專利名稱：分子檢測裝置的制作方法
分子檢測裝置發明領域本發明涉及一種分子檢測器， 一種分子檢測器中使用的載體，以 及由載體和檢測器形成的分子檢測器聯合裝置。本發明尤其涉及了使 用光散射，如拉曼散射的檢測器，或在光吸收上使用熒光的檢測器。
背景技術：
已知有許多檢測被分析物分子的行為或存在的技術。其中之一是利用拉曼散射(RS)效應。入射到分子的光被散射了，作為能量轉移的 結果，散射光的頻率發生了變化，因此，波長也發生了變化。造成這 種非彈性散射的過程叫作拉曼效應。頻率的變化是被分析物分子所特 有的。但是RS效應是非常微弱的，所以已知優選使用膠體的技術來增 強這種效應。將被分析物分子放在幾埃的金屬表面上，例如銀、金、 銅或其它這類材料，能量從金屬表面經各種機制進行轉移。這就是所 謂的表面增強拉曼散射(SERS)，可以用傳統的分光鏡檢測器法來測量。 表面增強拉曼光鐠和它的衍生品，表面增強共振拉曼光譜(SERRS) 做為定量生物分析工具得以普及。這兩種技術很大程度上取決于金屬 (等離子體振子)表面的運動傳導電子的"等離子"和與表面接近的分子種類之間的交互作用。這種交互作用導致了特定振動能量下，拉曼 散射的顯著增強，在拉曼散射光中產生了強烈的光鐠信號。直到最近，在對這種增強機制的理解上還有爭論。兩個主要的派 別不同意在化學增強機制和電磁增強機制之間超過106的增強因子的 劃分。化學增強機制，目前認為提供102的增強因子，斷言在金屬和 被吸附分子間產生了電荷轉移狀態。這種機制是位點特異性的和被分 析物依賴性的。分子必須直接吸附到表面，從而經歷化學增強。電磁 增強機制使得普通的拉曼散增強超過104倍。為了理解電磁增強，人6們必須考慮到表面的毫微級糙度特征的大小、形狀和材料。如果光的 適合波長與金屬的糙度特征相吻合，傳導電子的等離子體將共同振蕩。 因為這種共同振蕩是局限在電子的這種等離子體的表面，所以也叫做局部化表面等離子體振子共振(LSPR) 。 LSPR允許共振波長吸收和散 射，在糙度特征附近產生大的電磁場。如果分子放在電磁場內，可以 測量到增強的拉曼信號。場的強度和局部密度用大量的參數來測定。反射光的波長決定了 其能量，金屬的成分和形態決定表面等離子體振子結合光子能的強度 和效率。其它因素，如金屬和被分析溶液的相對介電特性也對效應產 生了很大的影響。此外，在場和任何接近金屬表面的分子間的能量轉 移的效率也取決于分子本身共振能量狀態，例如包括在紅外線光譜內 的特定振動模式和紫外內的電子能量轉移。SERRS就是通過這種機制 在傳統的SERS上提高了性能。我們認識到這個問題，即拉曼散射效應即使使用了表面增強拉曼 散射(SERS )，其提供的拉曼散射線也比普通散射(有效的弱信噪比) 少。我們進一步認識到，因為拉曼信號比噪聲弱，所以需要引入一種 機制來從噪聲中區別拉曼信號。發明概述本發明在權利要求中定義。本發明的一個實施方案利用表面增強 拉曼散射(SERS)在表面附近的區域來檢測被分析物。和已知的裝置 不同，實施方案使用了報告染料和校準染料，連同選擇性試劑如抗體， 因而裝置是這樣的校準染料放置在表面附近的區域，報告染料用選 擇性試劑固定在遠離表面的地方，直到被分析物分子與選擇性試劑在 報告染料被位移的點相結合，也變成被局部化在表面附近的區域。這 種裝置有效地提供了從被分析物中散射出的拉曼信號的校準。在沒有 被分析物分子時，因表面增強拉曼效應引起的拉曼散射主要僅來自于 校準染料。在與被分析物分子結合后，報告染料被取代到表面附近的 區域，這樣也有助于表面增強拉曼信號。這使來自報告和校準染料的信號的比例可作為一種量度標準，獨立于必然包括未知噪聲影響的散 射光的絕對強度。因此，這種裝置被認為是一種用于檢測被分析物分 子的校準裝置。當然，"染料"對于本領域技術人員而言是公知的，用在本文中 包括特定的光學特性的基團，也就是所謂的"發色團"。術語"染料" 因此包括"拉曼活性發色團"。"染料"應強烈吸收波長適用于表面增強的激發激光(最常見的拉曼激光是514nm， 532nm和785nm)。