免疫測定裝置和方法

專利名稱：免疫測定裝置和方法
技術領域：
本發明涉及一種在臨床檢查等領域中利用的免疫測定裝置，涉及 一種能夠簡便、迅速且高靈敏度地定量測定被檢體中的測定對象物的 免疫測定裝置。
背景技術：
作為測定血液、尿等生物試樣中所含物質的方法，正在開發使用 方法簡便、能夠在短時間測定的簡易型的免疫測定裝置。近年，這種 裝置被廣泛地用于緊急檢査、床旁等的檢査等，其重要性和實用性正 在增大。
作為簡易型的免疫測定裝置，已知以免疫色譜法、流室法、免疫 傳感器法等為原理的測定裝置。這些裝置所采用的方法基于下述原理-在添加試樣后，在進行抗原抗體反應的同時在載體上將溶液上下或左 右移動，最終獲得相當于測定對象物量的信號，裝置的構造也比較簡 單。作為信號的檢測法， 一般采用在抗體上標記以膠體金或著色膠乳 為代表的著色顆粒，讀取檢測線或檢測面的呈色的方法。其它的方法 中，也利用測定操作復雜的由酶反應產生的呈色等。
這些簡易型的免疫測定裝置基本上用作判定測定對象物有無的定 性用。但是，近年，為了進行更有益的診斷，嘗試利用這些裝置進行 定量化。這些嘗試基于測定后的檢測線的色調依賴于測定對象物的量 (濃度)而變化的原理。具體而言，作為譯解檢測線的色調的方法，
開發了使用反射率計進行測定的方法、使用CCD圖像傳感器進行圖像 分析的方法(日本專利特開平8-334511、日本專利特開2000-266751)、 根據電導率進行測定的方法(日本專利特開2001-337065)等。
另外，現有技術還公開了涉及下述方法的裝置，該方法是在同樣 的免疫測定裝置中，在全部的標記抗體中，捕捉未反應的標記抗體， 測定未被捕捉的標記抗體(即發生反應的標記抗體)。例如，美國專利 US5705338號、日本專利特開平4-16745號、日本專利特開2003-262636 號等。但是，這些裝置不具有充分的定量性。再者，作為同樣的現有 技術，日本專利特開平7-151757中公開了關于抗獨特型抗體的使用。
此外，近年，被稱為Lab on Chip (芯片實驗室)的技術受到矚目。 該技術是一種根據分析對象的種類而在被稱為臨床分析芯片、環境分 析芯片、基因分析芯片(DNA芯片)、蛋白質分析芯片(蛋白質組芯 片)、糖鏈芯片、色譜芯片、細胞分析芯片、制藥篩選芯片等的數平方 厘米大小的基板(生物芯片)上進行混合、反應、分離、測定和檢測 等的技術。例如，在日本專利特開2001-4628中記載了在這種微芯片上 進行各種通過抗原一抗體反應的免疫分析的方法。

發明內容
上述的定量化的嘗試，是一種意旨利用機器測定并定量化由定性 用的裝置獲得的檢測結果的應用研究。因此，呈色的色調或強度差微 妙，定量范圍狹窄，很難確保充分的定量性。雖然在檢測方法中利用 酶反應的情況下，對定量化和高靈敏度化有效，但是需要洗凈操作和 試液的添加等的操作，還存在背景升高等課題。
另外，在使用上述微芯片時，需要洗凈操作，或者需要向進行反 應的部位供給多種溶液而使其反應等的煩雜的工序，存在測定需要耗 費較長時間這樣的問題。再者，還需要多個注入部和導入部，使芯片 的占有面積增大，存在不能制得小型且簡易的微芯片的問題。
本發明就是鑒于上述問題點而作出的發明，本發明的目的在于提 供一種在發揮簡易型的免疫測定裝置的優點的同時，即，在具有使用 方法簡便、 一步操作、能夠短時間測定等原有性質的同時，能夠實現 能夠對應各種抗原、準確而快速的定量分析的免疫測定裝置。
為此，本發明的發明人進行了深入的研究，結果想到，通過構成 在裝置內具有四個不同部位的裝置，能夠進行能實現準確且迅速的定 量分析的免疫測定，從而完成本發明。
艮口，本發明的免疫測定裝置，其能夠通過使試樣中的作為測定對 象物的抗原與標記抗體特異地結合、測定其結合體的標記物而測定抗
原量，在1個裝置內，具有下述4個部位(1)使試樣中的抗原與作
為能夠與上述抗原特異地結合的標記抗體的第一抗體反應的第一部
位；(2)使未與抗原結合的第一抗體與作為結合有生物素或抗生物素 蛋白的抗體的第二抗體反應的第二部位；(3)當第二抗體為生物素結 合抗體時，以不能移動至第四部位的方式將抗生物素蛋白固定在固定 單元上，當第二抗體為抗生物素蛋白結合抗體時，以不能移動至第四 部位的方式將生物素固定在固定單元上，以上述被固定的抗生物素蛋 白或生物素補足第二抗體的第三部位；以及(4)檢測與抗原結合的第 一抗體的標記物的第四部位。并且，以溶液能夠依次移動經過各個部 位的方式構成。第一抗體是抗體部分為F(ab')片段或還原IgG、F(ab') 片段或還原IgG按特定的結合比與標記物結合的標記抗體，包含在第 一部位或其鄰接部；第二抗體是結合有生物素或抗生物素蛋白的抗體， 是針對第一抗體的抗獨特型抗體，并且是不能與抗原和第一抗體的結 合物結合的種類的抗獨特型抗體，包含在第二部位或其鄰接部。
在本發明的免疫測定裝置中，優選相對于測定對象物含有過量的 第一抗體，并優選相對于第一抗體也含有過量的第二抗體。第一抗體 能夠利用例如酶標記。再者，還可以在第一部位的鄰接部設置抗體保 持部，在那里保持第一抗體。
在第四部位能夠保持用于檢測標記物的試劑。此外，也能夠在第 四部位的鄰接部設置底物保持部，在該部位預先保持該試劑。作為該 試劑，可以例示電子傳遞介質和/或顯色底物等。所謂底物保持部， 意指預先或者其即將使用之前保持用于檢測標記物的試劑的全部或部 分的部位。
