專利名稱：：一種用于測定血漿纖維蛋白原fib含量的體外診斷試劑盒的制作方法一種用于測定血漿纖維蛋白原FIB含量的體外診斷試劑盒
技術領域：
-本發明屬于生物
技術領域：
，特別是涉及一種用Clauss法測定血漿纖維蛋白原(FIB)含量的體外診斷試劑盒。
背景技術：
：-血漿纖維蛋白原(Fibrinogen,FIB)是所有凝血因子中含量最高的一種凝血蛋白，是參與止血、血栓形成的主要物質，是凝血活性的主要影響因素，其水平高低可以嚴重影響血液凝固和血流變，其水平的變化與凝血障礙、出血性疾病、彌漫性血管內凝血(DIC)以及炎癥反應等有密切關系。近年來，發現FIB是心血管疾病的重要危險因素之一，在心血管疾病發生發展過程中，血漿FIB主要參與血管內梗阻性血栓形成，并在動脈血栓形成的最后階段起增強作用。有報道證實大部分心肌梗死、心肌缺血性猝死以及不穩定心絞痛病人冠狀動脈內均發現有梗阻性血栓形成，并認為血管內血栓形成是造成這些動脈硬化并發癥的主要發病機制，因而在臨床上倍受重視。又由于纖維蛋白原是由肝臟實質細胞合成的一種急性反應蛋白，在炎癥或臟器損傷時合成增加，在肝功能嚴重受損或失代償時合成會減少，故肝臟嚴重病變，如肝硬化、中毒性肝炎等可出現減低。因此，血槳纖維蛋白含量的測定，在臨床中具有重要意義。血漿纖維蛋白原屬于血流變檢査的重要指標，其數量或質量的異常均可導致出血性或血栓性疾病的發生。其結果準確與否，直接關系到它的臨床應用價值，可影響到許多疾病的臨床診斷和治療。由于它與心血管性疾病、腦梗死、糖尿病、血栓性疾病、惡性腫瘤甚至妊娠等有著密切關系，是血栓與止血檢測中的重要項目，因此血栓與止血實驗室檢査的臨床重要性與日俱增，檢驗內容不斷擴大，工作量也日益增多；不斷出現的方法更新和試劑商品化、操作自動化，改變了以往靠手工操作、自配試劑、工作效率低的局面。與此同時，方法標準化和質量控制也顯得格外重要。文獻中査到和臨床實驗室正式使用過的檢測方法有數十種。這些方法有的精密度及準確性較好，但操作過于復雜、繁瑣，不適于常規應用；有的雖簡便、快速，但準確性及精密度都較差。目前測定纖維蛋白原的方法大體上分三大類(1)物理、化學測定法(2)免疫學測定法(3)功能法。物理、化學測定法是根據蛋白質的理化特性建立的，這種方法比較簡單、快速，尤其適于急診檢驗，但缺點是本法的特異性不強，所測的不是有凝固功能的纖維蛋白原，可能包括部分的降解產物和/或其它蛋白，影響因素較多，不適于常規工作。免疫學方法目前多采用抗FIB多克隆抗體與FIB起免疫反應，優點是大部分方法簡便，但缺點是所測的不僅是可凝固的纖維蛋白原，可能包括了它的降解產物(因為它們有共同抗原)，也可能包括了障礙性纖維蛋白原，又稱缺維生素K引起的蛋白質，因而特異性也較差。功能法測定是建立在FIB經凝血酶作用后形成纖維蛋白凝塊基礎上的，這類方法的優點是測定的是有凝血功能的纖維蛋白原，又稱為可凝固蛋白(dottableprotein),最能直接反映FIB的凝血功能，故特異性較好。常規使用中，多采用Clauss法和PT-der法。PT-Der法是在檢測PT過程中演算出來的，當血漿纖維蛋白原含量在正常范圍時，PT-Der法與經典的Clauss法無顯著差異或略高于Clauss法；但當纖維蛋白原減低或增高時，PT-Der法往往偏高，使檢測結果失去可靠性。我們用Clauss法和PT-Der法對纖維蛋白原含量作比較(表1)，結果是PT-Der法在正常組與Clauss法相比，無差異(P>0.05)，但在增高組和降低組均有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。表lPT-Der法和Clauss法測定纖維蛋白原含量的比較(單位g/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>相較之下，Clauss法在準確度與精密度方面都是FIB含量測定很理想的選擇，且操作快速、簡便，對臨床血栓與止血類疾病的診斷和治療提供可信的實驗數據。
