專利名稱：用于定性分析分子相互作用的方法
技術領域：
本發明是關于可用于定性分析高親和力分子反應的方法及組合物。
背景技術：
許多生產治療性單克隆抗體的生物技術公司的目標是研發以高親和力與生物靶 標結合的抗體。大多數治療性抗體具有毫微摩爾范圍內的親和常數且許多研究致力于 提高親和力以接近皮摩爾范圍。能夠進行結合反應動力學或實時測量的儀器(例如， 可自福特生物(Fort6Bio)公司購得的標準具基于纖維的系統及可自巴考(Biacore)購得的 基于表面等離子共振的儀器)在監測雙分子相互作用方面較為有利，因為其可用于確 定結合的締合及解離階段二者的速率常數，且因此提供優于基于平衡的結合測量的優 點。因此，基于動力學的定性分析代表測定生物反應(例如抗體與受體結合反應)親 和力的優選方法。然而，高親和力反應(例如那些涉及高親和力抗體的反應)給這些 方法造成挑戰。結合解離階段時間期限的跨度可能自數小時(對于毫微摩爾解離常數， KD)至數天(對于皮摩爾解離常數，KD)。對于解離速率測量來說， 一般通過固定一 個組件且允許另一個結合所述經固定組件在傳感表面上形成結合復合物。為便于論述， 我們集中于抗體結合反應，但所闡述及主張的方法原理及實踐適合于任何結合反應， 包括那些涉及其他生物分子的結合反應。對于抗體結合親和力測量來說， 一般將抗原 固定在傳感表面上。隨后將所述表面暴露于含有所關注抗體的溶液中，并進行結合。 一旦發生結合，即將所述傳感表面暴露于緩沖溶液(即，最初不含有游離抗體的溶液) 中并實時連續監測解離速率。對于高親和力抗體需要連續監測解離數小時至數天，此 占用儀器，因此限制了樣品通量。
延長的解離速率測量對儀器寄予了最小化基線漂移的額外性能要求，所述基線漂 移可能干擾速率測量并導致錯誤結果。在諸如那些由福特生物及巴考出售的固相儀器 中，固相提供潛在影響表觀解離速率的擴散障蔽層。當抗體從抗原解離時，所述固相 限制抗體擴散，使其仍接近于抗原，因此使抗體與表面上的抗原再結合的可能性增加。 抗體再結合在傳感表面上可能會導致異常緩慢的表觀解離速率常數。因此，業內需要 用于定性分析結合反應的改良方法。本發明提供針對現有技術的這些及其他缺點的解 決辦法。
發明內容
本文揭示用于定性分析結合反應的方法及組合物。所述方法尤其適用于特征在于 解離常數在毫微摩爾至皮摩爾范圍內的反應。 一方面，本發明方法包含在溶液中提供 受體及第一形式配體，等待一段時間以允許所述受體及配體基本上達到結合平衡，隨 后向所述溶液中添加第二形式配體，并在固相結合分析中測定由所述第一形式配體與 所述固相結合所產生的信號。另一方面，所述第一形式配體與固相特異性結合且所述 第二形式配體不與固相特異性結合。再一方面，在添加第二形式配體之前，基本上所 有第一形式配體都與受體結合。又一方面，實施多次固相結合分析，其中在添加第二 形式配體后的多個時間測定信號。另一方面，所述時間中至少兩個時間彼此相差至少
5小時、或至少10小時、或至少20小時、或至少100小時。另一方面，所述測定信 號中至少兩個信號彼此有所不同。又一方面，所述方法包括計算解離速率常數。再一 方面，所述方法包括自測定信號計算結合第一形式配體與游離第一形式配體的比值或 所述比值的倒數。又一方面，在相同容器中實施多次固相結合分析。再一方面，所述 固相結合分析對樣品沒有破壞性。另一方面，所述固相結合分析是基于纖維的分析。 又一方面，所述基于纖維的分析包含產生干涉測量信號。另一方面，所述固相結合分 析是基于表面等離子共振的分析。
例示性實施例包括使用標準具-基于纖維的或基于表面等離子共振的儀器所實施 的分析。
在本發明變體中，所述反應涉及抗體及抗原。在另一變體中，兩種形式配體在包 括可特異性地與固相結合的標記方面有所不同。在優選實施例中，所述標記是生物素， 并且所述固相包括抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素。