這 是在綠-紅可見范圍，因此這種傳統的亮色染料是特別好的拉曼活性 發色團。被分析物是需要檢測或定量的任何化學試劑。合適的分析物的實 例包括生物分子(例如蛋白質、抗體、核酸、碳水化合物、蛋白多糖、 脂質，或激素)、醫藥品或其它治療劑及其代謝物、濫用藥物(例如安 非他明、鴉片、苯二氮萆類、巴比妥酸鹽、大麻素、可卡因、LSD及 其代謝物)，炸藥(例如硝化甘油和硝基甲苯包括TNT、 RDX、 PETN和 HMX)，和環境污染物(例如除草劑、殺蟲劑)。被分析物樣品是需要測試確定被分析物存在或數量的任何樣品， 許多情況需要測試被測試物的存在或不存在，或數量。例子包括醫療 用途(例如測試生物試樣，如血或尿樣中的抗原或抗體)，檢測濫用藥 物(例如違法樣品、或生物試樣如體液或呼吸樣品)的存在，檢測爆 炸物、或檢測環境污染物(例如液體、氣體、土壤或植物樣品)。本發明的方法可用于同時檢測被分析樣品中的幾種不同類型的被 分析物。這可以通過使用不同的選擇性試劑和報告染料，用于每種不 同的被分析物得以實現。 一種單一的校準染料可用于這種同時檢測， 或使用多種校準染料(例如不同的校準染料用于每個不同的被分析需要注意的是，在一些情況下，被分析樣品可能不含有任何被分 析物。例如，需要表明通過純化過程去除了的特定的化學品，或傳染 劑(或傳染劑的標記)不再存在于獲自經處理的受試者的生物樣品中。選擇性試劑是任何在被分析物樣品的其它成分存在時，選擇性的結合到被分析物上的試劑，從而在使用檢測方法的條件下，可檢測出 樣品中被分析物的存在(或數量)。選擇性試劑的特性當然取決于被分 析物的特性。在許多情況下，選擇性試劑是抗體。但是，可以使用其 它適合的被分析物配偶體。例如，如果被分析物是抗體，選擇性試劑 可以是抗原或抗原衍生物，其選擇性地被抗體結合。如果被分析物是 核酸，選擇性試劑可以是核酸，或核酸類似物，其與被分析物的核酸 雜交。
本文中所用的術語"抗體"包括能選擇性的結合到被分析物上用
于檢測被分析物的抗體或片斷(例如Fab片斷，Fd片斷、Fv片斷、dAb 片斷、F(ab， )2片斷、單鏈Fv分子或CDR區域)，或抗體或片斷的衍 生物。
在本發明的一些優選的實施方案中，報告染料可以是報告體系的 一部分。典型的報告體系會包括報告染料、選擇性試劑結合基團，和 金屬表面結合基團。在被分析樣品引入到載體前，將報告體系結合到 選擇性試劑(通過選擇性試劑結合基團)。被分析物與選擇性試劑的結 合取代了報告體系，其然后被結合到金屬表面(通過金屬表面結合基 團)，從而導致報告染料移動到金屬表面附近區域。
可能被分析物本身原本是拉曼活性的。在這種實施方案中，報告 染料可以與被分析物具有化學同一性。使用報告體系時，不需要單獨
的選擇性試劑結合基團。
通常，希望報告體系的各成分用單獨的交聯劑連接在一起。對于 本領域技術人員而言，很明顯可使用多種可能的合適的交聯劑。交聯 劑的特性取決于報告體系各成分的特性。如果選擇性試劑結合基團包 括肽，那么交聯劑與傳統的肽連接化學相容就比較有利。例如，交聯 劑可以優選地包括單一的羧酸基團，用于與肽的N末端反應。
在一些情況下，根據所用的特定成分，連接報告體系的兩個或多 個成分可以不使用單獨的交聯劑，例如通過報告體系中不同成分的化 學基團間的反應來連接。
報告體系成分的連接可以是任何順序，只要當報告體系通過其金屬表面結合基團連接到表面時，報告染料是在金屬表面附近的區域內。
報告體系的金屬表面結合基團應該是優選結合(典型的是通過吸 附)到金屬表面的基團。在一些情況下，理想狀況是金屬結合基團與金 屬表面的結合是足夠強，以至于能將報告體系固定到金屬表面上。金 屬表面結合基團的化學特性取決于所用的金屬表面。適當的銀結合官 能基包括具有雜環氮的基團，例如嚙唑，噻唑、二唑、三唑、-惡二唑、 蓉二唑、噶蓉唑、蓉三唑、苯并三峻、四唑、苯并咪哇、吲唑、異吲 唑、苯二唑或苯異二唑。其它適當的官能基包括胺、酰胺、硫醇、硫 酸鹽、硫代硫酸鹽、磷酸鹽、硫代磷酸鹽、羥基、羰基、羧酸鹽和硫 代氨基曱酸鹽。氨基酸例如半胱氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸、天 冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或精氨酸也可與銀結合。
