用于檢測真菌毒素的設備和方法

專利名稱：用于檢測真菌毒素的設備和方法
用于檢測真菌毒素的設備和方法
技術領域：
本發明涉及用于檢測真菌毒素的設備和方法并涉及適于實施所述 方法的試劑盒。
真菌毒素的檢測包括很多領域的應用，例如用于食品和飼料方面， 用于環境分析，用于農作物保護和用于生化研究。
真菌毒素是真菌產生的有毒物質，它們具有非常不同的化學結構。 真菌毒素在諸如谷物、含油種子和水果的收獲產物中被找到，而且可導
致人和動物中毒。到現在已有超過300種不同的真菌毒素^:鑒定出來，
其被分成約25種結構類型并表現出不同的毒性作用。根據毒素類型，
真菌毒素可導致急性或慢性中毒。真菌毒素的常規種類有黃曲霉毒素、 赭曲毒素、麥角生物堿、棒曲霉素和鐮刀霉毒素。鐮刀霉毒素中特別重
要的有脫氧瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、瓜萎鐮菌醇、T-2-mT2-毒素和 伏馬菌素，因為它們經常在谷物產品中被發現。因此，在谷倉、谷物貿 易和谷物加工部分(例如磨坊、麥芽坊、飼料生產商、農場、咨詢中心、 大學或政府部門，例如為了保證食品質量的消費者保護部門)中應當實 現針對真菌毒素的測試，例如針對田間真菌毒素(例如鐮刀霉毒素)或 針對貯藏真菌毒素的測試。
現有技術中已經公開了用于檢測真菌毒素的許多方法。例如通過色 譜方法(如HPLC),其可與基于熒光的吸收或質譜檢測聯用，來檢測 真菌毒素。例如，HPLC分析谷物樣品前，通常通過免疫親和柱濃縮并 純化分析物。所有基于HPLC的方法都投資額高、樣品處理相對復雜和 時間分析長的缺點。由于所述缺點，基于HPLC的檢測方法不適于快速、 廉價并簡單地分析諸如生產、存放、貿易或加工的谷物中的谷物樣品。
代之以在專門的分析實驗室中進行基于HPLC的分析。結果，在實踐中， 只能延遲幾天得到結果。
檢測真菌毒素的備選方法是ELISA (酶聯免疫吸附測試)技術。在 微滴定板上進行ELISA,微滴定板的孔用諸如特異性結合真菌毒素的捕 獲抗體涂覆。ELISA測試的缺點是有許多移液、洗滌和溫育步驟，這會 使分析時間相對較長，超過30分鐘。這限制了該測試在分析實驗室之 外的地點快速進行。而且，該測試不能同時檢測多種分析物，因為每個
微滴定板上通常只涂覆以 一種抗體。
檢測真菌毒素的另一種方法是側向流動測試(LFA)。通過LFA可檢 測真菌毒素，例如在硝化纖維條上進行直接竟爭性免疫測試，其中通過 毛細管力使要分析的樣品經過整個硝化纖維條。不利的是，該方法4義能 進行定性真菌毒素檢測。該測試的另一個缺點是每種真菌毒素需要單獨 的條。
現有技術還包括開發用于檢測真菌毒素的方法的研究，例如M. M. Ngundi等，Anal. Chem. 2005, 77, 148-154所述的。該方法包括通過 將赭曲毒素A固定在玻璃載片上來實現檢測赭曲毒素A的間接竟爭性 免疫測試。熒光標記的赭曲毒素A抗體和要確定的樣品的混合物上樣 于玻璃載片上，在通過洗滌去除未結合的抗體后對其讀數。不利的是， 該方法需要洗滌步驟和10至20分鐘的溫育時間，還需要復雜的熒光成 像系統來讀出結果。結果，在此基礎上不可能開發出能在分析實-瞼室外 的地點上進行的快速測試。
因此，由于要復雜的讀數設備，現有技術已知的檢測真菌毒素的方 法需要巨大投資額，包括許多手工步驟或不能在分析實驗室以外使用。
因此，本發明的目的是提供克服至少一個上述現有技術缺點的方 法，尤其是能以快速、廉價和容易實現的方式在樣品中檢測真菌毒素的 方法。
該目的通過用于快速檢測真菌毒素的方法實現，其包括以下步驟
a) 提供薄膜波導，其包括在第二光透明層(b)上的第一光透明波導 層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率，特異性和/或親和性結合配偶體作 為真菌毒素和/或結合配偶體的化學或生化識別元件以空間分離的方式 固定在該薄膜波導上，
b) 將含一種或多種真菌毒素的樣品和結合配偶體施加于所述薄膜 波導上固定的結合配偶體上，
c) 檢測由薄膜波導上固定的結合配偶體與樣品中的真菌毒素和/或 與結合配偶體的相互作用產生的消逝場中的信號，
d) 確定樣品中存在的一種或多種真菌毒素的量。 本發明的另一主題在于用于實施檢測真菌毒素的方法的設備。 進一步的主題是適于實施用于檢測真菌毒素的方法的試劑盒。 本發明其他有益的實施方案來源于從屬權利要求。
令人驚訝的是，發現本發明用于檢測真菌毒素的方法可容易地并在 專門的分析實驗室以外進行。這使本發明的方法能通過快速測試來進 行，而無需將樣品轉送分析實驗室。而且有利的是，根據本發明方法所 述的真菌毒素檢測僅需很少或者無需洗滌步驟。這是特別有利的，因為 進行洗滌步驟是耗時的，推遲了分析結果的獲得，并可能歪曲分析結果， 或者尤其在較不小心或不適當地進行后者的時候，甚至使沖企測完全不可 能進行。
綜合本發明方法的有利性質，使得能在諸如谷倉、谷物貿易和谷物 加工場所中的食品中檢測真菌毒素。該方法尤其能方便而快速地進行， 這甚至能使不是專家實驗室的專門分析員的個人都能實現所迷方法。
