評估人半胱氨酸蛋白酶抑制劑c的濁度測定法免疫測定的制作方法

專利名稱：評估人半胱氨酸蛋白酶抑制劑c的濁度測定法免疫測定的制作方法
技術領域：
本發明涉及這樣的納米顆粒-抗體綴合物在評估人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫測定中或者在評估哺乳動物的腎小球濾過率的診斷方法中的應用。
最后，本發明涉及這樣的納米顆粒-抗體綴合物在評估人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫測定中或者在評估腎功能障礙如腎不足或衰竭的診斷方法中的應用。
b)抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的制備 b1)多克隆抗體 多克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體可以通過本領域公知的方法制備，諸如例如由Chase，M.W.，1967，.在″Methods of Immunology andImmunochemistry(免疫學和免疫化學方法)″中，Williams，A.等編，M.W.，第197-209頁，學院出版社(Academic Press)，紐約中所述的那些。簡言之，將適當物種的動物(例如，兔、山羊、或綿羊、或者，優選地禽類物種，特別是家禽，如母雞)用在適當的佐劑如弗氏完全或不完全佐劑中的純化的抗原重復免疫。在免疫后，將動物采血，并且通過諸如例如硫酸銨或氯化銨沉淀、陰離子交換層析、免疫親和層析和/或親和層析的方法純化多克隆抗體。
為了獲得充分的濁度測定信號，優選高抗體親抗原性的抗體。由于多克隆抗體包括許多不同的抗體分子，所以不能計算親和力常數，然而，通過常規的多克隆抗體技術獲得高的抗體親抗原性和親和力。使用通過常規方法獲得的兔抗體，然而，使用綿羊抗體獲得甚至更好的結果。當使用禽類抗體時，獲得甚至更好的結果。禽類抗體可以按照在Larsson A，BaaloewR-M，Lindahl T，和Forsberg P-O在Poultry Science(家禽科學)721807-1812，1993中所述的方法。考慮到在遺傳上與人更不同的禽類能夠產生具有比多克隆哺乳動物抗體更高的抗體親抗原性的針對人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的抗體。
多克隆禽類抗體通常從蛋黃中獲得(并且因此指定為IgYs)。然而，蛋黃含有大量的脂質，使得它們的進一步應用成問題。IgY可以通過使用逐步硫酸銨(例如25-40％)和聚乙二醇(PEG)沉淀而從蛋黃中分離。對于初始純化，還可以參考供應商的用法說明而應用也是商業的可從GallusImmunotch Inc，Cary，美國獲得的IgY純化試劑盒，或從Pierce，Rockford，美國獲得的雞EggcellentIgY純化試劑盒。
此外，多克隆抗體的抗體親抗原性可以通過使用利用抗原親和純化方法，如按照從www.piercenet.com(2006年4月)下載并且通過引用結合的“Affinity Purification of Proteins(蛋白質的親和純化)”中的教導，而純化的抗體而進一步提高。在下文進一步描述親和純化。
當所用的抗體中有20％是抗原親和純化的時，特別觀察到提高的抗體親抗原性，當所述抗體中有50％是抗原親和純化的時，觀察到甚至有更高的提高，并且當所述抗體中有大于75％，如75-100％是通過抗原親和純化方法獲得的時，甚至提高更高。
對于禽類多克隆抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的親和純化，已經制備了適當的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C親和柱。通過標準方法將純化的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C固定在適當的固體支持物上，例如瓊脂糖或親和凝膠，其是活化的以將所述抗原共價連接到支持物上(例如，適當的活化的固體支持物可從Pierce，Rockford，美國獲得)。然后，由所述攜帶抗原的樹脂而制備親和柱。
抗體的成功的親和純化取決于所述抗原上的相關表位向所述抗體的結合位點的有效呈遞。如果所述抗原是小的，并且通過多個化學鍵直接固定在固體支持物表面上，那么重要的表位可能被封閉或者空間位阻，而抑制有效的抗體結合。因此，最好使用獨特的官能團(例如，在肽的單個末端半胱氨酸上的巰基)而固定抗原，并且最好使用其反應基團存在于幾個原子長的間隔臂上的活化的支持物。對于更大的抗原，特別是具有多個固定位點的那些抗原，由于所述抗原本身作為支持基質和表位之間的有效的間隔，所以所述間隔臂長度不那么重要。
由于每種方法的核心是對于其各自的抗原的抗體的親和力，所以在抗體的親和純化的典型的結合和洗脫條件之間通常存在很少的變化。由于抗體設計成在生理條件下識別并且緊密結合抗原，所以大部分的親和純化方法使用模擬生理pH和離子強度的結合條件。最常見的結合緩沖液是在pH7.2的磷酸緩沖鹽(PBS)和Tris緩沖鹽(TBS)以及1.5M NaCl(例如，預先混合的緩沖液包裝可從Pierce，Rockford，美國獲得)。一旦所述抗體已經結合到固體的抗原上，其余的結合緩沖液用來洗滌支持物的未結合的物質。為了將非特異性結合最小化，所述洗滌緩沖液可以包含其它的鹽或去污劑，以破壞任何弱的相互作用。
特別地，通過改變緩沖液(例如，常見的洗脫緩沖液可從Pierce，Rockford，美國獲得)的pH和/或離子強度而將純化的抗體從親和樹脂上洗脫下來。抗體通常是耐受pH 2.5-11.5范圍的彈性蛋白，具有最小的抗體親抗原性損失，并且迄今為止，這是最常見的洗脫策略。在一些情形中，抗體-抗原的相互作用沒有被pH變化有效破壞或者被pH損壞，這需要應用備選策略。
下面給出親和純化方法的實例 步驟1在每次使用之前，用10個柱體積的下述順序的緩沖液洗滌柱(～1ml樹脂床)，以去除殘留的蛋白質 0.2M甘氨酸，pH 2.8～10ml 0.1M NaHCO3，pH 8.5，0.5M NaCl～10ml 使用上述緩沖液重復循環兩次。然后將所述柱在含有被調整到0.5M的NaCl的TTBS緩沖液(0.3M NaCl，20mM Tris/Cl，pH 7.8，0.1％(v/v)吐溫-20和0.01％NaN3)中平衡。
步驟2向10ml等分試樣的粗抗體制備物中，加入1ml 10X TTBS和0.55ml 4M NaCl。將混合物離心以去除任何沉淀。
步驟3通過將所述親和樹脂轉移到含有血清的管(15ml管)中，而分批吸收所述抗體。在冷室中溫育。備選地，人們可以使用低流速將血清施加到柱上。獲得人工收集的級分。收集流過柱的相(phase)，并且使用低流速將其第二次重新施加。
步驟4用TTBS+NaCl至0.5M充分洗滌柱，直到A280小于0.02。收集10ml洗滌的級分，并且檢驗所述級分的A280。
步驟5使用含有0.02％NaN3的0.2M甘氨酸，pH 2.8洗脫抗體。使用1ml等分試樣的緩沖液進行洗脫。將級分收集到含有50ml 1M Tris，pH8.5的1.5ml微量離心管中。這在蛋白洗脫下來之后立即中和酸性的洗脫緩沖液。收集至少10個級分。這通常足以去除所述抗體。使用適當的空白(即，1ml甘氨酸緩沖液加50ml 1M Tris)，讀取每個級分的A280。
步驟6將適當的級分合并。獲得合并物的A280，并且將抗體保存在4℃，或者考慮在存在50％甘油時以等分試樣冷凍(-70℃)。
步驟7通過用0.2M甘氨酸，pH 2.8緩沖液，而后用TTBS充分洗滌而洗滌柱。
b2)單克隆抗體 在顆粒-增強的濁度測定中，多克隆抗體通常比單克隆抗體更優選。多克隆抗體固有地與抗原(或分析物)上的許多不同的表位反應(與單克隆抗體相反)，并且因此，更容易在抗原分子自身之間，以及在抗原和固定抗體的顆粒之間產生交叉結合和網絡。相反，單克隆抗體通常只結合一種類型的表位，這使得其更難以形成交叉結合和網絡。然而，診斷行業通常優選使用單克隆抗體，原因在于它們更容易標準化，并且更容易對預先確定的標準物進行定性控制，特別是在許多年的產品壽命時間內。因此，存在關于將單克隆抗體用于顆粒增強的濁度測定法免疫測定的良好的實例，特別是當存在有利于單克隆抗體的使用的抗原性特征時。Eda等，在“Development of a New Microparticle-Enhanced Turbidimetric Assay forC-reactive proten With Superior features in Analytical Sensitivity and Dynamicrange(在分析靈敏性和動力學范圍內具有優良特征的C-反應性蛋白的新的微粒-增強的濁度測定法測定的發展)”，J.Clin.Lab.Analysis(臨床實驗室分析)，12137-144(1998)中描述了使用兩種不同的單克隆抗體和兩種不同的微粒。由于CRP分子是相同亞基的五聚體----并且因此攜帶五個所有表位的重復(Pepys MB等，Adv.Immunol.(高級免疫學)34141-212(1983))，這使得使用單克隆抗體容易得多，所以CRP特別有利于使用單克隆。然而，此外，與單體和更小的蛋白如半胱氨酸蛋白酶抑制劑C一起，不同的單克隆抗體的混合物可以用于本發明的特別的實施方案中。不同的單克隆抗體的混合物，特別當它們由具有針對半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的高親和力的許多不同的單克隆抗體組成時，將導致關于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定的本發明的良好的實施方案。
單克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體還可以通過本領域公知的方法制備，例如由G.