值得一提的是選擇性試劑與校準染料的結合應足夠穩定，以至于 被分析物與選擇性試劑的結合不會從選擇性試劑中取代校準染料。通 常，校準染料將與選擇性試劑共價連接。
校準染料可以通過金屬表面結合基團固定在金屬表面附近區域， 所述結合基團結合在(優選是共價結合)校準染料或選擇性試劑上。上 面給出了金屬表面結合基團的例子。結合到校準染料或選擇性試劑上 的金屬表面結合基團可以是與報告體系上的金屬表面結合基團是同一 種，或是不同種，但是其應與金屬表面結合的足夠強以將校準染料和 選擇性試劑固定在金屬表面上。選擇性試劑、校準染料和金屬表面結 合基團可以以任何順序結合在一起，只要當選擇性試劑固定到金屬表 面時，校準染料是在金屬表面附近區域內。
在另 一選擇的實施方案中，選擇性試劑可以本身是拉曼活性的， 這樣選擇性試劑可以具有校準染料的功能。在這種實施方案中，不需 要單獨的校準染料。
現在將僅僅利用例子，并且參照附圖，描述本發明的實施方案 圖l表示拉曼散射的能量水平；圖2表示利用表面強化拉曼散射原理的檢測器的原理圖； 圖3是表示通過選擇性試劑將校準染料和報告染料連接到表面的 排列；
圖4表示第一被分析物載體和檢測器一起形成能體現本發明的檢 測器聯合裝置；
圖5表示能體現本發明的可選擇的被分析物載體；
圖6表示能體現本發明的可選擇的另一個被分析物載體。
發明詳述
所述實施方案使用表面強化拉曼光i普(SERS)的技術，但是本發明 還可以用于熒光發射或者熒光淬滅技術。本實施方案包含兩個主要組 成部分被分析物載體，其提供支持待分析分子的被分析物區；以及 檢測器，其向載體上的被分析物區提供激光輻射并且具有檢測來自被 分析物區的輻射的傳感器。被分析物載體和檢測器一起構成檢測器裝 置。
檢測器本身可以包括后面描述的各種形式的激光源和傳感器。適 合于檢測器的被分析物載體的實施方案可以是各種形式。優選的實施 方案是微流體芯片，但是其他的實施方案包括后面描述的適當改良的 微量滴定板。被分析物載體因此叫做"芯片上的實驗室"。在描述實 施方案之前，SERS效果將首先通過背景技術進行簡要的描述。
如之前討論的，當光從分子上散射，大部分的光子被彈性散射。 大部分散射的光子具有和入射光子相同的能量(以及頻率和波長)。 然而小部分的光(大約107之一的光子)散射的頻率與圖1中的入射 光子的頻率不同，通常低于入射光子的頻率。當散射后的光子丟失能 量至分子，其具有比入射光子更長的波長(術語叫做斯托克司散射)。 相反的，當其獲得能量，則具有更短的波長(術語叫做反斯托克司散 射)
導致該非彈性散射的過程的術語叫做拉曼效應，以C.V.Raman先 生命名，他在1928年發現了該現象。它與分子振動的，旋轉的或者電子能量的改變相關，與從光子向分子轉移的能量(通常作為熱量消散) 有關。熱能還可以傳遞給散射光子，因此降低了它的波長。在非量子 物理的術語中，可以將這種交互作用看作分子電場的擾動，其不僅僅 依賴于分子的特定的化學結構，還依賴于它的精確的構像和環境。入 射光子和拉曼散射光子之間的能量差等于散射分子振動態的能量，給 予散射的光子量化的能量值。散射光強度對能量(波長)差異的曲線用
拉曼光譜[RS]表示。不同的能量狀態的解釋表示在圖1中。
