用于診斷胃癌的作為標(biāo)記的mac-2bp的制作方法

專利名稱：：用于診斷胃癌的作為標(biāo)記的mac-2bp的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于胃癌的診斷標(biāo)記。更具體地，本發(fā)明涉及一種用于胃癌的診斷試劑盒，其包括可以檢測(cè)被確認(rèn)為胃癌標(biāo)記的Mac-2BP(Mac-2結(jié)合蛋白)的試劑。本發(fā)明還涉及一種使用該試劑盒用于檢測(cè)該胃癌標(biāo)記的方法。
背景技術(shù)：
：人體胂瘤表達(dá)并分泌各種被稱為癌癥標(biāo)記抗原的特異性分子。目前，已經(jīng)提供大量用于癌癥抗原的診斷和治療的抗原。迄今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了60多種腫瘤標(biāo)記。在它們之中，商業(yè)上應(yīng)用的一些癌癥標(biāo)記包括AFP(肝癌)，CEA(結(jié)腸直腸癌，胃癌，胰臟癌，乳腺癌)，HCG(絨毛膜癌),PAP(前列腺癌),NSE(肺癌),C15-3(乳腺癌),和CA19-9(結(jié)腸直腸癌，胰腺癌)。胃癌是世界上表現(xiàn)最高發(fā)病率和死亡率的癌癥之一，并且在包括韓國(guó)，日本，中國(guó)，俄羅斯，香港，和中歐，中美和南美的國(guó)家和斯堪的納維亞半島的不同國(guó)家中，胃癌是死亡的主要原因。在胃癌的診斷和治療中，標(biāo)記或治療劑是非常有用的，然而，標(biāo)記或治療劑還沒(méi)有被開(kāi)發(fā)出來(lái)。起初，Mac-2BP(Mac-2結(jié)合蛋白)被稱為90kd。Mac-2BP是一種分泌性糖蛋白，并在血漿、尿液、母乳和其它人體體液中被發(fā)現(xiàn)，并作為結(jié)合到半乳凝素-1,-3和-7上的配體。迄今為止，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)在包括乳腺癌，肺癌，結(jié)腸直腸癌和卯巢癌的不同癌癥病人的血漿中Mac-2BP以高水平分泌總計(jì)若干ug/ml。對(duì)于乳腺癌和肺癌，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)Mac-2BP的表達(dá)和分泌的水平可以作為指示病人的轉(zhuǎn)移階段和存活率的標(biāo)記。然而，在前述報(bào)導(dǎo)中完全提到Mac-2BP用于診斷乳腺癌的應(yīng)用。對(duì)于本發(fā)明，本發(fā)明人在與癌細(xì)胞的發(fā)生和產(chǎn)生有關(guān)的基因上進(jìn)行了大量并徹底的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mac-2BP基因在胃癌細(xì)胞中特異性的表達(dá)并且在Mac-2BP的表達(dá)和分泌與胃癌的發(fā)生之間存在緊密的關(guān)系。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于胃癌的診斷試劑盒，其包括可以檢測(cè)該胃癌標(biāo)記Mac-2BP的試劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用該試劑用于4全測(cè)該胃癌標(biāo)記的方法。通過(guò)下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明的上述和其它目的，特征和其它優(yōu)點(diǎn)將被更加清楚的理解，其中圖1A顯示通過(guò)Northern印跡測(cè)定，與作為對(duì)照組的^吏用實(shí)體瘤標(biāo)記豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶(Legumain)的原發(fā)性癌組織比較，Mac-2BP轉(zhuǎn)錄物在轉(zhuǎn)移性的繼發(fā)性癌組織中以較高的水平表達(dá)；圖1B顯示通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)定的在胃癌細(xì)胞4朱中Mac-2BP蛋白的特異性表達(dá)，其中每種細(xì)胞;昧用曱醛固定并用針對(duì)Mac-2BP的單克隆抗體染色；圖2A顯示使用細(xì)胞林的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，通過(guò)Mac-2BPELISA測(cè)定的在胃細(xì)胞抹中Mac-2BP蛋白的表達(dá)水平；圖2B顯示使用細(xì)胞培養(yǎng)液的濃縮物，通過(guò)ELISA測(cè)定從胃細(xì)胞抹S冊(cè)-484、-620、和-638中分泌的Mac-2BP水平，其不同于細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平；圖3顯示與正常組織(3A和3C)比較，Mac-2BP在胃癌組織(3B和3D)中以較高水平的過(guò)度表達(dá)，其使用Mac-2BP的單克隆抗體，通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)定；和圖4顯示使用取自胃癌病人和正常人體的血清，通過(guò)ELISA測(cè)定的分泌到細(xì)胞外環(huán)境的Mac-2BP水平。