專利名稱：檸檬酸測定試劑盒及檸檬酸濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種檸檬酸測定試劑盒，同時本發明還涉及測定檸檬酸濃 度的方法，屬于食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
檸檬酸主要用于食品、飲料行業作為酸味劑、調味劑及防腐劑、保鮮 劑，也用于制備醫藥清涼劑，還在化工行業、化妝品行業及洗滌行業中 用作抗氧化劑、增塑劑、洗滌劑。
強制性國家標準GB17203-1998《食品添加劑檸檬酸鈣》規定，檸檬酸 鈣含量為98. 0 100. 5%。國家質檢總局組織對食品添加劑劑檸檬酸其鹽 類(檸檬酸、檸檬酸鉀、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣)產品質量進行了國家監督抽 查。抽查中發現的主要質量問題是檸檬酸鈣含量不合格。抽査中有個別產 品食品添加劑劑檸檬酸鈣含量超過國家標準規定的要求。主要是原料碳酸 鈣轉化不完全，成品中存在雜質。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測 定檸檬酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的檸檬酸測 定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行檸檬酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得 到切實的推廣應用。本發明檸檬酸濃度測定方法原理如下檸檬酸檸檬酸裂解酶乙酸+草酰乙酸乙酸+還原型輔酶醛脫氫酶乙醛+輔酶+水這種方法應用檸檬酸裂解酶(citrate lyase ; EC4丄3.6)酶(偶)聯醛脫 氫酶(Aldehyde dehydrogenase ; EC 1.2.1.3; EC 1.2.1.4; EC 1.2.1.5)酶 促反應連續監測法/速率比色法。檸檬酸裂解酶酶解檸檬酸反應產生乙酸， 再通過(偶)聯合醛脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有 吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型 輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處吸光度下降 的程度/速度，可以測算擰檬酸的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明擰檬酸測定試劑盒較 為理想緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L檸檬酸裂解酶 10000 U/L醛脫氫酶 12000 U/L本發明的檸檬酸測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、醛脫氫酶。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩定劑、還原型輔酶。 試劑2緩沖液、穩定劑、檸檬酸裂解酶、醛脫氫酶。 還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、醛脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可 以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l緩沖液、穩定劑、還原型輔酶。 試劑2緩沖液、穩定劑、醛脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩定劑、檸檬酸裂解酶。還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、醛脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定檸檬酸濃度的方法，其還原 型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一本實施例的檸檬酸測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L檸檬酸裂解酶 10000 U/L醛脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成千粉試劑；使用前，力l]入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測擰檬酸樣品與試劑的體積比例為1/25,反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出擰檬酸的濃度大小。實施例二本實施例的檸檬酸測定試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L50 mmol/L 0.25 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩定劑擰檬酸裂解酶500 mmol/L 10000U/L 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37T:，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測檸檬酸樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出檸檬酸的濃度大小。實施例三本實施例的檸檬酸測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩定劑 還原型輔酶50 mmol/L 0.25腿ol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩定劑100 mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L檸檬酸裂解酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定檸檬酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時 間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測檸檬酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應 方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘 左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分 析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出擰檬酸 的濃度大小。申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類 同，不另一一例舉。總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析 儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的檸檬酸濃度測定方法，其方法原理如下檸檬酸 檸檬酸裂解酶 乙酸+草酰乙酸乙酸+還原型輔酶 醛脫氫酶 乙醛+輔酶+水將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出檸檬酸的濃度大小測定結果。
2. —種檸檬酸測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩定劑 1——4000mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L檸檬酸裂解酶 1000——80000 U/L醛脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述檸檬酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、醛脫氫酶組成單劑 試劑。
4. 根據權利要求2所述檸檬酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、醛脫氫酶組成雙劑 試劑；試劑l,由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、檸檬酸裂解酶、醛脫氫酶組成。還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、醛脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述檸檬酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、醛脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖 液、穩定劑、醛脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、擰檬酸裂 解酶組成。還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、醛脫氫酶在試劑1、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述檸檬酸測定試劑盒，其特征在于還包括穩定劑 l-"4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的檸檬酸測定試劑盒，同時本發明還涉及測定檸檬酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、醛脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出檸檬酸的濃度大小。采用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果。
文檔編號G01N21/31GK101324506SQ20071002321
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優先權日2007年6月13日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司