參閱以下闡述及附圖可更好地理解本發明的這些及其他特點、方面及優點，其中
圖1是繪示本發明的步驟及用福特生物公司制造的OctetTM生物傳感器實施本發
明所獲得的結果的圖示。
圖2繪示使用OctetTM生物傳感器用其中抗體為抗-FITC、第一形式配體為FITC-
葡聚糖-生物素且第二形式配體為FITC-葡聚糖的模型系統所獲得的介于0時間至9小 時范圍內的5個時間點的標準化數據(所述數據擬合獲得解離速率常數)及使用本發 明方法及現有技術分析所獲得的解離速率的比較。
圖3繪示使用與圖2中相同的儀器及模型系統在介于10分鐘至9小時范圍內的4 個不同時間點的原始數據。
圖4繪示使用與圖2及3中相同的儀器及模型系統在介于29分鐘至1763分鐘范 圍內的16個不同時間點的原始數據。
圖5繪示用一次指數擬合圖4數據的方法。
圖6繪示使用與圖2及3中相同的儀器及模型系統但用兩個不同的第二形式配體 濃度所獲得之數據及在半對數尺度上繪制之所獲得數據的線性擬合。
具體實施方式
優點及用途
簡單來說，且如下文更詳細闡述，本文所述者是用于定性分析結合反應的方法。 應注意當前方法的數個特點。第一，本發明方法通過減少誤差來源(包括儀器漂
移、樣品蒸發及擴散偽像)提高了解離速率常數估計的準確度。本發明方法容許在單
一樣品上進行多次測量。在使用基于纖維的分析的優選實施例中，可使用極小體積實
施多次測量，由此節省樣品物質。
此方法的優點很多。其包括樣品節省、參數估計的準確度提高及使用單一儀器的
測量通量顯著增加。
本發明可用于估計化學反應的解離速率，并且尤其適用于當化學反應的特征在于 緊密親和(例如，具有毫微摩爾至皮摩爾或更小范圍內的解離常數)且其中解離速率 足夠緩慢以使在數小時至數天或更長間隔內發生解離時。
定義
除非另有說明，否則本權利要求書及說明書中所用的術語都如下文所述定義。 "固相結合分析"是其中將至少一種反應組份固定在支撐襯底上的結合反應。例 示性固相結合分析是使用標準具纖維的分析，例如那些使用可自加利福尼亞(CA)門洛 帕克(Menlo Park)的福特生物公司購得的OctetTM實施的分析或那些使用表面等離子共 振儀器(例如那些可自瑞典(Sweden)烏普薩拉(Uppsala)的巴考公司購得者)實施的分 析。
"特異性結合反應"是可顯示為可飽和且其中經標記組份的結合可與過量未經標 記的所述組份形式競爭的結合反應。
"非破壞性分析"是未本質上消耗樣品即可完成樣品測量的分析。因此，非破壞 性分析是可從單一樣品獲得重復測量的分析。
"基于纖維的分析"是從在纖維(例如，玻璃纖維)上發生的反應獲得測量的分析。
"干涉測量信號"是由電磁輻射射線中的干涉產生的信號。
"抗體"定義為具有兩條重鏈及兩條輕鏈且在重鏈與輕鏈的可變區界面處形成抗 原結合位點的全長免疫球蛋白分子。另外，除全長免疫球蛋白分子外，術語"抗體" 意欲涵蓋相同片段(例如Fab片段)以及重組單鏈分子(例如，scFv)。 本申請案中所用的縮寫包括以下
"FITC"是異硫氰酸熒光素。
"L*"是在固相結合分析中與固相特異性結合的第一形式配體。
"L"是在固相結合分析中不與固相特異性結合的第二形式配體。
"R"是與乙*及L 二者特異性結合的結合配偶體或受體。
必須注意，除非上下文另外明確說明，否則本說明書及隨附權利要求書中所用的 單數形式"一 (a及an)"及"所述"都包括多個指示物。 本發明方法
技術領域：
本發明是關于準確定性分析結合反應的問題，其中解離非常緩慢地在介于數小時 至數天或更長范圍內的時間期限內發生。盡管例示性反應是那些抗體與抗原之間發生 的反應，尤其是那些特征在于解離常數在毫微摩爾至皮摩爾范圍內的反應，但是所述 方法可使用其中可制備兩種形式配體以使一種形式配體與固相特異性結合且第二形式 配體不與固相特異性結合的任何結合反應實踐。 一般來說，第一及第二形式配體的區