圖2表示來自于在金屬表面幾十納米內的化合物或離子的拉曼散 射如何比溶液中大103到106倍。這種表面增強拉曼散射(SERS)在銀上 是最強的，但在金和銅上也很容易觀察的到。最近研究表明大量的過 渡元素也可以引起有用的SERS增強。SERS效應基本是由能量轉移產 生的，即分子和金屬表面附近因金屬中的電子產生的電磁場間的能量 轉移。用SERS產生增強拉曼散射的準確的機制不需要在這里描述，本 領域技術人員知道多種模型例如被分析物分子的圖像與金屬中電子的 耦合。有效地，金屬層6的電子為分子提供能量，從而增強拉曼效應。 特定分子的存在可以用SERS通過檢測散射輻射的波長來檢測，所 述散射輻射表示為散射束4。散射是不具有方向性的，所以傳感器(沒 有顯示)可以放在任何合理的位置來捕獲散射輻射，以測量散射輻射的 波長，由此產生的能量變化。能量變化與分子狀態的帶隙有關，因此 可以確定特定分子的存在。在已知的裝置中，報告染料最初與選擇性 試劑8,例如抗體相結合。被分析物10與選擇性試劑的結合取代了報 告染料，導致其移動到金屬表面，產生了 SERS信號。報告染料可以通 過圖1中表示的其特有的拉曼位移來檢測。
本發明實施方案中用于檢測被分析物存在的載體表示在圖3a和 3b中，包括金屬表面6。選擇性試劑8，例如抗體，與通過金屬表面 結合基團31固定在表面6的校準染料30相結合。校準染料30在區域 34內，這樣它就處于表面6的衰減場效應中，以增強SERS效應。報 告體系38包括與金屬表面結合基團33相連接的報告染料32和選擇性 試劑結合基團35(例如用抗體選擇性結合的肽)。報告體系38(因此報告染料32)用抗體8固定在遠離表面的地方，所以報告染料32在區域 34外。被分析物36和選擇性試劑8結合后，報告體系38從選擇性試 劑8中被取代出來。報告體系38的金屬表面結合基團33接著導致報 告體系38結合到表面6，如圖3b所示。報告體系38和表面6的結合 將報告染料32帶到了區域34內，這樣它就處于表面6的衰減場效應 中，以增強SERS效應。
檢測器的信噪比可通過使用2個拉曼活性基團(即校準和報告染 料)來增強 一個是32(報告染料)，其通常固定在遠離表面并在被分 析物存在時釋放，另一個是30(校準染料)，其永久固定在衰減場中從 而做為一種內部校準信號。不是依賴拉曼散射光的絕對強度來進行量 化，這種裝置是使用每種染料散射的光的比率。因為染料最初的比率 通常是已知的常數，任何觀察到的比率變化提供了一種量化，其基本 獨立于絕對強度、從而提供了一種內部校準信號，其不易受檢測器變 化、傳感器裝置構成的再現性或其它噪聲源帶來的噪聲影響。
當被分析物分子36與選擇性試劑8相結合時，報告染料32從選 擇性試劑中釋放出來，移動到衰減場，與表面結合，如右圖所示。在 第一種情況，因為報告體系38的報告染料32固定在遠離表面的地方， 所以僅產生了來自校準染料30的信號。當被分析物存在時，可以觀察 到來自兩種染料的信號，兩者的比率可以用來量化報告體系的分子被 取代的程度，從而量化被分析物存在的數量。
優選的光譜對照不是特定的拉曼位移中量出的強度的簡單比率， 盡管這可作為一種合理的第一個近似值。來自染料的光i普信號是加和 性的，這表明如果染料之間的光鐠峰值有任何重疊時，特定拉曼位移 的強度來自于兩種染料，數量關系與強度變成了非線性關系。峰值強 度，.特別是強峰("比爾-郎伯定律")，本身的非線性使這進一步復雜 化。分析光i普的最好方式是使用非線性多元校準技術，例如神經網絡， 遺傳編程、偏最小二乘法分析或支持向量機。這些在本領域都進行了 很好的研究，在這里不再做深入的描述。
優選的分析數據集包括完整的拉曼光語，典型的是選自200-4000cnf1范圍。染料內單獨的化學基團將在這些光謙內的特定的 拉曼位移處有峰值，可以通過多元校準軟件來使用這些，從而確定報 告體系相對校準染料的量。 一旦找到了定量模型，可以僅使用完全光 i普的子集，所以可以設計簡單化的檢測器，其僅觀測這些拉曼位移， 但這將是專門針對那些染料的，不太適合普通的技術平臺。
在優選的實施方案中，報告體系分子的選擇性試劑結合基團結合 在選擇性試劑與被分析物相同位置。能成功這樣做的一種方式是根據
