專利名稱：一種用hplc指紋圖譜鑒別黑米或其制品真偽的方法
技術領域：
本發明涉及一種鑒別黑米或其制品真偽的方法，尤其涉及一種用HPLC指紋 圖譜鑒別黑米或其制品的真偽方法。
背景技術：
隨著經濟的發展和生活水平的提高，黑米或其制品因天然的色、香、味和良好的營 養保健功能越來越受到人們的關注，黑米及其制品不斷問世，并受到消費者的普遍歡迎。 黑米呈色是因色素在果皮和種皮內沉積所致，其種皮部分為黑色，胚乳部分為白色，因 此市面上出現了不少通過色素染色制成的假冒黑米及黑米制品，嚴重影響了消費者健康 和黑色食品產業的健康發展。
目前關于黑米及其制品的鑒偽方法多以目測和紫外一可見光譜分析法，目測法人為 因素很多，準確性不高；紫外一可見光譜法是基于黑米色素的主要成分花色苷類化合物 在525 540nm之間有特征吸收峰，通過測定黑米浸泡液是否存在上述特征吸收峰可以 辨別黑米的真偽。但由于某些其它天然色素或人工合成色素在該區域也存在特征吸收， 例如甜菜紅和莧菜紅的最大吸收峰均在535nm。如果有些不法商販用上述一類的色素對 普通的白糙米進行染色，在525 540nm區域內仍可以檢測到特征吸收峰，從而會影響 到檢測結果的準確性。因此建立可靠的黑米及其制品的真偽鑒別技術勢在必行。
發明內容
本發明的目的在于提供一種用HPLC指紋圖譜鑒別黑米或其制品真偽的方法， 該方法具有穩定、精密度高、重現性好的特點。 本發明的目的通過以下技術措施來實現-其包括以下步驟-
(1) 精密稱取黑米，用乙醇浸提得到黑米浸提物，然后對黑米浸提物進行 脫脂處理后，用甲醇溶解脫脂物，過濾得到上樣液；取上樣液測定黑米HPLC標準 指紋圖譜；
(2) 分別測定不同黑米品種的HPLC指紋圖譜，并進行比較，得到具有6個共有特 征峰的黑米HPLC標準指紋圖譜，所述的共有特征峰的保留時間RT值依次為32. 2， 36. 6， 44. 1， 48.9， 52.6， 65. 5分鐘;
(3) 以上述相同的步驟測定待測的黑米或其制品的指紋圖譜；
(4) 將待測黑米或其制品的指紋圖譜與黑米標準指紋圖譜對比，確定待測黑米或 其制品的真偽。
本發明所述的步驟(l)的具體過程是
1) 精密稱取黑米，按料液重量體積比l: 4 1: 6 (m/v)用50 70%的乙醇在常 溫下浸提黑米20 24小時后，過濾，將浸提液減壓真空0. 08-0. lMPa濃縮，得到漿 狀黑米浸提物；
2) 將上述浸提物用雙蒸水溶解至與歩驟l)中所述的浸提液相同的體積，并加入等 體積的石油醚萃取2 3次，得到黑米脫脂液；
3) 將脫脂液減壓真空濃縮，得到漿狀脫脂物，再用50 60%的甲醇溶解脫脂物， 并使黑米與脫脂物甲醇溶液的質量體積比為1 : 2 1 : 3，過0. 3 0. 5微米濾膜得上樣 液，在4'C條件下保存備用；
4) 取上樣液測定黑米HPLC標準指紋圖譜。
所述的步驟1) 3)制備上樣液的過程是一個純化的過程，目的是脫去米皮中含有的 較多的脂肪酸以及其它一些脂溶性成分， 一方面減少指紋圖譜中的雜峰的量另一方面可 以減少雜質，提高色譜柱的使用壽命。
步驟3)中減壓真空濃縮的真空度為0. 08-0. lMPa。
本發明所述測定黑米HPLC標準指紋圖譜的色譜條件色譜柱為Cw， 5ixm， 250X 4. 6 mi;流動相為甲醇、0.5%甲酸和乙腈；洗脫方式為梯度洗脫，在線脫氣；檢測波長 為254nm。
本發明測定國內外60個不同黑米品種的HPLC指紋圖譜并進行比較，得到具有6 個共有特征峰的黑米HPLC標準指紋圖譜。
本發明與現有方法相比，具有以下的優點
(1) 本發明是根據60個國內外不同品種的黑米中主要的非營養素生物活性 成分是水溶性成分，建立黑米及其制品的水溶性提取物HPLC指紋圖譜，從而確 定其標準指紋圖譜的共有特征峰有6個，其保留時間RT值依次為32.2， 36.6， 44.1， 48.9， 52.6， 65.5分鐘；將測定黑米待檢樣品的色譜圖與標準色譜圖比較，即可鑒定待 測黑米及其制品的真偽，具有穩定、精密度高、重現性好的特點。
(2) 將黑米整個HPLC指紋圖譜作為一個整體看待，注重各個共有特征峰的 有無和相互關系，注重圖譜的整體面貌特征，為準確鑒別黑米及其制品的真偽提 供了對照標準，將為黑色食品市場的健康穩定發展做出貢獻。