本發明的免疫測定裝置，也能夠制成生物芯片狀的裝置。此時， 四個部位分別由微小的空間構成，作為固定單元，能夠使用例如微顆 粒，能夠設定為通過不使作為固定單元的微顆粒流通的通道部隔離第 三部位和第四部位的形態。這樣的生物芯片狀的裝置中，在第四部位 形成一對電極，能夠采用電化學方法檢測標記物。
本發明還涉及一種免疫測定方法，該方法使試樣中的作為測定對 象物的抗原與作為與上述抗原特異地結合的標記抗體的第一抗體反 應，接著使未反應的第一抗體與作為結合有生物素或抗生物素蛋白的 抗體的第二抗體反應，之后，當上述第二抗體為生物素結合抗體時，使用抗生物素蛋白捕捉上述第二抗體，當上述第二抗體為抗生物素蛋 白結合抗體時，使用生物素捕捉上述第二抗體，檢測未被捕捉的抗原
和第一抗體的結合物。上述第一抗體是抗體部分為F (ab')片段或還 原IgG、 F (ab')片段或還原IgG按特定的結合比與標記物結合的標記 抗體；上述第二抗體是針對第一抗體的抗獨特型抗體，并且是不能與 抗原和第一抗體的結合物結合的種類的抗獨特型抗體。
在本發明的免疫測定方法中，同樣優選相對于測定對象物含有過 量的第一抗體，并優選相對于第一抗體也含有過量的第二抗體。此外， 優選采用電化學方法或光學方法進行測定對象物的檢測。
發明的效果
利用本發明的免疫測定裝置，能夠操作簡便、迅速且高靈敏度地 進行定量測定。特別是通過利用生物素一抗生物素蛋白的結合性，能 夠在更短的時間內完成測定。因此，能夠用于緊急檢査、床旁的診察， 在醫療領域內的實用性極高。同時，能夠容易地應用于對各種測定對 象抗原的檢測，通用性高。


圖1為顯示本發明的測試條狀的裝置的一個實施方式的平面圖。 圖2為顯示本發明的測試條狀的裝置的另一個實施方式的平面圖。 圖3為顯示本發明的生物芯片狀的裝置的一個實施方式的平面圖 和剖面圖。
圖4為顯示本發明的生物芯片狀的裝置的另一個實施方式的平面 圖和剖面圖。
圖5為顯示本發明的生物芯片狀的裝置的又一個實施方式的平面 圖和剖面圖。
圖6為顯示試驗例1中得到的反射率與人CRP的濃度之間的關系 的標準曲線。
圖7為顯示試驗例2中得到的吸光度變化率與人CRP的濃度之間 的關系的標準曲線。
圖8為簡潔地顯示本發明的測定原理的圖。
符號說明
1 第一部位
2 第二部位
3 第三部位
4 第四部位
5 裝置
6 支持體
11 抗原
12 第一抗體(標記抗體)
13 第二抗體
14 當第二抗體為生物素結合抗獨特型抗體時，表示抗生物素蛋白； 當第二抗體為抗生物素蛋白結合抗獨特型抗體時，表示生物素
15 當第二抗體為生物素結合抗獨特型抗體時，表示生物素；當第二 抗體為抗生物素蛋白結合抗獨特型抗體時，表示抗生物素蛋白
31 微小流路
32 通道部
33 注入口
41 微顆粒
42 抗體保持部
43 底物保持部 51 電極
具體實施例方式
以下，更詳細地說明本發明。
本發明是能夠使試樣中的作為測定對象物的抗原與標記抗體特異 地結合、通過測定其結合體的標記物而測定抗原量的免疫測定裝置， 具有下述的四個部位，并以溶液能夠依次移動經過各個部位的方式構 成。
第一部位，是使試樣中的抗原與能夠與上述抗原特異地結合的標 記抗體的第一抗體反應的部位。試樣溶液既能夠直接添加在該部位， 也能夠在上游部設置試樣添加部，以使試樣溶液移動至第一部位的方
式構成。在該第一部位中，在試樣溶液添加后，第一抗體和抗原與第 一抗體的結合物不被保持，而向第二部位移動。第一抗體是在針對試
樣中的作為測定對象物的抗原的單克隆抗體的F (ab，)片斷或還原IgG 上結合有在通常的免疫測定法中使用的各種標記物的抗體，是F (ab') 片斷或還原IgG與標記物按特定的結合比，即1 : 1 1 :n (n為整數， 其中，優選1 10)中的任一比例結合的抗體，包含在第一部位或其鄰 接部。此外，將單克隆抗體制成F (ab')片斷、標記物與F (ab')片 斷的結合，能夠采用公知的方法。并且，優選通過精制完全除去混入 最終結合物中的未反應的酶或未標記的抗體。
在本裝置中使用這種第一抗體，對于提高靈敏度和定量性非常有 利。在第一抗體的調制中， 一般使用單克隆抗體，通常使用IgG。當直 接將IgG作為第一抗體使用時，由于IgG通常具有二價結合性，所以 在與作為測定對象物的抗原反應時，如果除去未反應的物質，則會混 合存在有第一抗體與抗原的結合比為1 : 1或1 : 2的結合物。這是因 為在一分子的IgG中所包含的結合部位上，抗原經常并不全部結合。 結合比混合存在的結合物一旦通過第二部位，不但未反應的物質被捕
捉，而且結合比為i : i的結合物也被捕捉，這就成為使靈敏度和定量
性降低的主要原因。對此，本發明使用了一價結合性的F (ab，)片斷 或還原IgG得到的半分子的IgG，因此，如果除去未反應的物質，則僅
存在第一抗體和抗原的結合比為i : i的結合物，從而能夠提高靈敏度
和定量性。
第一抗體可以預先保持在第一部位。此外，也可以在第一部位的 鄰接部設置抗體保持部，在那里保持第一抗體。該抗體保持部，例如， 能夠設定與第一部位等相同的形狀和尺寸等。該抗體保持部能夠作為 添加試樣溶液的試樣添加部，也能夠臨時保持試樣溶液，具有向第一 部位導入試樣溶液和/或第一抗體的功能。