在該方法的優選實施方案中，作為薄膜波導使用基于薄膜波導的消 逝場生物芯片(優選是基于薄膜波導的平面光波導生物芯片)。
光波導是一類信號換能器，其能用于檢測與波導層(通常是電介質) 接觸的介質的光學性質的改變。當光以引導模式傳入波導層時，光場在 介質/波導分界面上并不陡然下降，而是在鄰接于波導的所謂檢測介質中 指數衰減。該指數衰減的光場被稱為消逝場。用合適的測量裝置能檢測 消逝場內與波導層接觸的介質的光學性質的改變。
波導用作信號換能器是有利的，因為對于在波導分界面上固定的識 別元件的情況，在波導內的分界面上檢測介質光學性質改變的時候，能
;險測所述識別元件的結合或反應。
因此，在實施所述檢測時可能節約時間并簡化過程。
因此，通過改變直接在信號換能器或薄膜波導表面上的例如要分析
的樣品的介質光學性質，例如通過吸收、熒光、磷光、發光等的變化，
能檢測到信號或標記的元件。
優選檢測消逝場中的熒光信號。根據本發明用于標記結合配偶體 (例如真菌毒素、真菌毒素綴合物、抗體綴合物或抗體)的標記元件優
選是有機熒光團、納米顆粒、熒光納米顆粒、珠、熒光珠、熒光蛋白質
或其他發出信號分子或單位或者各種標記元件的任意組合。優選使用以
能發光的方式標記的結合配偶體。優選的標記元件是有機熒光團和/或萸
光蛋白質。
根據本發明的方法，優選熒光標記的結合配偶體可受消逝場激發。 在優選的實施方案中，消逝場由Duveneck等的US 5, 959， 292所述的
平面光波導產生。用合適的裝置能檢測各向同性發出的熒光。在其他實
可通過合適的光學裝置來檢測:'' 尤其有利的是，優選在檢測信號前可限制或甚至完全省去洗掉熒光 標記的結合配偶體或者含標記的結合配偶體的樣品或溶液。因為也可省 去提供的洗滌規程中通常使用的各種緩沖溶液，所以這能節約時間并以 簡化的方式檢測真菌毒素。
可用的薄膜波導優選包括光透明波導層(a),其包括氧化物，選自包 括Ti02、 ZnO、 Nb205、 Ta205、 Hf02和/或Zr02的組，優選選自包括 Ti02、 Ta205和/或1%205的組。光透明波導層(a)優選由Ti02、 ZnO、 Nb2〇5、 Ta205、 Hf02或Zr02制成，優選由Ti02, Ta205或Nb205制成。 五氧化鉭經證實是特別有利的，尤其是用于檢測熒光信號。
在一個優選實施方案中，向薄膜波導上，尤其向包括氧化物的光透 明波導層(a)上，所述氧化物選自包括Ti02、 ZnO、 Nb205、 Ta205, 、 Hf02 和/或Zr02的組，施加單或多層下式(I)的有枳〃疇酸
R-OP03H2 (I)
和/或下式(II)的有機膦酸
R-P03H2 (n)
和/或它們的鹽，其中
R是Cio至C24貌基。
優選可用的有有機磷酸和/或有機膦酸，更優選有機磷酸鹽和/或有 機膦酸鹽，其中R選自包括無支鏈的 C1()至C2o烷基的組，優選選自 包括無支鏈的C12至ds烷基的組，優選選自包括十二烷基磷酸、十 二烷基磷酸鹽、十八烷基膦酸鹽和/或十八烷基膦酸的組。
優選可用的是有機磷酸或有機磷酸鹽，其通過水溶液中的水溶性鹽 的形式來施加于薄膜波導上。
在優選的實施方案中，有機磷酸和/或有機膦酸(優選有機磷酸鹽) 以單層的方式施加于薄膜波導，特別是消逝場生物芯片，優選是平面光 波導生物芯片。它們可通過浸涂方法來施加。
該單層可作為粘著促進層施加于由氧化物構成的光透明層。有利的 是，有機磷酸和/或有機膦酸能與識別元件(尤其與蛋白質或與蛋白質偶 聯的識別元件)相互作用，并增強所述識別元件與生物芯片的結合。
可用的結合配偶體優選選自包括抗真菌毒素抗體、抗真菌毒素抗體 綴合物、真菌毒素、真菌毒素綴合物、抗真菌毒素抗體片段、真菌毒素
結合肽、真菌毒素結合性抗運載蛋白(Anticaline)、真菌毒素結合性適 體、真菌毒素結合性適配子和/或真菌毒素結合性印跡聚合物的組，優選 選自包括抗真菌毒素抗體、抗真菌毒素抗體綴合物、真菌毒素和/或真菌 毒素綴合物的組。
結合配偶體在各種情況下特異地與和/或親和性地與各其他結合配 偶體相互作用。例如，施加于薄層波導上的抗真菌毒素抗體親和性地與 固定在所述薄膜波導上的真菌毒素結合。同樣，固定在薄膜波導上的抗 真菌毒素抗體親和性地與用于所述薄層波導上的真菌毒素或真菌毒素 綴合物結合。結合特異性在此取決于所用的親和性配偶體。因此，可用 的交叉反應性抗真菌毒素抗體親和性地與諸如伏馬菌素類的相應真菌 毒素結合，但特異性不如諸如抗伏馬菌素Bl的特定抗體。固定的結合 配偶體也被稱為識別元件或"捕獲分子"。
可從諸如蛋白質和抗真菌毒素抗體或真菌毒素中形成抗真菌毒素 抗體綴合物和真菌毒素綴合物。
在優選的實施方案中，例如在間接竟爭性測試中，固定的結合配偶 體是真菌毒素綴合物。真菌毒素綴合物優選由結合至蛋白質(例如牛血 清白蛋白(BSA))的真菌毒素形成。使用該真菌毒素-BSA綴合物的特 定益處是以下事實，即真菌毒素與薄膜波導的結合能通過蛋白質和有機 磷酸和/或有機膦酸間的相互作用增強。這可改善識別元件與所述薄膜波 導的粘著。
