免疫分析微芯片、免疫分析用試劑盒及免疫分析方法

專利名稱：免疫分析微芯片、免疫分析用試劑盒及免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析微芯片及使用該免疫分析微芯片的免疫分析方 法。具體地涉及通過對(duì)均勻分散保持有微細(xì)珠粒的親水性光固化性樹脂溶 液實(shí)施曝光處理，在微小流路中形成免疫分析用微小結(jié)構(gòu)的免疫分析微芯 片或免疫分析試劑盒、以及使用了該微芯片的免疫分析方法。
背景技術(shù)：
向在基板上形成的微通道中導(dǎo)入表面固定有抗體的珠粒體，通過阻擋 部阻擋所述導(dǎo)入的珠粒體，用作免疫分析用柱，利用熱透鏡顯微鏡等分析 單元來分析流過阻擋部的酶反應(yīng)產(chǎn)物的酶免疫分析芯片和酶免疫分析方法 已有記載(參照專利文獻(xiàn)1)。
由此，與使用以往的微滴定板的免疫分析法相比，樣品量可以大幅度 減少、操作簡便，檢測所需要的時(shí)間也能夠縮短。
另一方面，已知，將含有親水性固化性樹脂、光聚合引發(fā)劑以及水溶 性高分子多糖類的液態(tài)組合物滴入含有堿金屬或多價(jià)金屬離子的水性介質(zhì) 中使所述組合物凝膠化成粒狀，并照射活性光線使其固化，由此獲得具有 適于微生物黏附的表面的微生物菌體固定化用粒狀載體，其中所述的水溶 性高分子多糖類具有通過與堿金屬或多價(jià)金屬離子的接觸而凝膠化的能力
(參照專利文獻(xiàn)2)。
另外，使用單細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)用的局部光聚合的微芯片內(nèi)單細(xì)胞固定化 技術(shù)是已知的其中，向微通道內(nèi)的含有細(xì)胞的溶液中分散光交聯(lián)樹脂滴， 用顯微鏡選擇所希望的細(xì)胞，通過在其周圍照射激光使周圍的光交聯(lián)樹脂 局部地光聚合，僅將所述選擇的細(xì)胞在微芯片中固定化，另外對(duì)照射時(shí)間 和固化樹脂直徑的關(guān)系也有所了解(參照非專利文獻(xiàn)1)。
專利文獻(xiàn)1:國際公開第2003/062823號(hào)小冊子
專利文獻(xiàn)2:國際公開第97/19978號(hào)小冊子
非專禾U文獻(xiàn)1: Maruyama，H.，及另夕卜3人，"Immobilisation of individual cells by local photo-polymerisation on a chip", "The Analyst", The Royal Society of Chemistry, 2005年1月31日，(2005)， 130， p, 304-310
專利文獻(xiàn)1通過使用微通道，雖然可以大幅度地減少樣品量，但是另 一方面，由于樣品量變小，反應(yīng)產(chǎn)物量也變得極少，其分析需要稱作熱透 鏡顯微鏡的特殊的分析儀器，因此能夠適用的環(huán)境自然有限。
作為解決這樣技術(shù)課題的一個(gè)方向性是提高反應(yīng)效率，使即使樣品量 少也能夠生成充分量的反應(yīng)產(chǎn)物，但是為了提高反應(yīng)效率，需要增大反應(yīng) 面積，進(jìn)一步減小珠粒直徑。
但是，可以預(yù)料，在進(jìn)一步減小珠粒直徑的情況下，珠粒本身的操作 (例如將珠粒導(dǎo)入至阻擋部以形成柱)必然變得更加困難，樣品等液體流 過塞滿了大量這樣小直徑的珠粒的微通道時(shí)，從珠粒間的空隙間距可知， 流路阻力非常地大、處理液變得不能流下。
另一方面，專利文獻(xiàn)2或非專利文獻(xiàn)1雖然公開了在珠粒狀的親水性 光固化性樹脂中分別固定化微生物或細(xì)胞的技術(shù)，但是對(duì)于將固定有抗體 的微細(xì)珠粒在微通道內(nèi)部、在維持低流路阻力的狀態(tài)下作為反應(yīng)相進(jìn)行柱 化并無任何教示。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明人等對(duì)將流路阻力抑制到實(shí)用范圍內(nèi)的同時(shí)構(gòu)建微小珠 粒的柱的方法進(jìn)行了探索，其結(jié)果是想到，通過將微通道的截面區(qū)分成流 路部和均勻分散保持有珠粒的柱部來抑制流路阻力的方法。
但是，在均勻分散保持有珠粒的柱部的親水性低的情況下，即使樣品 等的液體能夠流下，作為柱的功能也幾乎喪失了，因此需要在柱部和流路 部之間構(gòu)建保持液體的滲透、擴(kuò)散可能程度高的親水性的狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu) 物的方法。
而且，免疫分析用的微通道的問題是，從避免抗體等的變性的觀點(diǎn)出 發(fā)，珠粒等的導(dǎo)入后不能進(jìn)行高溫處理等，因此難以在流路形成時(shí)預(yù)先制 出所需的柱等，另一方面，在形成微通道后，再制備在該微通道內(nèi)均勻分 散保持有珠粒的柱等三維結(jié)構(gòu)物也相當(dāng)困難。
發(fā)明人等為了在形成微通道后構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)物，首先對(duì)使用作為代表
性的三維塑造技術(shù)的對(duì)光固化性樹脂進(jìn)行曝光處理的光刻技術(shù)進(jìn)行了研 究。但是已清楚，僅用通常的光固化性樹脂溶液，即使能夠在微通道內(nèi)構(gòu) 建所希望的三維結(jié)構(gòu)物，也不會(huì)發(fā)揮本來的作為珠粒柱的功能。
因此，本發(fā)明人等為了使流路部與珠粒柱部之間能夠進(jìn)行充分的物質(zhì) 移動(dòng)，在能夠維持三維結(jié)構(gòu)外形的范圍內(nèi)，對(duì)能夠緩和地保持珠粒的固化 處理、及光固化性樹脂溶液的稀釋比例和曝光條件以及三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探 索。
