小于100ns)消退后，特異地收集稀土離子螯合物的長壽命熒光。除了在熒光壽命上的特點外，稀土離子螯合物熒光還具有很寬的Stoke’s位移，通過波長分辨可使其進一步區別于背景熒光；稀土離子螯合物狹窄的熒光發射峰使其熒光檢測具有很高的效率，進一步提高了信號檢測的特異性和靈敏性；因此，以稀土離子螯合物為標記物的時間分辨熒光檢測為生物分析提供了一高靈敏的測試方法。
2.實施方式1)層析試條掃描檢測儀主要由光學系統、層析試劑條驅動系統、信號檢測與控制系統組成，分述如下A.光學系統如圖2所示光學系統包括氙燈光源1、紫外透鏡組2、紫外濾光片3、分束器4、透鏡組6、濾光片7、光電倍增管8、紫外透鏡9和紫外光電管10，分束器4設置系統中部，在分束器4右方由內向外設有紫外透鏡組2和氙燈光源1，在紫外透鏡組2的透鏡間設置有紫外濾光片3，在分束器4的左方由內向外設有紫外透鏡9和紫外光電管10，在分束器4上方由內向外設有透鏡組6和光電倍增管8，在透鏡組的透鏡間設置有濾光片7。工作過程為采用能量強、脈寬窄的氙燈為光源，經濾光后獲得紫外光，分束器4將紫外光分為兩束一束經紫外透鏡組2聚焦到測試樣品5層析試條上，作為熒光激發光。另一束經紫外透鏡組2聚焦到光電管中，作為處理熒光數據的參考信號。被檢測物質在紫外光激發下產生熒光，向上部發射的熒光經分束器4、透鏡組6和濾光片7聚焦到光電倍增管8的靶面上，光電倍增管8將光信號轉變成電信號。
B.層析試劑條驅動系統層析試條在高精度步進電機驅動下，做一維運動，使層析試條作固定間距的進給運動，并進行逐點熒光掃描測定。
掃描檢測時，固定進給間距應足夠小，以保證掃描所獲測試值擬合曲線波峰無明顯變形和信息缺失。
C.信號檢測與控制系統系統原理圖如圖3所示，其工作過程是由電源點亮脈沖氙燈，作為激發光源；層析試條的某一位置在一個脈沖激發過后，產生的熒光通過濾光片進入光電倍增管，將光變成電信號，經濾波、放大后變成一個時間函數信號；紫外光電管接收參考信號，以對激發光強和激發時間予以反饋控制；以觸發信號為起始時間T0，根據層析試條上稀土離子螯合物熒光的壽命，選擇合適延滯時間Tτ和時間窗Tτ-T2。待T0-Tτ的干擾信號消失，信號采集器收集Tτ-T2時間內的信號，再通過500-1000次的重復累積積分，信號信噪比得以極大的提高。以Eu3+螯合物熒光檢測為例，測定條件為延滯時間100-400μs；時間窗，200-400μs；單循環時間，500-1000μs。
2)層析試條掃描檢測與定點測試的對比A)125I-抗AFP單克隆抗體致敏有機高分子熒光納米微粒(EDC法)攪拌下將5ml表面帶-COOH的有機高分子熒光納米微粒(含Eu3+螯合物，Seradyn，Inc.，95nm)對0.1M pH6.2的PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水)緩沖液透析24小時，取出置于潔凈的玻璃小瓶中；加入水溶性EDC(碳二亞胺，Sigma)12mg，攪拌溶解，室溫反應10min；加入125I標記的抗AFP單克隆抗體1mg(北京原子高科，比放射性強度1886μBq/μg)，攪拌均勻，4℃反應10min；將混合物上2×50cm sephadex G200柱，以50mM的Tris-HCl緩沖液(pH7.8，含0.9％NaCl)洗滌，收集第一個熒光納米微粒標記的抗體峰。
B)制備標記物涂膜與抗體包被硝纖膜取連接有125I-抗AFP單克隆抗體標記的熒光納米微粒，與稀釋液混勻，配制成工作濃度(～20000μBq/mL)；將溶液加入Biodot噴涂機的Airjet噴頭儲存瓶中；設定壓力為16PSI，聚酯膜的移動速度為50mm/s；每條噴2遍；真空干燥箱中于37℃烘干12h，放入鋁薄袋中，加入干燥劑，熱合封口，4℃保存。
