專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑盒及腺苷脫氨酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定腺苷 脫氨酶活性濃度的方法，屬于醫學檢驗測定技術領域。
技術背景醫學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關系的 核酸代謝酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌 等疾病鑒別的重要診斷標志。腺苷脫氨酶的活性測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。 據申請人了解，目前國際上普遍采用紫外光法，其測定原理是腺苷(白 色結晶粉末)+水(H20 )腺苷脫氨酶肌苷(Inosine )+氨離子(NH4+)， 此反映過程生成的肌苷會在波長為265mn處顯現，因此可以通過測定此波 長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無法用 一般醫院的可見光分析儀測定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難 以切實推廣應用。發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)聯法(CoupleReaction)技術，連續監測 還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測 定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或 半、全自動生化分析儀上進行腺苷脫氨酶活性濃度測定，而且測定速度快、 準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。本發明腺苷脫氨酶活性濃度測定方法原理如下 腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子 肌苷+磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+ 1-磷酸核糖 次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸+過氧化氫 過氧化氫+輔酶NAD(P)H氧化酶還原型輔酶+氧 這種方法應用腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase; EC 3.5.4.4)酶聯核苷 磷酸酶、(Nucleoside phosphorylases; EC 2.4.2.2)、黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase; EC 1.17.3.2)、 NAD(P)H氧化酶(NAD(P)Hoxidase; EC 1.6.3.1) 酶促反應連續監測法。腺苷脫氨酶酶解腺苷反應產生肌苷，再通過聯合核 苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、NAD(P)H氧化酶的作用，最終將輔酶(在340nm 處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以 測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度 上升的速度，可以測算腺苷脫氨酶的活性濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明腺苷脫氨酶診斷試劑 較為理想磷酸緩沖液 lOOmmol/L 穩定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L腺苷 3 mmol/L核苷磷酸酶 8000 U/L黃嘌呤氧化酶 8000 U/LNAD(P)H氧化酶 10000 U/L本發明的腺苷脫氨酶診斷試劑盒可以是單劑，包括磷酸緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1磷酸緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷。 試劑2磷酸緩沖液、穩定劑、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、NAD(P)H 氧化酶。輔酶、腺苷、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1 或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1磷酸緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷。 試劑2磷酸緩沖液、穩定劑、黃嘌呤氧化酶、NAD(P)H氧化酶。 試劑3磷酸緩沖液、穩定劑、核苷磷酸酶。輔酶、腺苷、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1 、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加 水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法， 其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，包括磷酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L腺苷 3 mmol/L核苷磷酸酶 8000 U/L黃嘌呤氧化酶 8000 U/LNAD(P)H氧化酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品 與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約 l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值4180。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活 性濃度大小。 實施例二本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為雙試劑，包括試劑1磷酸緩沖液 10Ommol/L穩定劑 50 mmol/L輔酶 3 mmol/L腺苷 3 mmol/L試劑2磷酸緩沖液 100mmol/L穩定劑 500 mmol/L核苷磷酸酶 8000 U/L黃嘌呤氧化酶 8000 U/LNAD(P)H氧化酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光 度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)， 延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活 性濃度大小。 實施例三本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑1磷酸緩沖液 穩定劑 輔酶 腺苷 試劑2磷酸緩沖液 穩定劑黃嘌呤氧化酶 NAD(P)H氧化酶試劑3磷酸緩沖液穩定劑核苷磷酸酶100隨ol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L畫mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 10000U/L100 mmol/L500 mmol/L8000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用,測定腺苷脫氨酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37'C,反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長 405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢 測時間2分鐘左右，理論K值2170。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活 性濃度大小。申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同， 不另一一例舉。總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的腺苷脫氨酶活性濃度測定方法，其方法原理如下腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨離子肌苷+磷酸鹽核苷磷酸酶次黃嘌呤+1-磷酸核糖次黃嘌呤+水+氧黃嘌呤氧化酶尿酸+過氧化氫過氧化氫+輔酶NAD(P)H氧化酶還原型輔酶+氧將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小測定結果。
2. —種腺苷脫氨酶診斷試劑盒，主要成分包括磷酸緩沖液 20--500 mmol/L穩定劑 輔酶 腺苷核苷磷酸酶黃嘌呤氧化酶 iooo-NAD(P)H氧化酶 1000-4000 mmol/L6 mmol/L50 mmol/L畫0——80000 U/L■00 U/L-80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于 由磷酸緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、NAD(P)H氧化酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于由磷酸緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、 NAD(P)H氧化酶組成雙劑試劑；試劑1，由磷酸緩沖液、穩定劑、輔酶、 腺苷組成；試劑2，由磷酸緩沖液、穩定劑、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化 酶、NAD(P)H氧化酶組成。輔酶、腺苷、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、 NAD(P)H氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于 由磷酸緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、 NAD(P)H氧化酶組成多劑試劑；試劑1，由磷酸緩沖液、穩定劑、輔酶、 腺苷組成；試劑2，由磷酸緩沖液、穩定劑、黃嘌呤氧化酶、NAD(P)H 氧化酶組成；試劑3，由磷酸緩沖液、穩定劑、核苷磷酸酶組成。輔酶、 腺苷、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、NAD(P)H氧化酶在試劑1、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑盒，其特征在于還包括穩 定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的腺苷脫氨酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷、核苷磷酸酶、黃嘌呤氧化酶、NAD(P)H氧化酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N33/50GK101324565SQ20071002323
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者王爾中 申請人:沈麗華