系的選擇性試劑結合基團。例如，、如果被分析物是蛋:質，選擇性試 劑是抗體，那么報告體系的選擇性試劑結合基團可以包括能被抗體識 別的被分析物的區域相一致的肽。可選的是，被分析物可以是一種特 定的核酸(例如，DNA或RM)。報告體系的選擇性試劑結合基團于是可 以包括寡核苷酸，其堿基序列對應于通過選擇性試劑進行選擇性結合 的被分析物的部分。同樣的，碳水化合物或蛋白多糖被分析物可以用 報告體系進行檢測，該報告體系含有選擇性試劑結合基團，其含有通 過選擇性試劑進行選擇性結合的被分析物的糖基。對于脂質被分析物， 報告體系的選擇性試劑結合基團可以含有一種或多種來自通過選擇性 試劑進行選擇性結合的被分析物結構的脂肪酸鏈。
在另一個實施方案中，報告體系可以用變構機制進行取代。在這 種實施方案中，選擇性試劑結合基團與選擇性試劑上與被分析物結合 的位置不同的位置結合。選擇性試劑結合基團在其位置的結合導致了 被分析物結合的位置的變化，因此被分析物與選擇性試劑的親和力降 低了，被分析物接著被釋放(即被取代了)。
根據本發明的備選的優選實施方案，被分析物可以是一種可以裂 解底物(例如核酸或肽底物)的一種酶(例如蛋白酶或核酸酶)。在這些 實施方案中，選擇性試劑包括識別位點，其能通過酶進行選擇性地結 合，和裂解位點，其能被酶裂解釋放出(即被取代)附著在選擇性試劑 上的報告染料。需要注意到通過監測反應的速率并將其與已知的酶/ 底物組合的酶變率相比較，可使用該實施方案來確定存在的被分析物酶的數量。
報告體系分子至金屬表面的運動有多種機制，但最簡單的是通過 簡單的擴散。 一旦它存在了，金屬結合基團將其固定在適當的位置。 當然，許多報告體系分子會簡單的從表面擴散開來，進入到本體溶液 中。在非微流體檢測器室里，這將導致檢測器靈敏度下降，但是這個 也是可行的，因為報告體系分子可再生部分將在給定時間內結合到表 面上。在微流體環境里，檢測器室壁的作用是限制分子，所以它們會 快速反彈回來，"粘"到金屬上(通過與金屬結合基團結合)，從而大 幅增加靈敏度。最終(取決于室的大小和擴散的速率)，報告體系的大 部分或者甚至全部都會結合到金屬上。
還有其它測量分子存在的技術， 一種技術是所謂的表面等離子體
振子共振(SPR)。在SPR中，激發的激光束電矢誘導在金屬層表面產生 了偶極。來自于陽極極化電荷的還原力導致了在這個激發的共振頻率 下的振動電磁場。在瑞利極限中，這種共振主要由金屬層("等離子體 振子")表面的自由電子的密度以及金屬和其環境的介電常數來確定， 所述金屬層確定了所謂的"等離子體波長，，。
吸附在層表面上或接近層表面的被分析物中的分子經過一個特別 大的電磁場，其中垂直于表面的振動模式大大增強了。這是表面等離 子體振子共振(SPR)效應，其使得可進行金屬層的等離子體振子和表面 附近的分子間的通過空間的能量轉移。散射的光子可用傳統的分光鏡 檢測器來測量(沒有顯示出來)。排列平面偏振光的激發激光束使撞擊 在金屬表面的臨界角附近。臨界角可通過金屬的折射率來確定。SPR 效應產生了衰減波，電磁場，其從金屬表面延伸了大約400nm。場和 被分析物分子間的能量轉換導致了層有效折射率的變化，導致了臨界 角的變化，從而政變了折射光的強度，這些可以通過使用傳統的分光. 鏡設備來檢測。
另一種檢測被分析物的方法是在單一檢測器中結合SERS和SPR 效應。在這種裝置中，如果SPR束的激發波長改變了 (如通過使用可調 諧激光器)或者金屬層的成分和厚度發生了變化，SPR效應可選擇性地被優化以最大化源自特定被分析物分子的SERS信號。這樣做的優點是 對于一種既定的分子，SERS信號的強度可顯著增強(使其對檢測更敏 感)，以及在一個區域的SPR電磁場可被調整，以選擇性地增加來自復 雜生物混合物的特定成分的信號。因為組合檢測器使用了人工SPR場 來增強來自被分析物分子的熒光，我們給這種方法命名為表面等離子 體振子輔助拉曼分光鏡法(SPARS)。有效的是，使用第二激光來將能量 輸送到由第 一激光產生的激發中。
可以使用其它帶校準染料的檢測方法。例如可使用熒光，這樣僅 當第二種染料被分析物分子取代時產生熒光。做為選擇的是，也可以 使用熒光猝滅。