標記元件(例如熒光染料或熒光團)可直接與結合配偶體結合， 例如與抗真菌毒素抗體或真菌毒素結合，或通過間隔元件(例如蛋白質 或烷基鏈或聚乙二醇鏈)連接。標記元件(例如熒光染料或熒光團)優 選通過蛋白質與真菌毒素結合。合適蛋白質的例子是BSA。熒光團通過 BSA與真菌毒素的結合可顯著改善標記元件與結合配偶體(例如抗體) 的結合。另一個益處在于，可以由此避免用于將例如熒光團直接結合到 真菌毒素的復雜方法。例如，用于直接竟爭性測試中的針對固定的抗真 菌毒素抗體的優選結合配偶體是熒光標記的真菌毒素-BSA綴合物。
真菌毒素原則上可在樣品、溶液或其他介質中檢測，其都可施加于 薄膜波導上。在優選的實施方案中，樣品是人或動物的食物。優選根據
本發明的方法，在谷類、谷類產品、酒、果汁或水果和/或含谷類、酒、 果汁和/或水果的產品中檢測真菌毒素。要分析的樣品(例如食品或產品) 在本文中可施加于薄膜波導上，或用溶劑或溶劑混合物提取出來并使用 提取出的提取物。所迷提取物可以稀釋或濃縮的方式使用。
真菌毒素可通過與溶劑或溶劑混合物處理而從要研究的樣品(例如 谷物或其他食品)中取出。例如，真菌毒素可通過研磨并接著用水或有 機溶劑或溶劑混合物提取而從谷物樣品中取出，例如使用水(視需要可 以與緩沖物質、鹽、酸或堿和其他添加劑混合)和有機溶劑的混合物， 例如使用水和甲醇或乙醇或水和乙腈的混合物。其他提取真菌毒素的方 法對普通技術人員來說是已知的。然后所得的溶解的真菌毒素直接或在 稀釋或濃縮后在薄膜波導或芯片上分析。
可用的識別元件被稱為"捕獲分子"，其優選選自包括抗真菌毒素抗 體、抗真菌毒素抗體綴合物、真菌毒素和/或真菌毒素綴合物的組，優選 是兩種或更多的不同物質，其可以共價或通過諸如疏水吸附非共i"介固定 于薄膜波導表面或芯片表面上。例如，將識別元件通過被稱為點的測量 場方式施加于薄膜波導表面或芯片表面，來固定它們，該方法也凈皮稱為 點樣。優選進行溶液(優選含有作為識別元件的一種或多種結合配偶體 的緩沖溶液)點樣，其通過被稱為點樣儀的自動應用設備實施。優選在 點樣后溫育薄膜波導或芯片至少1小時(優選數小時)，從而能使識別 元件粘附在所述薄膜波導或芯片上。
優選在點樣后用蛋白質溶液(優選可用的封閉蛋白質
(Blocking-Proteins)溶液，例如BSA)處理生物芯片至少1小時，優 選2小時至6小時，特別優選3小時至4小時。去除溶液后，干燥并 存儲薄膜波導或生物芯片。
樣品和優選的熒光標記的結合配偶體可同時或先后地施加于薄膜
波導(優選消逝場生物芯片，優選平面光波導生物芯片)上固定的識別 元件。因此在溫育樣品(例如芯片上的提取物)之前或期間，可能要加 入優選的熒光標記的結合配偶體，例如針對一種或多種真菌毒素的 一種 或多種優選熒光標記的真菌毒素、真菌毒素綴合物或抗體。例如，也可 能將要分析的樣品提取物以與針對 一種或多種真菌毒素的優選標記的、 更優選熒光標記的真菌毒素、真菌毒素綴合物或抗體的混合物形式施加 于芯片上。
特別有利的是，根據本發明的方法，樣品可與用作薄膜波導上化學
或生化識別元件的固定的結合配偶體和/或結合配偶體溫育小于15分 鐘，優選小于IO分鐘，尤其優選小于5分鐘，然后檢測信號。
這些使得大大優于已知的方法，所述方法需要溫育時間，其中所施 加的真菌毒素綴合物與標記的真菌毒素抗體溶液有時要花多至2小時， 或者大大優于需要讓樣品與標記的抗真菌毒素抗體預先溫育的方法。相 對于已知的方法，這能通過本發明的方法快得多地確定真菌毒素，更具 體的，溫育時間被顯著縮短。在尤其優選的實施方案中，溫育時間可小 于10分鐘或甚至僅有5分鐘。尤其在綜合了能省去洗滌步驟的其他益 處的情況下，這能使本發明的方法在小于20分鐘(優選小于15、特 別優選小于IO分鐘)內產生結果。
利用本發明的方法，可定量并優選只有4艮小差異地測定真菌毒素。 例如，所謂"實驗室間差異系數"——重復性的量度，可小于50%,優選 小于40%。而且，所謂"實驗室間差異系數"——重復性的量度，可小于 20%。這能使本發明的方法在標準化和簡單的方法框架內使用，來用于 確定食品(例如谷物、谷物產品或酒)中的真菌毒素。
可檢測的真菌毒素優選選自包括黃曲霉毒素、赭曲毒素、麥角生物 堿、棒曲霉素和/或鐮刀霉毒素的組，例如選自包括脫氧瓜萎鐮菌醇、 瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲毒素A和/ 或伏馬菌素的組。伏馬菌素優選選自包括伏馬菌素Bl、伏馬菌素B2和 /或伏馬菌素B3的組。
因此，可用的結合配偶體優選選自包括黃曲霉毒素、赭曲毒素、麥 角生物堿、棒曲霉素和/或鐮刀霉毒素的真菌毒素組，例如選自包括脫氧 瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲 毒素A和/或伏馬菌素的組，而真菌毒素抗體選自包括黃曲霉毒素、赭 曲毒素、麥角生物堿、棒曲霉素和/或鐮刀霉毒素的組，例如選自包括脫 氧瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素和/ 或伏馬菌素的組。
根據所用的免疫測試類型，將結合配偶體(例如間接竟爭性免疫測 試情況下一種或多種真菌毒素)作為識別元件固定在薄膜波導上，而另 外的結合配偶體(例如間接竟爭性免疫測試情況下一種或多種抗真菌毒 素抗體)在使用樣品前或與樣品同時上樣于薄膜波導。加入的結合配偶