等，1975，Nature(自然)256，495，G. Galfre等，1981，Meth.Enzymol.(酶學方法)73，3-46，或R.Kennet，1980，在″Hybridomasa new dimension in biological analysis(雜交瘤生物學分析的新紀元)″中，R.Kennet等編，Plenum出版社，紐約和倫敦中所述的那些。將來自免疫小鼠或大鼠的脾細胞或外周血細胞與骨髓瘤細胞系融合，例如使用聚乙烯融合方法進行。在融合后，將細胞在適當的條件下生長，例如，在培養平板上，并且使用例如次黃嘌呤/氨喋呤/胸苷(HAT)選擇方法進行正確融合的細胞的選擇。產生抗體的細胞系通過如EIAs，RIAs或凝聚測定的方法鑒定。在鑒定產生抗體的細胞系后，將所述細胞重復亞克隆，例如通過有限稀釋的方法，以保證新生長的細胞系來源于一個單一的細胞。
b3)嵌合抗體 嵌合的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體可以通過本領域公知的方法獲得，諸如由G.L.Boulianne等，1984，Nature(自然)312，643-645所述的方法。所述方法可以概括描述如下。將來自于一種物種或其部分的單克隆抗體的抗原-結合位點的DNA轉移到不同物種的另一種抗體的抗體構架的DNA。將這種新的構建體克隆到表達載體中，將其轉移到相對應的表達系統中以產生所述抗體。
b4)重組抗體 重組抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體可以通過本領域已知的方法不使用動物載體而獲得，例如由G.Winter等，1991，Nature(自然)，349，293或J.S.Huston等，1988，Proc.Ntl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院學報)，85，5879所述的那些方法。那些方法包括下述步驟將編碼抗體或其片段的DNA(cDNA或合成的DNA)引入到宿主細胞中，例如，大腸桿菌(E.coli)，真菌，酵母菌，植物或真核細胞中，選擇具有需要的特異性和親和力的抗體，并且在相應的表達系統中表達所述抗體或其片段。
b5)抗體片段 任何物種的多克隆抗體、單克隆抗體(包括嵌合抗體和/或重組抗體)的Fab-，Fab′-，和F(ab′)2-片段可以通過本領域公知的方法制備，諸如例如由A.Nissonoff等，1960，Arch Biochem Biophys(生物化學和生物物理學檔案)，89，230，或R.P.Porter，1959，Biochem J(生物化學雜志)，73，119，或E.Harlow等，1988，在″Antibodies-A Laboratory Manual(抗體-實驗室手冊)″，626-631，冷泉港出版社(Cold Spring Harbour Press)，紐約，美國所述的那些方法。
b6)選擇與人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C不同反應性的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體 當使用單克隆抗體或其片段作為結合配偶體時，可以便利地進行不同的、特別是高和低反應性的抗體的選擇，其通過常規包被技術，將每種單克隆抗體獨立地包被到相同材料和大小的納米顆粒上，而后以給定的比例，如1/1v/v，以變換的方式將納米顆粒試劑與分析物混合。在相同條件下生成納米顆粒試劑的校正曲線之后，對于低濃度的分析物所得到的校正曲線的斜率給出所述免疫結合配偶體的反應性的第一指示。
當使用多克隆抗體作為結合配偶體時，可以按照本領域公知的方法進行高和低反應性多克隆抗體的制備，其通過將所述多克隆抗體引入到攜帶與凝膠基質共價結合的抗原性分析物的親和層析柱上而進行。使用梯度洗脫緩沖液，低反應性的多克隆抗體級分將最先從柱上洗脫下來，而后是具有增加的更高的反應性的級分(參見，S.Yamamoto等，1993，″VeterinaryImmunology and Immunopathology(獸醫免疫學和免疫病理學)″36，257-264，Elsevier科學出版社(Elsevier Science Publishers)B.V.，Amsterdam)。然后，可以使用BIAcore儀器或者通過將它們獨立地包被到相同大小和材料的納米顆粒上并且生成相應的校正曲線，而檢驗級分的反應性。
抗體的選擇可以通過上文提及的將它們包被在納米顆粒上的方法進行，而后檢測界限分析或確定其功能親和性，如上文所述。如果適當的話，關于它們對人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的親和力/抗體親抗原性而不同的不同的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的混合物可以用于制備本發明的納米顆粒-抗體綴合物。適當的混合比例可以由熟練的技術人員通過有限系列的實驗而確定。
適當的抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體還可以從不同的來源商購。例如，芬蘭的HyTest提供一組識別所述抗原的不同表位的高親和力抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體。這些抗體以常規方法制備，其通過用從人尿純化的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫Balb/c小鼠，并且通過與雜交瘤細胞系Sp2/0融合而產生雜交瘤進行。通過選擇的克隆產生的抗體通過蛋白質A親和層析而純化。目前可從HyTest獲得下述mAbsCyst10，Cyst13，Cyst16，Cyst18，Cyst19，Cyst23，Cyst24，和Cyst28。其它商購單或多克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的供應商為Fusion，北愛爾蘭；Bio Vendor，捷克共和國，AB Location，德國；高級Immunicemical(AdvancedImmunicemical)，美國；Abcam，英國；Axxora，英國；生物設計(Biodesign)，美國；R&D系統，美國；AbD Serotec，挪威；Strategic生物溶液(StrategicBiosolutions)，美國。原則上，所述來源的所有抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體可以單獨或組合使用，以實施本發明。
c)納米顆粒以及它們與抗體的綴合物 用于制備本發明的納米顆粒的物質可以是適合產生并且實施顆粒-增強的光散射測定的任何天然的或合成的、無機的、有機的、非聚合物或聚合物物質。這樣的物質包括，例如，硒，碳，金；碳、硅或鍺的氮化物，例如Si3N4；鐵、鈦或硅的氧化物，例如TiO2或SiO2；以及聚合材料，諸如例如，膠乳，聚苯乙烯，聚(氯乙烯)，環氧樹脂，聚偏1，1-二氯乙烯，聚(α-萘基甲基丙烯酸酯)，聚(乙烯基萘(naphtalene))，或它們的共聚物，特別是苯乙烯和可共聚化的烯鍵式不飽和的化合物的共聚物，例如苯乙烯-(甲基)丙烯酸酯共聚物。由聚合材料制成的顆粒，以及由苯乙烯聚合的內核和苯乙烯與可共聚化的烯鍵式不飽和的化合物共聚形成的外殼而組成的核-殼顆粒，如例如在美國專利號4,210,723中所述，也是適合的。
適用于綴合的聚合物顆粒可以購自Bangs顆粒公司(Bangs ParticlesInc.)或界面動力學公司(Interfacial Dynamics Inc)，默克SA，法國或其它適當的來源。所述顆粒可以按照許多方法激活，用于結合抗體，例如，這樣的偶聯化學的詳細的教導可以在TechNote 205，Rev.003中，例如2002年3月，“共價偶聯(Covalent Coupling)”(通過引用結合)中找到，其可以從Bangs實驗公司(Bangs Laboratories，Inc)的網頁上下載。例如，偶聯可以通過在它們表面上攜帶羧基-、氨基-、羥基-、酰肼-或氯甲基基團的顆粒的方式而實現。待偶聯的分子可以直接與這樣的基團反應，或者通過適當的接頭如例如碳二亞胺、戊二醛或溴化氰的方式反應。
按照本發明的顆粒的外殼優選地必須包括對半胱氨酸蛋白酶抑制劑C具有高親和力的抗體，其與特定大小的納米顆粒核心組合，產生充分的濁度測定信號。典型地，包括蛋白物質的外殼的納米顆粒在58和200nm之間，更優選地在65和150nm之間，并且甚至更優選地在80和135nm之間。
在本發明的一個特別的實施方案中，未包被的顆粒的平均直徑約80nm。使用這些顆粒，在包被之后，它們的直徑典型地為90-100nm。作為通用的法則，單層抗體約5nm厚，以致認為這樣的顆粒攜帶單層抗體。
當所述綴合的顆粒總干重的5-35％是由抗體組成時，這些顆粒將具有良好的性能，在所述綴合的顆粒的總干重的10-30％由抗體組成時，所述顆粒具有更好的性能，并且當所述綴合的顆粒的總干重的15-25％是由抗體組成時，具有最佳性能。
如果使用稍微更大的顆粒，這些最佳百分比值下降。通過舉例的方式，如果使用95nm的裸顆粒，如果包被的話，它們的中值直徑典型地終止在110nm。那么，相對應的百分比為4-32％，8-26％，并且對于最佳性能，相對應的百分比為12-22％(由抗體組成的綴合的顆粒的總干重百分數)。然而，使用這些稍微更大的顆粒，在所述測定中必須使用更多的顆粒(是更重的顆粒的意思)，以具有足夠的結合容量來產生校正曲線，而在更高半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濃度，沒有所述曲線的平化(測定校正曲線必須具有達到超過8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/μl樣品的良好的動力學范圍)，這導致高得多的吸收背景(更大的顆粒和更多的顆粒)，和更低的信號比噪音比例。
在另一方面，更小的顆粒將在包被的免疫顆粒中具有更高的抗體百分數最適值。例如，如果使用大小70nm的未包被的顆粒，那么包被的顆粒的中值直徑典型地為80nm，并且綴合顆粒的總干重的18-30％抗體的比例將導致最佳百分數，并且次最佳的是12-36％的比例，并且甚至更次最佳的是4-42％的抗體的比例。然而，使用這些稍微更小的顆粒，在所述測定中必須使用更少的顆粒(是更少重量的顆粒的意思)，以產生在更低的濃度，即，低于1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/μl樣品，足夠陡峭的校正曲線，并且信號將更低，并且還更容易受背景噪音的影響。
基于上述闡釋，在本發明的教導的指導下，熟練的讀者應該能夠提供用于不同的測定條件的最佳免疫顆粒制劑。
將抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體包被到納米顆粒上可以按照滿足所用的材料的特性的本領域公知的方法而吸附性地或共價性地實施。
按照一個優選的實施方案，一種或多種親水惰性蛋白質與抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的混合物應該存在于所述抗體與所述納米顆粒的綴合/結合過程中。本發明人已經意外地觀察到，當將抗體與具有接近綴合pH的pI值的親水蛋白一起與所述顆粒綴合時，獲得使用具有高結合容量的親水性顆粒的最佳結果。當在綴合過程中存在牛運鐵蛋白和白蛋白時，獲得最好的結果。然而，在綴合過程中，其它的惰性蛋白也可以與抗體混合。這樣的親水性、惰性蛋白的非限制性實例是