其結(jié)果確認(rèn)了，即使在稀釋超過30%、懸浮有固定化有第一抗體 (primary antibody)的珠粒的光固化性樹脂溶液中，也可以形成即使經(jīng)過 離心分離處理等也不會(huì)倒塌、外徑40nm左右、高度10(Him左右的圓柱結(jié) 構(gòu)。而且確認(rèn)了，由于在微通道內(nèi)確保了各柱間的流路，因此三維結(jié)構(gòu)物 的制出所導(dǎo)致的流路阻力的增大是輕微的、對(duì)操作幾乎沒有成為障礙。
本發(fā)明(1)為免疫分析微芯片，其具有在至少一部分上配置有微小結(jié) 構(gòu)物的流路，其中所述微小結(jié)構(gòu)物為將表面上固定化了第一抗體的微細(xì)珠 粒均勻分散保持于經(jīng)光固化的親水性樹脂中而形成的。
本發(fā)明(2)為本發(fā)明(1)的免疫分析微芯片，其特征在于，所述微 小結(jié)構(gòu)物是通過對(duì)懸浮有所述微細(xì)珠粒的親水性光固化性樹脂溶液進(jìn)行曝 光處理而形成了圖案的結(jié)構(gòu)物。
本發(fā)明(3)為本發(fā)明(1)的免疫分析微芯片，其特征在于，所述微 小結(jié)構(gòu)物是通過在對(duì)親水性光固化性樹脂溶液進(jìn)行曝光處理而形成了圖案 的微小結(jié)構(gòu)的周圍，對(duì)進(jìn)一步導(dǎo)入的懸浮有微細(xì)珠粒的親水性光固化性樹 脂溶液進(jìn)行曝光處理而形成了圖案的結(jié)構(gòu)物，其中所述的微細(xì)珠粒的表面 上固定化有第一抗體。
本發(fā)明(4)為本發(fā)明(1) 本發(fā)明(3)中任一發(fā)明的免疫分析微芯 片，其特征在于，所述流路中沿著流路方向依次配置有微小結(jié)構(gòu)物，其中 所述微小結(jié)構(gòu)物分散保持有色調(diào)不同的微細(xì)珠粒。
本發(fā)明(5)為本發(fā)明(1) 本發(fā)明(4)中任一發(fā)明的免疫分析微芯 片，其特征在于，所述流路是由在基板上形成的槽和至少包括開口部的蓋 板形成的。
本發(fā)明(6)為本發(fā)明(1) 本發(fā)明(5)中任一發(fā)明的免疫分析微芯 片，其特征在于，所述流路的寬度為10(Him 500(Him、深度為50pm 200pm，且至少一部分含有能夠使利用毛細(xì)管現(xiàn)象導(dǎo)入的液體沿流路方向 流下的流路截面積的區(qū)域。
本發(fā)明(7)為本發(fā)明(1) 本發(fā)明(4)中任一發(fā)明的免疫分析微芯 片，其特征在于，所述流路為由至少包括開口部的毛細(xì)管的內(nèi)表面劃分而 成的空間。
本發(fā)明(8)為本發(fā)明(1) 本發(fā)明(4)中任一發(fā)明的免疫分析微芯 片，其特征在于，所述流路是直徑為50pm 100(^m的圓柱狀或邊長為 50pm 100(^m的棱柱狀，且是由至少包括開口部的毛細(xì)管的內(nèi)表面劃分 而成的空間。
本發(fā)明(9)為免疫分析用試劑盒，其將本發(fā)明(1) (8)中任一發(fā) 明的免疫分析微芯片與含有經(jīng)標(biāo)記的第二抗體(secondaiy antibody)的溶 液或含有經(jīng)標(biāo)記的抗原的溶液、洗滌液以及含有底物的試劑溶液，以能夠 導(dǎo)入至所述微芯片的流路的方式包裝在一起。
本發(fā)明(10)為使用檢査芯片的免疫分析方法，其中所述檢查芯片含 有配設(shè)有微小結(jié)構(gòu)物的流路，該方法至少含有下述工序
準(zhǔn)備含有至少1個(gè)流路的基板的工序；
導(dǎo)入親水性光固化性樹脂溶液，利用毛細(xì)管現(xiàn)象將所述親水性光固化 性樹脂溶液填充至所述流路內(nèi)的工序，其中所述親水性光固化性樹脂溶液 懸浮有表面上固定化了第一抗體的微細(xì)珠粒；
對(duì)填充在所述流路內(nèi)的所述親水性光固化性樹脂溶液的至少一部分， 用任意圖案的光掩模進(jìn)行曝光的工序；
保留通過曝光固化的區(qū)域、將其它區(qū)域的未固化的所述親水性光固化 性樹脂溶液從所述流路中除去，進(jìn)而向流路中導(dǎo)入封閉溶液的工序；
至少將作為待測物質(zhì)的抗原與含有經(jīng)標(biāo)記的第二抗體的溶液或含有經(jīng) 標(biāo)記的抗原的溶液依次或同時(shí)導(dǎo)入至所述流路內(nèi)的工序；
洗滌后，將含有底物的試劑溶液導(dǎo)入至所述流路內(nèi)的工序；
在規(guī)定時(shí)間后，檢測所述第二抗體或所述抗原與所述底物的反應(yīng)產(chǎn)物 的存在的工序。
本發(fā)明(11)為本發(fā)明(10)的方法，其特征在于，所述流路含有開 口部，其寬度為100(im 5000|im、深度為50|im 20(^m，且使利用毛細(xì) 管現(xiàn)象導(dǎo)入至開口部的液體沿流路方向流下。
本發(fā)明(12)為本發(fā)明(10)的方法，其特征在于，所述流路為在基 板上形成的、寬度為100nm 5000iam、深度為50|am 200nm的上部開放 的槽，其通過被至少包括開口部的蓋板覆蓋而形成。
本發(fā)明(13)為本發(fā)明(10)的方法，其特征在于，所述流路包括開 口部、是由50nm 1000|im的圓柱狀或邊長為50nm 1000jim的棱柱狀的 毛細(xì)管的內(nèi)表面劃分而成的空間，且使利用毛細(xì)管現(xiàn)象導(dǎo)入至開口部的液 體沿流路方向流下。
這里，本發(fā)明的親水性光固化性樹脂溶液是指含有在1分子中具有至 少2個(gè)烯鍵式不飽和鍵的親水性光固化性樹脂(a)和光聚合引發(fā)劑(b) 而成的水性液態(tài)組合物。