體在此優選經可發光標記，優選經熒光團標記。
可用的結合配偶體優選選自包括脫氧瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉
米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲毒素A和/或伏馬菌素Bl、 伏馬菌素B2和/或伏馬菌素B3的組，而真菌毒素抗體選自包括脫氧瓜 萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲 毒素A和/或伏馬菌素Bl、伏馬菌素B2和/或伏馬菌素B3的組。
本文可優選使用針對真菌毒素的單克隆抗體，例如抗伏馬菌素Bl、 抗伏馬菌素B2或抗伏馬菌素B3。也可用用于抗伏馬菌素類的抗體。 可用的結合配偶體(優選針對真菌毒素的抗體)可單獨或混合使用，而 且還可能使用交叉反應性抗體。
本發明方法的特定益處源于以下事實，即本發明的方法能以提高的 靈敏度檢測真菌毒素。例如，尤其在人或動物食品中，例如在谷物、酒、 果汁、水果和/或其產品中，或在所述食品或產品的提取物中，甚至可以 檢測納摩爾或皮摩爾真菌毒素濃度范圍的真菌毒素。例如，在谷類提取 物中，甚至可以檢測0.1 pM至100nM真菌毒素范圍內(優選lpM至 lnM真菌毒素范圍內)的真菌毒素。更具體的，可以檢測的濃度小于1 nM，優選小于100pM的真菌毒素，優選小于10pM真菌毒素，尤其 優選小于1 pM真菌毒素。
而且，在谷類提取物中可檢測lO"ppb至10 000 ppb真菌毒素范圍 內的真菌毒素，在谷物中是10^ppb至10 000 ppb真菌毒素范圍內的真 菌毒素。在谷類提取物中優選可檢測^0.1 ppb真菌毒素范圍內的真菌毒 素，優選SO.Ol ppb真菌毒素范圍內的，特別優選^10^ppb真菌毒素 范圍內的真菌毒素，在谷物中是SO.l ppb真菌毒素范圍內的，優選￡0.01 ppb真菌毒素范圍內的，特別優選^l()4ppb真菌毒素范圍內的真菌毒 素。
這使得能在分析實驗室外比迄今可能的方法更準確地確定食品中 所含的真菌毒素。
本發明的方法使得能檢測至少2種真菌毒素，優選2至IOOO種真 菌毒素，優選5至IOO種真菌毒素。特別是可同時確定多種真菌毒素。 這大大優于已知的方法，所述方法大部分僅能在同時檢測單一真菌毒 素。
用于檢測真菌毒素的方法的優選實施方案提供了以空間分離的方
式在薄膜波導表面上固定特異性和/或親和性結合配偶體作為真菌毒素 和/或結合配偶體的化學或生化識別元件，所述薄膜波導包括在第二光透
明層(b)上的第一光透明波導層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率。然后， 同時或先后加入要分析的樣品和優選的熒光團標記的結合配偶體。固定 在薄膜波導上的結合配偶體、樣品中的真菌毒素和/或優選的熒光團標記 的結合配偶體之間的特異性和/或親和性相互作用，可以作為消逝場中的 信號編號而檢測。樣品中存在真菌毒素導致在消逝場產生信號的變化。
根據本發明，可通過測試來檢測真菌毒素，例如在芯片上的免疫測 試。優選通過免疫測試(優選竟爭性免疫測試)來實施真菌毒素的檢測， 例如有直接或間接竟爭性免疫測試，尤其優選通過間接竟爭性免疫測試 來實施。
用于通過直接竟爭性免疫測試檢測真菌毒素的方法的優選實施方 案可以構思為以空間分離的方式在薄膜波導表面上固定抗真菌毒素抗 體作為真菌毒素的化學或生化識別元件，所述薄膜波導包括在第二光透 明層(b)上的第一光透明波導層(a)，其中(b)具有比(a)低的折射率。然后， 與要分析的樣品同時或在其之前加入優選的熒光團標記的真菌毒素或 優選的熒光團標記的真菌毒素-BSA綴合物。固定在薄膜波導上的抗真 菌毒素抗體、樣品中的一種或多種真菌毒素和/或優選用焚光團標記的真 菌毒素或真菌毒素-BSA綴合物之間的相互作用，可以作為消逝場中的 信號改變進行檢測。
在直接竟爭性免疫測試的情況下，優選在芯片表面上通過諸如點樣 來共價或非共價固定兩種或多種不同抗真菌毒素抗體。例如，如果將要 研究的樣品的提取物與優選熒光標記的真菌毒素或真菌毒素綴合物的 混合物上樣于芯片，就能使所述標記的或未標記的真菌毒素或真菌毒素 綴合物竟爭所述芯片上可供使用的抗體結合位點。在芯片上溫育提取物 之前或期間，可加入焚光標記的真菌毒素。結合至固定的抗體的標記的 真菌毒素的量與提取物中存在的真菌毒素的量成反比。
也可通過夾心測試(Sandwich-Assay)進行^r測。在這種情況下，使用 標記的檢測抗體，而不是4吏用標記的真菌毒素或真菌毒素綴合物，所述 經標記的檢測抗體結合到由固定在芯片上的抗體和真菌毒素組成的固 定復合物上。在夾心測試中，結合至抗體的熒光團的量與提取物中的真 菌毒素濃度成正比。
用于通過間接竟爭性免疫測試檢測真菌毒素的方法的另 一種優選