(limpet)血藍蛋白、觸珠蛋白以及其它水溶性蛋白，它們對于所述抗體和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C沒有任何親和力。
在偶聯過程中，條件為，或者應該為，或者如果必要，應該采用這樣的條件，以致所述抗體比所述惰性蛋白與納米顆粒核心材料更具反應性，以致它們將或多或少地與所述核心定量結合。所述納米顆粒表面的殘余的反應部分將由所述惰性蛋白封閉。
本發明人觀察到，作為通用法則，在第一步驟中，抗體的疏水部分似乎與所述顆粒物理性結合，并且因此整個分子接近顆粒表面上的反應基團，例如氯甲基基團，然后其與蛋白分子的相對應的基團例如胺反應。由于這種物理學吸附，大的抗體分子令人驚訝地與更小的、惰性的親水蛋白如白蛋白和運鐵蛋白充分競爭。然而，由于使用比顆粒的結合容量更少的抗體，所述惰性蛋白，如白蛋白和運鐵蛋白，與顆粒表面上留下來反應的任何基團起反應，并且然后使得本發明的顆粒同時具有良好的親水表面和良好的抗體結合容量，并且具有可以產生良好的信號的適當的納米顆粒材料比例。
采用適合每種包被方法的條件，通過本文提供的教導的指導，對于本領域的技術人員，變化是常規的。
例如，對于偶聯，當使用單克隆抗體時，可以選擇高于抗體的pI半個單位的pH。多克隆抗體具有非常多變的pI，并且因此可以優選地選擇使用pH 8.8的多克隆抗體。
在一個優選的實施方案中，基于偶聯反應混合物的總蛋白含量，在綴合過程中存在的約3-70重量％，或者甚至更優選地5-40重量％的蛋白應該由所述抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體組成。
如上述所闡釋，由于所述抗體具有比親水惰性蛋白更高的與所述顆粒的結合率，所以，抗體蛋白與結合到顆粒表面上的總蛋白的比例將高得多，例如，20-90％，并且更優選地結合到顆粒表面上的總蛋白的35-80％，并且甚至更優選地40-70％是由所述抗體組成的。
d)所要求保護的濁度測定方法的優選實施方案 d1)發明優點 本發明提供具有比現有技術更強的信號比噪音比例的濁度測定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定。通過選擇大的核心和蛋白外殼顆粒，優選特定的最小的大小，與抗原親和純化的抗體組合，獲得了令人吃驚地高凝聚信號。由于與測定緩沖液相比較，在顆粒的折射指數和高度純化的抗體的高親和力(或抗體親抗原性)之間的令人吃驚的協同作用，獲得了強濁度測定信號。所述強濁度測定信號導致對干擾物質如三酰甘油的更高的穩定性，并且比濁度測定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定的現有技術具有更好的線性。
均相免疫測定的關鍵因素是每質量單位每體積測定混合物所產生的信號。所述測定混合物是在已經加入全部的試劑和樣品時獲得的混合物。例如，如果要分析3μl的樣品，并且所述樣品含有1mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的，并且在混合全部的試劑和樣品后終體積是300μl，那么半胱氨酸蛋白酶抑制劑C在終測定混合物中的濃度是10μg/l。如果所述分析物在樣品中的濃度是低的，那么這通常可以通過使用與測定混合物的體積相比更大的樣品而補償，例如，在300μl的測定混合物體積中將樣品增加到6μl。對于增加樣品體積，存在一些障礙。首先，在樣品中可能存在的所有干擾物質在所述測定混合物中的濃度增加。其次，為了克服臨界曲線作用(critical hook effect)(即，具有負斜率的劑量/反應曲線)，對抗體的需求增加，其又相對應地增加測定的抗體成本。
因此，存在這樣的需要，即，在分析物的低的測定混合物濃度以及相對應低的樣品體積下，獲得良好的信號強度和穩定的測定。在均相免疫測定中增加樣品的體積導致更多的干擾和更昂貴的測定。
本發明提供濁度測定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定的信號強度、穩定性和線性的令人吃驚的增加。本發明還具有來自脂質如三酰甘油的更少的干擾。在理解基于每質量單位的分析物的濁度測定信號中的過低的信號強度的現有技術的缺點后，實現了上述，并且提供具有比現有技術中的濁度測定方法更好的精確性、線性和更少的干擾的方法。
d2)在不同的檢測條件觀察到的特別的改進 按照本發明，提供用于測量體液樣品中或者來自于體液的樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的改進的濁度測定免疫測定方法，其特征在于， 通過將含有所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的液體樣品，或者來自于含有半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的液體的樣品，或者含有半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的稀釋物的樣品，與納米顆粒結合的多克隆抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體或抗體片段接觸，形成測定混合物，以結合所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，并且 如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，通過測量所述混合物的濁度的變化而評估半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的含量，并且所述濁度進一步特征在于，所述混合物在546nm波長處光吸收的改變，所述改變 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于75mAbs單位/cm， 并且所述方法進一步特征在于所述納米顆粒結合的多克隆抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體或抗體片段綴合物的中值直徑大于58nm。
由于546nm的波長和37℃是許多大規模自動化臨床化學分析器如日立(Hitachi)，來自羅氏(Roche)的Cobas和Modular，奧林巴斯以及許多其它的儀器的典型的操作模式，所以這是特別有益的。
本發明還提供改進的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有546nm波長的光吸收的變化，所述變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于25mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于55mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于125mAbs單位/cm， 所述方法因為同樣的原因而有益。
此外，本發明提供一種方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有546nm波長的光吸收的變化，所述變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于85mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于190mAbs單位/cm， 所述方法也是因為同樣的原因而有益。
一些分析型分光光度計儀器在更低的波長下操作。因此，本發明還提供這樣一種方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有505nm波長的光吸收的變化，所述變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于20mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于50mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于90mAbs單位/cm。
特別地，本發明提供這樣一種方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有505nm波長的光吸收的變化，所述變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于75mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于150mAbs單位/cm。
此外，本發明提供一種這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有505nm波長的光吸收的變化，所述變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于40mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于100mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于250mAbs單位/cm。
其它分析型分光光度計儀器可以在更高的波長操作。
因此，本發明還提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有570nm波長的光吸收的變化，所述變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于10mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于80mAbs單位/cm。
特別地，本發明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有570nm波長的光吸收的變化，所述變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于45mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于100mAbs單位/cm。
另外，本發明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述混合物在具有570nm波長的光吸收的變化，所述變化為 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于20mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于55mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于125mAbs單位/cm。
存在一些在比37℃更低的溫度操作的臨床化學儀器。因此，本發明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在32℃保持600秒，所述混合物在具有546nm波長的光吸收的變化，所述變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于12mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于25mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于70mAbs單位/cm。