產生信號的染料基團可以根據所用的檢測方法來選擇。如果使用 拉曼分光鏡作為選擇的檢測器法，增強應發生在可見光/紅外光譜區。 因此應優選使用表現強拉曼分光鏡特性的染料基團，選擇傳感器材料 和形態以便最優化這種光鐠范圍的能量轉移。如果熒光輻射為優選的 檢測方法，則相關的光鐠區是可見光/紫外光，同樣，可合理地選擇傳 感器材料和形態來優化它們在這個光譜區的效應，合適的熒光染料基 團可從市場上購得，或定制合成來滿足應用要求的這一些中選擇。熒 光發射的一種備選方案是熒光猝滅。如前所述，在表面吸附分子和電 磁場間的能量轉移是雙向的過程。衰減場因此可以用作吸能源，以吸 取來自激發熒光分子的能量，因此產生猝滅效應，其減少來自金屬表 面附近分子的熒光。傳感器因此檢測到報告體系分子釋放上的熒光猝 滅增強。在所有情況中使用兩種染料， 一種報告結合， 一種是用作校 準基線。
也知有許多可用SERS或SERRS檢測的染料，這可以參考相關文獻 (例如:W099/994065)。,刺子中包括熒光素染料、若丹明染料、酞胥染 料、偶氮染料、青色素、黃嘌呤和琥珀酰熒光素。任何具有大有機系 統且在適合表面等離子體振子與金屬(例如對于銀MOOnm)共振波長處 發出熒光的化合物都是合適的。
需要注意的是校準和報告染料必須使用特定的檢測技術區別開來。
在拉曼光譜中觀察到的特定波長位移用分子的拉曼活性振動模式 的頻率來確定。
一些化學基團(例如羧酸鹽、芳香環、曱基)通過少量
原子的局部運動提供了特有的振動模式。其它的是因為遍及分子的大
規模的振動運動。拉曼活性振動通常在與紅外活性的波長一致的波長
處發生。區別在于強拉曼活性振動誘導了基團極化性("尺寸")的變
化，而紅外活性誘導了偶極("電荷分布")的變化。
在一些情況下，報告體系的選擇性試劑結合基團或金屬表面結合 基團本身含有一種染料、從而避免了使用單獨報告染料的需要。
下面將描述被分析物載體的實施方案，還描述整個載體和檢測器 聯合裝置。
優選的被分析物載體實施方案表示在圖4中，其為微流體芯片形 式。在適當的塑料、玻璃或可以透過選定波長的輻射的其它合適材料 的底物11上，形成了一個具有通道22的通道層13。將溶液中的被分 析物按箭頭所指的方向引入到通道中。在通道的區域17，形成了傳導 層或半導體層16。這個層優選是銅、鋁、銀或特別是金之一。如前所 述，金層可以是粒子大小為80nm量級的膠體，選擇金屬膠體內的粒子 大小以提供如前所述的適當的等離子體振子波長。
芯片的主要用處在檢測蛋白質被分析物。關于這個作用，附著在 可結合被分析物蛋白質的抗體(或其他選擇性試劑)上的校準染料保 持在金表面16上。校準染料在金表面的衰減場的影響范圍內區域20 中。報告體系包括附著于肽或能模擬抗體可結合的被分析物蛋白質的 一部分的類似片斷的報告染料。報告染料通過將報告體系的肽與抗體 結合最初遠離表面。通過將蛋白質被分析物與抗體結合，報告體系被 取代了，進入到金表面的衰減場的影響范圍內區域20中。報告染料的 選用取決于被分析的蛋白質。校準和報告染料提供了光學效應例如 SERS散射。
插入了被分析物載體芯片的檢測器包括為被分析物，和在金層16 的表面區域17的報告體系分子提供了光束2的SERS激光28。 SERS激光28提供了在一波長的輻射，該波長被選擇以與選定的報告體系分 子的帶隙匹配，其將根據分子不同而變化。為了提供可變的檢測器， 因此SERS激光優選是可調的。因為SERS散射4不具有方向性，用于 散射輻射的傳感器26可以放在任何位置。但是，這個傳感器優選不與 SERS激光器相對，以避免來自激光器的直接輻射到達傳感器。
為SPR效應提供平面偏振光束12的激光27也可以在表面16的臨 界角處提供，放置傳感器陣24來接收反射束14。選擇SPR激光27使 其波長與表面等離子體振子共振相匹配，等離子體振子本身被安排以 偶聯報告染料分子的帶隙。因此，SPR激光27也優選是可調節的。傳 感器陣24包括多個傳感器，每一個與反射束的角度稍微不同。因此， 當報告體系分子與表面16的衰減波發生作用，它改變了 SPR折射輻射， 這可以通過折射光角度的變化來測量。同樣，由于SPR激光是可調節 的，當被分析物結合到抗體上時，SPR效應可通過掃描激光的調節， 記錄發生在給定的檢測器位置上折射光的波長的變化來檢測。
