專利名稱：趨化因子表達的依賴egfr的調控和對腫瘤的診斷和治療的影響及其副作用的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過化學抑制劑或者單克隆抗體，利用表皮生長因子 (EGFR)腫瘤的診斷和治療。本發明還涉及與用抗癌物質治療利用EGF受 體的腫瘤有關的皮膚刺激，尤其是皮滲。本發明還涉及基于用EGFR抑制 劑尤其是抗EGFR的抗體來治療腫瘤時對在患者中腫瘤治療/腫瘤應答的 效力的預測方法。本發明另外還涉及在EGFR相關腫瘤的治療中確定抗癌 物質的最適劑量的方法。本發明還涉及監測在早期階段通過EGFR抑制劑 對EGFR相關癌癥的治療效果的方法，以及監測與所述治療有關的作為副 作用的皮滲發生的可能性的方法。最后，本發明還涉及趨化因子作為診斷 標記或者作為指導鑒定腫瘤治療中的新靶標的用途，所述趨化因子在癌癥 治療過程中通過抗癌物質而被上調或者下調。
背景技術：
有理由認為，由erbBl基因編碼的EGFR在人類惡性疾病中起作用。 特別是，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、頭(head)癌、頸癌、胃癌以及膠質母 細胞癌中都發現EGFR表達增強。EGFR的增強表達通常都會和EGFR 配體，轉化生長因子(TGF-oc)的產生增強相關聯，同一種腫瘤細胞作為受 體激活的結果通過自分泌激活通路完成。(Basdga和Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64:127 (1994))。 EGF受體是一類分子量為170000的橫跨膜糖蛋白質， 已在多種上皮細胞中被發現。目前為止，已經發現七種EGFR配體，他們 通過和受體結合保護腫瘤細胞逃避凋亡、刺激細胞增殖和腫瘤細胞入侵。 這些生長因子不和EGFR家族的三個其他成員HER2、 HER3以及HER4 結合，這三者能夠和EGFR作用形成異源二聚體。(Riese和Stern， Bioassays20: 41-48 (1998); Kochupurakkal J Biol. Chem. 280:8503- 8512 (2005))。HER受體網絡不僅能夠整合它本身的信號輸入而且可以整合異源信 號，包括激素、淋巴因子、神經遞質以及脅迫誘導物。許多鼠科(murine)和大鼠的抗EGF受體的單克隆抗體已凈皮研發出來， 還在體內和體外測試了它們抑制腫瘤細胞生長的能力(Modjtahedi和Dean， 1994， J. Oncology 4， 277)。針對EGF受體的人源化單克隆抗體425 (hMAb 425， US 5,558,864; EP 0531 472)和嵌合單克隆抗體225 (cMAb 225)在臨床 試驗中都顯示出了效果。C225抗體(西妥昔單抗(cetuximab))已被證明能夠 在體外抑制EGF介導的腫瘤細胞生長和在棵鼠體內抑制人腫瘤的形成。 在異種移植的小鼠模型中，該抗體以及基本上所有的抗EGFR的抗體主要 通過和某些化學治療物質(例如多柔比星、阿霉素、紫杉醇和順鉑)在體內 協同根除人腫瘤(例如EP 0667165)。 Ye等人(1999， Oncogene 18， 731)報道 針對HER2受體的嵌合MAb 225和人源化MAb 4D5的組合能夠成功地治 療人卵巢癌細胞。除了抗ErbB的抗體外，有許多化學小分子已知是ErbB受體分子的 有效抑制因子，其主要阻礙受體的ATP結合位點。術語"酪氨酸激酶拮抗 劑/抑制劑"是指才艮據本發明的天然或者合成的物質，其能夠抑制或者阻礙 酪氨酸激酶包括酪氨酸激酶受體。因此，該術語包括以上定義的ErbB受 體拮抗劑/抑制劑本身。