為了提高臨床化學自動化的能力，存在對于更快和更有效的測定方法的巨大的需求。如果測定運行得更快，那么在每個時間單位可以進行更多的測定。特別地，如果構建所述儀器以動力學模式運行，那么在測定開始后，快速而強烈的信號的增加是有益的。因此，本發明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持120秒，所述混合物在具有546nm波長的光吸收的變化，所述變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于8mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于20mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于50mAbs單位/cm。
特別地，本發明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持120秒，所述混合物在具有546nm波長的光吸收的變化，所述變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于75mAbs單位/cm。
此外，本發明提供這樣的方法，其特征在于，如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持40秒，所述混合物在具有546nm波長的光吸收的變化，所述變化為 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于4mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于7mAbs單位/cm，或者 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm。
d3)使用現有技術濁度測定系統在相同條件下獲得的結果 如上文所闡釋，用于所述測定的納米顆粒的顆粒大小必須仔細平衡。大的顆粒產生良好的信號，然而，背景高，并且結合容量低，以致必須加入大量的顆粒，這產生高的背景濁度。先前的測定供應商，如DakoCytomation AS，可能是由于這一主要原因而沒有獲得良好的濁度測定信號。
當按照在Dako Cytomation AS，產品號LX002/EFG/CS/25.10.04，S2361/EFG/KGR/09.07.03和X0974/EFG/SUM/09.09.04的包裝插件中提供的用法說明，以及在上文所引用的Schmidt，Kjoller和

的論文中的用法說明，這導致用于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測定免疫測定方法，其特征在于----在37℃260秒內，在波長546nm----吸收的變化，如下 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為9mAbs單位， 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為24mAbs單位，和 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為50mAbs單位。
這些結果遠低于本發明觀察到的結果(見上文)。
當嘗試使用更短的測定時間(目的在于動力學讀數)時，120秒導致下述吸收的變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為6mAbs單位， 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為15mAbs單位，并且 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為24mAbs單位， 其遠低于本發明所獲得的結果。
此外，當嘗試使用甚至更短的測定時間(目的在于動力學讀數)時，40秒導致下述吸收的變化 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為3mAbs單位， 在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為6mAbs單位，并且 在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，僅為9mAbs單位， 其也遠低于本發明所獲得的結果。
上述測定時間定義為從將免疫顆粒混懸液加入到測定試劑和樣品的混合物起的時間。所有的體積和順序都按照供應商的信息。使用來自美國埃德-白令(Dade-Behring)，產品號OQNM13N膠乳半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的ProSpec比濁法參照方法，確定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濃度。
d4)實施本發明的測定方法 在本發明的一個優選的實施方案中，將測定緩沖液與樣品和免疫顆粒混懸液混合，并且通過光度計，特別是記錄式光度計，并且更優選記錄式分光光度計，監測所述混合物或得到的混懸液的濁度。優選的步驟順序為將樣品混合在測定緩沖液中，允許所述混合物完全溶解并且穩定，然后加入免疫顆粒混合物。本發明還可以這樣實施，即，通過最先將測定緩沖液與免疫顆粒混懸液混合，然后加入和混合樣品而進行。應該應用最佳混合方法(在本領域公知的方法中選擇)，其可以通過有限量的預實驗而確定。
當使用記錄式光度計時，可以確定濁度增加的初始速率，其通過測量吸收增加的初始速率而確定樣品的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度，或者通過在混合時直接記錄，或者通過在混合后立即記錄，與吸收的初始增加的后推組合，或者通過在樣品和試劑混合后測量在兩個或多個小于1分鐘的時間點之間的吸收差異。
這些測量或組合的測量可以是相關的，或者與使用已知的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度的校正的對應結果進行比較，并且這樣可以計算未知樣品的濃度。這些記錄吸收值和計算結果的方法對于臨床化學領域的技術人員測量的許多其它物質是眾所周知的。當然，來自于本發明的非常良好的信號使得這樣的測量和計算穩定和準確得多，特別在如上文所述，在將樣品和試劑混合之后立即獲得的良好的信號時。
存在一些可以使用的測定緩沖液混合物，其具有加入所述緩沖液中的不同種類的緩沖物質，具有不同種類的去污劑和/或不同種類的聚合物和/或鹽。
可以使用TRIS緩沖液，磷酸鹽緩沖液，硼酸鹽緩沖液以及其它緩沖物質，如MOPS，PIPES，HEPES，并且對于本發明不是關鍵的，只要所述測定可以不依賴于加入的樣品的pH和緩沖能力而保持最終測定混合物的充分調節的pH。典型地，以約5mM-0.2M或10mM-0.1M的終摩爾比例加入所述緩沖液。將pH調整到6-8的范圍，特別是6.5-7.5。
此外，可以使用一些去污劑，只要它們能夠溶解所加入的樣品的任何脂質內容物，并且不太強烈地干擾抗體與所述樣品引入的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的反應。由于脂質形成給出干擾信號的微滴和微團，所以，三酰甘油，膽固醇和一定范圍的脂蛋白是濁度測定法測定中干擾物質的實例。吐溫20，Triton X-100和脫氧膽酸鹽是適當的去污劑的實例。在含有脂質的樣品中測量半胱氨酸蛋白酶抑制劑C是一個大挑戰，并且需要所述脂質的良好的溶解性，但是甚至更重要地是，超過任何次要的干擾的強信號。去污劑典型地以分別為最終反應混合物重量的0.01-0.5％或0.1-0.3％的終比例加入。
最廣泛應用的聚合物是不同分子大小的聚乙二醇(特別地，約6.000-8.000)，但是還可以使用葡聚糖和其它聚合物。所述聚合物具有缺點，----當濃度過高時----它們產生在將檢測樣品與測定混合物混合時引入的其它物質的非特異性沉淀。另一方面，同時，所述聚合物提高信號。然而，它們傾向于減小免疫顆粒的總體結合容量。聚合物典型地以分別為最終反應混合物重量的約0.05-0.5％或0.1-0.3％的終比例加入。
適合離子強度的適合鹽是例如，堿金屬鹵化物，特別是氯化鈉，以1-100mM，或5-50mM的濃度加入。
可以存在于測定混合物中的其它適當的成分為 氨基酸，如甘氨酸，以約1-50mM或5-20mM的終濃度加入； 蛋白質，如白蛋白，以0.1-5g/l或0.5-2g/l的終比例加入； 抗微生物試劑，如疊氮鈉，以0.1-10或1-5g/l的終比例加入； 校正劑或對照物質這些是典型地包括溶解在緩沖物質中，典型地是磷酸緩沖液或TRIS緩沖液中的已知濃度的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的溶液，任選地具有一些蛋白質物質，任選地包括達到100體積％的人或動物血清(如果100體積％是血清，那么對于緩沖溶液，沒有空間也沒有需要)。
此外，一種或多種試劑可以以干燥的、任選地凍干的形式使用。綴合到納米顆粒上的抗體可以以干燥的形式使用，例如，作為顆粒物(pellet)，并且在使用之前溶解，或者可以溶解在測定緩沖液試劑中或者溶解在反應混合物中。反應緩沖液中的一種或多種成分可以在實施所述測定之前或過程中以干燥形式加入，校正劑也是這樣。甚至所述樣品可以以干燥的或凍干的形式提供，并且以干燥形式加入到反應混合物中，或者在其使用之前溶解。
在臨床化學分析中，使用用于校正目的的標準曲線是標準實踐。因此，在實施本發明的方法時，可以使用已知半胱氨酸蛋白酶抑制劑C含量的樣品替代臨床樣品，以構建待測量的反應/信號的標準曲線，并且然后，可以通過從所述標準曲線的內插法而計算未知樣品的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C含量。
按照顆粒增強的光散射免疫測定領域中公知的方法，選擇在混合物中納米顆粒-免疫綴合物的總濃度，以致來源于所述納米顆粒的吸收值不影響準確的和精確的測量，但是微粒的濃度足夠高，足以得到信號發展。所述量當然受到不同的參數的影響，如體液樣品或來源其的樣品的體積，以及半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的含量。
作為測定的非限制性的典型的參數，可以提及下述 典型的樣品體積是1-20μl，例如2-10μl，或者特別是3μl。
典型的免疫顆粒體積是10-100μl或20-60μl，或者特別是40μl。
所述免疫顆粒可以提供為0.5-10或1-5，典型地約2-3，特別是2.26mg顆粒/ml緩沖溶液的混懸液。所述緩沖液可以具有在6-9范圍內的pH，例如7-8.5，典型地約pH 8.4。除了緩沖物質之外，所述緩沖溶液可以包含其它組分，例如氨基酸、鹽、惰性蛋白質和乳化劑或增溶劑，如上文所定義。這樣的組分和緩沖液的典型的混合物包括10mM硼酸鹽緩沖液，10mM甘氨酸，15mM NaCl，0.25％吐溫20和1g/l白蛋白。
典型的總測定體積是100-1000μl，或200-500μl，或250-300μl，或者特別地約280μl。
不同的儀器使用不同的總體積運行，以致這些體積的30％或60％，或者這些體積的150％或300％典型地用于其它的儀器。樣品體積和免疫顆粒體積的比例可以是在1/100-2/3，更優選地2/100-1/3，并且甚至更優選地1/40-1/5之間的任意值。
d5)醫學用途 本發明的測定方法可以用于診斷和監測與體液或組織的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C含量相關的或以此為表現的病理性或潛在的病理性病況。這些特別包括哺乳動物的腎小球濾過率(GFR，作為腎功能的測量)或影響所述濾過率的病理性病況。