第一抗體的標記物，可以使用酶、色素、氧化還原物質、著色顆 粒、磁性顆粒、熒光物質、發光物質、二茂鐵等一般的用于免疫測定 的物質，能夠根據需要的測定靈敏度等適當地選擇。在使用酶的情況 下，優選使用不易受底物影響的酶、生物體內或試樣中幾乎不存在的 酶。例如，可以列舉過氧化物酶、氧化酶類的酶等。作為氧化酶類的
酶，可以使用葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、乙醇氧化酶等。作為其 它的酶，雖然可以列舉脫氫酶類的酶，但是由于其為在生物體內不存 在的酶，所以幾乎不能低價購買得到。在使用與源自生物體的酶具有 相同作用的源自微生物或細菌等的酶的情況下，只要以使第一部位或 第二部位含有針對該酶的抗體等、除去源自人體的酶的方式構成，就 能夠利用。另外，還能夠利用針對酶的底物或輔酶的特異性。例如，
在源自Leuconostoc mesenteroides (腸膜樣明串珠菌)的葡糖-6-磷酸脫 氫酶中使用NAD作為輔酶的情況下，由于源自人的主酶為NADP依 賴性，所以源自人的酶不發生作用，因此，即使在試樣中存在也沒有 問題。
第一抗體，通常優選相對于抗原含有過量的第一抗體，但是也能 夠預先設定測定范圍，使用適于該范圍的量。例如，預先設定能夠測 定的抗原濃度或其范圍，使用按摩爾比計，其設定的濃度或范圍上限 為1 100倍的量是合適的。混合試樣溶液與第一抗體使二者反應時的 條件沒有特別限定，可以根據打算測定的試樣溶液、第一抗體的種類 等適當地設定。溫度優選不影響這些物質的活性的條件，例如20 40 "C左右。時間能夠根據適當裝置的形態設定，可以為30秒鐘 10分鐘 左右。
第二部位是使未與抗原結合的第一抗體與第二抗體反應的部位。 在該第二部位中，從第一部位移動過來的溶液與第二抗體混合并反應， 保持該狀態而向第三部位移動。第二抗體是結合有生物素或抗生物素 蛋白的抗體，是針對第一抗體的抗獨特型抗體，并且是不能與抗原和 第一抗體的結合物結合的種類的抗獨特型抗體，包含在第二部位或其 鄰接部。
將生物素與抗體結合能夠采用公知的方法。例如，在利用抗體的 氨基的情況下，可以使用N-羥基琥珀酰亞胺一生物素。另外，在利用 還原IgG、或者用胃蛋白酶消化而形成F (ab')片段、再還原而得到 的巰基的情況下，可以使用馬來酰亞胺一生物素。該情況下，為提高 與抗生物素蛋白的反應性，優選使用導入有間隔區(spacer)的生物素 化試劑。此外，優選通過精制完全除去混入最終結合物的未反應的生 物素化試劑或未標記的抗體。 將抗生物素蛋白與抗體結合能夠采用公知的方法。例如，可以使
還原IgG、或者用胃蛋白酶消化而形成F (ab，)片段、再還原而得到 的巰基與導入有馬來酰亞胺基的抗生物素蛋白反應。此時，向抗生物 素蛋白導入馬來酰亞胺基時，能夠利用4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-l-羧酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯等市售的導入試劑。此外，優選通過精制完 全除去混入最終結合物的未反應的抗生物素蛋白化試劑或未標記的抗 體。
這里使用的抗獨特型抗體，意指識別第一抗體的抗體部分具有的 抗原結合部位的固有結構的單克隆抗體。抗獨特型抗體已知存在能夠 抑制抗原與針對該抗原的抗體結合的類型和不能抑制的類型。本發明 中能夠使用的抗獨特型抗體為前者，即，是指不能與抗原和第一抗體 的結合物結合的類型的抗獨特型抗體。
抗獨特型抗體能夠按照通常的方法容易地制作。例如，在制作小 鼠由來的單克隆抗體的抗獨特型抗體時，能夠將作為抗原的單克隆抗 體作為KLH復合物給予小鼠，然后按通常的單克隆抗體的制作方法制 作。另外，產生目的類型的抗獨特型抗體的雜交瘤，能夠通過采用 ELISA等的篩選容易地獲得。因此，本發明中能夠使用的抗獨特型抗 體與通常的單克隆抗體一樣，能夠容易且大量地制作。
本發明中，在第二部位中使用的第二抗體的量，因為需要幾乎完 全地捕捉未反應的第一抗體，所以相對于第一抗體，需要過量。具體 而言，優選使用按照摩爾換算10倍以上的量。這里，雖然也能夠使用 抗原代替抗獨特型抗體，但是根據實用的觀點考慮，該情況限定于穩 定性優良的抗原、能夠以低成本大量制備的抗原，因而測定對象物受 到限定，因此，本發明的裝置中不使用抗原。
第二部位的反應條件沒有特別限定，能夠適當地設定。溫度優選 不影響這些物質的活性的條件，例如20 4(TC左右。時間能夠根據適 當裝置的形態設定，可以為30秒鐘 10分鐘左右。
第三部位，是當第二抗體為生物素結合抗體時，以不能移動至第 四部位的方式將抗生物素蛋白固定在固定單元上，當第二抗體為抗生 物素蛋白結合抗體時，以不能移動至第四部位的方式將生物素固定在 固定單元上，以上述被固定的抗生物素蛋白或生物素補足第二抗體的
部位。在該第三部位中，通過生物素與抗生物素蛋白的結合性，與未 反應的第一抗體結合的第二抗體以及未反應的第二抗體被固定單元捕 捉而不能向第三部位移動，另一方面，抗原和第一抗體的結合物由于 不含抗生物素蛋白或生物素，所以不被固定單元捕捉，而向第四部位 移動。此外，本發明中使用的抗生物素蛋白能夠使用任何來源的抗生 物素蛋白。例如，能夠使用來自卵白的抗生物素蛋白、來自放射菌的 抗生物素蛋白鏈菌素等。