發明內容本發明的目的是為了提供一種用Clauss法測定人血漿中纖維蛋白原含量，且操作安全簡便、穩定性佳、重復性好、兼容性強的體外診斷試劑盒。為解決上述技術問題，本發明是這樣實現的-一種用Clauss法檢驗血漿纖維蛋白原(FIB)含量測定體外診斷試劑盒，其特征在于它是由FIB凝血酶、FIB緩沖液、FIB定值血漿組成。1.FIB凝血酶由下述原料制成凝血酶80200u/ml，氯化鈉0.350.5%，甘氨酸37%，HEPES0.240.72%，NaN31%。；該試劑中凝血酶的最適含量應選為100u/ml;該試劑中氯化鈉的最適含量應選為0,39%;該試劑中甘氨酸的最適含量應選為4%;該試劑中HEPES的最適含量應選為0.43yo。2.FIB緩沖液0.05mol/L咪唑緩沖液3.HB定值血漿健康人血漿，其定值由標準血漿標定得到。本發明相比現有技術具有如下優點1.本發明通過研究反應機理，摸清了穩定凝血酶活性的有效方法，在凝血酶試劑復溶后37i:條件下能夠穩定八天，與市售產品相比，在重復性和穩定性方面較好，且結果準確性較高。因此，對于各級醫院來說，使用方便、節省時間、減少浪費并降低醫療成本。2.適用面廣，對于光學法、磁珠法原理的血凝儀測定結果一致性好，具有很好的兼容性，使不同醫院的檢驗結果之間具有可比性，對于推行檢驗報告"一單通"具有重要意義。具體實施例方式本發明的設計是由FIB凝血酶、FIB緩沖液、FIB定值血漿組成。本發明還將結合實例作進一步詳述-實施例1本發明試劑盒的應用1.檢測原理將凝血酶加到待測血漿中，使纖維蛋白原轉變成不溶性的纖維蛋白，出現凝固。在有足量的凝血酶存在時，與不同含量的纖維蛋白原作用，其出現凝固的時間與纖維蛋白原含量呈負相關，從而計算出纖維蛋白原的含量。2.檢測步驟(太平洋TS400C血凝儀)將FIB凝血酶用一定體積的蒸餾水輕搖溶解。將FIB定值血漿用l.Oml蒸餾水復溶，再用緩沖液將其作1:5、1:10、1:15、1:20、1:30稀釋。在血凝儀主菜單中選擇FIB項目進行檢測取不同稀釋度定值血漿各100ul，37。C預溫孔預溫3分鐘，移入測量孔并激活測試通道。分別加入凝血酶溶液50tU，測定凝固時間(S)。以不同濃度纖維蛋白原定值血漿含量(mg/dL)為橫坐標，以相應的凝固時間(s)為縱坐標，作標準曲線。待測血漿用FIB緩沖液作1:10稀釋，測定凝固時間(S),待測樣本HB含量即可直接讀出。不同血凝儀測定時，按儀器提供的參幾操作，根據具體情況選擇特定的標準曲線，并進行樣本測定，檢測結果可直接讀出。實施例2與市售FIB試劑穩定性比較FIB凝血酶用一定體積的蒸餾水輕搖溶解，然后將復溶后試劑置于37。C保存。在太平洋TS400C血凝儀上測定同一正常質控血漿(FIB值200400mg/dL)，市售試劑同步進行測定。(結果見表2)表2表明，本發明的FIB試劑在復溶后的八天內測定結果較穩定，第九天才開始有變化，而市售試劑在第二天時就開始變化，這一結果對臨床檢驗科來說非常重要，因為它可以減少浪費，從而降低成本。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例3與市售FIB試劑Jl復性比較將本發明FIB測定試劑與市售試劑按實施例一所述的方法在太平洋TS400C血凝儀上同步測定同一樣本。(結果見表3)表3表明，本發明所講的FIB試劑與市售試劑相比，變異系數(CV)較小，重復性較好。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例4.FIB定值血漿的定值確定取凍干標準血漿(FIB定值:3.15g/L，該品是按暫用的國際標準品89/644定值)用1.0ml蒸餾水復溶，分別取8、12、16、20、24、28、32ul,加入相應體積的緩沖液，使稀釋血漿總體積為200Pl。FIB凝血酶用一定體積的蒸餾水輕搖溶解。