專利名稱：檢測細胞內氫離子的近紅外熒光探針及其合成方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測技術及臨床醫學檢測領域，尤其涉及用于檢測細胞內氫離 子的近紅外熒光探針；本發明還涉及該熒光探針的合成方法；另外，該發明還涉及 該熒光探針的用途。
背景技術：
氫離子濃度作為一個重要的新陳代謝及細胞內的參數，在許多細胞過程中起到關 鍵的調節作用，比如細胞生長、鈣離子調節、酶活性、信號傳導、細胞內吞作用、化 學向性及其他的細胞過程。許多報道認為一些疾病如癌癥、腎衰竭、肺病等與細胞質 或者酸性細胞器內的pH異常有關。因此，細胞內pH的精確測量是非常重要的。目前，許多方法可用于檢測pH。比如微電極、核磁、吸收及熒光光譜方法。在 這些方法中，熒光法由于其非入侵的性質、高的靈敏度和專一性，以及廣泛可用的熒 光染料在測定pH時比其他方法更為優越。而且，熒光顯微成像技術通過使用熒光pH探針能夠捕捉到細胞內氫離子的時空分辨。現在，兩類熒光pH探針已經被開發， 一類是用于檢測細胞質內pH的探針，其 工作pH范圍大約是6.8-7.4 (K. M. Sun， C, K. McLaughlin, D. R. Lantero and R. A.Manderville, ■/爿附.Cte附.5bc. 2007, 129, 1894 -1895; M. S. Briggs, D. D. Burns, M. E. Cooper and S. J. Gregory, CT^m. Go附www., 2000, 2323—2324; J. A. Thomas, R. N. Buchsbaum, A. Zimniak and E. Racker,歷octe附.1979, 18, 2210-2218; A. H. Lee and I. RTannock, Cancer Res. 1998, 58, 1901-1908; R. Pal and D. Parker, C&附.Cowmw". 2007, 474476);另一類是用于檢測酸性器官如溶酶體，內涵體等的探針，其工作pH范圍 大纟勺是4.5-6.0.(H.-J. Lin, P. Herman, J. S. Kang and J. R. Lakowicz, J""/. 2001, 294， 118-125; R Galindo, M. I. Burguete, L. Vigara, S. V. Luis, N. Kabir, J, Gavrilovic and D. A. Russell,C/zew. /脫2005,44, 6504-6508.)。 眾所周知，細胞內pH的 微小變化可能引起細胞的功能紊亂，理想的熒光探針應當靈敏的響應細胞內pH的微
小變化，并且能夠避免來自細胞生物本身的干擾。然而，目前可用的pH熒光探針有 以下缺點低的靈敏度，有的激發在紫外區。激發在紫外區能夠損傷組織樣品并且引 起生物樣品自發熒光的干擾。另外，用于檢測酸性器官內的理想的pH探針較少，這 被認為是細胞生物學及醫學發展的瓶頸。因此，發展pH熒光探針的焦點在于設計近 紅外、具有好的選擇性、高的靈敏度、好的光穩定性以及工作pH在酸性范圍的熒光 探針。
發明內容
本發明的目的之一旨在克服現有技術熒光探針的不足之處，提供一種性能優良、 適用于檢測細胞內氫離子的基于花菁熒光染料的近紅外熒光探針；目的之二是提供 工藝簡單、成本低廉的該熒光探針的合成方法；目的之三是提供該熒光探針的用途。本發明的目的之一可通過如下技術措施來實現該花菁染料熒光探針具有以下結構通式通式中R=-CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3， -CH2CH2CH2CH2S03-; -OH位于氨基的鄰位、間位或者對位。 本發明的目的之二可通過如下技術措施來實現 該方法按如下步驟進行a. 