詳細(xì)地說，上述親水性光固化性樹脂(a) —般優(yōu)選使用下述樹脂具 有300-30000、優(yōu)選500-20000的范圍內(nèi)的數(shù)均分子量，含有在水性介質(zhì) 中均勻分散的充分的離子性或非離子性的親水性基團(tuán)，例如含有羥基、氨 基、羧基、磷酸基、磺酸基、醚鍵等，且照射了波長在約250 約600nm范 圍內(nèi)的活性光線時(shí)發(fā)生固化、變?yōu)樵谒胁蝗苄缘臉渲Ｗ鳛檫@樣的光固 化性樹脂，可以使用包括作為固定化用的固定化載體的已知樹脂(例如參 照特公昭55-40號(hào)公報(bào)、特公昭55-20676號(hào)公報(bào)、特公昭62-19837號(hào)公報(bào) 等)。
作為代表性的物質(zhì)，可以列舉出以下所述的物質(zhì)。 (i)在聚烷撐二醇的兩個(gè)末端具有能夠光聚合的乙烯性不飽和基團(tuán)的 化合物例如，
-用2摩爾(甲基)丙烯酸將1摩爾的分子量為400~6000的聚乙二醇 的兩個(gè)末端羥基酯化而成的聚乙二醇二 (甲基)丙烯酸酯類；
-用2摩爾(甲基)丙烯酸將1摩爾的分子量為200 4000的聚丙二醇 的兩個(gè)末端羥基酯化而成的聚丙二醇二 (甲基)丙烯酸酯類；
-用2摩爾的甲苯撐二異氰酸酯、苯撐二甲基二異氰酸酯、異佛爾酮二 異氰酸酯等二異氰酸酯化合物將1摩爾的分子量為400~6000的聚乙二醇的
兩個(gè)末端羥基進(jìn)行氨酯化、然后加成了2摩爾的(甲基)丙烯酸2-羥乙基 酯等不飽和單羥乙基化合物而成的不飽和聚乙二醇氨酯化物；
-用2摩爾的甲苯撐二異氰酸酯、苯撐二甲基二異氰酸酯、異佛爾酮二 異氰酸酯等二異氰酸酯化合物將1摩爾的分子量為200~4000的聚丙二醇的 兩個(gè)末端羥基進(jìn)行氨酯化、然后加成了2摩爾的(甲基)丙烯酸2-羥乙基 酯等不飽和單羥乙基化合物而成的不飽和聚丙二醇氨酯化物，等。
(ii) 高酸值不飽和聚酯樹脂通過含有不飽和多元羧酸的多元羧酸成 分與多元醇的酯化而獲得的酸值為40~200的不飽和聚酯的鹽類等。
(iii) 高酸值不飽和環(huán)氧樹脂在環(huán)，樹脂與(甲基)丙烯酸等不飽 和羧基化合物的加成產(chǎn)物上殘留的羥基上i卩成酸酐而獲得的酸值40~200 的不飽和環(huán)氧樹脂等。
(iv) 陰離子性不飽和丙烯酸樹脂在含有羧基、磷酸基和/或磺酸基 的共聚物中導(dǎo)入了可光聚合的乙烯性不飽和基團(tuán)的樹脂等，所述共聚物是 由選自(甲基)丙烯酸和(甲基)丙烯酸酯中的至少2種(甲基)丙烯酸 類單體共聚獲得的。
(V)不飽和聚酰胺使甲苯撐二異氰酸酯、苯撐二甲基二異氰酸酯等
二異氰酸酯與丙烯酸2-羥乙基酯等乙烯性不飽和羥基化合物的加成物與明
膠等水溶性聚酰胺進(jìn)行加成反應(yīng)而獲得的不飽和聚酰胺等。
(vi)不飽和聚乙烯醇樹脂通過平均聚合度為300-5000、平均皂化 度為70。/。以上的聚乙烯醇樹脂與N-羥基烷基(甲基)丙烯酰胺的稠合，導(dǎo) 入了聚合性不飽和基團(tuán)的樹脂。作為N-羥基垸基(甲基)丙烯酰胺，例如 可以列舉出N-羥甲基丙烯酰胺、N-羥甲基甲基丙烯酰胺、N,N-二羥甲基丙 烯酰胺、N,N-二羥甲基甲基丙烯酰胺、N-羥乙基丙烯酰胺、N-羥乙基甲基 丙烯酰胺等。
如上所列舉的的光固化性樹脂可以分別單獨(dú)使用，或者可以2種或2 種以上組合使用。
這些光固化性樹脂中，本發(fā)明中可以特別有利地使用的是在上述(i) 的聚垸撐二醇的兩個(gè)末端具有可光聚合的乙烯性不飽和基團(tuán)的化合物等，
作為代表性的化合物，可列舉出由關(guān)西涂料株式會(huì)社以ENT-IOOO、 ENT畫2000、 ENT-3400、 ENTG誦IOOO、 ENTG-2000、 ENTG誦3800、 ENTP-2000、ENTP-4000、 ENTV-500等商品名出售的化合物。
光聚合引發(fā)劑(b)通過光照射分解產(chǎn)生自由基，成為聚合引發(fā)種，在 具有聚合性不飽和基團(tuán)的樹脂之間引起交聯(lián)反應(yīng)，例如可以列舉出苯偶姻 等a-羰基類；苯偶姻乙醚等偶姻醚類；萘酚等多環(huán)芳香族化合物類；甲基 苯偶姻等a-取代偶姻類；2-氰基-2-丁基偶氮甲酰胺等偶氮酰胺化合物類等。
對(duì)上述(a)及(b)的各成分的使用比例并無嚴(yán)格的限制，可以根據(jù) 各成分的種類等在寬范圍內(nèi)變化， 一般地，相對(duì)于(a)成分的親水性光固 化性樹脂100質(zhì)量份，光聚合引發(fā)劑(b)優(yōu)選以0.1~5質(zhì)量份、更優(yōu)選0.3~3 質(zhì)量份的比例使用。
另外，固定化第一抗體的珠粒可以使用聚苯乙烯、玻璃、膠乳、瓊脂 糖等。另外，還可以使用磁性、含色素、含熒光色素的珠粒或者表面經(jīng)羧 基、氨基、環(huán)氧基等表面處理的珠粒。可以使用的粒徑為0.1pm 5(Him左 右。
另外，標(biāo)記方法除了過氧化物酶之外，還可以使用堿性磷酸酶、葡糖 氧化酶、脲酶等酶。而且，通過選擇其顯色底物，可以獲得熒光、化學(xué)發(fā) 光、有色等顯色。另外，作為標(biāo)記方法，可以使用膠體金或量子點(diǎn)等納米 材料等。


圖1為表示制備本發(fā)明的微小結(jié)構(gòu)物中使用的光掩模的一例的圖(放 大照片)。
圖2為表示本發(fā)明的微通道內(nèi)部的微小結(jié)構(gòu)物的配置的一例的圖。 圖3為表示本發(fā)明的固定化有第一抗體的珠粒均勻分散保持于親水性
光固化性樹脂而成的微小結(jié)構(gòu)物的一例的圖(放大照片)。
圖4為表示本發(fā)明的在流路方向上配置有珠粒顏色不同的微小結(jié)構(gòu)物
的微通道的一例的圖。
圖5為表示本發(fā)明的微芯片的顯色狀態(tài)的一例的圖。
圖6為表示本發(fā)明的微芯片的布置的一例的示意圖。
圖7為表示本發(fā)明的配置有多個(gè)流路的微芯片的一例的示意圖。
圖8為表示本發(fā)明的實(shí)施例1的心臟疾病標(biāo)記物BNP的濃度校正曲線
的一例的圖。
圖9為表示本發(fā)明的實(shí)施例2的朊蛋白rPrP的濃度校正曲線的一例的圖。