固定單元是能夠固定抗生物素蛋白或生物素的單元，只要不影響 抗生物素蛋白一生物素的反應，則沒有特別限定，能夠根據測定對象 物以及標記抗體的種類、抗獨特型抗體的種類等適當調整。其形狀可 以列舉過濾器狀、紡織物狀、微顆粒狀、纖維狀等形狀的載體。作為 材質，可以列舉玻璃、濾紙、尼龍、聚苯乙烯等。作為過濾器狀、紡 織物狀、纖維狀的載體，優選玻璃纖維膜、多孔性膜、濾紙、尼龍膜 等多孔質體。作為微顆粒的載體，優選玻璃珠、聚苯乙烯等聚合物珠、 瓊脂糖、殼聚糖等多孔質載體。抗生物素蛋白或生物素的固定方法能 夠采用物理吸附、共價鍵、離子鍵、交聯、靜電相互作用等公知的方 法中的任一種方法。再者，作為固定的方法，優選不影響抗生物素蛋 白一生物素的反應的方法。
如本發明那樣，使用抗生物素蛋白或生物素作為在固定單元上固 定的物質，有利于縮短反應時間。當固定單元為微顆粒且以分散在緩 沖液等的溶液中的狀態下存在時，該反應時間縮短的效果特別顯著。 在反應方式上，也能夠使生物素或抗生物素蛋白未標記的第二抗體直 接結合在這樣的固定單元上，補足未反應的第一抗體。但在該情況下，
需要進行10分鐘 1小時左右的反應。與之相對，已知如果像本發明 那樣利用抗生物素蛋白或生物素，則能夠在30秒鐘 5分鐘、在最適 的條件下為30秒鐘 1分鐘內完全捕捉與未反應的第一抗體結合的第 二抗體以及未反應的第二抗體。這成為對縮短本發明的測定時間做出 巨大貢獻的主要因素。
第四部位是檢測與抗原結合的第一抗體的標記物的部位，為檢測 標記物能夠根據標記物采用公知的檢測方法。用于檢測標記物的試劑 能夠包含在第四部位。這些試劑類既可以全部包含在第四部位，也可
以一部分試劑包含在第三部位、第二部位或第一部位或者其它的部位。 此外，底物保持部能夠以串聯或附加、隔著流路或不隔著流路的方式 與第四部位連接，并能夠采用與第一部位等相同的形狀和尺寸等。標 記物的檢測可以利用例如反射率計、分光光度計、熒光檢測器等實施。 作為用于檢測標記物的試劑類，可以根據標記物適當地選擇。在 標記物為酶的情況下，可以列舉顯色底物、熒光底物、發光底物、有 機酸或無機酸、能夠作為在電極與測定對象物之間可授受電子的電子
移動介質而發揮作用的電子傳遞介質等的1種或2種以上的組合。例 如，在脫氫酶類的酶的情況下，可以使用NAD或NADP、酶底物、硫 辛酸脫氫酶、以及顯色底物的組合。在過氧化物酶的情況下，能夠使 用有機酸或無機酸、以及顯色底物的組合。進而，在氧化酶類的酶的 情況下，能夠使用酶底物、顯色底物、以及過氧化物酶的組合。
作為顯色底物、熒光底物、發光底物，可以列舉l，2-苯二胺(OPD)、 3， 3'， 5, 5'-四甲基聯苯胺(TMBZ)、 2， 2'-聯氮雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、 3-(4-羥基苯基)丙酸(HPPA)、酪胺(Tyramin)、氨基 苯二酰一肼、螢光素等。
作為有機酸或無機酸，可以列舉過氧化氫、甲酸、乙酸等。或者， 也能夠使用使其在裝置內生成的試劑類。例如，作為用于使過氧化氫 在裝置內生成的試劑類，能夠使用葡萄糖和葡萄糖氧化酶。作為使用 例，在兩個地方預先準備保持部，測定開始后混合二者，由此生成過 氧化氫。此外，還能夠在裝置外的部位內保持。
作為電子傳遞介質，例如，可以列舉二茂鐵、鐵氰化堿金屬(鐵 氰化鉀、鐵氰化鋰、鐵氰化鈉等)或其垸基取代物(甲基、乙基、丙 基取代物等)、亞甲藍、吩嗪硫酸甲酯、對苯醌、2， 6-二氯酚靛酚、卩-萘醌-4-磺酸鉀、吩嗪硫酸乙酯、紫精、維生素K等的l種或2種以上 的組合。其中，優選二茂鐵、鐵氰化鉀等。
此外，作為保持這些試劑等的方法，能夠使用將試劑本身直接溶 解或懸浮在不抑制自身功能的溶劑等中等再涂布并干燥的方法、或者 在載體(例如上述的固定單元等)等中混合或分散的方法等、該領域 中公知的方法中的任一種方法。
所謂本發明的測定對象，意指一般臨床檢查等中的檢査對象，具
體而言，意指血液、尿、唾液、分泌液等中含有的各種成分、從組織、 糞便等固態物中提取的提取液等中含有的各種成分等。本發明針對測 定對象物僅需要一種抗體，因此，不僅多個單克隆抗體能夠結合的那 種分子量大的物質可以成為測定對象物，即使只有一個單克隆抗體能 夠結合的低分子物質(半抗原)也可以成為測定對象物。
以上，說明了本發明的免疫測定裝置。在圖8中，簡潔地圖示了 本發明的測定原理。圖中的上部(甲)，用立體圖顯示了裝置5全體。 圖中的箭頭X表示試樣的流動方法。另外，圖中的下部(乙)，經時地 顯示了裝置中發生反應的狀況。即，T=t0，顯示抗原A與第一抗體B 在第一部位被混合的狀態。經過適當的時間， 一旦T41，試樣就經過 第二部位2，通過第三部位3、第四部位4。此時，未與抗原A反應的 第一抗體B，被作為第二抗體的生物素結合抗體C結合，再被第三部 位的抗生物素蛋白結合，而不能從第三部位3移動至第四部位4。另一 方面，與抗原A反應了的第一抗體B，通過第二部位2、第三部位3， 到達第四部位4。這樣，在第四部位4中，只有與抗原A反應了的第 一抗體B被檢測出來。
另一方面，因為使用本發明的免疫測定裝置能夠容易地實施，所 以省略關于本發明的免疫測定方法的進一步的說明。以下，作為本發 明的裝置的一個例子，詳細地說明也被稱為試驗片的測試條狀的裝置、 生物芯片狀的裝置。