本發明的方法可以用來確定兒童的GFR；或者患有肌肉萎縮的患者的GFR；用來指導腎功能癌癥治療的作用；用來指導腎臟移植和免疫抑制治療；用來指導糖尿病的腎臟濾過率；用于檢測并且管理驚厥；并且在藥物施用與可能導致體內不理想的藥物累積的GFR減少相關的情形中，用來發現正確的藥物劑量。
所述測定方法還可以用于評估藥物對所述濾過率的作用。
對于本說明書的熟練的技術人員可以明白其它潛在的應用。
本發明還提供實施按照本發明的免疫測定的一組試劑。所述試劑組特征在于，包括抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒，適當的測定緩沖液，和任選地，校正劑溶液與對照溶液。任選地，所述顆粒混懸液和測定緩沖液作為組合的試劑遞送。
在另一個方面，本發明提供分析產品，任選地以試劑盒或部分的試劑盒形式，用于測定樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，所述產品包括至少一種如上文所述的以干燥的或混懸形式存在的納米顆粒-免疫綴合物，并且任選地，一種或多種如本文定義的其它組分，例如，適當的測定緩沖液，并且任選地，校正溶液和對照溶液。
本發明還提供用于實施按照本發明的免疫測定的一組試劑。所述試劑組特征在于，包括，抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒，適當的測定緩沖液，并且任選地，校正劑溶液和對照溶液。任選地，所述顆粒混懸液和測定緩沖液作為組合的試劑遞送。
任選地，還可以存在信號評估的方式，如計算方案，允許將觀察到的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度與GFR參數直接相關。
下述非限制性實例舉例說明本發明方法的非限制性方式。
實驗部分 合成實施例1制備多克隆禽類血清及其親和純化 a)制備禽類血清 可以使用下述免疫方法來產生針對人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的多克隆IgY抗體 每個免疫實驗使用2-4只母雞。在免疫開始之前，收集一對卵。從這些卵中純化的IgY將作為對照IgY。將在磷酸緩沖液中的100μg高度純化的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(從患有腎小管蛋白尿的患者的尿中純化)用弗氏完全佐劑乳化，并且注射到母雞的胸肌中。每4周重復注射。在注射起始后10周，收集卵。將蛋黃從卵分離，并且通過氯化銨沉淀，以按照卵抗體分離的現有技術方法的常規方式，分離來自蛋黃的IgY級分(參見，例如，Larsson A，Baaloew R-M，Lindahl T，和Forsberg P-O，在PoultryScience(家禽科學)中，721807-1812，1993)。
b)多克隆血清的親和純化 按照在柱子的包裝插件中的指示，將10mg高度純化的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C固定在來自安瑪西亞法瑪西亞生物技術(AmershamPharmacia Biotech)的HITRAP NHS-活性HP柱上。
將分離的IgY級分在磷酸緩沖鹽中稀釋至2mg/ml。將200ml的這種IgY溶液流過柱子，然后是50ml無IgY的磷酸緩沖鹽。具有對固定的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的特異性親和力的抗體用35ml 0.1摩爾的檸檬酸鹽緩沖液pH＝3.2洗脫。將洗脫的特異性抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體針對磷酸緩沖鹽透析，并且使用具有30,000道爾頓的截留分子量的AmiconCentircon離心過濾裝置濃縮至3mg/ml。
合成實施例2制備單克隆抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體 單克隆抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體的制備可按照下述實施，通過利用本領域公知的方法，例如，由Harlow等，1988，″AntibodiesaLaboratory Manual(抗體實驗室手冊)″的第6節，冷泉港出版社，紐約，美國所述。按照Sensabaugh等，1990，J.Urology(泌尿學雜志)144，1523所述，從人精液血漿中分離人PSA。
在規律的時間間隔，將小鼠用在RAS(RIBI佐劑系統)中的50μg人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的4次注射進行免疫。在第一次注射后4個月，使用G.Galfre等，1981，Methods in Enzymology(酶學方法)，73，3-46所述的聚乙二醇方法，將從免疫的小鼠的脾臟分離的淋巴細胞與骨髓瘤細胞系SP2/0-Ag14融合。
分泌針對半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的抗體的雜交瘤通過下述篩選ELISA鑒定將微量滴定板用兔抗-人-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫球蛋白包被；將結合到這種固相上的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與雜交瘤培養物的上清一起溫育。使用抗-小鼠-免疫球蛋白-過氧化物酶-綴合物，檢測與半胱氨酸蛋白酶抑制劑C結合的單克隆抗體。
可以分離數百種分泌針對人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的不同的表位的抗體的雜交瘤。然后，親和純化相對應的單克隆抗體，并且可以進行更詳細地特征性描述。
實施表位結合，并且使用BIAcore生物傳感器技術(法瑪西亞(Pharmacia)，瑞典)，關于它們的表觀解離常數確定抗體的相關反應性。后者是基于表面等離振子共振技術(參見，J.L.Daiss等，1994.在″MethodsA Companion to Methods in Enzymology(方法酶學方法的指南)″中6，143-156，學院出版公司(Academic Press Inc.)，紐約，美國)，并且允許監測生物分子反應的動力學和化學計量。
從細胞培養物的上清開始，單克隆抗體通過多克隆兔抗-小鼠-Fc-抗體而結合到生物傳感器的表面。監測抗原半胱氨酸蛋白酶抑制劑C與所述單克隆抗體的締合和解離。數據可以使用內在的BIA評估軟件，基于簡單的A+B＝AB平衡模型(L.G.Fagerstam等，1992，Journal of Chromatography(層析雜志)，597，397-410)，而進行分析。然后，得到的抗體可以關于它們各自的表觀解離常數進行比較。然后，適當的抗體或它們的組合可以用于制備本發明的免疫顆粒。
合成實施例3制備抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒 a)偶聯方法-標準方法 (1)緩沖液和試劑
為了具有來自聚合物顆粒的更多的信號/mg抗體，將偶聯緩沖液的pH以特殊方式適合待偶聯的抗體的pI。另外，在偶聯之前，將所述抗體用白蛋白/運鐵蛋白稀釋(見下文)。對于偶聯，當使用單克隆抗體時，選擇高于抗體的pI半個單位的pH。多克隆抗體具有非常多變的pI，并且因此使用pH 8.8的多克隆抗體。通過將上文提及的PBS和硼酸鹽緩沖液混合，而獲得所選擇的pH。
下述標準方法概括了通過抗體與氯甲基的物理吸附而附著的兩種簡單的一步方法。所述方法用于以1％固體的1μm的氯甲基膠乳。這一反應可以容易地放大或縮小，以適合個別需要。例如，如果使用不同的顆粒大小，那么可以從下式計算抗體(Ab)的量 Ab的重量＝(用于1μm-顆粒的Ab的重量)/(單位為μm的顆粒直徑) (2)制備膠乳顆粒混懸液 1.移取2.5ml(40mg/ml)氯甲基膠乳微球體，并且用10mL MES緩沖液稀釋。
2.將所述混合物離心，以沉淀顆粒～3,000G持續～20分鐘。
3.去除上清，并且將沉淀重新分散在10ml MES緩沖液中。
4.再次離心，并且從顆粒上去除上清。
5.將沉淀重懸在5ml MES緩沖液中，確保完全懸浮微球體顆粒。
現在，所述膠乳混懸液約2％固體(即，～20mg/ml)。
(3)偶聯 1.向5ml在調節到適當的pH(見上文)的PBS/硼酸鹽緩沖液中的1.5mg抗體、3.75mg白蛋白和7mg牛運鐵蛋白的溶液中，加入5ml的膠乳。這小于需要的抗體單層。所述抗體與所述運鐵蛋白(transferring)和白蛋白相比，與膠乳更具反應性，并且或多或少地與膠乳定量結合，并且其余的膠乳表面由白蛋白和/或運鐵蛋白飽和。這種混合物還保證顆粒的抗凝聚和良好的親水性。此外，其它的惰性蛋白質可以在綴合過程中與抗體混合，如

血藍蛋白、觸珠蛋白以及其它水溶性蛋白，它們對于所述抗體和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C沒有任何親和力。
2.在室溫下輕輕攪拌，將膠乳/蛋白混合物溫育過夜。
3.離心，以從未結合的蛋白質分離蛋白-標記的膠乳顆粒。
4.去除并且保留用于蛋白質確定的上清。在這一步驟，可以保留上清，并且進行蛋白確定。可以從加入的初始量中減去上清中的任何殘留的蛋白。將剩余的包被在顆粒上。與膠乳微球體相容的用于蛋白確定的唯一的方法是來自Pierce的Micro BCA蛋白測定試劑盒。
5.將沉淀重懸在10ml PBS中。
6.再次離心，以沉淀所述顆粒。
7.再重復步驟5-6兩次，總共進行3次洗滌。
8.將最終的膠乳重懸在10ml儲存緩沖液中，產生1％固體的終濃度。在4℃保存備用。勿冷凍。
將甘氨酸用于儲存緩沖液中，以填充已經被蛋白質覆蓋的微球體表面上的任何反應位點。這是減少非特異性的結合。如果需要，惰性蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)或牛運鐵蛋白，可以用于同樣的目的。存在NaN3作為生物殺滅劑。如果所述膠乳保持無菌，可以省略與細胞或組織培養物不相容的NaN3。
b)制備包被的納米顆粒 應用上述標準方法包被直徑0.08μm的膠乳顆粒，以制備本發明的納米顆粒-綴合物。按照上式，24mg的抗體和65mg的白蛋白用來包被100mg的顆粒。
通過將來自挪威的挪威抗體AS(Norwegian Antibodies AS，Norway)的產品號A167 Cys-C-AF的抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體(所述多克隆抗人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體對應從用來自患有慢性腎小管蛋白尿的患者的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫的母雞的卵分離的免疫球蛋白的親和純化的免疫球蛋白級分；親和純化方法使用固定的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C而進行)，偶聯到氯甲基活化的膠乳顆粒(0.08μm，來自美國的界面動力學公司(Intefacial Dynamics Inc.，USA)，產品號C37487)上，而產生所述抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒。對于所述偶聯，可以使用從http://www.idclatex.com/body-bgrounder-superactive-protocol-11.asp下載的方法“蛋白與IDC超凈氯甲基膠乳的偶聯(Coupling of Proteins toIDC Ultraclean Chloromethyl Latex)”。