的實施方案可構思為以空間分離的方式在薄膜波導表面上固定真菌毒 素或優選用熒光團標記的真菌毒素-BSA綴合物作為化學或生化識別元 件，所述薄膜波導包括在第二光透明層(b)上的第一光透明波導層(a)，其 中(b)具有比(a)低的折射率。然后，與要分析的樣品同時或在其之前加入 優選用熒光團標記的抗真菌毒素抗體。固定在薄膜波導上的真菌毒素或 優選用熒光團標記的真菌毒素-BSA綴合物、樣品中的一種或多種真菌 毒素和/或優選用熒光團標記的抗真菌毒素抗體之間的相互作用，可以作 為消逝場中的信號改變進行檢測。
根據本發明，也可通過間接竟爭性免疫測試4企測真菌毒素。在這種 情況下，可在芯片上固定真菌毒素或真菌毒素綴合物，例如真菌毒素-蛋白質綴合物，優選真菌毒素-BSA綴合物。如果將要研究的樣品提取 物與優選用熒光標記的抗真菌毒素-抗體的混合物上樣于芯片，就能使固 定的真菌毒素和存在于溶液中的真菌毒素竟爭熒光標記的抗體可供使 用的結合位點。在芯片上溫育提取物之前或期間，可加入熒光標記的抗 真菌毒素抗體。在這種情況下，被結合的標記抗體的量與提取物中存在 的真菌毒素的量成反比。
另外有利的是，可通過讀數設備檢測消逝場中的信號。例如，所述 讀數設備可以是耐用而廉價的讀數設備。
可用合適的軟件評估信號強度(例如熒光強度)并計算樣品中存在 的真菌毒素的量。
尤其在綜合了方法易于實現、可能同時并定量地在耐用而廉價的讀 數設備上檢測數種真菌毒素的情況下，本發明的方法提供的益處使得能 在分析實驗室以外簡單而快速地檢測真菌毒素。
本發明的另 一主題在于用于實施用于檢測真菌毒素的方法的設備。
實施用于檢測真菌毒素的方法的設備有薄膜波導，優選有基于薄膜 波導的平面光波導生物芯片，所述薄膜波導包括在第二光透明層(b)上的 第一光透明波導層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率。識別元件優選固 定于層(a)上。
合適的平面光波導的例子在WO 01/92870或US 5, 959, 292中有描述。
在設備的優選實施方案中，薄膜波導(優選平面光波導生物芯片)
的光透明層(b)，可由諸如玻璃或石英的硅酸鹽或由透明塑料(優選選自 包括聚碳酸酯、聚酰亞胺、聚曱基丙烯酸酯、聚苯乙烯、環狀聚烯烴和 /或環狀聚烯烴共聚物的組)制成，優選由環狀聚烯烴或環狀聚烯烴共聚 物制成。適于制備光透明層(b)的塑料的例子在WO 03/020488中有描述。
優選的是透明熱塑性塑料或可注射塑料，例如選自包括聚碳酸酯， 聚酰亞胺，丙烯酸酯(尤其是聚曱基丙烯酸甲酯)、或聚苯乙烯的組。
在設備的優選實施方案中，光透明波導層(a)可包括氧化物，所述 氧化物選自包括Ti02、 ZnO、 Nb205、 Ta205、 Hf02和/或Zr02的組， 優選選自包括Ti02、 Ta205和/或Nb205的組。也可用幾種這類氧化物 的組合。優選光透明波導層(a)由Ti02、 ZnO、 Nb205、 Ta205、 Hf02或 Zr02 (優選Ti02、 Ta20s或Nb205)制成。4吏用五氧化鉭經證實是尤其 有益的。
在優選的實施方案中，薄膜波導，尤其在含選自包括丁102、 ZnO、 Nb205、 Ta205、 Hf02和/或Zr02的組的氧化物的光透明層上，包括單 或多層下式(I)的有機磷酸，
R-OP03H2 (I)
和/或下式(n)的有機膦酸
R-P03H2 (II)
和/或它們的鹽，其中 R是Cio至C24坑基。
優選可用的是有機磷酸和/或有機膦酸，優選是有機磷酸鹽和/或有
機膦酸鹽，其中R選自包括無支鏈的 C1Q至C2o烷基的組，優選選自 包括無支鏈的C12至C!s烷基的組，優選選自包括十二烷基磷酸、十 二烷基磷酸鹽、十八烷基膦酸鹽和/或十八烷基膦酸的基團。
優選的是有機磷酸或有機磷酸鹽，其通過水溶液中水溶性鹽的方式 施加于薄膜波導。
在優選的具體實施方案中，有機磷酸和/或有機膦酸(優選有機磷酸 鹽)以單層方式施加于薄膜波導，尤其是消逝場生物芯片，優選平面光 波導生物芯片。
該單層可以作為粘著促進層施加于由氧化物制備的光透明層。有利 的是，有機磷酸和/或有機膦酸能與識別元件(尤其與結合在載體蛋白質 上的識別元件)相互作用，并增強所述識別元件與生物芯片的結合。 在設備的優選形式中，有機磷酸和/或有機膦酸(優選有機磷酸鹽) 以粘著促進層形式施加于薄膜波導，優選施加于由氧化物制備的光透明 層。所述粘著促進層可增強識別元件對薄膜波導或生物芯片的結合。
優選粘著促進層具有小于200nm、優選小于20 nm的厚度。 激發光優選通過使用一種或多種格柵結構而耦合進光透明波導層
(a)。
所述格柵結構優選是具有任何剖面的凹凸格柵(Reliefgitter)(例 如具有矩形、三角或半圓剖面)，或是在基本平的光透明層(a)中周期調 節折射率的相格柵或體積格柵。格柵結構也可以是帶有一致周期的衍射
格柵，或可以是多衍射格柵。格柵結構可具有周期性，其在垂直或平行 于耦合入光透明波導層(a)的激發光傳播方向的空間中變化。
優選可用于耦合入激發光的格柵結構具有200 nm至1000 nm,優選 200 nm至400 nm的周期。而且，優選格柵的調制深度(Modulatkmstief) 為3 nm至60 nm，優選為10 nm至40 nm。優選調制深度與第一光透明 波導層(a)厚度的比率等于或小于0.4。同樣，優選折射率的調節發生在 層a和層b之間的分界面上以及在層a與分析介質的分界面上。