首先，在圖1和圖2中，例示了測試條狀的裝置。裝置5由第一 部位l、第二部位2、第三部位3和第四部位4構成。這些各部位可以 由多種材質、形態構成，其中，優選以玻璃纖維膜、多孔性膜、濾紙、 尼龍膜等多孔質載體構成。己被提供給第一部位的試樣溶液或其一部 分被依次展開或輸送，通過第二部位，再通過第三部位，到達第四部 位。作為第三部位的固定單元，優選使用過濾器狀、紡織物狀、纖維 狀的多孔質體。當使用微顆粒狀的物質作為固定單元時，優選使用顆 粒的尺寸大于構成第三部位的多孔質載體的孔徑的顆粒。當在第一部 位的上游部設置試樣添加部時，例如，能夠利用血球分離膜、離子交 換膜等。這里，雖然也能夠在一種多孔載體上構成各部位，但是也能 夠在各部位分別選擇使用最佳的載體。在各部位分別采用不同材質的情況下，各部位需要以相互接觸的方式配置，以便不阻礙溶液的流動。 各部位的尺寸并不特別限定，雖然需要具有用于實現該目的足夠的尺 寸，但是能夠根據這些物質的種類、量、反應時間等適當地設定。作 為各部位的載體的組合，可以例示第一部位使用玻璃纖維膜、第二部 位和第三部位使用硝化纖維膜、第四部位使用濾紙這樣的實施方式。 此外，優選在由塑料制的片材等構成的支持體上配置各部位，這種裝
置的例子如圖2所示。在圖2中，在支持體6上，配置有第一部位l、 第二部位2、第三部位3、以及第四部位4，這些部位構成了裝置5。
其次，在圖3和圖4中，例示了生物芯片狀的裝置。第一部位l、 第二部位2、第三部位3和第四部位4，每個部位均由微小的空間構成， 分別通過流路或不通過流路直接、串聯連接。在圖3 圖5中，設定了 通過微小流路31連接的結構。已被提供給第一部位的試樣溶液或其一 部分被依次輸送，通過第二部位，再通過第三部位，到達第四部位。 為了調節或計量向下一個部位移動的反應液量，也可以在第一部位、 第二部位、第三部位和第四部位的每個區間設置容積為0.5 1.5pL的 計量部。在固定單元為微顆粒41的情況下，第三部位3和第四部位4 通過使固定單元不能通過的通道部32隔離。這里，優選在第二部位與 第三部位之間也設置與通道部32相同的構成物。在第一部位、第二部 位和第四部位的鄰接部，還能夠設置用于保持反應所需的試劑等的部 位(抗體保持部42、底物保持部43)。該各部位與抗體保持部和/或 底物保持部以串聯或附加、通過流路或不通過流路的方式連接。在設 置底物保持部的情況下，能夠設定與第一部位等相同的形狀和尺寸等。 由此，能夠將試劑類預先或其即將使用之前保持在底物保持部。連接 各部位的流路的形狀、尺寸等并不特別限定，例如，可以列舉截面積 為0.01ixn^ 100mn^左右、長度為1(im 100mm左右的流路。
第一部位，作為獨立于其它部位的空間被規定，其尺寸優選為 10々 1031111113左右。此外，形狀只要適于達到混合目的，則沒有特別 限定。平面和截面的形狀均可以為例如四邊形、梯形等多邊形和其角 部分圓潤的形狀、圓形或左右不對稱的不均勻形等的任一形狀。在第 一部位或其鄰接部，形成有從外部注入試劑溶液的注入口 33。在第一 部位可以預先地保持第一抗體。另外，當在第一部位的鄰接部設置抗 體保持部時，該抗體保持部可以代替上述注入試樣溶液的注入口或者 配備注入口而形成。該抗體保持部，例如，能夠設定為與第一部位等 相同的形狀和尺寸等。
第二部位作為獨立于其它部位的空間被規定，其尺寸優選為10—2 1031111113左右。此外，其形狀與第一部位同樣，能夠設定各種形態。另 外，在第二部位可以預先保持第二抗體。或者可以在第二部位的鄰接 部設置抗體保持部，保持第二抗體。該抗體保持部，例如，可以設定 為與第二部位等相同的形狀和尺寸等。
第三部位作為獨立于其它部位的空間被規定，在其內部含有固定 單元。因此，第三部位需要具有用于保持固定單元的足夠的空間，但 是能夠根據固定單元的種類、量等適當地設定。例如，優選為10—2 1031111113左右。此外，其形狀與第一部位或第二部位同樣，能夠設定各
種形態。
固定單元收納于第三部位，優選使用微顆粒狀的物質，其直徑優
選為10(xm lmm左右。
通道部優選具有比存在于第三部位的固定單元的直徑小的直徑。 這里，所謂"直徑"，根據固定單元和/或通道部的形狀，可以意指寬 度、高度、長度等。適當的含義是，固定單元的"直徑"意指1單位 的固定單元的最大長度(寬度)，通道部的"直徑"意指通道部的截 面的最小長度(寬度)。即，通道部，為了使存在于第三部位的固定單 元僅停留在第三部位內，在第三部位的出口 (優選也在入口)，提供使 固定單元不能通過的功能或形狀。此外，在通道部為流路自身的情況 下，例如，可以是其直徑小于固定單元的直徑的流路，也可以是在流 路的一部分中形成1個以上的凸部、含有該直徑被縮小的部分的流路。
第四部位作為獨立于其它部位的空間被規定，能夠根據其尺寸和 形狀、檢測方法(手法)、試樣溶液的種類和量等適當地設定。具體而 言，能夠設定10—2 1031111113左右的大小的各種形狀。例如，在檢測方 法為光學方法的情況下，在第四部位中，為了能夠對由試樣溶液、標 記物或底物生成的生成物照射光并檢測該光，需要能夠確保規定長度 的光路的形狀和尺寸。再者，在檢測方法為電化學方法的情況下，如 圖5所示，在第四部位中，為了能夠檢測包括試樣溶液在內的溶液的
電荷，需要以由導電材料制得的一對電極51與該溶液接觸的方式形成。 這里，上述一對電極，通常，只要是能夠作為電極發揮功能的材 料、尺寸和形狀，則沒有特別限定，能夠使用任一種電極。例如，可 以列舉石墨、碳、碳纖維織物等、金、鉑、銀、銅、鋁等金屬或合金、 Sn02、 ln203、 W03、 Ti02等導電性氧化物等的單層或兩層以上的疊層 構造。該電極可以通過在生物芯片上將導電材料片粘貼、埋設一部分 等形成，也可以采用使用了導電劑糊的絲網印刷法等的印刷法形成。