圖10為表示本發(fā)明的實(shí)施例3的在毛細(xì)管內(nèi)配置有三維微小結(jié)構(gòu)物的 微芯片的一例的圖。
圖11本發(fā)明的實(shí)施例3的微芯片的顯微鏡照片。 符號(hào)說明
C光固化性樹脂發(fā)生光固化而形成的微小結(jié)構(gòu)物
B表面上固定化有第一抗體的珠粒粒子
FP流路部
1芯片主體
2主流路
3輔助流路
4輔助流路
5柱區(qū)域
6洗滌液用貯槽
7第二抗體溶液用貯槽
8廢液用槽
9隔膜
10隔膜
11試樣導(dǎo)入口 12試樣等導(dǎo)入口 13試樣等排出口 14檢測窗 15毛細(xì)管 16開放端部 17三維結(jié)構(gòu)物
具體實(shí)施例方式
<光固化性樹脂溶液的制備>
在光固化性樹脂原液(關(guān)西涂料制，商品名ENT-2000) 100&中混 合水10(^L和引發(fā)劑苯偶姻乙醚2pL、制成本發(fā)明使用的光固化性樹脂溶 液。這里，用水稀釋是為了在降低將所述溶液導(dǎo)入微通道中時(shí)的粘性的同 時(shí)、提高光固化后凝膠的親水性。稀釋比例只要在0.1~1000%的范圍內(nèi)即 可使用。
<光掩模>
在對(duì)制備三維結(jié)構(gòu)物時(shí)的光固化性樹脂溶液進(jìn)行的曝光處理中，使用 圖1所示的光掩模。該光掩模由曝光波長光能夠透過的材料構(gòu)成，且印刷 有對(duì)應(yīng)于不曝光部分的遮光圖案。圖1的光掩模以間隔600pm最密配置有 直徑為400pm的圓形圖案。
<微芯片用基板>
本發(fā)明的微芯片用基板使用玻璃制基板。為了將基板成本控制到最小 限度，通過在基板上加熱壓接穿有導(dǎo)入口和排出口的蓋板來制備，所述基 板具有流路寬度為100(^m、流路深度為100pm的直線上的上部開放槽。 減小流路寬度、流路深度由于在之后制出三維結(jié)構(gòu)物時(shí)有成為堵塞等障礙 的顧慮，同時(shí)為了改善反應(yīng)產(chǎn)物的顯色的視覺識(shí)別性，優(yōu)選寬度為100pm 5000pm、深度為50拜 20(^m，并限于能夠利用毛細(xì)管現(xiàn)象導(dǎo)入液體的范 圍。
準(zhǔn)備好以上部件后，按照以下順序在上述微芯片的微通道內(nèi)部進(jìn)行制 備光固化性樹脂的三維結(jié)構(gòu)物的預(yù)備試驗(yàn)，以掌握各個(gè)條件。
(i)用移液管將稀釋后的光固化性樹脂溶液導(dǎo)入微芯片內(nèi)，利用毛細(xì) 管現(xiàn)象使其流入微通道內(nèi)，并流遍整體。接著，(ii)在熒光顯微鏡臺(tái)上放 置光掩模，在其上設(shè)置預(yù)先準(zhǔn)備的微芯片使光掩模和微通道的位置對(duì)準(zhǔn)， 利用物鏡及光圈選擇照射范圍，利用ND濾光片調(diào)節(jié)照射強(qiáng)度進(jìn)行照射。
作為具體推薦的條件，在物鏡10倍、無光圈、無ND濾光片的情況下， 照射時(shí)間為3秒鐘、光的強(qiáng)度在波長364nm下為13mW/cm2。其結(jié)果示于 圖2。另外，圖中C為從上方觀察圓柱狀的微小結(jié)構(gòu)物，估計(jì)平均直徑為 約420jom左右。
因此，參考上述預(yù)備試驗(yàn)的條件，對(duì)懸浮了結(jié)合有第一抗體的珠粒的 親水性光固化性樹脂溶液試著制備相同的三維結(jié)構(gòu)物(圓柱狀的均勻地均
勻分散保持有珠粒的柱)。
具體地說，(0)同樣地混合lOOpL的ENT-2000、 lOOpL水、lpL引發(fā)
劑苯偶姻乙醚，準(zhǔn)備光固化性樹脂溶液。然后從預(yù)先準(zhǔn)備的固定化有第一 抗體的珠粒溶液中取出100pL，離心分離、向棄去上清后的珠粒溶液中導(dǎo) 入混合lOOpiL光固化性樹脂溶液。
接著，(i)用移液管從導(dǎo)入口將如此制備的懸浮有珠粒的光固化性樹 脂溶液10(HiL導(dǎo)入預(yù)先準(zhǔn)備的微芯片的微通道內(nèi)，利用微通道的毛細(xì)管現(xiàn) 象使所述溶液流入微通道內(nèi)，流遍整體。
之后，(ii)在熒光顯微鏡的臺(tái)上放置光掩模，在其上設(shè)置預(yù)先準(zhǔn)備的 微芯片使光掩模和微通道的位置對(duì)準(zhǔn)，利用物鏡及光圈選擇照射范圍，利 用ND濾光片調(diào)節(jié)照射強(qiáng)度進(jìn)行照射。
接著，留出通過曝光固化的區(qū)域，將未固化的光固化性樹脂溶液從微 通道中洗滌、排出。這樣，如圖3所示，可以在微通道中制備珠?；揪?勻分散保持的光固化性樹脂的圓柱狀結(jié)構(gòu)物(圓柱的平均直徑估計(jì)為 420|_im)。另夕卜，在圓柱結(jié)構(gòu)物內(nèi)部看上去有些發(fā)暗的粒子(圖中B)為分 散保持在固化的樹脂中的珠粒的陰影。并且圖3的均勻分散保持有珠粒的 柱周圍的灰色所示的區(qū)域(圖中FP)通過酶反應(yīng)顯色底物顯色、柱周圍呈 現(xiàn)淡藍(lán)色。
利用注射器泵將水導(dǎo)入該微通道內(nèi)，但該圓柱結(jié)構(gòu)物不會(huì)倒塌。而且， 利用離心分離機(jī)試著將微芯片內(nèi)導(dǎo)入的水溶液排出，即使如此圓柱狀的立 體結(jié)構(gòu)物也不會(huì)倒塌。由上可知，如此制備的三維結(jié)構(gòu)物對(duì)通常設(shè)想的微 芯片的操作具有充足的物理強(qiáng)度。因此可知，溶液向微通道內(nèi)的導(dǎo)入可以 利用毛細(xì)管現(xiàn)象，排出可以使用離心分離機(jī)等快速地處理。