硝纖膜(NC膜)組件的制備NC膜活化處理，水洗，干燥；將抗AFP單克隆抗體MH2A以0.1M磷酸鹽緩沖液稀釋至1.5mg/ml；將抗AFP單克隆抗體MH2A噴涂于測試區(T帶)，干燥前以2B鉛筆標明測試區的確切位置與寬度(約1.5-2.5mm)；完成包被后，置37℃干燥箱24h；用含1％BSA、0.5％酪蛋白、1％表面活性劑的磷酸鹽緩沖液(0.1M，pH 7.0)封閉處理30min；用洗液抽洗一次；37℃干燥箱干燥備用。
C)組裝參照圖1在濕度小于30％的室溫條件下將包被有抗AFP測試區2的NC膜3粘于支撐片基的不干膠上；將含熒光納米微粒的聚酯膜、玻纖膜、濾紙按要求重疊組裝于NC膜上，使聚酯膜即標記物墊4的下端與NC膜3上端重疊2mm，玻纖膜即樣品墊5的下端與聚酯膜的熒光納米微粒吸附區重疊3mm，吸水濾紙即吸收墊1置于NC膜3的另一端，與NC膜重疊3mm，壓緊；將組裝的層析試條卡入檢測卡外殼內。
NC膜、聚酯膜、玻纖膜、濾紙由Milipore、S&S公司提供。
D)AFP標準品的配制與標定以50mmol/LTris-HCl緩沖液(pH 7.5，含0.9％NaCl，5％BSA，0.05NaN3)將嬰兒臍帶血清(含高濃度AFP)稀釋成六個不同AFP濃度的標準品(A、B、C、D、E、F)；以Wallac公司AFPTRIFMA(時間分辨免疫熒光分析)試劑盒測定其濃度，六個AFP標準品濃度分別為0、5.5、23.0、70.3、150.8、389.2ng/mL。
E)免疫層析平放層析條，在六條層析試條樣品區分別滴入50μl已知AFP濃度的校準品A、B、C、D、E、F；靜置層析15min。
F)二種熒光檢測方式的準確性對比由于示蹤AFP抗體同時標記有125I和熒光納米微粒，故層析試條T帶抗體所捕獲的AFP量可同時以放射性強度和熒光強度表示，且放射性強度與熒光強度的比例應具有一致性；由于放射性強度的檢測不受方向性影響、無須激發、儀器性能穩定，檢測結果可靠，熒光檢測的準確性可通過對比放射性強度與熒光強度的方式進行驗證。
熒光掃描檢測將層析試條固定于檢測底架上，以掃描方式檢測上述六種不同AFP標準品層析試條T帶的熒光強度值。熒光掃描檢測參數步進馬達驅動速度0.1mm/S，測試間距0.1mm；延遲400μS，收集400～800μS熒光，單循環時間為1000μs，1000個循環/秒；單一T帶獲得的多點熒光強度通過計算機處理，以峰值測試點為中心的15個測試點內的峰面積表征T帶的熒光強度(Fs)。
熒光定位檢測手工調節檢測底架位置，使激發光定位于層析試條T帶的中心位置；關好倉門，激發并記錄熒光強度值(F1/2)；以同樣方式，在離邊沿1/4條帶寬度位置激發并記錄熒光強度值(F1/4)。熒光定位檢測參數單循環時間為1000μs，延遲400μS，1000個循環/秒，收集400～800μS熒光。
125I放射性強度的檢測層析試條經熒光掃描檢測和熒光定位檢測后，以小刀切取層析試條的T帶，置于試管底部；以FJ-2008P型γ放免計數儀測定并紀錄125I的放射性強度(R)，測量時間1min。實驗結果如下
單位注釋CPM——counts per minute(每分鐘計數值)CPS——counts per second，(每秒鐘計數值)CPSS——counts per standard segment，(單位片斷計數值)上述數據及圖4、圖5表明以高分子熒光納米微粒為標記，采用掃描方式檢測T帶的熒光強度，熒光強度與放射性強度具有高度一致性(相關系數r＝0.998)；而定位檢測方式得到的熒光強度卻與放射性強度偏離較大。同熒光定位檢測相比，熒光掃描檢測可避免T帶上不同位置熒光分布的差異性和激發光定位的準確性對熒光強度的影響，顯著改善熒光信號檢測的準確性。基于該結果，掃描檢測將為定量免疫層析試條的研制提供一靈敏、準確的熒光檢測方式。另外，由于掃描檢測無需對T帶的位置作嚴格的定位，熒光掃描檢測還將降低定量層析試條的研制和生產對工藝的要求，提高檢測的精密性。