這樣，通過采用電化學方法，能夠不使用現有的光學檢測裝置那 種大規模、價格昂貴且大型的裝置，而通過檢測電流或電壓等簡便的 方法，進行被測物質的分析。因此，能夠減少分析所花銷的費用，與 此同時，能夠實現使用更小型的生物芯片以及更小型且便宜的分析裝 置。
上述生物芯片能夠使用與上述的用各種名稱稱呼的現有的芯片相 同的材料形成。例如，可以列舉PET(聚對苯二甲酸乙二醇酯)、PDMS (聚二甲基硅氧烷)、PMMA (聚甲基丙烯酸甲酯)、PC (聚碳酸酯)、 PP (聚丙烯)、PS (聚苯乙烯)、PVC (聚氯乙烯)、聚乙烯、聚硅氧烷、 烯丙酯樹脂、環烯烴聚合物等有機化合物、或ZEONOR、硅、石英、 玻璃、陶瓷等無機化合物等。
該生物芯片例如能夠通過利用例如熔接、粘結劑、超聲波處理等， 粘合在一方或雙方具有由凹部產生的各種形狀的圖形的第一基板和第 二基板而簡便地制造。具體而言，準備具有與所期望的第一^^第四部 位、保持部、流路等對應的形狀的模具。該模具能夠通過機械加工形 成。接著，在該金屬模內將樹脂模塑等，得到轉印有各部位形狀的基 板。最后，將該基板以圖形彼此相對的方式兩張粘合在一起。再者， 也可以僅一方使用具有與第一 第四部位、保持部、流路等對應的形 狀的基板，另一方使用平板基板。另外，還可采用注射成型法或轉印 法等，代替使用模具的模塑法。還可在平板基板的一方或雙方直接進 行光刻工序、機械加工等，制得轉印有與第一 第四部位、保持部、 流路等對應的形狀的基板。而且，本發明的生物芯片，其操作(例如 試樣等的導入、混合、攪拌、試樣等的移動、檢測等)，既可以采用手 動方式進行，也可以采用機械方式進行。例如，攪拌和混合、試樣等
的移動，能夠采用使用泵的方法、利用振動或離心力的方法。 實施例
以下，列舉本發明的實施例，更詳細地說明本發明。但本發明并 不限于這些實施例。 1.生物素標記抗獨特型抗體的制作
(1) 免疫原的制作
在含有市售的抗人CRP小鼠單克隆抗體(Oriental Yeast制造)5mg 和KLH (Merck制造)4mg的0.1M磷酸緩沖溶液(pH6.7) 2mL中， 添加戊二醛(70%) 3pL，在室溫下反應1小時。反應后，使用PBS緩 沖液透析，作為免疫原。
(2) 免疫化
將混合上述免疫原的0.5mg/mL溶液lmL和弗式完全佐劑lmL后 乳化而得到的混合物20(^L腹腔內注入給8周齡的BALB/c小鼠。其 后，每隔2周3次腹腔內注入上述免疫原一弗式不完全佐劑等量混合 乳化液20(HiL。而且，自第3次的注入起2周后，靜脈注射上述0.5 mg/mL的免疫原100pL。
(3) 脾細胞的細胞融合
3日后，從上述小鼠摘除脾臟，使脾細胞懸浮在DMEM培養基中， 進行洗凈。另一方面，培養小鼠骨髓瘤細胞株P3X63Ag8 (大日本制藥 制造)，使其進入對數增殖期，用于細胞融合，并通過離心分離收集。 采用PEG法(PEG4000)實施細胞融合。
(4) 雜交瘤的制作和篩選
雜交瘤使用添加有10%FCS的DMEM培養基和HAT培養基培養， 并采用下述的方法篩選。雜交瘤培養上清的一次篩選，通過使用作為 固相抗原的由抗人CRP小鼠單克隆抗體經胃蛋白酶消化而得到的精制 F (ab') 2片段、作為二次抗體的市售的HRP標記山羊抗小鼠IgG (Fc) 抗體(ICN社制造)的夾心ELISA法實施。進而，作為二次篩選，使 CRP與上述固相抗原預先反應，進行同樣的操作，由此判定是否屬于 由CRP引起結合抑制的類型。陽性孔的克隆和篩選的結果為，作為特 異地識別抗人CRP單克隆抗體、并產生由CRP引起結合抑制的抗體的
雜交瘤，得到13D和14A這2個克隆。
(5) 抗體的調制
在上述得到的雜交瘤細胞株中，擴大培養13D，采集抗獨特型抗 體。利用蛋白A柱(AmershamBiosciences制造)，精制培養上清。
(6) 生物素標記物的制作
使用NHS-Biotin (Pierce社制造)，按照試驗設計(protocol),對 步驟(5)中得到的抗體進行生物素標記。此外，通過凝膠過濾除去未 反應的生物素化試劑。 2. HRP標記抗人CRP抗體的制作
(1) 蛋白酶消化
在0.1M乙酸緩沖液(pH4.0) lmL中，混合抗人CRP小鼠單克隆 抗體5mg和蛋白酶(SigmaAldrich制造)0.3mg，在37'C下反應24小 時。反應后，通過凝膠過濾精制，得到F (ab，) 2片段1.8mg。此外， 抗人CRP小鼠單克隆抗體使用上述同樣的市售品。
(2) 還原
采用超濾膜，在含有5mM的EDTA的0.1M磷酸緩沖液(pH6.5) 中置換F (ab') 2片段溶液。在該抗體液中，添加0.1M胱胺溶液，在 37。C下反應2小時。反應后，通過凝膠過濾精制，得到F (ab')片段 1.0mg。
(3) HRP的馬來酰亞胺化