別僅在于存在或不存在與固相特異性結合且不會本質上干擾配體與其受體的結合的親 和標記。典型親和標記包括生物素、寡聚組氨酸、寡核苷酸、凝集素等。
為便于闡釋，本發明通過提及抗體結合反應來闡述，但本發明范圍并不限于所述
實例，而是僅限于隨附權利要求書。在優選實施例中，本發明可用于解決使用生物傳 感器(例如可自加利福尼亞門洛帕克的福特生物公司購得的標準具基于纖維的OctetTM
或可自瑞典烏普薩拉的巴考公司購得的基于表面等離子共振的生物分子相互作用分析 儀(Biacore))測量高親和力抗體速率常數的問題。在本發明實施例中，解離速率是使 用其中允許解離在液相中發生且使用固相分析監測所述解離進展的分析形式測定。如 下實施所述固相分析使固相與液相在一或多個時間間隔接觸以獲得由固相與液相相 互作用所產生的信號，由所述信號可測定結合配體對游離配體的分數估計值。
所述分析形式的原理是基于提供兩種形式的配體1^*及L，所述兩種形式的配體與 固相特異性結合的能力不同，但其與液相中存在的結合配偶體R的結合能力無本質不 同。在尤佳實施例中，在固相分析中能夠特異性結合的1^形式配體的濃度小于液相結 合配偶體R的濃度，液相結合配偶體R的濃度又小于在固相分析中不能夠特異性結合 的L形式配體的濃度。所述固相包含區別y與L的部分的結合配偶體。例示性固相 結合配偶體包括抗體、抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素、鎳、寡核苷酸(包括適體)、 凝集素、碳水化合物等，其識別諸如抗原、蛋白質、肽、生物素、寡聚組氨酸、互補 寡核苷酸、碳水化合物及凝集素等部分。用于衍生諸如玻璃或塑料等固相及用于衍生 可用于本發明方法的配體的例示性化學已為所屬技術領域的技術人員所熟知且例示性 方案在公開文獻及課本中廣泛可得，例如以下緊接所列示者，其全部揭示內容為了各 種目的而以引用方式并入本文中用于蛋白質純化的親和標記的比較(Comparison of Affinity Tags for Protein Purification), 2005， 41， 98-105，利克蒂(Lichty)等人；設計用 于結構生物學的高通量蛋白質生產方法(Design of High-Throughput Methods of Protein Production for Structural Biology),結構(Structure), 2000，第8巻，9， R177-R185,史 蒂文斯(Stevens);蛋白質微陣列挑戰與前景(Protein Microarrays: Challenges and Promises),藥物基因組(Pharmacogenomics)， 2002， 3(4)， 1-10，塔拉帕特(Talapatra)等人；適體用于RNA及核糖核蛋白研究的親和標記(Aptamers: Affinity Tags for the Study of RNA and Ribonucleoproteins)， RNA 2001，第7巻(4)， 632-641,思瑞撒瓦特 (Srisawat)及恩蓋克(Engelke);在表面等離子共振中用于雙特異性相互作用分析的蛋白 質至經羧基甲基葡聚糖改良的金表面的固定(Immobilization of Proteins to a Carboxymethyldextran Modified Gold Surface for Bispecific Interaction Analysis in Surface PIasmon Resonance),分析生物化學(Analytical Biochem.) 1991 ， 198， 268-277， 約翰遜(Johnsson)等人；蛋白質結合及交聯化學(Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking)，翁珊(Shan Wong)編輯，CRC出版社，伯克萊屯(Boca Raton), FL， 1993; 以及固相免疫分析的免疫化學(Immunochemistry of Solid Phase Immunoassay),約翰巴 特勒(JohnButler)編輯，CRC出版社，伯克萊屯，FL, 1991。