而且，如圖4所示，通過在改變所導(dǎo)入的珠粒種類(表面上固定化的 抗體種類)的同時(shí)反復(fù)進(jìn)行曝光處理，構(gòu)建在1個(gè)微通道內(nèi)能夠同時(shí)對(duì)多 種樣品進(jìn)行檢測分析。這里，考慮到檢測操作時(shí)的視覺識(shí)別性，對(duì)應(yīng)于抗 體種類，也改變導(dǎo)入各個(gè)柱內(nèi)的珠粒的顏色(圖中深淺表示柱的顏色差異)。 進(jìn)而，通過改變帶色珠粒和白色或透明珠粒的混合比，也可以使柱色產(chǎn)生 深淺、在微通道方向上產(chǎn)生顏色層次。
另一方面，如果應(yīng)用通過選擇珠粒顏色來配置著色柱的技術(shù)，還可以
提高目視的檢測靈敏度。實(shí)際上，目視的顯色檢測存在個(gè)人差異，如果不
是相當(dāng)高濃度的試樣則難以應(yīng)用，因此限于專用用途(private use)的應(yīng)用。 例如，認(rèn)為一般人對(duì)藍(lán)色顯色的辨別能力在深度為100Min時(shí)換算成熱透鏡 顯微鏡輸出值為1000nV左右。
但是，對(duì)此程度的顯色強(qiáng)度的試樣，不僅需要熟練的顯色檢測，而且 大多數(shù)種類的專用檢查需求高的樣品多是濃度不足100(HiV的樣品，因此 如果不能增感目視靈敏度，則有實(shí)用性受損的顧慮。
因此，本發(fā)明人等著眼于互補(bǔ)色帶來的視覺識(shí)別性的差異，考慮構(gòu)建 由5組柱組構(gòu)成的微通道，例如使位于色澤環(huán)相反側(cè)的顏色(相對(duì)于SAT Blue的藍(lán)色的橙色)的珠粒柱組位于中央，在其前后配置位于色澤環(huán)90 度處的黃綠色和紫色珠粒柱組，進(jìn)而，在其周圍配置藍(lán)色的珠粒組。
由此，即使是藍(lán)色顯色微弱的稀薄的樣品濃度的試樣(例如換算成熱 透鏡顯微鏡輸出值稍微低于1000pV的試樣)，至少能夠容易地識(shí)別中央橙 色柱組的顯色。根據(jù)情況，為了使利用目視的觀察變得容易，可以在對(duì)應(yīng) 于微通道的配置有柱的區(qū)域的蓋板上設(shè)置所需曲率的凸部，以放大視野。
另一方面，本發(fā)明的免疫分析芯片雖然成功地將使用以往的滴定板法 的分析時(shí)間(心臟疾病標(biāo)記物BNP的情況下為4 5小時(shí))大幅度地縮短至 約20分鐘，但相對(duì)于所謂上述專利文獻(xiàn)1所例舉的微芯片ELISA法的約 15分鐘的分析時(shí)間認(rèn)為是等同的，因此本發(fā)明人等對(duì)柱設(shè)計(jì)進(jìn)一步進(jìn)行了 深入研究。
也就是說，本發(fā)明圖3所示的免疫分析微芯片是下述的系統(tǒng)由于構(gòu) 建成珠粒均勻地分散保持于各柱的整體上，在樣品含浸于整個(gè)柱中后導(dǎo)入 顯色劑，使顯色劑含浸在柱整體中，然后其顯色的反應(yīng)產(chǎn)物從柱中滲出， 不可避免地需要到同樣擴(kuò)散至柱周圍的流路部的時(shí)間，這樣就會(huì)花費(fèi)時(shí)間。
因此，本發(fā)明人等首先為了縮短進(jìn)行含浸的時(shí)間，將珠粒的分布限定 在圓柱狀的三維結(jié)構(gòu)物的周圍。也就是說，通過首先形成作為支柱的親水 性光固化性樹脂層，之后導(dǎo)入懸浮有表面上固定化了第一抗體的珠粒的親 水性光固化性樹脂溶液，在與上述支柱同軸的位置進(jìn)行曝光處理，制作圓 筒狀的柱，從而成功地縮短了含浸時(shí)間。
此時(shí)，隨著珠粒量的減少，反應(yīng)產(chǎn)物量也變得稀薄，因此優(yōu)選省略反
應(yīng)產(chǎn)物向柱周圍的流路浸出的過程，利用熱透鏡顯微鏡等對(duì)每個(gè)柱上環(huán)狀 分布的珠粒表面直接進(jìn)行局部分析。由此，可以進(jìn)一步縮短分析時(shí)間，分
析時(shí)間總共可以縮短5~10分鐘左右。
接著，圖6示意地表示本發(fā)明的免疫分析微芯片的布置(layout)的一 例。芯片主體(1)由玻璃基板和蓋板構(gòu)成，在玻璃基板上形成相當(dāng)于主流 路(2)、輔助流路(3、 4)的槽，同時(shí)形成相當(dāng)于洗滌液用貯槽(6)和第 二抗體溶液用貯槽(7)的凹部。
另外，主流路(2)上多處配置有柱區(qū)域(5)，其中作為在光固化性樹 脂內(nèi)均勻保持有珠粒的微小結(jié)構(gòu)物的柱狀的柱沿槽的深度方向林立。但是， 在流路壁和柱之間具有空隙，按照不妨礙液體流下的方式形成。在各個(gè)柱 區(qū)域(5)上通過制成均勻保持有顏色和/或固定化的第一抗體不同的珠粒 的柱狀的柱，可以對(duì)各個(gè)區(qū)域不同的樣品和/或以不同的視覺識(shí)別性一次性 地進(jìn)行分析。
而且，主流路(2)的一端與在蓋板上形成的試樣導(dǎo)入口 (11)和與其 對(duì)應(yīng)的凹部相連通，同時(shí)另一端與廢液用槽(8)相連通。在與所述試樣導(dǎo) 入口 (11)相對(duì)應(yīng)的凹部上連通有2個(gè)輔助流路(3、 4)。這些輔助流路(3、 4)的另一端側(cè)分別連通于洗滌液用貯槽(6)和第二抗體溶液用貯槽(7)。
使用微型注射器或移液管將含有樣品的試樣導(dǎo)入試樣導(dǎo)入口 (11)。由 于主流路(2)比輔助流路(3、 4)粗很多，因此所導(dǎo)入的試樣不會(huì)侵入輔 助流路(3、 4)，而是利用毛細(xì)管現(xiàn)象流入主流路(2)內(nèi)。試樣向主流路 (2)內(nèi)的導(dǎo)入結(jié)束后，用栓等封閉試樣注入口 (11)。
在與洗滌液用貯槽(6)和第二抗體溶液用貯槽(7)相對(duì)應(yīng)的蓋板區(qū) 域配置由氣密性的彈性體構(gòu)成的隔膜(9、 10)，在想要將洗滌液或含有第 二抗體的第二抗體溶液導(dǎo)入主流路(2)時(shí)，擠壓相對(duì)應(yīng)的隔膜(9、 10)， 使貯槽(6、 7)內(nèi)的液體流下。如上所述，由于試樣導(dǎo)入口 (11)已被封 閉，通過加減隔膜(9、 10)的擠壓，可以控制洗滌液或第二抗體溶液在主 流路(2)內(nèi)的位置。