先將花菁染料Cy.7和氫離子響應基團按照花菁染料Cy.7:氫離子響應基團=1: 1 3的質量比溶解于DMF (N,N-二甲基甲酰胺)中，然后在惰性氣體保護和70-85 'C下反應3 5小時；b. 將反應混合物冷卻至室溫，再于攪拌下加入無水乙醚中，經過濾，減壓干燥得 粗品；c. 硅膠柱層析分離得純品。本發明的目的之二還可通過如下技術措施來實現a工序中所述的花菁類染料Cy.7選自甲基花菁、乙基花菁、丙基花菁或者磺酸 基丁基花菁；a工序中所述的氫離子響應基團選自間氨基苯酚、鄰氨基苯酚或者對 氨基苯酚；b工序中所述的無水乙醚反應混合物=15 20: 1的體積比。本發明代表性的化合物顯示在下面的合成方案中。在惰性氣體保護下，花菁熒光染料與間氨基苯酚在DMF (N，N-二甲基甲酰胺) 中反應得到探針分子，最后經過分離得到探針純品。本發明檢測細胞內氫離子的近紅外熒光探針在使用時沒有特殊的限制，通常，可 以將探針分子溶解在生理鹽水、緩沖液或由乙醇、乙腈、二甲亞砜等水溶性有機溶劑， 然后加入含有細胞組織的適當緩沖液中進行測試。本發明的目的之三可通過如下技術措施來實現本發明的檢測細胞內氫離子的近紅外熒光探針用于化學模擬生物體系中氫離子 的檢測，生物活細胞和活組織內的氫離子的分析檢測和熒光成像檢測，以及臨床醫 學上病變組織中氫離子的檢測。本發明以丙基花菁、間氨基苯酚為原料，合成的熒光探針'H NMR (300 MHz, CDC13): S 1.04 (t, 6H, J=7.5Hz), 1.27 (s, 12H), 1.83 (m， 2H)， 2.06 (m， 4H), 2.58 (m, 4H), 3.89 (t, 4H, J=6.8Hz), 5.84 (d, 2H, J=14.0Hz), 6.45 (m， 4H), 6.92-7.23 (m， 8H), 8.08 (d, 2H， J=14.0Hz). ESI掘cal for [M] + = 612.4， found 612.4 (M-r)。本發明的重要貢獻在于合成的熒光探針分子屬于近紅外熒光探針，可以有效避免 細胞內自發熒光的干擾，提高檢測方法的選擇性和靈敏度，減少對生命體的損傷，有 利于活體檢測；本發明熒光探針分子的設計基于分子內誘導電子轉移(PET)，該探 針顯示了高的靈敏度，在不同的激發和發射波長下能夠對酸堿兩種條件下的pH分別 做出響應。pH滴定實驗表明酸性條件下在4.0-6.5的pH范圍熒光強度能增加10倍有 余，p/Ca是5.14，這對研究細胞內的酸性器官是非常有意義的；在堿性條件下，工作 pH范圍是10.5-11.8，p《a是11.31 。另夕卜，將探針應用到人的肝癌細胞內(HepG2 cells)
通過激光共聚焦顯微成像技術進一步證明了該探針的價值。本發明涉及的探針分子具有極其重要的應用價值。特別是該系列探針分子發射波 長位于近紅外區，能夠實現pH的雙重檢測，測定靈敏度高，選擇性好，對細胞的滲 透性和毒副作用小。另外該系列探針分子結構簡單，合成簡易且效率高使得極易推廣 實際應用。
圖1是本發明實施例的熒光探針分子在酸性緩沖溶液中其熒光強度和氫離子濃度 的關系及pH滴定曲線。橫坐標為波長(nm)，縱坐標為熒光強度。圖2是本發明實施例的熒光探針分子在堿性緩沖溶液中其熒光強度和氫離子濃度 的關系及pH滴定曲線。橫坐標為波長(nm)，縱坐標為熒光強度。圖3是本發明實施例的熒光探針分子對氫離子具有很好的選擇性，橫坐標為各種離子，1: H+; 2: H+ + Cu2+; 3: H+ + Zn2+;4: H+ + Ca2+; 5: H+ + Mg2+。縱坐標為加入各種離子前后探針溶液的熒光強度。圖4是本發明實施例的熒光探針分子對人的肝癌細胞(HepG2 cells)的激光共聚 焦顯微成像。a:人的肝癌細胞用熒光探針在37'C下孵育1小時的激光共聚焦照片；b:亮場照片以表明細胞活力。
具體實施方式