在一些實施例中，允許1^*與R之間的結合反應在將L添加至液相中之前進行至 平衡。在一些實施例中，在將L添加至液相中之前基本上所有L^都與R結合。 一旦 將L添加至液相中，即實施一或多次固相結合分析以獲得可用于定性分析1^*與R保 持結合的程度的信號。通過獲得多個所述信號，溶液中L*g R的解離速率可利用所屬 技術領域的技術人員所熟知的技術予以估計。
通過本發明方法所得到的解離速率常數比通過自固相解離直接測量所獲得的解 離速率常數更為準確。 一般來說，如下實施所述測量例如，使R與L在固相上結合 并將所述固相暴露至具有很少或沒有游離L的液相中。所述自固相的直接測量易于出 現誤差，因為(例如)固相可提供促進L與R再結合的擴散障壁層。相反，利用本發 明方法所得到的解離速率常數反映液相中所發生的過程且更接近地模擬活體內結合并 避免用固相裝置實施的速率常數測量的擴散障壁層偽像。本發明方法提供不需要生物 傳感器儀器連續測量的額外優點，使其可用于處理其他樣品。根據結合親和力及反應 的解離階段的時間期限而定，本發明方法僅在解離階段期間的選擇間隔實施測量。因 此，本發明方法容許定性分析具有緩慢解離速率的親和力非常高的反應(例如，毫微 摩爾至皮摩爾或更緊密的平衡解離常數)，因此一旦提供L， ！^即在許多小時至數天 的時間間隔跨度內自R解離。 實例
下文是實施本發明的具體實施例的實例。所提供的這些實例僅用于說明目的，而 不意欲以任何方式限制本發明的范圍。盡管力求使所用數值(例如，數量、溫度等) 達到準確，但當然應允許某些實驗誤差及偏差。
除非另有說明，否則本發明實踐將采用所屬技術領域的技術人員所習知的蛋白質 化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學常用方法。所述技術充分闡述于文獻中。 參見，例如，克里頓(T.E. Creighton)，蛋白質結構及分子特性(尸rwe!7w.'朋d AfoZecw/ar尸ro/7em'^)(弗里曼公司(W.H. Freeman and Company), 1993);里尼格(A丄. Lehninger)，生物化學(價值出版公司(Worth Publishers, Inc.),最近添加)；薩姆布魯 克(Sambrook)等人，分子克隆實驗室手冊(Mo/ecw/ar C7om'wg: A La6oraf， A^2肌a/)
(第2版，1989);酶學方法(M"/w^/" ^zymoZogy)(克羅韋克(S. Colowick)及卡普 蘭(N. Kaplan)編輯，學術出版公司(Academic Press, Inc.));雷明頓藥物科學(i em!'"gfo^ 尸/iflrmflcew"cfl"a'mce力，第18版，(賓夕法尼亞州(Pennsylvania),伊斯頓(Easton): 麥克出版公司(Mack Publishing Company), 1990);凱里(Carey)及森德伯格(Sundberg) 高級有機化學，第3版，普雷尼出版社(PlenumPress) A及B巻(1992)。 實例l:用于定性分析抗體抗原反應的方法的概述。
用于實踐本發明方法以定性分析抗原-抗體反應的方案揭示于圖1中。在步驟1 中，如下制備樣品在標準生物緩沖液(例如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))或任何其他合適
結合緩沖溶液或溶液中于經親和標記(例如，經生物素化)的抗原(L"與擬估計解離