具體實(shí)施例在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于胃癌的診斷試劑盒，其包括一種可以確定Mac-2BP基因的mRNA或蛋白水平的試劑。另一方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)胃癌標(biāo)記的方法，其包括將生物樣品與確定Mac-2BP基因的mRNA或蛋白水平的試劑進(jìn)行接觸。在此使用的術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"意思是一種可以在正常細(xì)胞之中鑒別癌細(xì)胞的材料，并且它可以是Mac-2BP基因的核香酸標(biāo)記或是Mac-2BP蛋白的多肽標(biāo)記。與正常細(xì)胞比較，在胃癌細(xì)胞中，這些標(biāo)記的表達(dá)是增加的。在此使用的術(shù)語(yǔ)"診斷"意思是鑒別胃癌的存在或特征，并且特別地，其與胃癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)，胃癌的轉(zhuǎn)移包括轉(zhuǎn)移是否已經(jīng)發(fā)生和是否有轉(zhuǎn)移的可能性。已知Mac-2BP(NCBI編號(hào)；L13210)在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌中被過(guò)度表達(dá)。例如，在血漿或其它人體體液中的Mac-2BP的水平凈皮公認(rèn)是指示肺癌或乳腺癌的病人的癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和存活率的臨界參考(IacobelliS等人，Br.J.Cancer,1994,69,171-76;AntonioM等人，CancerRes，2002，62，2535—39)。然而，在本發(fā)明之前，沒(méi)有出版物公開(kāi)Mac-2BP基因與胃癌發(fā)生之間的關(guān)系。在本發(fā)明中，Mac-2BP作為胃癌標(biāo)記的效用被證實(shí)如下發(fā)現(xiàn)Mac-2BP轉(zhuǎn)錄物在來(lái)源于韓國(guó)病人的胃癌細(xì)胞的SNU抹中被特異性表達(dá)。特別地，原發(fā)性癌組織細(xì)胞SNU-1和—484具有十分低的Mac-2BP轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平，而在繼發(fā)性癌組織抹SNU-16、-216、-620和-638中具有明顯增加的Mac-2BP轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平(圖1A)。在這張圖中，AZ521是取自日本病人的胃癌細(xì)胞林，并且其作為對(duì)照組。HS677st是取自韓國(guó)病人的胃癌細(xì)胞林，其作為陰性對(duì)照組。HLF(人體肺成纖維細(xì)胞)取自正常人體肺組織。參考對(duì)照組細(xì)胞中的結(jié)果，Mac-2BP可以在例如HLF的正常細(xì)l包中凈皮適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)，并且在例如AZ521的胃癌細(xì)胞中不能被表達(dá)。然而，與陰性對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)Mac-2BP對(duì)于韓國(guó)人的胃癌細(xì)胞林SNU具有高度特異性的表達(dá)。已知豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶基因在實(shí)體癌細(xì)胞中被過(guò)度表達(dá)并與癌癥的轉(zhuǎn)移有關(guān)，其被作為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記(ChengL等人，CancerRes.2003，63,2957-2964)。Mac-2BP蛋白在該胃癌細(xì)胞抹中同樣用于檢測(cè)特異性表達(dá)。為了這個(gè)目的，細(xì)胞內(nèi)的Mac-2BP蛋白使用單克隆抗體染色。使用單克隆抗體的免疫組織化學(xué)染色測(cè)定的結(jié)果與使用Northern印跡分析的結(jié)果相似，這就證明了Mac-2BP在SNU-620和SNU-638中被特異性地表達(dá)，SNU-620和S而-638都是可以轉(zhuǎn)移性的(圖IB)。隨后，為了定量測(cè)定Mac-2BP的表達(dá)水平，對(duì)胃癌細(xì)胞抹的溶胞產(chǎn)物進(jìn)行ELISA測(cè)定。在SNU-620和-638中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生高達(dá)0.4|ug/mg水平的Mac-2BP蛋白，但是在SNU-484中沒(méi)有產(chǎn)生Mac-2BP蛋白，在其中基本沒(méi)有Mac-2BP轉(zhuǎn)錄物。這些結(jié)果"i正實(shí)，Mac-2BP轉(zhuǎn)錄物的水平與Mac-2BP蛋白的水平是一致的(圖2A)。