除了前文和下文提到的抗ErbB受體抗體以外，該 定義下的更加優選的酪氨酸激酶拮抗劑主要是那些在單一 藥物治療如乳腺 癌和前列腺癌治療中顯示出功效的化合物。合適的吲哚并呼唑類酪氨酸激 酶抑制劑可以利用在如5,516,771 ; 5,654,427; 5，461 ，146; 5,650,407的美國 專利文件中存在的信息來獲得。美國專利5，475，110; 5,591 ，855; 5,594,009 和WO 96/11933揭示了吡咯并啼唑類酪氨酸激酶抑制劑和前列腺癌。吉非 替尼(易瑞沙(IRESSAf，阿斯利康(Astra Zeneca))是這方面最早的抗癌物 質之一 ，被報道在非d、細胞肺癌(NSCLC)以及晚期頭癌和頸癌的患者中有 治療功效。在EGF受體的上下文中，術語"利用"有兩層含義(i) 其反映受體參與信號的事實。EGFR的表達是信號發生的必要但是 非充分前提。可用配體的可獲得性和質量同樣重要。因此，受體表達的程 度通常并不直接和受體的使用相關。(ii) 反映肺瘤精確依賴于使用EGFR的事實。許多靶向該受體的物質，包括單克隆抗體(如西妥昔單抗(cetuximab))正在開發。最常見的針對EGFR抑制劑的不良作用是粉刺狀的皮滲，通 常出現在臉和上部軀干。皮膚過敏在45-100%的患者中都有發生，在大多 數患者都會迅速發病，在治療后大約7-10天可以看到并且在2-3周之后達 到頂峰(Robert等人，Lancet Oncol. 491， 2005)。有些物質(包括西妥昔單抗 和埃羅替尼)表現出皮滲的強度與治療應答和/或生存的正關聯，這使得皮 瘆成為抗腫瘤活性的潛在代替標記物(P erez-Soler和Saltz, J. Clin. Oncol" 23:5235， 2005)。皮疹的機制尚不明了。成體中，EGFR主要在表皮基底層的增殖、未 分化的角質細胞和毛嚢根部的外層中表達(Nanney等人，J. Invest. Dermatol. 83:385， 1984)。 EGFR表達和活性的改變與異常的表皮生長和分 化有關(Murillas R等人.，EMBO J 1995; Sibilia M等人.，Cell 2000; King LE等人，J Invest Dermatol. 19卯)。角質細胞是分層的鱗片狀上皮細胞，其包括皮膚和粘膜(包括口腔、食 道、角膜、結膜和生殖上皮細胞)。角質細胞在宿主和環境間提供了一道屏 障。它們阻礙來自環境中的有毒物質的進入同時防止宿主中重要組成的流 失。角質細胞當從基底層到皮膚表面發展時分化。角質細胞的正常更新時 間是30天左右，但是在某些皮膚疾病如牛皮癬中表皮的更新時間會加速。患者的皮膚活組織檢查的病理分析顯示EGFR阻塞導致基底角質層 變薄，促進炎癥細胞(包括嗜中性粒細胞和T淋巴細胞)侵入真皮組織，尤 其是毛嚢(Robert等人，Lancet Oncol. 6:491， 2005; Van Doom等人，Br. J. Dermatol. 147:598， 2002)。此外，與EGFR相關聯的信號轉導通路在皮膚 中被抑制提示抗EGFR的治療對表皮生理學有直接作用。例如，小化合物吉非替尼(易瑞沙⑧)能引起表皮基底層生長停止和成熟的標記物的上調。因 此，角質細胞的細胞周期停止和成熟可能引起皮滲，因為角質細胞分化改變可以引起如在患者中觀察到的嚢泡閉塞(Albanell等人，J. Clin. Oncol. 20:110， 2002)。或者，其提示皮瘆的發展是皮膚中改變的趨化因子表達方 式的直接結果，類似于EGFR可以作為負反饋調控因子起抑制體內慢性發 炎皮膚中的過度炎癥作用的結論(Mascia F等人，Am J Pathol. 2003)。趨化因子是具有有效的白細胞活化作用和/或趨化活性的結構相關的 糖蛋白家族。它們在長度上為70到90個氨基酸，并且分子量為約8到10 千道爾頓。它們中大部分有四個半胱氨酸亞基屬于兩個亞家族。