專利名稱：亞鐵離子診斷/測定試劑盒及亞鐵離子濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種亞鐵離子診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定 亞鐵離子濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
技術背景鐵和總鐵結合力在人體代謝過程中極為重要。鐵是人體正常生理過程中不可缺少的物質。人體含鐵約3~5g，其中70%存在于紅細胞血紅 蛋白中；25%分布在單核巨噬細胞系統(即網狀內皮系統，肝、脾、骨 髓中鐵蛋白和含鐵血黃素)；4. 9%分布于肌紅蛋白、細胞色素、含鐵 的酶；0. 1 %為循環血漿中的鐵。人體內的鐵來源于食物，主要在十二指腸和小腸上部被吸收。體內 鐵以鐵蛋白和含鐵血黃素形成貯存在骨髓、脾和肝臟內。有少量鐵與血 漿轉鐵蛋白結合，通過血漿輸送至各組織，被利用或被貯存。血清鐵的測定主要是用分光光度法，其次是原子吸收法。后者由于 靈敏度不高及基底的干擾，比分光光度法可靠性差。分光光度法應用一 類含-N《-C-N-結構的生色原，與亞鐵形成五元環，產生紫紅色。較早 使用的有聯吡啶和紅移菲羅啉；近來多推薦靈敏度較高的亞鐵嗪。此外， 尚有應用鉻天青S與高鐵的反應。 發明內容本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定亞鐵離子濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的亞鐵離子診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行亞鐵離子濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。本發明亞鐵離子濃度測定方法原理如下-順烏頭酸+水 烏頭酸酶 檸檬酸檸檬酸+輔酶A 檸檬酸合成酶乙酰輔酶A+草酰乙酸+水 乙酰輔酶八+ 二氧化碳+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸+輔酶A+輔酶這種方法應用需要亞鐵離子激活的烏頭酸酶(aconitase ; EC4.2丄3) 酶(偶)聯檸檬酸合成酶(citrate synthase ; EC 2.3.3.1 & EC 23.3.3)、丙 酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase ; EC 1.2.1.51)酶促反應速率比色 法。烏頭酸酶在亞鐵離子激活下酶解順烏頭酸產生檸檬酸，再通過(偶) 聯合檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定 還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處吸 光度下降的程度/速度，可以測算亞鐵離子的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明亞鐵離子診斷 /測定試劑盒較為理想緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/還原型輔酶 0.25 mmol/L順烏頭酸 10mmol/L 輔酶A 5 mmol/L二氧化碳 30 mmol/L烏頭酸酶 6000 U/L擰檬酸合成酶 12000 U/L丙酮酸脫氫酶 18000 U/L本發明的亞鐵離子診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括-緩沖液、穩定劑、順烏頭酸、輔酶A、 二氧化碳、還原型輔酶、 烏頭酸酶、檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑.-試劑1緩沖液、穩定劑、順烏頭酸、輔酶A、 二氧化碳、還原型輔 試劑2緩沖液、穩定劑、烏頭酸酶、檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶。 順烏頭酸、輔酶A、 二氧化碳、還原型輔酶、烏頭酸酶、檸檬酸合 成酶、丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以 是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接 使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、順烏頭酸、輔酶A、 二氧化 碳、還原型輔酶。 試劑2緩沖液、穩定劑、檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶。試劑3緩沖液、穩定劑、烏頭酸酶。順烏頭酸、輔酶A、 二氧化碳、還原型輔酶、烏頭酸酶、擰檬酸合 成酶、丙酮酸脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試 劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定亞鐵離子濃度的方法，其 還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一本實施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 還原型輔酶 順烏頭酸500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L輔酶A 5 mmol/L二氧化碳 30 mmol/L烏頭酸酶 6000 U/L檸檬酸合成酶 12000 U/L丙酮酸脫氫酶 18000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成千粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測亞鐵離子樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間3分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子的濃度大小。實施例二本實施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為雙試劑，包括-試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 還原型輔酶 順烏頭酸 輔酶A 二氧化碳100mmol/L 0.25 mmol/L10 mmol/L 5 mmol/L30 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L烏頭酸酶6000 U/L檸檬酸合成酶 12000 U/L丙酮酸脫氫酶 18000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37X:，反應時間10分鐘，起始吸 光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測亞鐵離子 樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5,反應方向為負反應(下降 反應)，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間3分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子 的濃度大小。 實施例三本實施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩定劑還原型輔酶順烏頭酸輔酶A畫mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 5 mmol/L二氧化碳 試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑檸檬酸合成酶 丙酮酸脫氫酶試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩定劑30 mmol/L畫mmol/L500腿ol/L12000U/L18000U/L100 mmol/L500 mmol/L6000 U/L:試劑，可以直接使用烏頭酸酶試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體測定亞鐵離子濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反 應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340mn，測試副波長 405nm，被測亞鐵離子樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約2分鐘左右， 檢測時間3分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子 的濃度大小。申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原型 色原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例 類同，不另一一例舉。10總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的亞鐵離子濃度測定方法，其方法原理如下順烏頭酸+水烏頭酸酶檸檬酸檸檬酸+輔酶A檸檬酸合成酶乙酰輔酶A+草酰乙酸+水乙酰輔酶A+二氧化碳+還原型輔酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸+輔酶A+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出亞鐵離子的濃度大小測定結果。
2. —種亞鐵離子診斷/測定試劑盒，主要成分包括-緩沖液 20-500 mmol/L穩定劑 l一 4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L順烏頭酸 1——50mmol/L輔酶A 1——10mmol/L二氧化碳 1——50mmol/L烏頭酸酶 1000——80000 U/L檸檬酸合成酶 1000——80000 U/L丙酮酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩定劑、順烏頭酸、輔酶A、 二氧化碳、還原型輔酶、烏頭酸酶、檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、順烏頭酸、輔酶A、 二氧化碳、還原型輔酶、 烏頭酸酶、擰檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由 緩沖液、穩定劑、順烏頭酸、輔酶A、 二氧化碳、還原型輔酶組成; 試劑2，由緩沖液、穩定劑、烏頭酸酶、檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫 酶組成。還原型輔酶、順烏頭酸、輔酶A、 二氧化碳、還原型輔酶、 烏頭酸酶、檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。
5. 根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、順烏頭酸、輔酶A、 二氧化碳、 還原型輔酶、烏頭酸酶、檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶組成多劑試 齊!h試劑l，由緩沖液、穩定劑、順烏頭酸、輔酶A、 二氧化碳、還 原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、檸檬酸合成酶、丙酮酸 脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、烏頭酸酶組成。還原型輔 酶、順烏頭酸、輔酶A、 二氧化碳、還原型輔酶、烏頭酸酶、檸檬 酸合成酶、丙酮酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不 限。
6. 根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩定劑l"^000 mmol/L或0.1Q/。-100y。體積比。所述穩定劑為硫 酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的亞鐵離子診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定亞鐵離子濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、順烏頭酸、輔酶A、二氧化碳、還原型輔酶、烏頭酸酶、檸檬酸合成酶、丙酮酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑混合，使之發生酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出亞鐵離子的濃度大小。
文檔編號G01N33/84GK101324608SQ20071002323
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司