另外，為了檢測(cè)Mac-2BP是否向細(xì)胞外分泌，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用超過(guò)濾器濃縮該培養(yǎng)液并對(duì)其蛋白水平進(jìn)行測(cè)定。在胃癌細(xì)胞抹中，Mac-2BP的細(xì)胞外的水平大約是其細(xì)胞內(nèi)的水平的10倍。特別地，發(fā)現(xiàn)SNU-620和-638分泌了大約3|ag/mg的Mac-2BP到其培養(yǎng)基中。不大相同的是，在SNU-484的培養(yǎng)基中幾乎沒(méi)有檢測(cè)出Mac-2BP。由于Mac-2BP基因在使用端粒酶陰性細(xì)胞林SW13的hTERT-過(guò)度表達(dá)克隆的微數(shù)列中鑒別，在這個(gè)試驗(yàn)中，SW13/pcDNA和SW13/hTERT作為對(duì)照組(圖2B)。Mac-2BP基因的轉(zhuǎn)錄物和蛋白在胃癌細(xì)胞中的特異性表達(dá)的事實(shí)的證明引起了在胃癌治療中有用的包含目的基因抑制劑的藥學(xué)組合物的開(kāi)發(fā)。在這點(diǎn)上，胃癌病人的胃組織使用抗-Mac-2BP的單克隆抗體染色。胃組織從包括正常人體和胃癌病人的22個(gè)人體中獲得。發(fā)現(xiàn)大約70~75%的胃癌組織中含有豐富的Mac-2BP。如圖3所示，Mac-2BP在正常胃組織中輕度地表達(dá)(A和C),但在胃癌組織(B和D)中被高度地特異性表達(dá)。對(duì)于該基因表達(dá)的定量，使用s90k/Mac-2BPELISA試劑盒(BenderMedSystemGmbH,Austria)。由于目的基因在胃癌細(xì)胞中特異性地表達(dá)，胃癌病人的血漿通過(guò)ELISA用于Mac-2BP的定量測(cè)定。血漿從9個(gè)正常人體和36個(gè)胃癌病人中獲得。病人血漿中的Mac-2BP水平范圍從2.4至22ug/ml,平均值是11pg/ml。這明顯地高于正常人體4.6(ag/ml的平均值，并在學(xué)生t-試驗(yàn)中顯示出p值-O.0012的顯著性(圖4)。血漿Mac-2BP的分布和胃癌臨床病理因素之間的關(guān)系用統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行分析。年齡或性別對(duì)病人血漿中的Mac-2BP水平?jīng)]有影響。然而，Mac-2BP的表達(dá)水平在繼發(fā)性轉(zhuǎn)移性的病人組中比無(wú)轉(zhuǎn)移性的病人組中要高(p值=0.05)。同樣，如下表1所示，發(fā)現(xiàn)在T服臨床階段III和IV的病人組中的Mac-2BP比在T麗臨床階段I和II的病人組中的Mac-2BP的分布稍高(p值=0.04)。在生物樣品中的胃癌標(biāo)記基因Mac-2BP的表達(dá)水平可以通過(guò)Mac-2BP的mRNA或蛋白的定量測(cè)定確定。可以使用各種已知的技術(shù)從生物樣品中分離mRNA或蛋白并確定其含量。在此使用的術(shù)語(yǔ)"生物樣品"意思是可以分析胃癌標(biāo)記基因Mac-2BP的mRM或蛋白水平的材料，其例子包括組織，細(xì)胞，尿液，血液，血漿，血清等，但不限于此。在此使用的術(shù)語(yǔ)"mRNA水平的分析"意思是測(cè)定生物樣品中的mRNA的含量，以檢測(cè)胃癌標(biāo)記基因Mac-2BP的mRNA的存在和表達(dá)程度，從而檢測(cè)該胃癌標(biāo)記基因。舉例說(shuō)明，mRNA水平的分析方法可以是RT-PCR,竟?fàn)嶳T-PCR，實(shí)時(shí)RT-PCR,RPA(RM酶保護(hù)測(cè)定)，Northern印跡，和DNA芯片，^f旦不限于此。使用這些方法，mRNA的表達(dá)水平可以在正常對(duì)照組和樣品組之間進(jìn)行比較。為了檢測(cè)從標(biāo)記基因Mac-2BP到mRNA的轉(zhuǎn)錄物水平是否增加，這些方法也是有用的，其是進(jìn)行診斷胃癌的依據(jù)。一種通過(guò)RT-PCR分析mRNA水平的試劑盒，包括對(duì)胃標(biāo)記Mac-2BP基因有特異性的一對(duì)引物。具有一個(gè)特異于一段標(biāo)記基因的核苷酸序列的每個(gè)引物的長(zhǎng)度范圍大約從7至50bp，并優(yōu)選大約從10到30bp。該試劑盒可以包括特異于一段控制基因的核芬酸序列的引物。另外，該RR-PCR試劑盒可以包括試管或適合的容器，反應(yīng)緩沖液(pH和鎂的濃度變化)，dNTPs,Taq-聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，脫氧核糖核酸酶，無(wú)核糖核酸酶的DEPC水和無(wú)菌水。術(shù)語(yǔ)"引物，，意思是可以與互補(bǔ)的模板形成堿基對(duì)的短鏈核苷酸序列，并且其具有游離的3，輕基，該3，羥基作為該模板的DNA復(fù)制的起始點(diǎn)。引物是需要的，這是因?yàn)榇呋揇NA復(fù)制的大多數(shù)酶(例如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)僅可以在適當(dāng)?shù)木彌_液，溫度，不同試劑，和四種不同的三磷酸核苷的條件下添加到即成的核普酸鏈中。引物可以以附加的特征加入，但不能改變它們作為DNA合成起始點(diǎn)的基本功能。