優選光透明波導層(a)具有40 nm至1000 nm的厚度，優選40 nm 至300 nm,更優選80 nm至200 nm。
層(a)和(b)間折射指數的差異優選 2 0.2,優選2 0.5,并更優選是
0.56。
激發光優選具有300 nm至1100 nm的波長，優選300 nm至 800 nm ,更優選500 nm至700 nm。
合適的激發光可通過格柵結構耦合進入，在耦合入和在層(a)中傳導 的光的傳播方向上，下游連接有層(a)的非調節區，其設置有多個測量區 的陣列，在這些陣列上檢測各種真菌毒素。在傳導光傳播的方向上，可 有利地下游連接有一個或多個其他格柵結構，其中其下游帶有另 一個測 量區陣列。或者， 一個陣列或多個陣列的測量區可在層(a)的調節區域中。
列，分配有對于該陣列呈特異性的格1冊結構、，來耦合出所:激發光，其 中對特定用于各陣列的格柵結構垂直于耦合入的激發光的傳播方向構 造，或者也可以該方向穿過整個薄膜波導而延伸。
設備可具有非常大量的單獨的測量場。在設備的優選實施方案中，
作為化學或生化識別元件的特異性和/或親和性結合配偶體以多至
100 000個測量場或點的形式以二維排列施加，其中單個測量場或點優 選具有0.001 mm 至6 mm 的面積，優選O. 1 mm2至1 mm范圍。優 選每平方厘米大于10、優選大于50個測量場施加于薄膜波導或生物芯 片上。
本發明的另 一主題是用于檢測真菌毒素的試劑盒。試劑盒包括至少 一個薄膜波導，所述薄膜波導包括在第二光透明層(b)上的第 一光透明波 導層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率，特異性和/或親和性結合配偶體 作為生物毒素和/或結合配偶體的化學或生化識別元件以空間分離的方 式固定在該薄膜波導上。
試劑盒可另外包括至少 一種包含優選標記的結合配偶體的試劑。試 劑盒還可包括數種包含優選標記的結合配偶體的試劑或包含不同標記 的結合配偶體混合物的試劑。試劑盒可另外包括用以實施如前述任意權 利要求所述檢測的緩沖液和/或溶劑。還設想了包括檢測單元的試劑盒。
試劑盒可用于快速檢測真菌毒素。
以下給出了用于舉例說明本發明的實施例。
實施例1
建立標準曲線用以在間接竟爭性免疫測試中在消逝場生物芯片上 測量玉米赤霉烯酮
7個生物芯片(Unaxis 乂>司，Liechtenstein),其外尺寸為1 cm x 2 cm，由玻璃制成，玻璃中刻有18 nm格柵深度的光格柵，并提供有155 nm厚的五氧化鉭層，通過將生物芯片浸入含500 十八烷基膦酸的 正庚烷/異丙醇(9:1)溶液中來涂覆十八烷基膦酸。在"生物芯片陣列器" (PerkinElmer,德國)型的點樣儀的幫助下，將玉米赤霉烯酮和牛血清白 蛋白的綴合物(ZEA-BSA, ZEA:BSA比率=50:1,由Biopure公司，Tulln, 奧地利制備)和標記有染料DyLight 647 (Pierce,德國)的BSA分子 (DyLight 647-BSA)上樣于生物芯片上。點樣溶液含濃度為5xl(T4 mg/ml DyLight 647-BSA,在含有0.1% BSA和0.1% Tween 20的PBS (137 mM NaCl, 2.8mMKCl， 10mMNa2HPO4， 1.8mMKH2P04, pH7.4)中，以 及0.5 mg/ml BSA-ZEA綴合物，在含有0.1% BSA和0.1% Tween 20的 PBS中。將點以兩個場(陣列)形式點樣到芯片上新的交替的行中，每
行有10個DyLight 647-BSA點和BSA-ZEA綴合物點。
高空氣濕度(40%)情況下溫育點過夜，然后用在PBS中的3% BSA 溶液處理生物芯片4小時。將測量室施加到芯片上，使得在每個芯片上 形成帶有分離的反應室的兩個陣列。制備0 )Lig/1至31 pg/1的不同濃度 的玉米赤霉烯酮水溶液，并與用DyLight 647標記的單克隆抗玉米赤霉 烯酮抗體(Biotez, Berlin)混合，由此在每種情況下制備出1 nM抗體溶 液。
在每種情況下，將不同濃度的混合物導入測量室中，在"Minifluo IV" 熒光讀數儀(Bayer Technology Services,德國)上測量生物芯片最多10 分鐘，而不進行其他處理步驟。每個玉米赤霉烯酮點上得到的熒光強度 除以特定點上下的DyLight 647-BSA點熒光強度的平均值。確定陣列中 所有40個點的熒光強度的平均值。得到的濃度依賴性熒光強度在Origin 7G (Origin Lab Corporation,美國)計算機程序的輔助下通過S形擬合來 擬合。
可以發現，通過評估樣品的熒光強度，能在0.4ppb至4ppb玉米 赤霉烯酮范圍內定量ZEA濃度，所述測量范圍分別對應于擬合的S形 曲線中最大熒光強度的80%和20%,對應于溶液中所用的ZEA濃度范 圍的1 nM至10nM 。
實施例2
建立標準曲線用以測量脫氧瓜萎鐮菌醇(DON)并測量污染的谷物 飼料樣品