在0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)750^iL中，溶解辣根過氧化物酶(HRP， Roche Diagnostics制造)5mg。在DMF 120(iL中，溶解4-(N-馬來酰亞 胺甲基)環己烷-l-羧酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Zieben Chemicals東京) 2mg，將75pL該溶液添加至HRP溶液中，在3(TC下反應1小時。反 應后，通過凝膠過濾精制，得到馬來酰亞胺化HRP2.6mg。
(4) 結合物的調制
將F (ab，)片段1.0mg與馬來酰亞胺化HRP1.0mg混合，在冷藏 的條件下反應24小時。反應后，通過凝膠過濾精制，在濃縮操作后， 得到1.2mg/mL的HRP標記抗人CRP抗體液。 實施例l測試條狀的CRP測定裝置的制作 (1)標記區域用濾紙(第一部位)的調制在PBS緩沖液10mL中，溶解BSA10mg、葡萄糖10mg。接著， 使用該溶液，5000倍稀釋實施例2中制作的HRP標記抗人CRP抗體。 再在該溶液中浸漬濾紙(Whatman Japan制造)，干燥后，按12mmX 5mm裁剪o
(2) 含有生物素標記抗體的濾紙(第二部位)的調制 在PBS緩沖液10mL中，溶解BSA10mg、蔗糖10mg。接著，使
用該溶液，調制實施例1中制作的生物素標記抗獨特型抗體的20嗎/mL 溶液。再在該溶液中浸漬濾紙(Whatman Japan制造)，干燥后，按1 Omm X5醒裁剪。
(3) 捕捉區域用膜(第三部位)的調制 使用PBS緩沖液調制抗生物素蛋白lmg/mL溶液。接著，在該溶
液中，浸漬已按15mmX150mm裁剪的高流量膜(MILLIPORE制造)， 并干燥。再將其放入3mg/mL酪蛋白溶液中，放置30分鐘后，取出并 干燥，按15mmX5mm裁剪。
(4) 檢測區域用濾紙(第四部位)的調制
在PBS緩沖液lmL中，溶解TMBZ 5mg、吡喃糖氧化酶30單位。 再在該溶液中浸漬濾紙(Whatman Japan制造)，干燥后，按7mmX5mm 裁剪。
(5) 試驗片的組裝
在作為支持體的塑料板(60mmX5mm)上，自上端起，粘貼寬度 為25mm的兩面膠條。接著，在距該塑料板的上端約5mm的地方，粘 貼固定上述(3)中得到的膜。接著，粘貼固定(4)中得到的濾紙， 使其與(3)中得到的膜的上端重疊約2mm。進而，粘貼固定(2)中 得到的濾紙，使其與(3)中得到的膜的下端重疊約2mm。并且，粘貼 固定(1)中得到的濾紙，使其與(2)中得到的膜的下端重疊約2mm。 試驗例l使用測試條狀的裝置進行CRP定量測定
使用含有O、 7.5、 15、 30、 60、 120ng/mL的CRP的溶液作為被 檢體。在實施例3中制作的試驗片的第一部位添加被檢體30^iL，開始 反應。5分鐘后，利用色差計測定第四部位的690nm的反射率。圖6 表示了測得的反射率與人CRP的濃度之間的關系的標準曲線。已判明， 如果應用本發明，則能夠從低濃度起顯示出良好的標準曲線，從而能
夠對CRP定量。
實施例2生物芯片狀的CRP測定裝置的制作
生物芯片的制作，通過粘合在一方具有由凹部形成的串聯配置第 一部位、第二部位、第三部位和第四部位、并在第三部位與第四部位 之間設有通道的形狀的圖形的第一基板和第二基板進行。在第一部位、 第二部位、第三部位和第四部位的各部位之間，設置有容積為0.5 1.5(iL的計量部。
第一部位形成50mm2 (平面面積)Xlmm (深度)左右的空間。 作為第一抗體，注入10pL實施例2中制作的HRP標記抗人CRP抗體 液0.05mg/mL溶液。
第二部位形成50mm2 (平面面積)Xlmm (深度)左右的空間。 作為第二抗體，注入5pL實施例1中制作的抗獨特型抗體液4.2mg/dL 溶液。
第三部位形成50mm2 (平面面積)Xlmm (深度)左右的空間。 向其中導入10pL固定有抗生物素蛋白的瓊脂糖凝膠(抗生物素蛋白結 合量10mg/mL的凝膠)。固定有抗生物素蛋白的瓊脂糖凝膠的調制， 使用NHS活性化瓊脂糖(AmershamBiosciences制造)，在凝膠上固定 抗生物素蛋白的方法采用生產廠商推薦的方法。
第四部位，為了便于采用光學檢測法測定吸光度，形成長度100mm 左右、截面積lmm2左右的形狀。作為顯色試液，注入SAT-Blue (同 仁化學研究所制造)20pL。
在第三部位與第四部位之間，設置使固定單元不能通過的通道部， 寬度設定為10(Him左右，深度設定為200pm左右。此外，使用微小流 路，串聯連接第一部位、第二部位、第三部位和第四部位。 試驗例2使用實施例2的生物芯片狀裝置進行CRP定量測定
使用含有0、 2.5、 5、 7.5、 10mg/dL的CRP的溶液作為被檢體。 向實施例2中制作的生物芯片的第一部位添加被檢體1.5^L。接著，使 溶液依次通過第一部位、第二部位、第三部位。各部位之間進行的溶 液計量一般采用周知的手法。此時，利用離心力輸送液體，并通過因 離心力而引起的湍流進行混合。最后，在第四部位測定670nm的吸光 度的變化速度。圖7顯示了測得的吸光度變化率與人CRP的濃度之間
的關系的標準曲線。己判明，如果應用本發明，則能夠從低濃度起顯
示出良好的標準曲線，從而能夠對CRP定量。
實施例3使用電化學檢測方法的生物芯片狀的CRP測定裝置的制作