引物可以使用亞磷酰胺固體載體方法或一些其它已知的方法化學(xué)合成。這些核苦酸序列還可以通過(guò)已知方法進(jìn)行修飾。在此使用的術(shù)語(yǔ)"蛋白水平的分析"意思是確定由胃癌標(biāo)記基因Mac-2BP編碼蛋白的含量，優(yōu)選使用對(duì)其有特異性的抗體，以檢測(cè)該蛋白的存在和表達(dá)程度。在此使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"意思是作為免疫應(yīng)答的一部分對(duì)抗原作出應(yīng)答而產(chǎn)生的蛋白分子。對(duì)于本發(fā)明的目的，該抗體指特異性結(jié)合到該胃癌標(biāo)記蛋白Mac-2BP上的蛋白分子，包括多克隆抗體，單克隆抗體，和重組抗體?？梢允褂酶鞣N方法使用抗體來(lái)分析蛋白水平，舉例說(shuō)明，其包括但不限于，Western印跡，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)，RIA(放射免疫測(cè)定)，放射免疫擴(kuò)散法，雙向免疫擴(kuò)散法，火箭免疫電泳法，免疫組織化學(xué)染色法，免疫沉淀作用法，補(bǔ)體結(jié)合作用法，F(xiàn)ACS，和蛋白芯片法。使用這些方法，可以在正常對(duì)照組和樣品組之間比較抗原-抗體復(fù)合物的含量。檢測(cè)從標(biāo)記基因Mac-2BP到蛋白的表達(dá)水平是否顯著的增加，這些方法也是有用的，其是進(jìn)行診斷胃癌的依據(jù)。在此使用的術(shù)語(yǔ)"抗原-抗體復(fù)合物"意思是通過(guò)Mac-2BP蛋白和對(duì)其有特異性的抗體的結(jié)合形成的復(fù)合物。該抗原-抗體復(fù)合物可以使用檢測(cè)指示物的信號(hào)強(qiáng)度定量地確定。在抗原-抗體復(fù)合物的定量測(cè)定中有用的是選自酶，熒光劑，配體，發(fā)光劑，微粒，氧化還原分子，和放射性同位素之中的檢測(cè)指示物。然而，在抗原-抗體復(fù)合物的定量測(cè)定中可以使用其它的檢測(cè)指示物?？梢宰鳛闄z測(cè)指示物用于分析的酶的例子包括3-葡萄糖苷酸酶，D-葡糖糖苷酶，D-半乳糖苷酶，尿素酶，過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶，乙酰膽堿酯酶，葡萄糖氧化酶，己糖激酶和GDP酶，核糖核酸酶，葡萄糖氧化酶和焚光素酶，磷酸果糖激酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶，磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶，和e-內(nèi)酰胺酶，但不限于此。對(duì)于熒光劑，舉例說(shuō)明，它們可以是，但不限于，二羥基熒烷，異硫氰酸鹽，玫瑰紅，藻紅蛋白，藻藍(lán)蛋白，異藻藍(lán)蛋白，鄰苯二曱醛，和熒光胺。生物素衍生物可以作為配體，但不限于此。作為檢測(cè)指示物有用的發(fā)光劑包括吖啶酯，熒光素，和熒蟲(chóng)素酶，但不限于此。舉例說(shuō)明，樣i粒的非限制性例子包括膠體金和染色的乳膠。氧化還原分子形式的檢測(cè)指示物可以是二茂絡(luò)鐵，釕絡(luò)合物，紫精，醌，Ti離子，Cs離子，二酰亞胺，1,4-苯醌,對(duì)苯二酚，LW(CN)8,2+或[M0(CN)8][，但不限于此。有用的放射性同位素是3H,"C,32P，35S，"CI,51Cr,"Co,58Co,"Fe,9°Y,125I，131I和186Re,但這些不是為了限制本發(fā)明。蛋白水平的分析優(yōu)選使用ELISA進(jìn)行(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)。ELISA可以被細(xì)分為直接夾心ELISA和間接夾心ELISA:前者中，附著在固體載體上的抗原-抗體復(fù)合物與可以識(shí)別該抗原的標(biāo)記的抗體結(jié)合，而后者利用識(shí)別一抗的標(biāo)記的二抗，一抗與附著在固體載體上的抗原-抗體復(fù)合物中的該抗原結(jié)合。優(yōu)選地，使用夾心ELISA測(cè)定該蛋白水平，其中附著在固體載體上的抗體與樣品反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物，并且隨后該復(fù)合物與可以識(shí)別該抗原的標(biāo)記的抗體結(jié)合，隨后發(fā)生酶介導(dǎo)顯色，或者其中標(biāo)記的二抗與可以識(shí)別抗原-抗體復(fù)合物的該抗原的抗體結(jié)合，并且隨后發(fā)生酶介導(dǎo)顯色?？梢允褂梦赴┘?xì)胞標(biāo)記蛋白Mac-2BP與抗體結(jié)合的復(fù)合物水平來(lái)診斷胃癌。同樣優(yōu)選的是使用蛋白芯片來(lái)分析蛋白水平，其中針對(duì)該胃癌標(biāo)記蛋白Mac-2BP的一個(gè)或多個(gè)抗體以高密度預(yù)定位置被排列并固定在基質(zhì)上。在這點(diǎn)上，蛋白從樣品分離并與蛋白芯片雜交，形成抗原-抗體復(fù)合物，隨后讀取該復(fù)合物來(lái)檢測(cè)樣品中蛋白的存在或表達(dá)水平，從而診斷胃癌的發(fā)生。