備選的顆粒和偶聯方法可以在界面動力學公司(Intefacial Dynamics)的網頁上、Invitrogen的網頁和Bangs顆粒公司(Bangs Particles Inc)的網頁上找到。
所獲得的顆粒用作在具有0.25％吐溫20和1g/l白蛋白的10mM硼酸鹽緩沖液，10mM甘氨酸，15mM NaCl中2.26mg顆粒/ml的混懸液。
測定實施例1在不同測定條件下，基于本發明的免疫顆粒的濁度測定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測定 按照合成實施例3制備的免疫顆粒混懸液用于下述實驗 在所述實驗中，使用下述最優化的測定緩沖液pH＝7.2 聚乙二醇(西格瑪(Sigma))22g/l， 吐溫20(西格瑪)3g/l， MOPS(西格瑪)9.4g/l， 疊氮鈉2.7g/l， 氯化鈉27g/l， 將3μl樣品與250μl所述測定緩沖液混合，并且允許靜止300秒，然后加入40μl顆粒混懸液并且混合。在所述混合之后，在Schimadzu UV 1601分光光度計中測量光吸收/cm。
取決于濃度、溫度、加入免疫顆粒混懸液并且混合后的時間、以及在分光光度計中所用光的波長，獲得下述結果(mAbs單位/cm＝毫吸收單位/厘米光徑) a)在波長546nm在37℃260秒測定時間內 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，33mAbs單位的吸收變化，并且在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，88mAbs單位的吸收變化，并且在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，194mAbs單位的吸收變化。
b)在波長505nm在37℃260秒測定時間內 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，43mAbs單位的吸收變化，并且在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，128mAbs單位的吸收變化，并且在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，282mAbs單位的吸收變化。
c)在波長570nm在37℃260秒測定時間內 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，24mAbs單位的吸收變化，并且在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，65mAbs單位的吸收變化，并且在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，148mAbs單位的吸收變化。
d)在波長546nm在37℃120秒測定時間內 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，11mAbs單位的吸收變化，并且在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，31mAbs單位的吸收變化，并且在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，72mAbs單位的吸收變化。
e)在波長546nm在37℃40秒測定時間內 在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，4mAbs單位的吸收變化，并且在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，11mAbs單位的吸收變化，并且在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，23mAbs單位的吸收變化。
所述“測定時間”定義為從將免疫顆粒與測定緩沖液和樣品的混合物混合直到讀取吸收的秒數。使用來自美國埃德-白令(Dade-Behring)的產品號為OQNM13N膠乳半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的ProSpec比濁法參照方法，確定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濃度。
然后，將這些結果，與更快和更強的濁度測定信號一起，用來研究來自三酰甘油的干擾的作用，三酰甘油是濁度測定免疫測定中常見的干擾物質，并且與最好的現有技術方法相比較，研究本發明方法的線性。這些實驗描述如下。
測定實施例2研究三酰甘油對本發明方法的濁度測量的干擾 本研究的目的是確定本發明的方法是否在檢測樣品中經歷來自三酰甘油(TG)的干擾。不管是否發現干擾低于預先確定的TG濃度，實施劑量反應研究，以證明干擾與可能干擾的物質的濃度之間的關系。這種方法是基于NCCLS指南“Interference testing in clinical chemistry；approvedguideline(臨床化學的干擾檢測；核準的指南)”，NCCLS第6.1.2部分。
a)裝置 儀器帶有標準附件的日立(Hitachi)917儀器，由羅氏診斷(RocheDiagnostics)提供。
日立917儀器的設置 ●測定緩沖液體積230μl ●樣品體積 3μl ●免疫顆粒體積 40μl ●水體積20μl ●一級波長546nm ●二級波長700nm ●校正稀釋0.055，0.125，0.250，0.432，0.667，1.000 ●Logit Log(4P) b)試劑 測定緩沖液聚乙二醇(西格瑪)22g/l，吐溫20(西格瑪)3g/l，MOPS(西格瑪)9.4g/l，疊氮鈉2.7g/l，氯化鈉27g/l，pH＝7.2。
校正劑包含7.70mg/l人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的血清，使用關于ProSpec比濁計的Dade-Behring’s比濁法由參照實驗室確定。
免疫顆粒按照上述合成實施例2制備的抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒。顆粒用作在10mM硼酸鹽緩沖液，10mM甘氨酸，15mM NaCl，0.25％吐溫20和1g/l白蛋白中的混懸液(2.26mg顆粒/ml混懸液)。
c)樣品 血清1具有高于20mmol/l的三酰甘油濃度的人血清的合并液。
血清2具有低于10mmol/l的三酰甘油濃度的人血清的合并液。
這兩種血清樣品用來制備需要的三酰甘油濃度的樣品。
d)確定在要用的兩種血清合并液中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度 以10次重復，測量在要用的兩種血清合并液中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度。
平均值指定所述血清合并液的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值。
選擇在高于1mg/l的值的+/-5％干擾和在低于1mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的值的+/-7.5％的界限作為允許來自三酰甘油的最大的干擾。這種不同叫作dmax。
按照NCCLS指南，實施具有95％置信水平(α＝0.05)和95％冪(β＝0.05)----雙邊檢測(two-sided test)的這一實驗需要的重復的數目(n) 其中s是在所述血清合并液的運行精確度內(以mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l)。
按照NCCLS指導計算最少重復 低樣品 高樣品 結果表明3次重復是充分的。
e)制備三酰甘油添加的血清(triglyceride spiked serum) 制備具有約20mmol/l三酰甘油的血清(血清合并液A)。由獨立的服務實驗室確定三酰甘油的含量。將這部分血清的一半添加來自英國Scipac有限公司的純化的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，得到高于3mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值(血清合并液B)。
將一半的血清合并液A和B通過在Beckman TL-100超高速離心機中以50,000rpm超高速離心30分鐘進行處理。樣品的澄清部分用作對照合并液，并且對于去除的脂質的體積校正體積。(分別命名為血清合并液C和D)。
f)分析運行 制備基本合并液混合物和對照合并液混合物A，B，C和D每一種的三份等分試樣。
按照用法說明校正儀器，并且以交替的順序進行基本合并液混合物和對照合并液混合物(合并液A，B，C和D)的分析。
如果觀察到干擾，制備來自0％和100％的合并液的50％的中等合并液。從中等合并液和0％的合并液，制備25％的合并液。從中等合并液和100％的合并液，通過將等量的每種合并液混合而制備75％的合并液。在具有新的校正的一次運行中隨機測量全部的n次重復。
對于0％的合并液，計算平均濃度，并且從所有其它的結果中減去。
g)數據分析的凈結果 g1)高半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值樣品
g2)低半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值樣品
觀察到，按照指定的檢測條件，在低于18mmol/l濃度的TG不干擾本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定。
因此，可以推論，本發明提供用于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測定免疫測定方法，其特征在于，在檢測樣品中的15mmol/l的三酰甘油對在3.2和0.83mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l水平的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的測量值具有等于或小于5％的干擾。
測定實施例3確定TG對現有技術測定的干擾 使用日立(Hitachi)917儀器和現有技術試劑(Dako Cytomation)進行相應的研究。
a)試劑 免疫顆粒 LX002/EFG/CS/25.10.04 校正劑X0974/EFG/SUM/09.09.04 對照組X0973/EFG/SUM/09.09.04 反應緩沖液9 S2361/EFG/KGR/09.07.03 b)結果 b1)高半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值樣品，現有技術試劑

b2)低半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值樣品，現有技術試劑

從上述表格，我們可以推論，本發明的方法更穩定地抵抗來自三酰甘油的干擾。
測定實施例4使用本發明的方法進行線性研究 本研究按照NCCLS方法EP6-A，卷23，No 16進行。