另一方面，由于蓋板的至少對(duì)應(yīng)于柱區(qū)域(5)的部分被作成透明的， 因此可以從外部觀察在所述區(qū)域?qū)氲娜芤旱娘@色等。另外，圖6的方式 中，為了提供在芯片內(nèi)預(yù)先作成貯槽或排液槽的檢查試劑盒，對(duì)對(duì)應(yīng)于1 個(gè)芯片設(shè)有1個(gè)主流路(2)進(jìn)行了說明，但關(guān)于與樣品的導(dǎo)入排出同樣地 使用移液管等手動(dòng)地進(jìn)行試劑或洗滌液的導(dǎo)入排出的設(shè)想的芯片，優(yōu)選如 圖7所示，對(duì)應(yīng)于1個(gè)芯片主體(1)，也可以配置多根分別設(shè)有試樣等導(dǎo) 入口 (12)和試樣等排出口 (13)的含有柱區(qū)域(5)的主流路(2)，可以 同時(shí)平行地進(jìn)行多種免疫分析。如圖7所示，通過將柱區(qū)域(5)集中配置 在由蓋玻片構(gòu)成的檢測窗(14)部，與圖5等所例示的配置相比，可以將 芯片的外形尺寸控制在很小，使相對(duì)于顯微鏡等檢測體系的位置對(duì)準(zhǔn)、操 作性等提高，從而更為優(yōu)選。
另外，本發(fā)明的免疫分析微芯片由于在不妨礙操作的范圍內(nèi)將各柱周 圍的流路部體積設(shè)定為很小，因此即使不導(dǎo)入停止底物氧化還原反應(yīng)的試 劑，在導(dǎo)入第二抗體溶液后IO分鐘左右，通過底物與反應(yīng)產(chǎn)物的限速轉(zhuǎn)移 顯色穩(wěn)定在規(guī)定的水平，因此不受分析的時(shí)間依賴性的制約，分析結(jié)果不 會(huì)受分析者的技巧等的很大影響。
實(shí)施例 (實(shí)施例1)
以下是將本微芯片用于心臟疾病標(biāo)記物即人腦性鈉利尿肽BNP的檢測 的例子。作為固定化于珠粒的第一抗體、抗原、酶標(biāo)記第二抗體，分別使 用由鹽野義制藥提供的BC203、 BNP、 Fab，-HRP。
作為操作順序，利用毛細(xì)管現(xiàn)象將結(jié)合有第一抗體的珠粒與光固化性 樹脂溶液(10(HiL的ENTG-2000、 lOOpL水、l^L引發(fā)劑苯偶姻乙醚)混 合制備的混合溶液導(dǎo)入微通道內(nèi)，用光掩模在沒有ND濾光片、物鏡4倍 下進(jìn)行照射時(shí)間為4秒的曝光。
將未固化的光固化性樹脂溶液從微通道中除去，為了防止蛋白質(zhì)非特 異性地結(jié)合于珠粒等上，利用1%牛血清白蛋白BSA和磷酸緩沖生理鹽水 PBS的封閉液2pL對(duì)微通道內(nèi)部的珠粒柱進(jìn)行處理。該封閉處理需要的時(shí) 間約為60分鐘。
接著，將上述抗原(相當(dāng)于樣品)和第二抗體溶液2pL導(dǎo)入微通道內(nèi)。 考慮到與固定化在珠粒上的第一抗體反應(yīng)的時(shí)間，在此狀態(tài)下保持10分鐘。 之后，利用0.01%聚氧單月桂酸酯Tween20和PBS的混合溶液10pL，進(jìn)行
微通道內(nèi)的洗滌。
之后，導(dǎo)入SAT Blue氧化還原系顯色試劑2pL，使其與固定化在珠粒 上的第一抗體-抗原-酶標(biāo)記第二抗體的檢測體系接觸，利用酶標(biāo)記的氧化還 原反應(yīng)使其顯色為藍(lán)色。其結(jié)果示于圖5。圖5中，沿著微通道，條紋狀陰 影表示的部分為配置有珠粒柱的區(qū)域，在整個(gè)流路寬度上呈現(xiàn)藍(lán)色。
使用熱透鏡顯微鏡對(duì)從圓柱狀結(jié)構(gòu)物浸出至其周圍的流路部、在呈藍(lán) 色的流路部與酶反應(yīng)的試劑進(jìn)行檢測。在0.1~1000pg/mL的范圍內(nèi)改變導(dǎo) 入的抗原的濃度，重復(fù)進(jìn)行以上的處理，縱軸取熱透鏡顯微鏡的輸出信號(hào) 強(qiáng)度、以校正曲線形式綜合的結(jié)果示于圖8。
結(jié)果，重現(xiàn)性高，其檢測限估計(jì)為10pg/mL左右。在心力衰竭診斷中， 將截止電平設(shè)定在100pg/mL，本實(shí)施例的檢測限被認(rèn)為足以滿足實(shí)際應(yīng) 用。
(實(shí)施例2)
另一方面，以下是將本發(fā)明用于朊蛋白的檢測的例子。 作為檢測體系，除了第一抗體使用T2、抗原使用rPrP、酶標(biāo)記第二抗 體使用T17之外，其它條件與上述實(shí)施例1相同。
結(jié)果示于圖9。檢測限估計(jì)每一次測定為4pg左右。雖然與所謂的檢測 限為60pg的ELISA法等同，但檢測時(shí)間相對(duì)于ELISA法的約4~5小時(shí)， 本發(fā)明20分鐘左右即可完成，因此認(rèn)為在實(shí)際使用上也具有充分的優(yōu)點(diǎn)。 (實(shí)施例3)
另外，還嘗試了代替使用通常的光刻法在基板上形成的流路，利用已 有或制備的毛細(xì)管(利用毛細(xì)管現(xiàn)象能夠?qū)胍后w的細(xì)管)、將所述管內(nèi)己 有的管內(nèi)空間作為流路，來制備本發(fā)明的微小結(jié)構(gòu)物，制成免疫分析微芯 片。
毛細(xì)管的截面可以使用圓形、方形中的任一種。截面為圓形時(shí)，可以 使用直徑為50 100(^m范圍的毛細(xì)管，另一方面，截面為方形時(shí)，可以使 用邊長為50 100(Vm的范圍的毛細(xì)管。另外，對(duì)其材質(zhì)也無特別限定，可 以利用玻璃制材料、也可以利用塑料制材料。
但是，為了將毛細(xì)管作為用于制備本發(fā)明的微小結(jié)構(gòu)物的流路使用， 由于需要將微小結(jié)構(gòu)物形成圖案，因此需要相對(duì)于曝光所需程度的曝光光
波長具有透明度的材料。另外，從微小結(jié)構(gòu)物的圖案精度的觀點(diǎn)出發(fā)，應(yīng) 該避免使用具有極端復(fù)雜截面形狀的毛細(xì)管。