另一種優(yōu)選的分析方法是Western印跡技術(shù)，其利用針對(duì)該胃癌標(biāo)記Mac-2BP的一種或多種抗體。對(duì)于Western印跡，蛋白與樣品分離，根據(jù)大小由電泳分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，并與針對(duì)該胃癌標(biāo)記Mac-2BP的抗體反應(yīng)。使用標(biāo)記的抗體定量分析該抗原-抗體復(fù)合物，來(lái)診斷胃癌。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法包括在未被感染胃癌的對(duì)照組和樣品細(xì)胞之間比較該標(biāo)記基因的表達(dá)水平。mRNA或蛋白的表達(dá)水平可以用該標(biāo)記蛋白的絕對(duì)含量(例如，ng/ml)或相對(duì)單位(例如，信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度)表示。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于胃癌的診斷試劑盒，其包括特異性結(jié)合到Mac-2BP蛋白上的抗體。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)胃癌標(biāo)記的方法，該方法包括將針對(duì)Mac-2BP蛋白的抗體與生物樣品接觸。如上面所述，由于Mac-2BP已經(jīng)被確認(rèn)為胃癌標(biāo)記，作用于它的抗體可以使用已知的技術(shù)容易地產(chǎn)生?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)制備多克隆抗體，例如，通過(guò)將該胃癌標(biāo)記蛋白Mac-2BP注入到動(dòng)物中并從該動(dòng)物中取得血清。產(chǎn)生多克隆抗體的宿主可以4吏用任何哺乳動(dòng)物，例如山羊，兔子，綿陽(yáng)，猴子，馬，豬，奶牛，狗等?？梢允褂靡阎姆椒ㄟM(jìn)行單克隆抗體的產(chǎn)生，例如雜交瘤方法(K6hler和Milstein(1976)EuropeanJournalofImmunology6:511-519)，或喧菌體抗體庫(kù)技術(shù)(Clackson等人，Nature,352:624—628,1991;Marks等人，J.Mol.Biol.，222:58,1-597,1991)。通常，雜交瘤方法利用來(lái)源于適合免疫的宿主動(dòng)物的細(xì)胞，例如注入抗原，胃標(biāo)記蛋白Mac-2BP,和癌瘤或骨髓瘤細(xì)胞抹的小鼠。這些兩種類型的細(xì)胞用已知方法使用例如聚乙二醇融合，并且從而形成該產(chǎn)生抗體的細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基方法培養(yǎng)。使用有限稀釋技術(shù)對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)一步亞克隆，確保單克隆性。可以產(chǎn)生對(duì)該胃癌標(biāo)記蛋白Mac-2BP有特異性的抗體的該雜交瘤細(xì)胞使用常規(guī)技術(shù)在體外或體內(nèi)大規(guī)模的培養(yǎng)。雖然它們使用時(shí)無(wú)需純化，由該雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的該單克隆抗體優(yōu)選使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法被純化到高濃度。在噬菌體抗體庫(kù)方法中，在體外通過(guò)克隆編碼該抗體的基因并在噬菌體表面以融合蛋白的形式表達(dá)它們來(lái)構(gòu)建針對(duì)該胃癌標(biāo)記蛋白Mac-2BP的巨大噬菌體表達(dá)的人單鏈可變區(qū)(scFv)抗體庫(kù)，隨后將結(jié)合到該Mac-2BP蛋白的單克隆抗體從該抗體庫(kù)中分離。對(duì)于使用上述方法制備的抗體的純化可以使用各種方法，包括凝膠電泳法，透析，鹽析，離子交換色語(yǔ)法，和親合色譜法。本發(fā)明的試劑盒中包括的抗體可以是包括兩個(gè)全長(zhǎng)輕鏈和兩個(gè)全長(zhǎng)重鏈或功能性抗原片段的完整形式。術(shù)語(yǔ)"功能性抗原片段"意思是具有抗原結(jié)合功能的片段，舉例說(shuō)明是Fab，F(xiàn)(ab，)，F(xiàn)(ab')2和Fv。根據(jù)本發(fā)明的包括特異性結(jié)合到Mac-2BP蛋白上的抗體的試劑盒優(yōu)選是診斷型ELISA試劑盒。它可以包括對(duì)調(diào)控蛋白有特異性的抗體，用于檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的i式劑，例:i口才示i己的二才元，生色團(tuán)，酵(例^口結(jié)合4元體(antibody—conjugated))和其酶作用物，或其它結(jié)合到該抗體上材料。本發(fā)明的更好的理解可以通過(guò)下面的出于舉例說(shuō)明的實(shí)施例獲得，^f旦是該實(shí)施例不是為了限制本發(fā)明。