本實施例的生物芯片如圖5所示那樣，在第四部位形成一對由炭 黑制成的電極25，并且填充氧化還原性物質，除此之外，與實施例2 的生物芯片同樣構成。電極長度為10mm左右，厚度為15pm左右，由 碳糊形成。該電極配置在與構成生物芯片的下部基板的第四部位相對 應的位置上。此電極以這樣的方式設計當將上部基板貼合在下部基 板上時，電極的一部分位于生物芯片內側，而另一部分露出。此外， 向第四部位注入5mM的過氧化氫和3mM的二茂鐵作為底物，以代替 SAT-Blue。
試驗例3使用實施例3的生物芯片狀的裝置的CRP定量測定
向該生物芯片添加含有CRP的被檢體1.5pL，使溶液依次通過第 一部位、第二部位、第三部位。在第四部位，使用作為標記物的酶， 將二茂鐵變換為二茂鐵離子(Fc+)，再將其在電極上還原，通過進行這 種氧化還原反應，測定當時產生的電流值。因為該電流值與CRP和標 記抗體的復合物的濃度成比例，所以能夠定量地測定CRP。
權利要求
1. 一種免疫測定裝置，其能夠通過使試樣中的作為測定對象物的抗原與標記抗體特異地結合、測定其結合體的標記物而測定抗原量，其特征在于在1個裝置內，具有下述4個部位(1)使試樣中的抗原與作為能夠與所述抗原特異地結合的標記抗體的第一抗體反應的第一部位；(2)使未與抗原結合的第一抗體與作為結合有生物素或抗生物素蛋白的抗體的第二抗體反應的第二部位；(3)當第二抗體為生物素結合抗體時，以不能移動至第四部位的方式將抗生物素蛋白固定在固定單元上，當第二抗體為抗生物素蛋白結合抗體時，以不能移動至第四部位的方式將生物素固定在固定單元上，以所述被固定的抗生物素蛋白或生物素補足第二抗體的第三部位；以及(4)檢測與抗原結合的第一抗體的標記物的第四部位，并且，以溶液能夠依次移動經過各個部位的方式構成，第一抗體是抗體部分為F(ab’)片段或還原IgG、F(ab’)片段或還原IgG按特定的結合比與標記物結合的標記抗體，包含在第一部位或其鄰接部；第二抗體是結合有生物素或抗生物素蛋白的抗體，是針對第一抗體的抗獨特型抗體，并且是不能與抗原和第一抗體的結合物結合的種類的抗獨特型抗體，包含在第二部位或其鄰接部。
2. 如權利要求l所述的免疫測定裝置，其特征在于 相對于測定對象物，含有過量的第一抗體。
3. 如權利要求1所述的免疫測定裝置，其特征在于 相對于第一抗體，含有過量的第二抗體。
4. 如權利要求1所述的免疫測定裝置，其特征在于- 第一抗體用酶標記。
5. 如權利要求1所述的免疫測定裝置，其特征在于-保持第一抗體的抗體保持部與第一部位的鄰接部連接。
6. 如權利要求l所述的免疫測定裝置，其特征在于-在第四部位保持有用于檢測標記物的試劑。
7. 如權利要求1所述的免疫測定裝置，其特征在于 保持用于檢測標記物的試劑的底物保持部與第四部位的鄰接部連接。
8. 如權利要求6所述的免疫測定裝置，其特征在于 在底物保持部中保持有電子傳遞介質或顯色底物。
9. 如權利要求l所述的免疫測定裝置，其特征在于 其為生物芯片狀的裝置，四個部位分別由微小空間構成，固定單元為微顆粒，第三部位和第四部位被不使作為固定單元的微顆粒通過 的通道部分離。
10. 如權利要求9所述的免疫測定裝置，其特征在于 在第四部位形成有一對電極。
11. 一種免疫測定方法，其特征在于使試樣中的作為測定對象物的抗原與作為與所述抗原特異地結合 的標記抗體的第一抗體反應，接著使未反應的第一抗體與作為結合有 生物素或抗生物素蛋白的抗體的第二抗體反應，之后，當所述第二抗 體為生物素結合抗體時，使用抗生物素蛋白捕捉所述第二抗體，當所 述第二抗體為抗生物素蛋白結合抗體時，使用生物素捕捉所述第二抗 體，檢測未被捕捉的抗原和第一抗體的結合物，所述第一抗體是抗體部分為F (ab，)片段或還原IgG、 F (ab，) 片段或還原IgG按特定的結合比與標記物結合的標記抗體；所述第二 抗體是針對第一抗體的抗獨特型抗體，并且是不能與抗原和第一抗體 的結合物結合的種類的抗獨特型抗體。
12. 如權利要求ll所述的免疫測定方法，其特征在于 相對于測定對象物，使用過量的第一抗體。
13. 如權利要求ll所述的免疫測定方法，其特征在于 相對于第一抗體，使用過量的第二抗體。
14. 如權利要求ll所述的免疫測定方法，其特征在于 采用電化學方法或光學方法進行測定對象物的檢測。
全文摘要
本發明提供一種使用方法簡便、一步操作、能夠在短時間內測定、且能夠對應各種抗原、準確而迅速地實現定量分析的免疫測定裝置。本發明的免疫測定裝置具有下述的四個部位(1)使試樣中的抗原與作為能夠與上述抗原特異地結合的標記抗體的第一抗體反應的第一部位；(2)使未與抗原結合的第一抗體與作為結合有生物素或抗生物素蛋白的抗體的第二抗體反應的第二部位；(3)當第二抗體為生物素結合抗體時，以不能移動至第四部位的方式將抗生物素蛋白固定在固定單元上，當第二抗體為抗生物素蛋白結合抗體時，以不能移動至第四部位的方式將生物素固定在固定單元上，以上述被固定的抗生物素蛋白或生物素補足第二抗體的第三部位；以及(4)檢測與抗原結合的第一抗體的標記物的第四部位。第一抗體是抗體部分為F(ab’)片段或還原IgG、F(ab’)片段或還原IgG按特定的結合比與標記物結合的標記抗體；第二抗體是結合有生物素或抗生物素蛋白的抗體，是針對第一抗體的抗獨特型抗體，并且是不能與抗原和第一抗體的結合物結合的種類的抗獨特型抗體。
文檔編號G01N33/543GK101379399SQ20068004830
公開日2009年3月4日 申請日期2006年12月21日 優先權日2005年12月22日
發明者林陽子, 竹廣敦 申請人:羅姆股份有限公司