盡管顯示的只是一個通道，但是芯片優選的是有多個通道的，每 一個通道可以在金屬層上包含不同的報告染料和/或抗體(或其它選擇 性試劑)。
笫二個具體表達的被分析物載體顯示在圖5中，其包括一個改良 的微量滴定板。微量滴定板是本領域技術人員所熟悉的，包括基層中 的一系列孔，典型的是塑料的。被分析物樣品引入到微量滴定析的孔 中用于分析。根據本發明的這個實施方案，每個孔的底部，或側面被 改良了，以包括可傳導的表面16。與選擇性試劑相結合的校準染料固 定在表面上。如前所述，含有報告染料的報告體系與選擇性試劑結合。 溶液中的被分析物被導入到每個孔中，然后將板插入前面圖4中所描 述的檢測器中。如前所述，傳導表夷優選是典型厚度在50到80nm的 金。檢測器裝置可依次輻照每個孔，但是優選的是有檢測器陣，可同 時輻照和檢測板中多個孔的每一個。
對于任何上面的"芯片上的實驗室"裝置，都還存在控制金屬層 16的準確成分的可能性。用多種攙雜劑原子改良金屬表面16將提供另外的可調節等離子波長的方法，甚至可以產生可電控的SPR場。
圖6表示了一個進一步備選的實施方案，其中校準和報告染料和 前面一樣是存在的，但是區別在于被分析物載體包括兩個表面。結合 到選擇性試劑的校準染料30如前所述結合在第一表面6。同樣，報告 染料32是報告體系38的一部分，當被分析物分子存在時，報告體系 38被取代了。在這個備選的實施方案中，當包括報告染料32的報告 體系38從選擇性試劑8中被取代時，它被位移到了第二表面46。在 描述的芯片上實驗室的實施方案中，這可能是在含有被分析物溶液的 通道的對面。因此檢測器可被安置以輻照第二表面46以及第一表面6。 這使用不同的激光器，選擇每一個激光器以最好地匹配選定的染料的 拉曼光語。
報告體系的SERRS檢測發生的金屬表面(即報告體系分子最后粘 附的表面)不必是抗體/校準染料放置的地方。但是，這可以使檢測器 變復雜(要求有兩個用于檢測的金屬點)，因為校準需要同時量化校準 劑和報告體系的SERRS信號。這可如下最有效地完成使用單檢測點， 并使用可通過分析單一拉曼光傳個別分辨的染料，和因此優選使用單 表面區域。
本發明還體現在一個裝置上，其中選擇性試劑和染料與膠體顆粒 結合，而不是與所示的表面結合。在這個裝置中，校準染料固定在微 粒上，當被分析物存在時含有報告染料的報告體系被取代。取代可以 在相同的膠體上或不同的膠體上。原理是報告染料固定在遠離任何膠 體金屬表面的地方直到由被分析物分子所取代。
用于SERRS的金屬表面的選擇要求金屬能夠支持具有適用于匹配 入射激光和化學系統的波長的等離子體振子。在實踐中，金、銀和銅 適用于可見波長激光，鋁適用于紫外激光。其它金屬也可以支持SERRS， 但是這里列舉的是優選的實施方案。
權利要求
1. 檢測樣品中是否存在被分析物的方法，包括 提供被分析物載體，其在金屬表面附近區域固定有校準染料，在遠離金屬表面區域固定有報告染料，報告染料可取代地附著在可結合被分 析物的選擇性試劑上，使得當被分析物與選擇性試劑結合時，報告染料 脫離，并移動到了金屬表面附近區域；向被分析物載體中導入樣品；輻照被分析物載體；和通過測量報告染料與校準染料對輻照的反應差異來檢測被分析物的 存在。
2. 權利要求l的方法，其特征在于輻照光源是激光。
3. 權利要求2的方法，其特征在于對輻照的反應是因拉曼散射而發 生的波長變化。
4. 權利要求3的方法，其特征在于對輻照的反應是SERS。
5，權利要求1或2的方法，其特征在于對于輻照的反應是熒光。
6. 權利要求1或2的方法，其特征在于對于輻照的反應是熒光猝滅。
7. 前述權利要求任一項的方法，其特征在于校準染料附著在選擇性 試劑上。