15個生物芯片(Unaxis公司，Liechtenstein)，其外形尺寸為1 cm x 2 cm,由玻璃制成，玻璃中刻有(18 nm格柵深度的)光格柵，提供有五 氧化鉭層(155 nm),(通過將生物芯片浸入十八烷基膦酸的正庚烷/ 異丙醇9:1溶液中來)涂覆十八烷基膦酸。在Nan叩lotter (GeSiM,德國) 型的點樣儀的幫助下，將脫氧瓜萎鐮菌醇和牛血清白蛋白的綴合物 (DON-BSA, DON:BSA比率=100:1,由Biopure公司，Tulln,奧地利 制備)和狗IgG (Rockland,美國)上樣于生物芯片上。點樣溶液由含濃 度為0.2 mg/ml的狗IgG的含海藻糖的PBS (137 mM NaCl, 2.8 mM KC1, 10 mM Na2HP04, 1.8 mM KH2P04, pH 7.4)和含濃度為1 mg/ml的 BSA-DON綴合物的含海藻糖的PBS組成。以兩排每排有12個狗IgG點
的和它們之間一排12個BSA-DON綴合物點的方式將點通過兩個場(陣 列)上樣到芯片上。
將點于37。C溫育1 h,然后用PBS中的BSA溶液處理生物芯片多至 4小時。將測量室加到芯片上，使得在每個芯片上形成帶有分離的反應 室的兩個陣列。通過與70Q/o曱醇的水溶液(v/v)—起搖動5分鐘來提取5g 無污染的小麥粉。離心提取物，然后用含BSA、酪蛋白、干燥低脂奶粉、 Tween20,聚乙二醇和蔗糖的Tris檸檬酸緩沖液(pH 7.4)以l:4(v/v, 提取物:緩沖液)的比率稀釋。制備不同濃度(15至150 pg/l)的脫氧瓜萎鐮 菌醇，并與用DyLight 647標記的單克隆抗脫氧瓜萎鐮菌醇抗體以及與 同樣標記有DyLight 647的單克隆山羊抗狗IgG抗體混合，由此在每種 情況下制備出lnM抗體溶液。
在每種情況下，將不同濃度的溶液導入測量室中，在"MinifluoIV" 熒光讀數儀(Bayer Technology Services,德國)上測量生物芯片最多10分 鐘，而不進行其他處理步驟。每個脫氧瓜萎鐮菌醇點上得到的熒光強度 除以各點上下的狗IgG點熒光強度的平均值。確定陣列中所有12個DON 點的熒光強度的歸 一化的平均值。得到的濃度依賴性的正態化的熒光強 度在計算機程序的輔助下通過指數擬合來擬合。
與以上所示提取方法相似，提取5gDON-污染的谷物并丑粉飼料樣品 (Coring公司，德國，被鑒定有526 ppb DON)并稀釋提取物。對于300 pl 稀釋的提取物，將用DyLight 647標記的單克隆抗脫氧瓜萎鐮菌醇抗體 和同樣標記有DyLight647的單克隆山羊抗狗IgG抗體加入，使得在每 種情況下得到lnM抗體溶液。在每種情況下，將100^1溶液導入測量 室中，在"Minifluo IV，，熒光讀數儀(Bayer Technology Services,德國)上 測量生物芯片最多10分鐘，而不進行其他處理步驟。每個脫氧瓜萎鐮 菌醇點上得到的熒光強度除以特定點上下的狗IgG點熒光強度的平均 值。確定陣列中所有12個DON點的焚光強度的歸一化的平均值。得到 的熒光強度在上述標準曲線的幫助下轉化成谷物粗粉飼料中的DON濃 度，通過3次測量由此得到590 ppb的平均值。
權利要求
1. 用于快速檢測真菌毒素的方法，其包括以下步驟:a)提供薄膜波導，其包括在第二光透明層(b)上的第一光透明波導層(a)，其中(b)具有比(a)低的折射率，特異性和/或親和性結合配偶體作為真菌毒素和/或結合配偶體的化學或生化識別元件以空間分離的方式固定在該薄膜波導上，b)將含一種或多種真菌毒素的樣品和結合配偶體施加于所述薄膜波導上固定的結合配偶體上，c)檢測由于固定在薄膜波導上的結合配偶體與來自樣品的真菌毒素和/或與結合配偶體的相互作用產生的消逝場中的信號，d)確定樣品中存在的一種或多種真菌毒素的量。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于將單或多層下式(I)的 有機磷酸R-OP03H2 (I)和/或下式(n)的有機膦酸R-P03H2 (II)和/或它們的鹽施加到所述薄膜波導，其中 R是Cio至C24坑基。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其特征在于使用有機磷酸、有機 膦酸、有機磷酸鹽和/或有機膦酸鹽，其中R選自包括無支鏈的 do至 C20烷基的組，優選選自包括無支鏈的C12至d8烷基的組，有機磷酸、 有機膦酸、有機磷酸鹽和/或有機膦酸鹽優選選自包括十二烷基磷酸、十 二烷基磷酸鹽、十八烷基膦酸鹽和/或十八烷基膦酸的組。
4. 如前述權利要求之一所述的方法，其特征在于使用包括光透明 波導層(a)的薄膜波導，該薄膜波導包括氧化物，所述氧化物選自包括 Ti02、 ZnO、 Nb205、 Ta205、 Hf02和/或Zr02的組，優選選自包括Ti02、 Ta205和/或Nb205的組。