權利要求
1.一種層析試條掃描檢測方法，包括以下步驟a、以長壽命熒光物質為標記，掃描檢測儀產生的激發光逐點掃描做固定間距進給運動的層析試條的測試區，測試區內有含有生物物質的樣本；b、在每個測試點，層析試條掃描檢測儀以平行或接近平行于測試區條帶的線狀激發光激發，通過時間分辨熒光檢測的方式檢測層析試條測試點的熒光強度；c、將層析試條的測試區域掃描完成后，得到的測試數值為一密集的測試點的序列測試值，根據測試值序列繪制其擬合曲線；計算測試值曲線波峰的面積確定熒光信號的強度。
2.根據權利要求1所述的一種層析試條掃描檢測方法，其特征是，所述的長壽命熒光物質指稀土離子螯合物或包含有稀土離子螯合物的高分子熒光納米微粒。
3.根據權利要求1所述的一種層析試條掃描檢測方法，其特征是，所述的樣本包括全血、血清或血漿、尿液或其他體液，或經稀釋的上述樣品。
4.根據權利要求1所述的一種層析試條掃描檢測方法，其特征是，所述的樣本中生物物質指可通過層析方式檢測的大分子蛋白質、小分子半抗原、核酸或寡核苷酸中的一種。
5.用于進行權利要求1所述的一種層析試條掃描檢測方法的掃描檢測儀，其特征是由光學系統、層析試條驅動系統、信號檢測和控制系統構成，光學系統、層析試條驅動系統分別連接信號檢測和控制系統，并由其中單片機MCU控制，層析試條驅動系統包括功率放大器、高精度步進電機、X位移和光電開關，四個元器件依次串接，功率放大器和光電開關還連接單片機MCU；信號檢測和控制系統包括單片機MCU，MCU分別連接RAM、EPROM、鍵盤、LCD、PRINTER及電源，通電后光源產生的激發光掃描樣品，通過依次串接光電倍增管PMT、前置放大器、信號放大及甄別器、A/D轉換電路將檢測到信號輸入單片機MCU，不掃描樣品的激發光信號則通過串接的光電二極管PT、信號放大及甄別器輸入單片機MCU。
6.根據權利要求5所述的掃描檢測儀，其特征是光學系統包括氙燈光源、紫外透鏡組、紫外濾光片、分束器、透鏡組、濾光片、光電倍增管、紫外透鏡和紫外光電管，分束器設置系統中部，在分束器右方由內向外設有紫外透鏡組和氙燈光源，在紫外透鏡組的透鏡間設置有紫外濾光片，在分束器的左方由內向外設有紫外透鏡和紫外光電管，在分束器上方由內向外設有透鏡組和光電倍增管，在透鏡組的透鏡間設置有濾光片。
全文摘要
本發明涉及一種層析試條的檢測方法及其檢測裝置，主要解決現有生物樣品分離分析方法存在的檢測靈敏度低、測量范圍窄的技術問題。一種層析試條掃描檢測方法，包括以下步驟以長壽命熒光物質為標記，掃描檢測儀產生的激發光逐點掃描做固定間距進給運動的層析試條的測試區，測試區內有含有生物物質的樣本；在每個測試點，層析試條掃描檢測儀以平行或接近平行于測試區條帶的線狀激發光激發，通過時間分辨熒光檢測的方式檢測層析試條測試點的熒光強度；將層析試條的測試區域掃描完成后，得到的測試數值為一密集的測試點的序列測試值，根據測試值序列繪制其擬合曲線；計算測試值曲線波峰的面積確定熒光信號的強度。檢測儀由光學系統、層析試條驅動系統、信號檢測和控制系統構成，本發明特別適用于生物樣品的分離分析。
文檔編號G01N33/52GK101034062SQ20071003755
公開日2007年9月12日 申請日期2007年2月14日 優先權日2007年2月14日
發明者吳馮波, 吳俊清, 許海峰, 劉永章, 胡永剛, 羅記平 申請人:上海新波生物技術有限公司, 蘇州新波生物技術有限公司