速率常數的抗體(R)之間形成免疫復合物。所述經標記抗原及抗體濃度優選地經選擇以
使平衡時基本上所有經標記抗原都被抗體結合。在步驟2中，添加大量過量未經標記 抗原(L)以引起與生物素-抗原競爭抗體結合位點的反應。在此形式中，由于生物素-抗 原先前已被抗體結合，所以所述免疫復合物必須解離以結合未經標記抗原。解離后， 摩爾過量的未經標記抗原即偏愛與抗體結合。隨時間推移樣品中開始出現游離生物素-抗原且其出現速率取決于抗體解離速率。步驟3顯示在選擇時間間隔將涂覆有抗生蛋 白鏈菌素的生物傳感器浸入樣品混合物中以測量結合對游離生物素-抗原的數值，此數 值隨后用于得到解離速率常數。
實例2:使用玻璃纖維生物層干涉測量傳感器定性分析抗-FITC/FITC反應。
圖2繪示抗熒光素/熒光素-葡聚糖結合對的步驟3解離結果(如圖1中所圖示)。 在此實例中，使用玻璃纖維生物層干涉儀傳感器來實施固相結合分析。傳感器及制造 及使用其的方法詳細闡述于共同擁有的美國專利申請公開案第20050254062號中，其 全文為了各種目的而以引用方式并入本文中。在此實例中，將所述纖維用與存在于 FITC-葡聚糖配體上的生物素標記結合的抗生蛋白鏈菌素衍生。在所述方法實踐中使用 此類型傳感器可提供意想不到的優點。在研發治療性抗體的早期，抗體的量可限制提 供。通過進行相同樣品混合物的重復測量傳感器測量使解離速率估計值的準確度得以 提高。由于玻璃纖維生物傳感器與常用樣品反應室相適合，所以其使抗體樣品的消耗 最小化，例如微量滴定板孔僅需要100 nL或更少。所述玻璃纖維傳感器的直徑約為 0.5 mm，此產生小的傳感面積。由于重復測量對樣品中生物素-抗原的總量的影響可以 忽略，所以具有相對有限的結合能力的小傳感面積有助于相同樣品的重復測量。
材料及方法
從以下來源獲得試劑
游離未經生物素化的分析物(目錄弁D3306，分子探針，葡聚糖-熒光素，3000 MW) 生物素-分析物(目錄tfD7156，分子探針，葡聚糖-熒光素及生物素，3000MW) 抗體(目錄#八-6413，分子探針，抗-熒光素抗體，兔多克隆，Fab-片段) K-傳感器(目錄#18-0002，福特生物) 樣品稀釋液(目錄#18-1000,福特生物)
實驗樣品
生物素-分析物(陰性對照；最小信號) 生物素-分析物+抗體(陽性對照；最大信號) 生物素-分析物+抗體+游離未經生物素化的分析物 添加不同濃度的游離未經生物素化的分析物以競爭
1. 生物素-分析物+抗體的平衡結合
l丄 在樣品稀釋液中制備2X生物素-抗原溶液。對于此實例制備生物素-葡聚 糖-熒光素(0.25 pg/ml)溶液。此原液用于制備陰性對照以及生物素+抗體溶液。
1.2. 將生物素-抗原及抗體(抗-熒光素)原液合并以獲得如下的最終濃度:41.67 nM生物素-抗原及125 nM抗體(R比L*3x摩爾過量)。
1.3. 制備陰性對照(僅生物素-抗原)以獲得41.67 nM濃度。
1.4. 將所有樣品在室溫下于輕輕搖動下培育過夜以達到平衡。
2. 離去速率(解離速率)測定的競爭分析
2丄 如下文所述制備一式兩份樣品組以獲得2塊用于使用可自福特生物公司 購得的Octet儀器的分析的分析板。
2.2. 將100x及1000x摩爾過量(上文抗體，R)的游離未經生物素化抗原(葡 聚糖-熒光素，L)添加到來自1.2的溶液的2份等分試樣中。兩份樣品中游離未經生 物素化抗原(L)的最終濃度分別為12.5 及125 一。
2.3. 通過用PBS調節總體積使所有樣品中添加到每一反應中的總體積保持相等。
2.4. 將PBS而非游離未經生物素化抗原(L)添加到陰性對照中以獲得與2.1中 的樣品相同的總體積。
2.5. 分析板來自格林納(Greiner) (E&K科學井EK-25209 (E&K Scientific # EK-25209))的平底黑96-孔PP板
2.5丄將管柱l中的孔裝滿樣品稀釋液以測定基線(每個孔200pl)。