在本實驗中，研究了本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定的線性。這通過將3份不同的添加高血清的樣品用低濃度的血清樣品稀釋，從0-100％而進行。通過繪制稀釋系列的結果并且通過一階、二階和三階回歸分析研究所述圖，我們推論，按照給定的標準，本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定方法是線性的。所述標準是通過斯氏t-檢驗而檢驗并且比較圖的參數，以查看測量點(針對稀釋因子繪圖)是否能夠比一階多項式更好地擬合二階或三階多項式。如果t-檢驗失敗了，我們接受在一階多項式和具有最低chi平方值的高階多項式之間6％的差異，其與每個水平的測量的平均值相關(除了在終點之外，在那里，由于人們很少或從不測量具有在這一區域的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度的樣品的事實，所以，可以接受達到25％的差異)。按照這些標準，本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定方法在日立(Hitachi)911測量系統上是線性的。
a)儀器 使用日立(Hitachi)911儀器。
b)試劑 使用上述測定緩沖液和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C校正劑以及抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒。
c)樣品 3份不同患者血清樣品，A，B和C，其中所有的樣品具有高于6mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值。
一份具有低半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度，低于0.8mg/l的患者血清樣品用作高血清的稀釋劑。
血漿樣品A，B和C的稀釋系列如在表1中關于樣品A所述。
使用低樣品D，將每份樣品A，B和C稀釋10次，制備從初始濃度的100％-0％，其中100％是純的高濃度血清(A100，B100，C100)，并且0％是純的低濃度血清(D100)。
表1.關于血清樣品A的稀釋表 進行如表1所述的樣品B和樣品C的相同的稀釋系列。
使用下述測定參數，進行關于日立(Hitachi)911的校正，以建立標準曲線 ○測定體積230μl ○樣品體積3μl ○免疫顆粒體積40μl ○水體積 10μl 每一份稀釋的樣品以3次重復測量，并且記錄每份樣品A，B和C的結果。
d)結果 d1)回歸分析 表1原始數據血清1 表2原始數據血清2 表3原始數據血清3 對于所有三種血清，使用回歸分析，測量的平均值相對于稀釋因子的圖顯示在

圖1，2和3中。
d2)斯氏t-檢驗 進行斯氏t-檢驗，以檢驗高階回歸參數是否擬合所述數據。結果顯示在表4中
表4斯氏t-檢驗值 血清1 從表4中，由于計算的t-值小于列表顯示的t-值，所以，我們推論，來自血清1的數據不擬合二階多項式。
從表4中，我們推論，所述數據可以擬合更高階的多項式，并且我們需要檢驗在一階多項式和具有最低的chi平方值的更高階多項式之間的差異是否大于6％。三階多項式具有最低的chi平方值。
DL＝P(x)-L(x)， 其中P(x)是多項式方程，并且L(x)是線性方程。
表5DL(％)計算血清1 關于血清1的DL(％)圖顯示在圖4中。
血清2 從表4中，由于計算的t-值小于列表顯示的t-值，所以，我們推論，來自血清2的數據不擬合二階多項式。
由于計算的t-值小于列表顯示的t-值，所以，從中我們推論，來自血清2的數據不擬合三階多項式，并且認為稀釋系列是線性的。
血清3 從表4中，由于計算的t-值小于列表顯示的t-值，所以，我們推論，來自血清3的數據不擬合二階多項式。
從表4中，我們推論，所述數據可以擬合更高階的多項式，并且我們需要檢驗在一階多項式和具有最低的chi平方值的更高階多項式之間的差異是否大于5％(DL)。三階多項式具有最低的chi平方值。
DL＝P(x)-L(x)， 其中P(x)是多項式方程，并且L(x)是線性方程。
表6DL(％)計算血清3 關于血清3的DL(％)圖顯示在圖5中。
從上述計算和對線性的規格設置，我們發現，本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定在約0.6-8.5mg/l的檢測范圍內是線性的。
由于參考區間包含在這一范圍內，并且已測量高于8mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度，所以，記錄的線性范圍對于本方法的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定的全部臨床目的是充分的。
從本研究可以推論，按照本發明用于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測定免疫測定方法特征在于，在1.32-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測量范圍內，具有小于4％的線性偏差，并且在0.75-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測量范圍內，小于15％的線性偏差。
測定實施例5關于按照本發明的方法的線性研究 本研究按照NCCLS方法EP6-A，卷23，No 16進行。
在本實驗中，研究了本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定的線性。這通過將添加的高血清樣品用低濃度的血清樣品稀釋，從0-100％而進行。通過繪制稀釋系列的結果并且通過一階、二階和三階回歸分析研究所述圖，我們推論，按照給定的標準，本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定方法是線性的。所述標準是通過斯氏t-檢驗而檢驗并且比較圖的參數，以查看測量點(針對稀釋因子繪圖)是否能夠比一階多項式更好地擬合二階或三階多項式。如果t-檢驗失敗了，我們接受在一階多項式和具有最低的chi平方值的更高階多項式之間6％的差異，其與在每一水平的測量平均值相關(除了在終點之外，在那里，由于人們很少或從不測量具有在這一區域的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度的樣品的事實，所以，可以接受達到25％的差異)。按照這些標準，本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定方法在Architect ci8200測量系統上是線性的。
a)儀器 使用Architect ci8200儀器。
b)試劑 使用上述測定緩沖液和半胱氨酸蛋白酶抑制劑C校正劑以及抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒。
c)樣品 一份患者血清樣品，A，其具有高于6mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C值。
一份患者血清樣品，D，其具有低于0.8mg/l的低半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度，用作高血清的稀釋劑。
血漿樣品A的稀釋系列，如在表1中所述。使用低樣品D，將樣品稀釋10倍，從初始濃度的100％-0％，其中100％是純的高濃度血清(A100)，并且0％是純的低濃度血清(D100)。
表7.血清樣品A的稀釋表 使用下述測定參數，進行關于日立(Hitachi)911的校正，以建立標準曲線 ○測定體積220μl ○樣品體積3μl ○免疫顆粒體積45μl 每一份稀釋的樣品以3次重復測量，并且記錄樣品A的結果。
d)結果 d1)回歸分析 表8原始數據血清A 使用回歸分析，對于血清A測量的平均值相對于稀釋因子的圖顯示在圖6，7和8中。
d2)斯氏t-檢驗
表9斯氏t-檢驗值 血清A 從表9中，由于計算的t-值小于列表顯示的t-值，所以，我們推論，來自血清A的數據不擬合二階多項式。
從表9中，我們推論，所述數據可以擬合更高階的多項式，并且我們需要檢驗在一階多項式和具有最低的chi平方值的更高階多項式之間的差異是否大于6％。三階多項式具有最低的chi平方值。
DL＝P(x)-L(x)， 其中P(x)是多項式方程，并且L(x)是線性方程。
表10DL(％)計算 從上述計算和對線性的規格設置，我們發現，本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定在約0.6-8.8mg/l的檢測范圍內是線性的。
由于參考區間包含在這一范圍內，并且已測量高于8mg/l的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度，所以，記錄的線性范圍對于本方法的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定的全部臨床目的是充分的。
從本研究可以推論，按照本發明用于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度免疫測定方法特征在于，在1.32-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測量范圍內，具有小于4％的線性偏差，并且在0.75-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測量范圍內，小于15％的線性偏差。
測定實施例6關于現有技術濁度測定的線性研究 a)分析 使用現有技術方法和設置，按照Camilla Schmidt在journal EuropeanClinical Laboratory(歐洲臨床實驗室雜志)，2004年2月10日，“CystatinC-The marker of choice for renal function testing(半胱氨酸蛋白酶抑制劑C-腎功能檢測的選擇標記”，以及在所述文獻中提及的Dako產品的包裝插件，進行與測定實施例4相對應的研究，獲得下述結果 b)結果 b1)回歸分析 對于所有三份血清A，B和C，使用回歸分析，測定的平均值相對于稀釋因子的圖顯示在圖10，11和12中。
b2)斯氏t-檢驗 進行斯氏t-檢驗，以檢驗更高階回歸參數是否擬合所述數據。對應的值總結在表11中

表11斯氏t-檢驗值 血清1 數據可能擬合更高階多項式，并且我們需要檢驗在一階多項式和具有最低的chi平方值的更高階多項式之間的差異是否大于6％(DL)。所述三階多項式具有最低chi平方值。差異(DL)為 表12DL(％)計算 關于血清1的DL(％)圖顯示在圖13中。
血清2 數據可能擬合更高階多項式，并且我們需要檢驗在一階多項式和具有最低的chi平方值的更高階多項式之間的差異是否大于6％(DL)。所述三階多項式具有最低chi平方值。
差異(DL)為 表13DL(％)計算 關于血清2的DL(％)圖顯示在圖14中。
血清3 這意味著，數據可能擬合更高階多項式，并且我們需要檢驗在一階多項式和具有最低的chi平方值的更高階多項式之間的差異是否大于6％(DL)。所述三階多項式具有最低chi平方值。
差異(DL)為 表14DL(％)計算 關于血清3的DL(％)圖顯示在圖15中。
我們推論，在參照范圍的下限部分，通過Dako半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定示例的濁度測定法免疫測定的現有技術不是令人滿意的線性的。
測定實施例7本發明的濁度測定與比濁度參照方法的相關性 參考2005年春季C.Schmidt，C.