這里，圖IO示意地表示利用圓筒狀的毛細(xì)管時(shí)的微小結(jié)構(gòu)物的配置的 一個(gè)例子。圖10 (a)為從一側(cè)開放端側(cè)看毛細(xì)管的側(cè)視圖、圖10 (b)為 從在管內(nèi)成形的微小結(jié)構(gòu)物的曝光軸方向看毛細(xì)管的正視圖、圖10 (c)為 毛細(xì)管的立體圖。
另外，使用內(nèi)徑為63(Him (外徑為90(Him)、軸線長為32mm、管內(nèi)容 量為10pL的、在兩側(cè)具有開放端部(16)的毛細(xì)管(15)。但是，圖10 不過是示意圖，并未嚴(yán)密地反應(yīng)尺寸比等。
具體地說，第一抗體采用鼠抗人IgE單克隆抗體(Beckman Coulter公 司制)、抗原采用人IgE (Yamasa公司制)、酶標(biāo)記第二抗體采用HRP-抗人 IgE抗體(Goat-Poly) (KPL公司制)，按照以下的操作順序，在毛細(xì)管內(nèi) 制造本發(fā)明的微小結(jié)構(gòu)物。
在光固化性樹脂液中混合懸浮有固定了第一抗體的珠粒的液體中，浸 漬毛細(xì)管的一端，利用毛細(xì)管的毛細(xì)管現(xiàn)象，將所述光固化性樹脂液導(dǎo)入 管內(nèi)后，對(duì)準(zhǔn)管外側(cè)欲配置微小結(jié)構(gòu)物的位置來配置光掩模，用無濾光片、 物鏡倍率為4倍的光學(xué)體系照射照射光量調(diào)節(jié)為55mW/cn^的光3秒鐘， 使規(guī)定區(qū)域的光固化性樹脂固化，將成為光掩模陰影的區(qū)域的未固化光固 化性樹脂液排出除去。
在曝光了的區(qū)域，光固化的樹脂作為微小結(jié)構(gòu)物(17)以橫切毛細(xì)管 (15)內(nèi)流路的形式保留。顯示其樣子的顯微鏡照片為圖11。如圖ll所示， 沿著光掩模圖案的截面形狀的三維結(jié)構(gòu)物(17)保留在毛細(xì)管(15)內(nèi)。 但是，通過調(diào)節(jié)曝光用光源的照射光量或曝光時(shí)間，光固化性樹脂進(jìn)行固 化的深度發(fā)生變化，因此與利用毛細(xì)管形狀的衍射效果互相作用，不限于 光掩模圖案的圓柱或棱柱到達(dá)毛細(xì)管相反側(cè)側(cè)面，也可以形成附著管內(nèi)表 面的泡樣形狀的三維結(jié)構(gòu)物(圖IO左側(cè)呈現(xiàn)白色的區(qū)域)。選擇這種三維 結(jié)構(gòu)體形狀時(shí)，具有流路阻力變小、試劑或樣品等液體的導(dǎo)入、排出變得 容易的優(yōu)點(diǎn)。
通過向含有該三維結(jié)構(gòu)物的毛細(xì)管中，導(dǎo)入1%牛血清白蛋白BSA和 磷酸緩沖生理鹽水PBS的封閉液IO]liL并保持60分鐘而實(shí)施封閉處理后，
同樣利用毛細(xì)管現(xiàn)象導(dǎo)入上述抗原(人IgE (Yamasa公司制))和第二抗體 溶液(HRP-抗人IgE抗體(Goat-Poy) (KPL公司制))10pL并保持10分 鐘，進(jìn)而用0.01%的聚氧單月桂酸酯Tween20和PBS的混合溶液10pL進(jìn) 行洗滌，導(dǎo)入SATblue氧化還原系顯色試劑10nL并保持IO分鐘，結(jié)果通 過目視可以確認(rèn)藍(lán)色的顯色。 (實(shí)施例4)
分別準(zhǔn)備與實(shí)施例3相同的固定化有第一抗體的橙色珠粒和白色珠粒， 通過與實(shí)施例3同樣的方法，分別在不同的毛細(xì)管內(nèi)制備三維結(jié)構(gòu)物。通 過向這些毛細(xì)管中，導(dǎo)入1%牛血清白蛋白BSA和磷酸緩沖生理鹽水PBS 的封閉液lOpL并保持60分鐘而實(shí)施封閉處理后，同樣利用毛細(xì)管現(xiàn)象導(dǎo) 入上述抗原(人IgE (Yamasa公司制))和第二抗體溶液(HRP-抗人IgE 抗體(Goat-Poly) (KPL公司制))10pL并保持10分鐘，進(jìn)而用0.01%的 聚氧單月桂酸酯Tween20和PBS的混合溶液lOpL進(jìn)行洗滌，導(dǎo)入SAT blue 氧化還原系顯色試劑10pL并保持10分鐘。
結(jié)果，盡管導(dǎo)入有白色珠粒的毛細(xì)管的顯色強(qiáng)度與導(dǎo)入有橙色株粒的 毛細(xì)管的顯色強(qiáng)度作為物理量相同，但與導(dǎo)入有白色珠粒的毛細(xì)管的顯色 相比，導(dǎo)入有橙色珠粒的毛細(xì)管的顯色由于珠粒與試劑的色對(duì)比度鮮明， 因此視覺識(shí)別性優(yōu)異。
本發(fā)明提供通過向基板上通用的微通道(或通用的毛細(xì)管)中再制備 珠粒柱的三維結(jié)構(gòu)物，即使少量的樣品，也能夠迅速簡便且高靈敏度地進(jìn) 行檢測的免疫分析微芯片或免疫分析用芯片，或者使用該微芯片的免疫分 析方法。
另外，本發(fā)明提供通過使用熱透鏡顯微鏡等分析儀器來分析柱的反應(yīng) 產(chǎn)物，即使對(duì)極微量的試樣也可以進(jìn)行定量分析，同時(shí)由于利用珠粒著色 的視覺識(shí)別性提高，因此不僅能夠同時(shí)檢測多種樣品，而且對(duì)于除極低濃 度的情況外的低濃度范圍的樣品，可以在不需要使用特別分析儀器的情況 下靠目視檢測，以及可移動(dòng)性優(yōu)異的免疫分析微芯片或免疫分析用芯片。 另外，對(duì)于從實(shí)際使用的觀點(diǎn)出發(fā)敬而遠(yuǎn)之的放射性同位素、毒性物質(zhì)、 有感染性顧慮的物質(zhì)，可以將遭受傷害的可能性降到很低。
權(quán)利要求
1. 一種免疫分析微芯片，其具有在至少一部分上配置有微小結(jié)構(gòu)物的流路，其中所述微小結(jié)構(gòu)物是由表面上固定化了第一抗體的微細(xì)珠粒均勻分散保持于經(jīng)光固化的親水性樹脂中而形成的。
2. 權(quán)利要求l所述的免疫分析微芯片，其特征在于，所述微小結(jié)構(gòu)物 是通過對(duì)懸浮有所述微細(xì)珠粒的親水性光固化性樹脂溶液進(jìn)行曝光處理， 從而以任意形狀形成了圖案的結(jié)構(gòu)物。