圖1是本發明實施例一的黑米標準指紋圖譜。圖中箭頭所指從左到右分別是 1至6號6個共有特征峰。
圖2是本發明實施例一中市售黑米的HPLC指紋圖譜。圖中箭頭所指從左到 右分別是1至6號6個共有特征峰。
具體實施例方式
下面結合實施實例對本發明做進一步說明。 實施例一
1儀器、試材及藥品 1.1儀器
Agilent 1200LC高效液相色譜儀，Agilent VWD紫外可變波長檢測器，Agilent Chemstation工作站。
1.2試材及藥品黑米樣品自超市購買，乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均 為分析純。
2、黑米標準指紋圖譜的建立
(1)黑米標準指紋圖譜的建立
1) 精密稱重黑米8.00g，用60X的乙醇40ml在常溫下浸提黑米24小時后，用普 通濾紙過濾，將浸提液減壓真空0.09MPa濃縮，得到漿狀黑米浸提物；
2) 將上述浸提物用雙蒸水溶解至總體積為40ml，加入40ml石油醚萃取3次，得到 黑米脫脂液；
3) 將脫脂液減壓真空0.09MPa濃縮，得到漿狀脫脂物，再用50%的甲醇溶解至 20ml，過0. 45微米濾膜得上樣液，在4'C條件下保存備用；
4) 色譜條件色譜柱為Dikma Diamonsil C18， 5 p m， 250X4.6 mm;流動相為甲 醇、0.5%甲酸和乙腈；準取吸取10u 1上樣液進樣，記錄100分鐘色譜圖。洗脫方式 為梯度洗脫，在線脫氣；檢測波長為254nm。梯度洗脫方案如下表。
時間流速甲醇0.5%甲酸乙腈曲線類型
00. 62962
50. 639436
100, 668866
230.61276126
430. 21663216
530. 41858246
630. 41858246
730.62053276
950. 6500506
、1000. 6100006
5)按同樣的方法測定60個不同黑米品種的HPLC指紋圖譜并進行比較，得到具有 共有特征峰的黑米HPLC標準指紋圖譜，所述的共有特征峰總共有6個，其保留時間RT 值依次為32.2， 36.6， 44.1， 48.9， 52.6， 65.5分鐘。
3、 以上述相同的方法測定市售黑米或其制品的指紋圖譜。
4、 市售黑米真偽的辨別取市售黑米樣品的HPLC指紋圖譜與黑米標準指紋圖譜進 行對比，確定6個共有峰均存在，其RT分別為32.6， 36.0, 44.8， 48.0， 53.2， 65.1 分鐘。因此可以判斷此黑米樣品為真的黑米。
實施例二
與實施例一不同的是 黑米標準指紋圖譜的建立
1) 精密稱重黑米10. 00g，用65%的乙醇50ml在常溫下浸提黑米20小時后，用普 通濾紙過濾，將浸提液減壓真空0.08MPa濃縮，得到漿狀黑米浸提物；
2) 將上述浸提物用雙蒸水溶解至總體積為50ml,加入50ml石油醚萃取2次，得到 黑米脫脂液；
3) 將脫脂液減壓真空0.08MPa濃縮，得到漿狀脫脂物，再用60%的甲醇溶解至 30ml，過0.5微米濾膜得上樣液，在4。C條件下保存備用；
4) 色譜條件色譜柱為Hypersil ODS ， 5um， 250X4.6 mm;流動相為甲醇、0.5 %甲酸和乙腈；準取吸取10ul上樣液進樣，記錄100分鐘色譜圖。
實施例三
與實施例一不同的是 黑米標準指紋圖譜的建立
1) 精密稱重黑米5.00g，用70X的乙醇30ml在常溫下浸提黑米22小時后，用普 通濾紙過濾，將浸提液減壓真空0. lMPa濃縮，得到漿狀黑米浸提物.；
2) 將上述浸提物用雙蒸水溶解至總體積為30ml，加入30ml石油醚萃取2次，得到 黑米脫脂液；
3) 將脫脂液減壓真空O. lMPa濃縮，得到漿狀脫脂物，再用50%的甲醇溶解至 12ml，過0.3微米濾膜得上樣液，在4'C條件下保存備用；
4) 色譜條件色譜柱為Aglient C18， 5 u m， 250X4. 6隱；流動相為甲醇、0.5% 甲酸和乙腈；準取吸取IOPI上樣液進樣，記錄100分鐘色譜圖。
實施例四
與實施例一不同的是 黑米標準指紋圖譜的建立
1) 精密稱重黑米10.00g，用55X的乙醇45ml在常溫下浸提黑米23小時后，用普 通濾紙過濾，將浸提液減壓真空0. 09MPa濃縮，得到漿狀黑米浸提物；
2) 將上述浸提物用雙蒸水溶解至總體積為45ml，加入45ml石油醚萃取3次，得到 黑米脫脂液；