和K

的公布“Newimproved automated particle-enhanced turbidimetric immunoassay forquantitative determination of human Cystatin C in serum and plasma(用于定量確定血清和血漿中的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的新改進的自動化顆粒-增強的濁度免疫測定)”，其可從Dako Cytomation網頁下載。在使用來自埃德-白令(Dade-Behring)的比濁法參照方法的相關性研究中，他們發現+0.214的截取，以及在相關性曲線中0.6954的增量/斜率。這是與所述參照方法的大的差異。
由于上述原因，通過本發明，提供比所述參照方法具有好得多的相關性的方法。
a)測定條件 在本實驗中，在瑞典烏普薩拉的Akademiska大學醫院(AkademiskaUniversity Hospital)，將本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定，其使用如上文所述的日立917儀器的設置，與在BN ProSpec上的埃德-白令(Dade-Behring)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C方法進行比較，其通過用兩種方法一式兩份測量相同的51份血清樣品(在同一種校正劑和同一天)，并且將它們使用偏性分析(bias analysis)和線性回歸分析進行比較。另外，確定與埃德-白令(Dade-Behring)置信上限的差異，也叫作醫學決定點(Medical Decision point)。實驗設計和數據分析按照NCCLS方法EP-2，卷22，No.19的推薦。
b)結果 下述附圖16，17和18表示所述結果。所述附圖16，17和18表明，本發明的方法令人吃驚地提供具有非常好的準確性的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測量，其使得結果沒有顯著不同于比濁法參照方法。在50份檢測樣品的所述研究中，在兩種方法之間沒有顯著的偏性。總共存在0.023的偏性，具有-0.023到+0.0658的95％置信區間；本質上，沒有顯著不同于0的偏性。
埃德-白令(Dade-Behring)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定具有0.95mg/l的醫學決定點。使用線性回歸分析，我們發現，用Dade Behring方法測量為0.95mg/l的樣品，使用按照本發明的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫測定方法，將測量在0.83-0.89mg/l之間。血漿方法比較分析導致0.968的相關性曲線斜率，具有0.103mg/l的截取。這意味著，所述血漿分析的斜率和截取落在血清分析的斜率和截取的置信區間內。
這證明，與濁度測定方法技術先前的最好狀態相比，本發明的方法導致與比濁法參照方法好得多的相關性。
上文提及的公布“New improved automated particle-enhancedturbidimetric immunoassay for quantitative determination of human Cystatin Cin serum and plasma(用于定量確定在血清和血漿中的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的新改進的自動化顆粒-增強的濁度測定法免疫測定)”證明，濁度測定半胱氨酸蛋白酶抑制劑C測量可以用來估計腎小球濾過率。這也由Grubb等在Clinical Chemistry(臨床化學)518，1420-1431中的公布“SimpleCystatin C-Based Prediction Equations for Glomerular Filtration RateCompared with the Modification of Diet in Renal Disease Prediction Equationfor Adults and the Schwartz and the Counahan-Barratt Prediction Equations forChildren(單純基于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的腎小球濾過率預測方程與用于成年人的腎病預測方程和用于兒童的Scwartz和Counahan-Barratt預測方程中的飲食改進的比較)”證明。使用比濁法參照方法的類似公布是A.Larsson等，在Scand.J.Lab.Invest.(斯堪的納維亞實驗室研究雜志)2004；64，25-30中的“Calculation of glomerular filtration rate expressed in ml/minfrom plasma Cystatin C values in mg/l(來自以mg/l的血漿半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的表示為ml/min的腎小球濾過率的計算)”。按照本發明的方法，其與比濁法方法具有更好的相關性，當然比現有技術濁度測定測量方法甚至更好地適用于這一目的。
權利要求
1.用于評估人體液樣品中的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測定法免疫測定，其通過下列步驟進行
a)通過將所述樣品與包含適用于濁度測定法測量的納米顆粒的納米顆粒-抗體綴合物接觸而形成測定混合物，其中所述納米顆粒用抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體或其抗原結合片段包被，以結合所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，其中所述包被的納米顆粒具有至少40nm范圍內的中值直徑，并且
b)通過測量所述混合物的濁度的變化而評估所述人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的含量。
2.權利要求1的方法，其中所述抗體是針對人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的多克隆非人、非嚙齒動物抗體。
3.權利要求2的方法，其中所述多克隆抗體是針對人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的禽類抗體。
4.權利要求2和3中任一項的方法，其中至少25重量％的所述多克隆抗體或片段通過使用人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C親和純化而獲得。
5.權利要求1的方法，其中所述抗體包括(a)結合人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的單一表位的單克隆抗體，或(b)一組兩種或多種種類的單克隆抗體，其中每種種類的單克隆抗體結合人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的不同的表位，或者兩種或多種種類以不同的結合強度而結合相同的表位。
6.權利要求5的方法，其中所述單克隆抗體是非人來源的。
7.前述權利要求中任一項的方法，其中所述包被的納米顆粒具有大于58nm的平均直徑。
8.權利要求7的方法，其中所述包被的納米顆粒具有80-105nm范圍內的平均直徑。
9.前述權利要求中任一項的方法，其中所述包被的納米顆粒用約5-35％的抗體/所述納米顆粒-抗體綴合物的總重而包被。
10.前述權利要求中任一項的方法，其中所述包被的納米顆粒用抗-人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C抗體和至少一種惰性蛋白質的混合物包被。
11.前述權利要求中任一項的方法，所述納米顆粒基本上由聚苯乙烯、聚氯乙烯、環氧樹脂、聚偏1，1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙烯酸酯、聚乙烯萘、以及它們相對應的共聚物制成。
12.前述權利要求中任一項的方法，其中所述濁度變化通過在所述測定混合物在500-600nm范圍的波長，以及在10-50℃范圍內的溫度的光吸收的變化而測量。
13.前述權利要求中任一項的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述關于波長546nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于75mAbs單位/cm。
14.按照權利要求1-12中任一項的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述關于波長505nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于20mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于50mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于90mAbs單位/cm。
15.按照權利要求1-12中任一項的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持260秒，所述關于波長570nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于10mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于80mAbs單位/cm。
16.按照權利要求1-12中任一項的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在32℃保持600秒，所述關于波長546nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于12mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于25mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于70mAbs單位/cm。
17.按照權利要求1-12中任一項的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持120秒，所述關于波長546nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于8mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于20mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于50mAbs單位/cm。
18.按照權利要求1-12中任一項的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持120秒，所述關于波長546nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于30mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于75mAbs單位/cm。
19.按照權利要求1-12中任一項的方法，其中如果在形成所述混合物后，將所述混合物在37℃保持40秒，所述關于波長546nm的光的濁度的變化，表示為mAbs單位/cm，是
在所述測定混合物中，在9.9μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于4mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在19.8μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于7mAbs單位/cm，或者
在所述測定混合物中，在34.1μg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的濃度下，大于15mAbs單位/cm。
20.按照前述權利要求中任一項的方法，其特征在于----當構建針對比濁法的相關性曲線時----關于用比濁法獲得的0mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的相對應值，用濁度測定方法獲得的是小于0.15mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的截取值。
21.按照權利要求1-19中任一項的方法，其特征在于----當構建針對非均相免疫測定方法的相關性曲線時----對于0mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的相對應值獲得小于0.25mg/l半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的截取值。
22.按照權利要求1-21中任一項的方法，其特征在于，在所述檢測的樣品中，對于在1.2mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l水平的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的測量值，具有來自15mmol/l三酰甘油的小于6％的干擾。
23.按照權利要求1-22中任一項的方法，其特征在于，在1.32-7.5mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測量范圍內，具有低于5％的線性偏差，并且在0.75-1.32mg半胱氨酸蛋白酶抑制劑C/l的測量范圍的測量區域內，具有低于15％的線性偏差。
24.按照權利要求1-23中任一項的方法，其特征在于，通過測量吸收增加的初始速率而確定樣品的半胱氨酸蛋白酶抑制劑C濃度，(a)通過在混合時直接記錄，或者(b)通過在混合后立即記錄，與吸收的初始增加的后推組合，或者(c)通過在樣品和試劑混合后測量在兩個或多個小于1分鐘的時間點之間的吸收差異而確定。
25.一種用于評估哺乳動物的腎小球濾過率的方法，所述方法包括按照權利要求1-24中任一項的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測定法評估。
26.用于實施權利要求1-25中任一項的方法的試劑盒或試劑組，其包括(a)顆粒，其包括以干燥或混懸形式存在的在前述權利要求1-12任一項中定義的抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑C免疫顆粒，(b)以干燥或溶解形式存在的測定緩沖液，以及，任選地，(c)分別以干燥或溶解形式存在的校正劑混合物和對照混合物。
27.權利要求26的試劑盒，其中所述顆粒和測定緩沖液以干燥或混懸的形式組合提供。
28.按照權利要求1-12中任一項的定義的納米顆粒-抗體綴合物。
29.權利要求28的納米顆粒-抗體綴合物在用于評估人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫測定中或在用于評估哺乳動物的腎小球濾過率的診斷方法中的應用。
30.權利要求28的納米顆粒-抗體綴合物在用于評估人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的免疫測定中或在用于評估腎功能障礙的診斷方法中的應用。
全文摘要
需要用于生物樣品，特別是人的體液臨床樣品中的人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的改進的濁度測定法免疫測定。本發明提供能夠通過濁度測定方法測量人半胱氨酸蛋白酶抑制劑C的濁度測定免疫測定方法和試劑組，其令人驚訝地導致比現有狀態的技術更強和更快的濁度測定信號。提高的和更快的信號通過使用新的試劑和組合物而獲得，并且能夠獲得更短的測定時間和具有更強的信號的動力學讀數，提高了整體測定速率和質量。本發明實現了針對脂質干擾的提高的穩定性和提高的線性。
文檔編號G01NGK101356438SQ200680043918
公開日2009年1月28日 申請日期2006年11月24日 優先權日2005年11月24日
發明者卡特林·森德, 湯姆·尼爾森 申請人:根田股份有限公司