: 實施例1: 探針的合成取1.4克(2mmo1 )具有近紅外熒光光譜的丙基花菁染料Cy.7、 5.2克間氨基苯 酚和40mL N,N-二甲基甲酰胺于100mL三口燒瓶中，使其完全溶解后在氮氣保護和 70。C下反應3小時，冷卻至室溫，后于攪拌下加入到940 mL乙醚中，過濾，減壓干 燥得熒光探針粗品，最后用硅膠柱分離組分，洗脫劑選自甲醇-乙酸乙酯(1: 20v/v) ,35°C旋轉蒸發去除溶劑，真空干燥得熒光探針純 實施例2:探針的合成取1.4克(2mmo1 )具有近紅外熒光光譜的丙基花菁染料Cy.7、 1.4克間氨基苯 酚和20mL N，N-二甲基甲酰胺于100mL三口燒瓶中，使其完全溶解后在氮氣保護和 85"C下反應5小時，冷卻至室溫，后于攪拌下加入到350 mL乙醚中，過濾，減壓干 燥得熒光探針粗品，最后用硅膠柱分離組分，洗脫劑選自甲醇-乙酸乙酯(1: 20v/v), 38°C旋轉蒸發去除溶劑，真空干燥得熒光探針純品。實施例3:探針的合成取1.4克(2mmo1 )具有近紅外熒光光譜的丙基花菁染料Cy.7、 2.5克間氨基苯 酚和28mL N,N-二甲基甲酰胺于100mL三口燒瓶中，使其完全溶解后在氮氣保護和 75。C下反應4小時，冷卻至室溫，后于攪拌下加入到550 mL乙醚中，過濾，減壓干 燥得熒光探針粗品，最后用硅膠柱分離組分，洗脫劑選自甲醇-乙酸乙酯(1: 20v/v), 30°C旋轉蒸發去除溶劑，真空干燥得熒光探針純品。實施例4:將甲基花菁替換丙基花菁，其他分別同實施例l、 2、 3。 實施例5:將乙基花菁替換丙基花菁，其他分別同實施例l、 2、 3。 實施例6:將磺酸基丁基花菁替換丙基花菁，其他分別同實施例l、 2、 3。 實施例7:將鄰氨基苯酚替換間氨基苯酚，其他分別同實施例l、 2、 3、 4、 5、 6。實施例8:將對氨基苯酚替換間氨基苯酚，其他分別同實施例l、 2、 3、 4、 5、 6。
權利要求
1、檢測細胞內氫離子的近紅外熒光探針，其特征在于該熒光探針具有下列結構通式通式中R＝-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2CH3，-CH2CH2CH2CH2SO3-；-OH位于氨基的鄰位、間位或者對位。
2、 檢測細胞內氫離子的近紅外熒光探針的合成方法，其特征在于該方法按如下 步驟進行a. 先將花菁染料Cy.7和氫離子響應基團按照花菁染料Cy.7:氫離子響應基團= 1: 1 3的質量比溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，然后在惰性氣體保護和70-85"C下反 應3 5小時；b. 將反應混合物冷卻至室溫，再于攪拌下加入無水乙醚中，經過濾，減壓干燥得粗品；c. 硅膠柱層析分離得純品。
3、 根據權利要求2所述的合成方法，其特征在于a工序中所述的花菁類染料Cy.7 選自甲基花菁、乙基花菁、丙基花菁或者磺酸基丁基花菁。
4、 根據權利要求2所述的合成方法，其特征在于a工序中所述的氫離子響應基 團選自間氨基苯酚、鄰氨基苯酚或者對氨基苯酚。
5、 根據權利要求2所述的合成方法，其特征在于b工序中所述的無水乙醚反 應混合物=15 20: 1的體積比。
6、 權利要求1所述的檢測細胞內氫離子的近紅外熒光探針用于化學模擬生物體 系中氫離子的檢測，生物活細胞和活組織內的氫離子的分析檢測和熒光成像檢測， 以及臨床醫學上病變組織中氫離子的檢測。
全文摘要
本發明提供一種檢測細胞內氫離子的近紅外熒光探針及其合成方法和用途，該方法按如下步驟進行a.先將花菁染料Cy.7和氫離子響應基團按照花菁染料Cy.7∶氫離子響應基團＝1∶1～3的質量比溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，然后在惰性氣體保護和70-85℃下反應3～5小時；b.將反應混合物冷卻至室溫，再于攪拌下加入無水乙醚中，經過濾，減壓干燥得粗品；c.硅膠柱層析分離得純品。
文檔編號G01N21/00GK101118236SQ20071001640
公開日2008年2月6日 申請日期2007年7月24日 優先權日2007年7月24日
發明者霞 劉, 波 唐, 張海燕, 張金軍, 徐克花 申請人:山東師范大學