8. 權利要求1到6任一項的方法，其特征在于選擇性試劑執行校準 染料的功能。
9. 前述權利要求任一項的方法，其特征在于被分析物載體包括一個 金屬層，校準染料放置在金屬層附近區域，并且其中選擇性試劑固定在 金屬層上，使得報告染料可分開地放置在遠離金屬層處。
10. 權利要求9中的方法，其特征在于當報告染料被分析物取代時， 移動到金屬層附近區域。
11. 權利要求9中的方法，其特征在于被分析物載體包括第二金屬 層，當報告染料被分析物取代時，其移動到第二金屬層附近區域。
12. 權利要求1到8的任一權利要求中的方法，其特征在于選擇性 試劑處于膠體金屬顆粒懸浮液中，這樣每個選擇性試劑分子附著到膠體 金屬顆粒的金屬表面上。
13. 權利要求12的方法，其特征在于給定的選擇性試劑分子的報告 染料移動到了給定的選擇性試劑附著的膠體金屬顆粒附近區域。
14. 檢測器聯合裝置中使用的被分析物載體，包括金屬表面、固定在金屬表面附近區域的校準染料、金屬表面的能結 合被分析物的選擇性試劑，和固定在遠離金屬表面附近區域的報告染 料，報告染料可取代地附著在選擇性試劑上，這樣當樣品中的被分析物 與選擇性試劑結合時，報告染料被解離，并轉移到金屬表面附近區域；通過比較報告染料與校準染料對輻照的反應差異來檢測被分析物的 存在。
15. 權利要求14的被分析物載體，其特征在于校準染料附著在選擇 試劑上。
16. 權利要求14的被分析物載體，其特征在于選擇性試劑執行了校準染料的功能。
17. 權利要求14到16中任一權利要求中的被分析物載體，其特征 在于被分析物載體包括金屬層，校準染料固定在金屬層附近區域，選擇 性試劑固定在金屬層，這樣報告染料可分離地固定在遠離金屬層的地 方。
18. 檢測器聯合裝置，包括權利要求14到17中任一項的被分析物 載體，而且還包括被安置以輻照金屬表面附近區域的激光源，被安置以 通過測量報告染料與校準染料對輻照的反應差異來檢測被分析物的存 在的檢測器。
19. 附著在校準染料和金屬表面結合基團上的選擇性試劑，用于將 選擇性試劑固定在被分析物載體的金屬表面。
20. 權利要求19中的選擇性試劑，其共價結合到校準染料和金屬表 面結合基團上。
21. 選擇性試劑，其執行校準染料的功能，并且其附著在，優選是 共價結合，用于將選擇性試劑固定在被分析物載體的金屬表面的金屬表 面結合基團上。
22. 選擇性試劑，附著了校準染料，并可取代地附著了報告染料， 使得被分析物與選擇性試劑結合后，報告染料而不是校準染料從選擇性 試劑中分離出來。
23. 選擇性試劑，執行校準染料的功能，且其具有可取代地附著的 報告染料， 一旦被分析物與選擇性試劑結合后，報告染料從選擇性試劑 中分離出來。
24. 權利要求22或23的選擇性試劑，其結合到金屬表面結合基團， 從而將選擇性試劑固定在被分析物載體的金屬表面上。
25. 權利要求22到24的任一權利要求的選擇性試劑，其特征在于 報告染料是報告體系的 一部分，報告體系還包括了選擇性試劑結合基團和金屬表面結合基團， 一旦被分析物與選擇性試劑結合后，報告染料從 選擇性試劑中分離出來。
26. 附著了校準染料并且具有可取代地附著了報告染料的選擇性試 劑在測試樣品中被分析物的存在中的用途。
27. 執行校準染料功能并具有可取代地附著了報告染料的選擇性試 劑在測試樣品中被分析物的存在中的用途。
全文摘要
一種檢測樣品中是否存在被分析物的方法，使用了分析物載體，其在金屬表面附近區域放置有校準染料。報告染料放置在遠離金屬表面附近區域，并可取代地附著在選擇性試劑上。選擇性試劑可結合被分析物，從而當被分析物與選擇性試劑結合時，報告染料解離并移動到了金屬表面附近區域；通過比較報告染料與校準染料對輻射的反應差異來檢測被分析物樣品的存在與否及其數量。
文檔編號G01N21/63GK101313211SQ200680043738
公開日2008年11月26日 申請日期2006年10月3日 優先權日2005年10月14日
發明者R·吉爾伯特 申請人:E2V生物傳感器有限公司