專利名稱：：一種利用生物傳感器快速測定魚皮膠原蛋白水解度的新方法
技術領域：
：本發明涉及膠原蛋白水解度的測定方法，屬應用生物
技術領域：
。具體涉及應用谷氨酸氧化酶生物傳感器測定膠原蛋白水解度的方法。采用本發明方法測定水解度，準確、快速，可在30s內得出數據，且能與微機聯機，實施打印、數據分析與自動控制功能，可在一般實驗室分析中應用，也可在膠原蛋白酶解制備活性肽的產業化生產中應用。
背景技術：
：-水產動物體內含有的膠原蛋白與陸生哺乳動物體內含有的膠原蛋白具有相同的特點，都是由三條多肽鏈構成的三股螺旋結構，氨基酸的主要組成也是甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸。同時，水產動物體內的膠原蛋白也具有.-些自身的特點和作用。與陸上動物相比，水產類膠原蛋白有其自身的特點。魚明膠中的脯氨酸和羥脯氨酸的含量比動物明膠低得多，而魚明膠中的蛋氨酸的含量卻比動物明膠高得多。由于魚明膠中的脯氨酸和羥脯氨酸的含量比陸生動物明膠低，在生產過程中蛋白結構易于破壞，致使其蛋白的組分中幾乎不存在Y組分，而中低分子量的a組分含量較多，因而魚明膠的膠凝溫度比陸生動物明膠低。膠原蛋白中蘊藏著多種生物活性肽，如抑制血管緊張素轉化酶活性、抑制血小板凝結活性、抗氧化活性、抗腫瘤活性等。膠原活性肽是以膠原為原料，經多種蛋白酶定向梯度水解后的產物，其分子量在2000Da以下。目前活性肽的生產方式主要有三種(l)從天然生物體中提取；(2)體外酶水解蛋白質產生；(3)通過化學方法和重組DNA技術合成。不同的生產方式各有特點，這取決于目的肽的長短、數量以及用途。天然產物中生物活性肽的含量很少，可作為生物活性肽進行研究，而用作食品是不可行的9化學合成法廣泛用于生產高價的藥用級肽，但是它的成本高，而且副產物會對人體有害。重組DNA技術合成法也被廣泛應用，但是這種方法多用來生產長肽和蛋白質，而許多生物活性肽都是短肽，所以也限制了這種方法的使用。酶法生產生物活性肽具有很多優點，即生產條件溫和、安全性高、價廉且控制反應時間就可以得到特定的活性肽，目前酶法在生物活性肽生產中得到廣泛應用。在蛋白質水解產品的開發上，肽的開發可能為傳統食品業開創出新的機會。酶法生產生物活性肽雖然具有很多優點，但在工業上酶解制備活性肽時，仍存在酶解過程復雜、繁瑣、難于控制的問題，需探討一種簡潔、快速，可用于生產控制的測定方法以控制酶解過程，從而實現酶解制備活性肽的規模化生產。
發明內容本發明的目的是針對酶解制備活性肽時存在酶解過程復雜、繁瑣、難于控制的問題提出的，本發明可為膠原蛋白酶解制備活性肽的產業化生產提供一種快速、準確測定酶解液水解度的新方法。步驟l:堿性蛋白酶酶解液的制備。在最佳水解溫度45i:，pH8.5，加酶量90mg/kg條件下，制備底物濃度為5%、酶解時間分別為1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h的堿性蛋白酶酶解液。.步驟2:堿性蛋白酶酶解液谷氨酸含量和水解度的測定。通過電位滴定法測定上述酶解液水解度大小。吸取酶解液5ml于100ml容量瓶中，定容。吸取20ml于200ml燒杯中，加60ml蒸餾水，開動磁力攪拌器，用0.05mol/LNaOH標準溶液滴定至酸度計指示pH8.2，記錄消耗NaOH的ml數；再加入10ml40X的中性甲醛，混勻。用上述NaOH標準溶液繼續滴定至pH9.2，記錄消耗NaOH標準溶液的ml數，同時做空白實驗。測定結果如圖l所示。隨酶解時間的延長，鱈魚皮膠原蛋白水解度呈逐漸增大趨勢。谷氨酸含量測定采用SBA-40C型生物傳感器分析。開機，自動清洗一次。.綠燈亮后，當屏幕處于自動零狀態的O值時，把吸取好的5(HiL標準樣品注入進樣口。定標完成后，加入50pL酶解液進行谷氨酸含量測定。測定結果如圖2所示。