2.5.2.將管柱2中的孔裝滿樣品溶液(每個孔200)il)。3.福特生物Octet上的分析
3.1.在培育開始后直接選取第一時間點。
3.2.使用Octet及K傳感器的分析方案
2丄將樣品板在Octet中升溫至3(TC，保持5分鐘(板上無覆蓋物)。
3.2.2.如下設置分析方案
3.2.2丄在板于200rpm下搖動及維持于30°C的溫度下在60秒內獲得管柱1樣稀釋液的基線。3.2.2.2.在板于200 rpm下搖動及維持于3(TC的溫度下在1200秒內自管柱2中的
孔獲得結合數據。
3.2.3.在獲得最初結合數據后，將樣品板自Octet中移除，用板密封器密封并在
環境溫度下于實驗臺上進行培育。 一塊板用于所有隨后時間點。
3.3. 在每一時間點重復3.2中的步驟。對于所顯示的實例數據，對于板1在14、 38、 132、 226、 361、 455、 1467、 1783分鐘采集數據且對于一式兩份板2在9、 32、 116、 263、 325、 430、 1437、 1725分鐘采集數據。例示性數據顯示于圖4中，其提供 來自兩個實驗的數據。應注意，圖4圖例中所提供的時間自段落中所提供的代表允許 進行的固相結合的時間量的值偏移20分鐘。
圖2 (左側)顯示使用上述方案所獲得的代表性標準化數據及其按照下文所述的 第一分析方法來估計解離速率常數的分析(右側)。圖3顯示在添加L后的時間點所 獲得的代表性數據以及RI^的最大結合(陽性對照)及乙*的最小結合(陰性對照)。
4. 數據分析
4丄 在分析結束時，測定每一測量的總nm移動。在此實例中，測定20分鐘 結合時間段后每一時間點的向傳感器尖端的nm移動。選擇所述20分鐘時間段是因為 其提供穩健讀出且經經驗確定為可有效報告溶液相組份與固相生物傳感器結合終點的 時間點。當然，在其他應用中，結合時間段可能為諸如以下等參數的函數而有所不同 溫度、離子、強度及RI^及L^且份的擴散常數，且適宜結合時間段可容易地由受益于 本揭示內容的所屬技術領域的技術人員確定。
盡管在此實例中每一時間點的結合數據是以在20分鐘時間段內發生的nm移動的
形式報告，但是所述方法也可通過使用在(例如)較短時間段(例如， 一分鐘至數分 鐘)內發生的最初移動或在最初結合時間段內取得的一階導數(例如，速率)來實踐。 使用最初移動或最初速率的優點在于其使在分析期間發生RI^復合物顯著進一步解離 的可能性最小化。
4.2. 解離速率常數kdis測定方法1:
4.2丄對于每份樣品，創建時間對nm移動的曲線圖(X對Y)。陽性生物素-抗原+抗體對照的平均值用于0時間時nm移動的數據點。
4.2.2.使用這些數據的指數擬合來測定kdis，其中y = y0 + A*exp(RO*x). = -RO。這些測定的實例提供于圖2的右手側及圖5中。
4.3. k^測定方法2:
4.3丄對于每份樣品，創建ln (時間)對nm移動的曲線圖(X對Y)且對經半 對數繪制的數據進行線性擬合。
4.3.2. 我們從線性擬合確定失去一半信號(nm移動)的時間。這就是tV2。
4.3.3. 使kdis值通過公式kdis= (ln2/tV2)近似，并將100倍及1000倍摩爾過量競爭 的值顯示于圖6的頂部。圖6的底部將使用兩種估計方法估計的解離速率常數(此處 表示為kd而非kdis)以及使用標準Octet實時分析所獲得的速率制成表格。
實例3:在生物分子相互作用分析儀裝置上實施本發明方法 1.樣品準備是以與實例2中所述方式類似的方式實施，只是以大批量制備樣 品(例如，10-20mL)。每一分析消耗一份等分試樣(例如，約為l-2mL)。另外，
使用溶液對照來校正由于蛋白質濃度引起的任何折射率變化。對于此工作實例來說，
理想溶液對照由未經生物素化的分析物加上抗體組成以給出與樣品類似的總蛋白質濃度。