3) 將脫脂液減壓真空0.09MPa濃縮，得到漿狀脫脂物，再用55%的甲醇溶解至 20ml，過0.4微米濾膜得上樣液，在4'C條件下保存備用；
4) 色譜條件色譜柱為Dikma Diamonsil邁C18， 5ura， 250X4.6 ;流動相為甲 醇、0.5%甲酸和乙腈；準取吸取lOii 1上樣液進樣，記錄100分鐘色譜圖。
實施例五
與實施例一不同的是 黑米標準指紋圖譜的建立
1) 精密稱重黑米10.00g，用60X的乙醇40ml在常溫下浸提黑米24小時后，用普 通濾紙過濾，將浸提液減壓真空O. 095MPa濃縮，得到漿狀黑米浸提物；
2) 將上述浸提物用雙蒸水溶解至總體積為40ml，加入40ml石油醚萃取3次，得到 黑米脫脂液；3) 將脫脂液減壓真空0.095MPa濃縮，得到漿狀脫脂物，再用50%的甲醇溶解至 20ml，過0. 45微米濾膜得上樣液，在4'C條件下保存備用；
4) 色譜條件色譜柱為Hypersil ODS C18， 5 u m， 250X4. 6咖；流動相為甲醇、 0.5%甲酸和乙腈；準取吸取10ul上樣液進樣，記錄100分鐘色譜圖。
權利要求
1、一種用HPLC指紋圖譜鑒別黑米或其制品真偽的方法，其特征在于其包括以下步驟(1)精密稱取黑米，用乙醇浸提得到黑米浸提物，然后對黑米浸提物進行脫脂處理后，用甲醇溶解脫脂物，過濾得到上樣液；取上樣液測定黑米HPLC標準指紋圖譜；(2)分別測定不同黑米品種的HPLC指紋圖譜，并進行比較，得到具有6個共有特征峰的黑米HPLC標準指紋圖譜，所述的共有特征峰的保留時間RT值依次為32.2，36.6，44.1，48.9，52.6，65.5分鐘；(3)以上述相同的步驟測定待測的黑米或其制品的指紋圖譜；(4)將待測黑米或其制品的指紋圖譜與黑米標準指紋圖譜對比，確定待測黑米或其制品的真偽。
2、 根據權利要求1所述的用HPLC指紋圖譜鑒別黑米或其制品真偽的方法，其 特征在于-所述的步驟(l)的具體過程是1) 精密稱取黑米，按料液重量體積比l: 4 1: 6用50% 70%的乙醇在常溫下浸 提黑米20 24小時后，過濾，將浸提液減壓真空0.08-0. lMPa濃縮，得到漿狀黑米 浸提物；2) 將上述浸提物用雙蒸水溶解至與步驟l)中所述的浸提液相同的體積，并加入等 體積的石油醚萃取2 3次，得到黑米脫脂液；' 3)將脫脂液減壓真空濃縮，得到漿狀脫脂物，再用50 60%的甲醇溶解脫脂物， 并使黑米與脫脂物甲醇溶液的質量體積比為1 : 2 1 :3，過0. 3 0. 5微米濾膜得上樣 液，在4'C條件下保存備用；4)取上樣液測定黑米HPLC標準指紋圖譜。
3、 根據權利要求l所述的用HPLC指紋圖譜鑒別黑米或其制品真偽的方法，其 特征在于測定黑米HPLC標準指紋圖譜的色譜條件為色譜柱為Cw， 5um， 250X4.6 ;流動相為甲醇、0.5%甲酸和乙腈；洗脫方式為梯度洗脫，在線脫氣；檢測波長為 254咖。
4、 根據權利要求1所述的用HPLC指紋圖譜鑒別黑米或其制品真偽的方法，其 '特征在于領J定國內外60個不同黑米品種的HPLC指紋圖譜并進行比較，得到具有6個共有特征峰的黑米HPLC標準指紋圖譜。
全文摘要
本發明公開了一種用HPLC指紋圖譜鑒別黑米或其制品真偽的方法，其包括以下步驟(1)黑米標準指紋圖譜的建立精密稱取黑米，用乙醇浸提得到黑米浸提物，然后對黑米浸提物進行脫脂處理后，用甲醇溶解脫脂物，過濾得到上樣液；取上樣液測定黑米HPLC標準指紋圖譜；(2)分別測定不同黑米品種的HPLC指紋圖譜，并進行比較，得到具有6個共有特征峰的黑米HPLC標準指紋圖譜；所述的共有特征峰的保留時間RT值依次為32.2，36.6，44.1，48.9，52.6，65.5分鐘；(3)以上述相同的步驟測定待測黑米或其制品的指紋圖譜；(4)將待測黑米或其制品的指紋圖譜與黑米標準指紋圖譜對比，確定待測黑米或其制品的真偽。本發明在鑒定黑米及其制品的真偽中具有穩定、精密度高、重現性好的特點。
文檔編號G01N30/02GK101178389SQ20071003211
公開日2008年5月14日 申請日期2007年12月5日 優先權日2007年12月5日
發明者唐小俊, 雁 張, 張名位, 張瑞芬, 池建偉, 魏振承 申請人:廣東省農業科學院農業生物技術研究所