5. 如前述權利要求之一所述的方法，其特征在于所述所述結合配 偶體選自包括抗真菌毒素抗體、抗真菌毒素抗體綴合物、真菌毒素、真 菌毒素綴合物、抗真菌毒素抗體片段、真菌毒素結合肽、真菌毒素結合 性抗運載蛋白、真菌毒素結合性適體、真菌毒素結合性適配子和/或真菌 毒素結合性印跡聚合物的組，優選選自包括抗真菌毒素抗體、抗真菌毒 素抗體綴合物、真菌毒素和/或真菌毒素綴合物的組。
6. 如前述權利要求之一所述的方法，其特征在于所述標記元件，優選是熒光團，通過蛋白質，優選通過牛血清白蛋白，與真菌毒素結合。
7. 如前述權利要求之一所述的方法，其特征在于所述樣品是人或 動物的食品，其優選選自包括谷類、酒、果汁、水果和/或含谷類、酒、 果汁和/或水果的產品、或用溶劑或溶劑混合物提取的所述食品或產品的 提取物的組。
8. 如前述權利要求之一所述的方法，其特征在于，在檢測信號前， 樣品與作為化學或生化識別元件的固定結合配偶體和/或結合配偶體一起溫育小于15分鐘，優選小于10分鐘。
9. 如前述權利要求之一所述的方法，其特征在于，所述真菌毒素 選自包括黃曲霉毒素、赭曲毒素、麥角生物堿、棒曲霉素和/或鐮刀霉毒 素的組，例如選自包括脫氧瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、 T-2毒素、HT-2毒素和/或伏馬菌素的組，優選選自包括赭曲毒素A、 脫氧瓜萎鐮菌醇、瓜萎鐮菌醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、 伏馬菌素Bl、伏馬菌素B2和/或伏馬菌素B3的組。
10. 如前述權利要求之一所述的方法，其特征在于在谷類提取物中 檢測甚至為0.1pM至100nM真菌毒素、優選1 pM至1 nM真菌毒素 的真菌毒素。
11. 如前述權利要求之一所述的方法，其特征在于通過免疫測試、 優選竟爭性免疫測試、尤其優選間接竟爭性免疫測試，實施檢測。
12. 用于實施快速檢測真菌毒素的方法的設備，其特征在于，該設 備含有薄膜波導，該薄膜波導包括在第二光透明層(b)上的第 一光透明波 導層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率。
13. 如權利要求12所述的設備，其特征在于，所述薄膜波導的光 透明層(b)由諸如玻璃或石英的硅酸鹽或由透明塑料制成，所述透明塑料 優選選自包括聚碳酸酯、聚酰亞胺、聚曱基丙烯酸酯、聚苯乙烯、環狀 聚烯烴和/或環狀聚烯烴共聚物的組，更優選由環狀聚烯烴制成，該薄膜 波導包括在笫二光透明層(b)上的第 一光透明波導層(a),其中(b)具有比(a) 低的折射率。
14. 如權利要求12或13所述的設備，其特征在于，所述光透明波 導層(a)具有40nm至1000 nm的厚度，優選40 nm至300 nm，更優 選80 nm至200亂
15. 如前述權利要求之一所述的設備，其特征在于，通過使用一種 或多種格柵結構將激發光耦合進光透明波導層(a)。
16. 如前述權利要求之一所述的設備，其特征在于，用于耦合激發 光的祐4冊結構具有200 nm至1000 nm的周期，優選200 nm至400 nm。
17. 如前述權利要求之一所述的設備，其特征在于，所述格柵具有 3nm至60nm的調制深度，優選10nm至40 nm。
18. 如前述權利要求之一所述的設備，其特征在于，所述激發光具 有300 nm至1100 nm的波長，優選300 nm至800 nm,更優選500 nm 至700 nm。
19. 如前述權利要求之一所述的設備，其特征在于，將單或多層下 式(I)的有機磷酸R-OP03H2 ①和/或下式(n)的有機膦酸<formula>formula see original document page 4</formula>(II)和/或它們的鹽施加于薄膜波導，其中R 是 Cio 至C24坑基。
20. 如前述權利要求之一所述的設備，其特4正在于所述識別元件以 多至iooooo個測量場形式以二維排列施加，其中一個測量場具有優選0週mm2至6 mm2的面積，更4尤選0.1 mm 至1 mm 。
21. 如前述權利要求之一所述的設備，其特征在于每平方厘米有大于10個、優選大于50個測量場#:施加于薄膜波導。
22. 用于快速檢測真菌毒素的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括至 少一個薄膜波導，該薄膜波導包括在笫二光透明層(b)上的第 一光透明波 導層(a),其中(b)具有比(a)低的折射率，特異性和/或親和性結合配偶體 作為真菌毒素和/或結合配偶體的化學或生化識別元件以空間分離的方 式固定在該薄膜波導上。
23. 如權利要求22所述的試劑盒，其特征在于它包含試劑，其優 選包含熒光標記的結合配偶體。
24. 如前述權利要求之一所述的試劑盒用于快速^^測真菌毒素的 用途。
全文摘要
本發明涉及用于檢測真菌毒素的設備和方法并涉及適于實施所述方法的試劑盒。
文檔編號G01N33/569GK101384896SQ200680053201
公開日2009年3月11日 申請日期2006年12月13日 優先權日2005年12月23日
發明者I·多恩, I·豪瑟-哈恩, J·伯梅斯特, U·拉比 申請人:拜爾技術服務有限責任公司;拜爾農作物科學股份公司