2. 使用抗生蛋白鏈菌素巴考芯片(傳感器芯片SA，巴考登記號 BR-1000-32)。或者，可使用胺反應性CM5芯片(巴考登記號BR-1006-68)通過標
準方案來固定抗生蛋白鏈菌素。
3. 對于每一時間點，使用新的巴考芯片。每一芯片含有四個流動池，所述流 動池可用于分析三份實例2中所述的樣品加上溶液對照。
4. 在每一時間點將每一溶液的一份等分試樣注射在單獨流動池上。
5. 在下一個時間點將新芯片插入到儀器中并注射每一樣品的新等分試樣及 溶液對照。
9. 一旦采集所有時間點，即進行如實例2中所述的數據分析，只是使用巴考 RU值(巴考信號單位)代替Octet nm移動。
盡管已參照優選實施例及多個替代實施例具體顯示及闡述本發明，但所屬技術領 域的技術人員應了解，可在形式及細節上對其進行各種改變，此并不背離本發明的精 神及范圍。
為了各種目的，本說明書主體中所引用的所有參考文獻、頒發的專利及專利申請 案的全文都以引用方式并入本文中。
權利要求
1、一種對反應進行定性分析的方法，其包含提供包含總濃度為[R]的受體及總濃度為[L*]的第一形式配體的基本上平衡的溶液；向所述溶液中添加總濃度為[L]的第二形式所述配體；以及在固相結合分析中測定在添加所述第二形式所述配體后的第一時間由所述第一形式所述配體與所述固相結合所產生的信號，其中所述第一形式所述配體與所述固相特異性結合，且所述第二形式所述配體不與所述固相特異性結合。
2、 如權利要求l所述的方法，其中[LKR]〈[L]。
3、 如權利要求1所述的方法，其中在所述第二形式所述配體的所述添加之前， 基本上所有所述第一形式所述配體都與所述受體結合。
4、 如權利要求1所述的方法，其進一步包含在多個固相結合分析中測定由所述 第一形式所述配體與所述固相結合所產生的多個信號，其中所述信號是在添加所述第 二形式所述配體后的多個時間測定。
5、 如權利要求4所述的方法，其中所述信號中至少兩個信號彼此不同。
6、 如權利要求4所述的方法，其中所述多個時間中至少兩個時間彼此相差至少5 小時。
7、 如權利要求6所述的方法，其中所述多個時間中至少兩個時間彼此相差至少 IO小時。
8、 如權利要求7所述的方法，其中所述多個時間中至少兩個時間彼此相差至少 20小時。
9、 如權利要求8所述的方法，其中所述多個時間中至少兩個時間彼此相差至少 100小時。
10、 如權利要求4所述的方法，其中所述多個固相結合分析是在含有所述溶液的 單一容器中實施。
11、 如權利要求4所述的方法，其進一步包含由在所述多個固相結合分析中所測 定的所述多個信號來計算解離速率常數。
12、 如權利要求4所述的方法，其進一步包含由在所述多個固相結合分析中所測 定的所述多個信號來計算結合1^與游離"的比值或所述比值的倒數。
13、 如權利要求l所述的方法，其中所述固相結合分析為非破壞性的。
14、 如權利要求13所述的方法，其中所述固相結合分析是基于纖維的分析。
15、 如權利要求14所述的方法，其中所述基于纖維的分析包含產生干涉測量信號。
16、 如權利要求13所述的方法，其中所述固相結合分析是基于表面等離子共振 的分析。
全文摘要
本發明提供使用用于測定液相中解離速率的分析形式來測量高親和力分子相互作用的速率常數的方法。本發明使用以選擇時間間隔與樣品溶液接觸以估計結合配體對游離配體的比值的生物傳感器。按照本發明方法測定的解離速率常數更接近地模擬活體內結合常數且避免使用固相裝置實施測量所伴隨的擴散障壁層偽像。本發明方法由于不需要在生物傳感器儀器上進行連續測量因此使其可用于處理其他樣品而提供另外優點。所述方法容許準確測定在數小時至數天或更長間隔內緩慢發生解離的反應的解離速率。
文檔編號G01N31/00GK101365943SQ200680052516
公開日2009年2月11日 申請日期2006年12月19日 優先權日2006年1月11日
發明者克麗斯塔·利婭·威特, 羅伯特·朱克, 貝蒂娜·海德克爾 申請人:佛特比奧公司