3. 權(quán)利要求1所述的免疫分析微芯片，其特征在于，所述微小結(jié)構(gòu)物 是通過在對(duì)親水性光固化性樹脂溶液進(jìn)行曝光處理而形成了圖案的微小結(jié) 構(gòu)的周圍，對(duì)進(jìn)一步導(dǎo)入的懸浮有微細(xì)珠粒的親水性光固化性樹脂溶液進(jìn) 行曝光處理而形成了圖案的結(jié)構(gòu)物，其中所述微細(xì)珠粒的表面上固定化有 第一抗體。
4. 權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的免疫分析微芯片，其特征在于，所述 流路中沿著流路方向依次配置有微小結(jié)構(gòu)物，其中所述微小結(jié)構(gòu)物分散保 持有表面上固定化了第一抗體的色調(diào)不同的微細(xì)珠粒。
5. 權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的免疫分析微芯片，其特征在于，所述 流路是由在基板上形成的槽和至少包括開口部的蓋板形成的。
6. 權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的免疫分析微芯片，其特征在于，所述 流路的寬度為100[xm 5000^im、深度為50^mi 20(^m，且至少一部分含 有能夠使利用毛細(xì)管現(xiàn)象導(dǎo)入的液體沿流路方向流下的流路截面積的區(qū)域。 .
7. 權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的免疫分析微芯片，其特征在于，所述 流路為由至少包括開口部的毛細(xì)管的內(nèi)表面劃分而成的空間。
8. 權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的免疫分析微芯片，其特征在于，所述 流路是直徑為50um 1000um的圓柱狀或邊長為50um 1000um的棱柱狀，且是由至少包括開口部的毛細(xì)管內(nèi)表面劃分而成的空間。
9. 一種免疫分析用試劑盒，其將權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的免疫分析微芯片與含有經(jīng)標(biāo)記的第二抗體的溶液或含有經(jīng)標(biāo)記的抗原的溶液、洗 滌液以及含有底物的試劑溶液，以能夠?qū)胫了鑫⑿酒牧髀返姆绞桨b在一起。
10. —種使用撿查芯片的免疫分析方法，其中所述檢查芯片含有配設(shè)有微小結(jié)構(gòu)物的流路，該方法至少含有下述工序準(zhǔn)備含有至少1個(gè)流路的基板的工序；導(dǎo)入懸浮有表面上固定化了第一抗體的微細(xì)珠粒的親水性光固化性樹脂溶液，利用毛細(xì)管現(xiàn)象將所述親水性光固化性樹脂溶液填充至所述流路內(nèi)的工序；對(duì)填充在所述流路內(nèi)的所述親水性光固化性樹脂溶液的至少一部分，用任意圖案的光掩模進(jìn)行曝光的工序；保留通過曝光而固化的區(qū)域、將其它區(qū)域的未固化的所述親水性光固化性樹脂溶液從所述流路中除去，進(jìn)而向流路中導(dǎo)入封閉溶液的工序；至少將作為待測物質(zhì)的抗原與含有經(jīng)標(biāo)記的第二抗體的溶液或含有經(jīng) 標(biāo)記的抗原的溶液依次或同時(shí)導(dǎo)入至所述流路內(nèi)的工序；洗滌后，將含有底物的試劑溶液導(dǎo)入至所述流路內(nèi)的工序；和在規(guī)定時(shí)間后，檢測所述第二抗體或所述抗原與所述底物的反應(yīng)產(chǎn)物 的存在的工序。
11. 權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述流路含有開口部，其 寬度為100um 5000um、深度為50um 1000um，且使利用毛細(xì)管現(xiàn)象導(dǎo)入至開口部的液體沿流路方向流下。
12. 權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述流路為在基板上形成 的寬度為10(Him 500(^m、深度為50(im 200|_im的上部開放的槽，其是 通過被包括至少開口部的蓋板覆蓋而形成的。
13. 權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述流路包括開口部，是 由50jim 1000nm的圓柱狀或邊長為5(^m 1000^im的棱柱狀的細(xì)管的內(nèi) 表面劃分而成的空間，且使利用毛細(xì)管現(xiàn)象導(dǎo)入至開口部的液體沿流路方 向流下。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供免疫分析微芯片以及針對(duì)微量試樣的簡便、高靈敏度的免疫分析方法，其中所述免疫分析微芯片在微通道內(nèi)部制備有在抑制流路阻力的同時(shí)具有充足反應(yīng)面積的珠粒的微小結(jié)構(gòu)物，該目的是通過具有在其至少一部分上配置有微小結(jié)構(gòu)物的微通道的免疫分析微芯片及使用該微芯片的免疫分析方法實(shí)現(xiàn)的，其中所述微小結(jié)構(gòu)物為表面上固定化了第一抗體的微細(xì)珠粒均勻分散保持于經(jīng)光固化的親水性樹脂中而形成的。
文檔編號(hào)G01N35/08GK101389961SQ20068005345
公開日2009年3月18日 申請(qǐng)日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月26日
發(fā)明者宮川堅(jiān)次, 泉田仁, 渡慶次學(xué), 角田正也, 高寺貴秀 申請(qǐng)人:微化學(xué)技術(shù)有限公司;關(guān)西涂料株式會(huì)社