實(shí)施例1:細(xì)胞林的培養(yǎng)韓國(guó)人的胃癌細(xì)胞4朱SNU-1,-16,-216，-484，-620和-638從位于首爾國(guó)立大學(xué)醫(yī)學(xué)院的韓國(guó)人的細(xì)胞4朱庫(kù)中購(gòu)買，并在RPMI1640下培養(yǎng)(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA,USA)。SW13/pc腿和SW13/hTERT在DMEM(InvitrogenCorporation)中培養(yǎng)。在37°C下的5%的0)2環(huán)境下培養(yǎng)之前，使用的所有培養(yǎng)基補(bǔ)充10°/。的牛血清(HyClone)和抗生素(LifeTechnologies)。實(shí)施例2:SW13/hTERT表達(dá)細(xì)胞林的構(gòu)建由Sungkyunkwan大學(xué)的Han-WoongLee，Ph.D教授的實(shí)驗(yàn)室獲得pcDNA3/hTERT全長(zhǎng)質(zhì)粒作為hTERTcDNA的表達(dá)載體。次日，在以5x106細(xì)爿包/100mm培養(yǎng)恥的密度接種后，SW13細(xì)胞用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。5mg的該表達(dá)載體在無(wú)血清培養(yǎng)基中被稀釋，形成500ml的最終體積。另外，30ml的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine)(GIBC0，GrandIsland,NY)被添加到475ml的無(wú)血清培養(yǎng)基中并在室溫下培養(yǎng)15分鐘。隨后，添加DNA的培養(yǎng)基和添加脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基混合，隨后在室溫下培養(yǎng)30分鐘。該細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌兩次。DNA-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(DNA-Lipofectamine)復(fù)合物被添加到5ml的培養(yǎng)基中，在稀釋的復(fù)合物覆蓋在洗滌過(guò)的細(xì)胞上后形成6ml的總體積。在該培養(yǎng)基被正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基取代之前，該細(xì)胞在37'C下的5°/。的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)。在開(kāi)始轉(zhuǎn)染的24小時(shí)后，該變異細(xì)胞針對(duì)G418在包含0.8mg/ml的G418(Sigma，StLouis，M0)的培養(yǎng)基中進(jìn)行兩周的篩選。該G418-抗性細(xì)胞以每孔0.5~1細(xì)胞密度在96孔板上接種，以選擇單克隆。最后選擇的是SW13/hTERT并31克隆，其顯示hTERT的最高表達(dá)率。實(shí)施例3:RNA分離和Northern印跡為了檢測(cè)該Mac-2BP基因是否在胃癌細(xì)胞抹中表達(dá)并且是否與胃癌的進(jìn)展有關(guān)，進(jìn)行Northern印跡分析。4吏用酸-碌u氰酸胍-苯酚-氯仿(acidguanidiniumthiocyanate-pheno卜chloroform)4是耳又方法分離總RNA。首先，該細(xì)月包才朱(2~10x10'細(xì)胞)用PBS洗滌并用lOOmM的2-巰基乙醇和2M的醋酸鈉在4M的異硫氫酸胍中溶解。在30分鐘的離心之前，在苯酚和氯仿-異胺醇(isoaminealcohol)中在4'C下培養(yǎng)1小時(shí)。將等體積的異丙醇添加到600pl的上清液中，在-20。C下培養(yǎng)1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。在離心后，形成的該RNA片狀物被干燥并溶解在用DEPC處理過(guò)的水中。該RNA使用UV分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度的分析。該RNA通過(guò)電泳在2%的瓊脂糖凝膠上分離，以鑒別18S和28S條帶，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。用》文射標(biāo)i己的Mac-2BP^罙針(NCBInumber;L13210,683bp-1275bp)和豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶才罙針(NCBInumber;麗_005606，525bp-1325bp)進(jìn)4亍雜交。曝光X光片2天使得每個(gè)細(xì)胞中的Mac-2BP和豆類天冬氨酸蛋白內(nèi)切酶基因的表達(dá)可視化。該結(jié)果在圖1A中顯示。實(shí)施例4:通過(guò)流式細(xì)^^計(jì)量術(shù)分析Mac-2BP的表達(dá)進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)Mac-2BP的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。