隨酶解時間的延長，鱈魚皮膠原蛋白酶解液中谷氨酸含量也呈逐漸增大趨勢。步驟3:谷氨酸含量和水解度大小的回歸分析。從圖3可以看出，數據點基本落在一條直線附近。由此看出，變量X(谷氨酸含量)與Y(水解度)的關系存在線性關系。但是由于并非所有的數據點完全落在一條直線上，因此X與Y的關系并沒有確切到可以唯一地由一個X值確定一個Y值的程度，即實際測量值與回歸值之間存在著偏差。根據實驗數據，得到回歸方程y-0.7811x+5.9172，不論是通過相關系數檢驗(IrI=0.9658〉rmin=0.754)、F檢驗(F=69.46>F001(1，5)=16.26)還是標準誤差(0.251)(見表l、表2)，都表明X(谷氨酸含量)與Y(水解度)有十分顯著的線性關系，證明通過測定谷氨酸含量來預測被測酶解物水解度大小有實際應用價值。表1回歸統計分析<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2實驗水解度與理論水解度的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權利要求1.一種利用生物傳感器快速測定膠原蛋白水解度的新方法。它是利用堿性蛋白酶水解大分子膠原蛋白生成小分子多肽的同時，酶解產物里游離氨基酸含量逐漸增加，其增加的量與水解度大小呈正相關，因此，通過檢測酶解液中氨基酸總量或某一種氨基酸含量(如谷氨酸含量)可計算出水解度的大小。本方法采用谷氨酸氧化酶生物傳感器，根據谷氨酸與谷氨酸氧化酶反應生成酮酸和H2O2的原理，生成的H2O2與生物傳感器中H2O2電極接觸產生電流信號，該電流信號與谷氨酸濃度成線性比例關系，經微機處理后，可直接顯示結果。選取堿性蛋白酶，在pH8.5、水解溫度45℃、加酶量90mg/kg、底物濃度2％的條件下水解鱈魚皮膠原蛋白，取酶解液50μL，注入谷氨酸氧化酶生物傳感器反應池，20s后讀數，根據谷氨酸含量與水解度的計算公式y＝0.7811x+5.9172計算水解度。本方法特點快速、準確，可用于一般實驗室分析或工業上用膠原蛋白生產活性肽的過程進行測定和控制。2.根據權利要求1所述的測定方法，其特征在于所測樣品為堿性蛋白酶水解鱈魚皮膠原蛋白的酶解物，酶解條件為pH8.5、水解溫度45°C、加酶量90mg/kg、底物濃度2%。3.根據權利要求1所述的測定方法，采用谷氨酸氧化酶生物傳感器測定谷氨酸含量時，谷氨酸氧化酶生物傳感器為SBA-40C型生物傳感分析儀，進樣量為50pL，谷氨酸含量與水解度的計算方程y=0.781lx+5.9172，方.程相關系數r=0.9658413，F值為69.46。全文摘要本方法是利用堿性蛋白酶水解大分子膠原蛋白生成小分子多肽的同時，酶解產物里游離氨基酸含量逐漸增加，其增加的量與水解度大小呈正相關，因此，通過檢測酶解液中氨基酸總量或某一種氨基酸含量(如谷氨酸含量)可計算出水解度的大小。本方法采用谷氨酸氧化酶生物傳感器，根據谷氨酸與谷氨酸氧化酶反應生成酮酸和H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>的原理，生成的H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>與生物傳感器中H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>電極接觸產生電流信號，該電流信號與谷氨酸濃度成線性比例關系，經微機處理后，可直接顯示結果。本方法特點快速、準確，可對工業上用膠原蛋白生產活性肽的過程進行測定和控制。文檔編號G01N27/416GK101246140SQ20071001496公開日2008年8月20日申請日期2007年6月16日優先權日2007年6月16日發明者劉尊英,杰徐,曾名勇,李八方申請人:中國海洋大學