取不同稀釋度標準血漿各100nl，在太平洋TS400C血凝儀上制作標準曲線，測定本發明FIB定值血漿，重復測定5次，計算均值，得到定值。實施例5與市售FIB試劑在光學法和磁珠法血凝儀上測定結果的比較FIB凝血酶凍干品用一定體積的蒸餾水復溶，分別在光學法和磁珠法血凝儀上測定同一正常質控血漿(FIB值200400mg/dL)，重復測定10次，計算均值(1)，進行統計學分析，采用t檢驗比較兩者的差異。(結果見表4)經統計分析，本發明所講的FIB試劑在光學法和磁珠法血凝儀上測定結果比較P>0.05，無顯著性差異，結果基本一致，具有很好的兼容性，相比之下，市售試劑P<0.01，差異非常顯著，兼容性欠佳。表4纖維蛋白原含量(mg/dL):n=10本發明F舊試劑市售F舊試劑次數光學法磁珠法光學法磁珠法1282.5285.2283.8310.12278.5276.9286289.7279.6286.5290.1308,94281.1291.3279.5303.4277.7278.8282.7295.26285.1285.1281.4302.47281.8278.6285.72988278.5281,8278.3305.19285.1282.3284.2308.910283.4284.7287.2300.2X281.33283.12283.89302.19綜上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用來限定本發明的實施范圍。即凡依本發明申請專利范圍的內容所作的等效變化與修飾，都應為本發明的技術范疇。權利要求1.一種用于測定血漿纖維蛋白原含量的體外診斷試劑盒，其特征在于，所述體外診斷試劑盒是由FIB凝血酶、FIB緩沖液、FIB定值血漿組成。2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，FIB凝血酶由下述原料制成凝血酶80200u/ml;氯化鈉0.350.5%;甘氨酸37%;HEPES0.240.72%;NaN31%。；余量為水。3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，凝血酶的最適含量應選為100u/ml。4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，氯化鈉的最適含量應選為0.39%。5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，甘氨酸的最適含量應選為4%。6.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，HEPES的最適含量應選為0.43%。7.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，FIB緩沖液為0.05mol/L咪唑緩沖液。8.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，FIB定值血漿的來源是健康人血漿，其定值由標準血漿標定得到。全文摘要本發明涉及一種用Clauss法檢驗血漿纖維蛋白原(FIB)含量的體外診斷試劑盒。它是由FIB凝血酶、FIB緩沖液、FIB定值血漿組成，用于血漿中纖維蛋白原含量的測定。其優點在于凝血酶試劑復溶后穩定時間長、重復性好，同時對于光學法、磁珠法的血凝儀測定結果一致性較好，因此，對大中小型醫院均適用，使不同醫院的檢驗結果之間具有可比性，對于推行檢驗報告“一單通”具有重要意義，為臨床診斷治療血栓與止血類疾病提供可靠的實驗數據。文檔編號G01N33/68GK101221184SQ20071003641公開日2008年7月16日申請日期2007年1月12日優先權日2007年1月12日發明者朱美萍,謝永華申請人:上海太陽生物技術有限公司