培養(yǎng)并收集該胃癌細(xì)胞抹。這些細(xì)胞用FACS染色緩沖液(0.05%BSA，0.02%疊氮化鈉，PBS中)洗滌一次，溶解在2%的多聚曱醛溶液中，在冰上固化15分鐘，并再次用FACS染色緩沖液洗滌一次。該洗滌過(guò)的細(xì)胞片狀物溶解在透化緩沖液(permeabilizationbuffer)(0.1%皂角苷和0.05%疊氮化鈉，在PBS中)中并在冰上培養(yǎng)15分鐘。隨后用FACS染色緩沖液洗滌，該細(xì)胞用Mac-2BP單克隆抗體(Alexis)培養(yǎng)30分鐘。在用FITC-結(jié)合IgG抗體(分子探針)在水上培養(yǎng)30分鐘之前，用FACS染色緩沖液再次洗滌。在該細(xì)胞用FACS染色緩沖液洗滌三次或四次之后，用流式細(xì)胞測(cè)定器對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1B中所示。實(shí)施例5:通過(guò)ELISA對(duì)Mac-2BP的定量測(cè)定收集每個(gè)細(xì)胞抹并在裂解緩沖液(O.01%諾乃洗滌劑(Nonidet)P-40,10mM三羥甲基氨基曱烷，pH7.6,50mMKC1,5mMMgCl2,2mM二硫蘇糖醇，20%甘油+蛋白酶抑制劑混合物)(Sigma)中完全溶解40分鐘。在定量分析蛋白之前，在12，OOOrpm下離心20分鐘將水不溶性蛋白去除。在Mac-2BPELISA中使用相同含量的蛋白。使用s90k/Mac-2BPELISA試劑盒(BenderMedSystem)。該蛋白混合物用Mac-2BP單克隆抗體包被的創(chuàng)口貼(strip)在4'C下隔夜培養(yǎng)，以在其上附著該Mac-2BP，隨后用洗滌緩沖液洗滌四次。隨后，該創(chuàng)口貼用HRP-結(jié)合的二抗在37。C下培養(yǎng)1小時(shí)，用洗滌緩沖液洗滌四次，并在用終止緩沖液^^應(yīng)終止前在100ml的底物溶液中培養(yǎng)5分鐘來(lái)顯色。在多孔板中引入酶標(biāo)儀，并在540nm下讀取吸光度并使用SoftMax軟件分析。當(dāng)使用細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，在對(duì)Mac-2BP進(jìn)行ELISA分析之前，濃縮并透析該蛋白。對(duì)于來(lái)自胃癌病人的血清，在對(duì)Mac-2BP進(jìn)行ELISA分析之前，它們以1:200的比例被稀釋。該結(jié)果在圖2A,2B和4中顯示。實(shí)施例6:胃癌細(xì)胞抹和SW13細(xì)胞林的培養(yǎng)基的收集為了定量地分析向細(xì)胞外分泌的Mac-2BP，收集胃癌細(xì)胞抹和SW13細(xì)胞抹的培養(yǎng)液。在15cm-培養(yǎng)亞中培養(yǎng)后，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌每個(gè)細(xì)胞4朱并隨后在無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)每個(gè)細(xì)胞林。在培養(yǎng)24小時(shí)后，該細(xì)胞培養(yǎng)在2,OOOrptn下離心兩次，每次10分鐘，收集無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液。該培養(yǎng)液使用導(dǎo)電4艮月交(Amicon)(cutoffMW50，OOODa，Millipore)濃縮。該濃縮物;故置于活性透析帶中并在1xPBS中4'C下每隔4小時(shí)透析3次或更多次。在用于ELISA之前，使用BioRad蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白的濃度。實(shí)施例7:由免疫組織化學(xué)染色法對(duì)Mac-2BP蛋白的4全測(cè)為了檢測(cè)在胃癌組織中Mac-2BP的表達(dá)水平，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色法。植入了取自胃癌病人的胃癌組織的石蠟切片用二曱苯去石蠟化并使用分級(jí)乙醇洗滌劑與水化合。在該水合的切片被微波照射3次，5分鐘后，該水合的切片被放置在10mM檸檬酸緩沖液(pH6.0)中。通過(guò)用3°/的過(guò)氧化氫在曱醇中處理6分^t阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。隨后，該切片用載體試劑盒(CatNo.PK6102)的工作溶液處理30分鐘，以防止非特異性的蛋白結(jié)合。在1xPBS稀釋的Mac-2BPIgG抗體中，在室溫下進(jìn)行培養(yǎng)2小時(shí)，并且隨后用生物素?；目剐∈驣gAb(載體試劑盒)，在室溫下培養(yǎng)30分鐘。隨后，該切片用ABCElite試劑盒(載體試劑盒)在室溫下處理30分鐘，并且隨后與二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽底物(diaminobenzidinetetrahydrochloridesubstrate)(載體試劑盒)反應(yīng)2分鐘，來(lái)分析在胃癌組織中的Mac-2BP的表達(dá)水平(圖3)。如圖3所示，在癌瘤感染的胃腸組織中，Mac-2BP以明顯的高水平表達(dá)(圖3B和3D),但在正常胃腸組織中其以低水平表達(dá)(圖3A和3C)。實(shí)施例8:血漿Mac-2BP的分布和臨床病理因素之間的關(guān)系血漿Mac-2BP的分布和胃癌的臨床病理因素之間的關(guān)系在圖4中顯示，對(duì)該關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并在以下的表1總結(jié)出。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>a:Mac-2BP水平高于截?cái)嘀?1.2g/ml的胃癌病人的數(shù)(百分比)。b:p值通過(guò)曼-惠特尼lM企驗(yàn)確定。從表1的數(shù)據(jù)中明顯的看出，在病人血漿中的Mac-2BP水平不受年齡或性別的影響。然而，在具有繼發(fā)性轉(zhuǎn)移性的病人組中，Mac-2BP的表達(dá)水平比沒(méi)有轉(zhuǎn)移性的病人組中要高(P值-O.05)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)與在T顧臨床階段I和II中的病人組比較，在TMN臨床階段III和IV中的病人組中，Mac-2BP的表達(dá)有較高分布(p值=0.04)。工業(yè)實(shí)用性如目前所描述的，該Mac-2BP基因在胃癌細(xì)胞中特異性地過(guò)度表達(dá)并且分泌到細(xì)胞的細(xì)胞外的環(huán)境中。另外，樣品基因在具有轉(zhuǎn)移能力的癌細(xì)胞組織的胃腸組織中明顯高水平地被表達(dá)。因此，通過(guò)檢測(cè)Mac-2BP基因的mRNA或蛋白水平，可以診斷胃癌，特別是診斷可以轉(zhuǎn)移性的或轉(zhuǎn)移性的胃癌。發(fā)現(xiàn)在36個(gè)胃癌病人中的血漿具有平均11|ug/ml的Mac-2BP水平，其明顯高于9個(gè)正常人體的4.6|ag/ml的平均值。特異性地結(jié)合到Mac-2BP的抗體在診斷胃癌中是有用的。雖然出于舉例說(shuō)明的目的已經(jīng)公開(kāi)了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，在不背離在所附的權(quán)利要求所公開(kāi)的本發(fā)明的范圍和精神下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將做出各種改進(jìn)，增加和替換是可能的。權(quán)利要求1.一種用于胃癌的診斷試劑盒，所述試劑盒包括特異性結(jié)合到Mac-2BP的抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的診斷試劑盒，其中所述胃癌是轉(zhuǎn)移性的或可以轉(zhuǎn)移性的。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的診斷試劑盒，其中所述診斷試劑盒允許在對(duì)照組和樣品組之間比較蛋白水平。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)所述的診斷試劑盒，其中所述診斷試劑盒利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的診斷試劑盒，其中所述診斷試劑盒利用夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法。6.—種用于檢測(cè)胃癌標(biāo)記的方法，所述方法包括將特異性結(jié)合到Mac-2BP結(jié)合蛋白的抗體與選自尿液，血液，血清，和血漿的生物樣品進(jìn)行接觸。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述胃癌是轉(zhuǎn)移性的或可以轉(zhuǎn)移性的。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述方法允許在對(duì)照組和樣品組之間比較蛋白水平。9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述方法包括(a)提供生物樣品；(b)將所述樣品與特異性結(jié)合到Mac-2BP結(jié)合蛋白的抗體進(jìn)行接觸；(c)定量分析抗原-抗體復(fù)合物；和(d)將所述步驟(c)的定量分析結(jié)果與正常對(duì)照組的定量分析結(jié)果進(jìn)行比較。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種用于胃癌的診斷試劑盒。它包括可以檢測(cè)并定量測(cè)定該胃癌標(biāo)記Mac-2BP的試劑。本發(fā)明還涉及一種使用所公開(kāi)的該試劑盒用于檢測(cè)該胃癌標(biāo)記的方法。文檔編號(hào)G01N33/574GK101389962SQ200680053460公開(kāi)日2009年3月18日申請(qǐng)日期2006年9月25日優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日發(fā)明者宋銀永,尹道榮,崔勝哲,廉榮一,樸六畢,李熙龜,金載和申請(qǐng)人:韓國(guó)生命工學(xué)研究院