這些亞家 族是基于兩個氨基末端半胱氨酸殘基是直接相鄰還是被一個氨基酸隔開的 基礎上。又稱為CXC的趨化因子在第一個和第二個半胱氨酸殘基之間含 有單獨的一個氨基酸；p或CC趨化因子則有緊密相鄰的半胱氨酸殘基。 大多數CXC趨化因子是嗜中性粒細胞的趨化物而CC趨化因子通常誘導 單核細胞、淋巴細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞。還有兩個其他的小 的亞類。C類有一個成員(淋巴細胞趨化蛋白)。它在四個半胱氨酸基序中 缺少一個半胱氨酸殘基，但是它的羧基末端卻和C-C趨化因子同源。C型趨化因子似乎是淋巴細胞特異性的。第四類亞類是c-x3-c亞類。c-x3-c類趨化因子(cxxxc趨化因子/神經趨化因子)在前兩個半胱氨酸殘基間有三個氨基酸殘基。它通過長的黏蛋白莖直接系于細胞膜并能引起淋巴細胞 的黏著和遷移。發明內容本發明是基于在通過抗癌物質，尤其是EGFR抑制劑，來治療EGFR 相關腫瘤時引起在皮膚組織以及在患者各自的腫瘤組織或血清中趨化因子 模式的特異調節這一原理的發現之上。在所述組織或者血清中的趨化因子 可能會根據治療中所用的抗癌物質的性質和數量而被下調或者上調。盡管尤其當在疾病早期、以高劑量，和/或長時間使用EGFR抑制劑 時，最佳的控制很重要，到目前為止在EGFR相關腫瘤的治療中還沒有明9確的有效處理皮滲的建議。基于目前的結果，其首次提示，皮膚中受受調 的趨化因子表達方式代表在患者抗癌治療早期時間點預測皮滲的有用的標 記物，使得臨床醫生可以在看到皮滲之前消除皮滲。其次，皮膚中受受調的趨化因子表達方式被認為是比皮滲更可靠的有 效抑制標記物(并且從而也可能是臨床成果)，因為除趨化因子調控以外， 皮滲還依賴于患者個體的免疫系統。因此可以在治療的第 一周內分析患者以準確找到不可能從抗EGFR的治療中受益的患者，從而使醫生能夠改變 到備選的治療。此外，其表明，特異性的物質，如趨化因子受體阻斷劑，其干擾由EGFR 阻礙引起的趨化因子介導的化學誘導，可能代表控制EGFR相關的腫瘤治 療中的皮膚病副作用的新的治療方法。應該優先局部使用這些物質，因為 它們在皮膚上的效果可以在腫瘤中反映出來。綜上所述本發明涉及下列問題*預測患者中與癌癥治療相關聯或者有關的皮膚刺激，尤其是皮滲， 發作和強度的方法，該方法包括(i) 用標準方法確定第一皮膚組織探針的趨化因子表達模式，其中該探 針采集自使用抗癌物質開始治療之前的患者，所述抗癌物質直接針對利用 表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細胞，(ii) 確定源于所述患者(優選來自相同的皮膚區域)的第二皮膚探針的 趨化因子表達模式，其中該探針從使用所述抗癌物質開始治療之后的某一 時間(優選1-10天，更優選l-7天，最優選5-7天)獲取，(iii) 任選的確定第三和更多的皮膚探針的趨化因子的表達模式，其中 該揮:針在比步驟(ii)中各個前驅探針更晚的時間從患者獲取，(iv) 分別將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的皮膚探針的各個趨化因子表達 模式與步驟(i)中的皮膚探針表達模式做比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中 哪些趨化因子在性質和/或數量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅探針 中的趨化因子才莫式已經發生了變化；(v) 從趨化因子模式的變化預測后期用所述抗癌物質治療引發的皮膚疾病發作和強度。根據本發明的發現，如果在5-10天，優選7天內趨化因子模式沒有發 生變化或者變化不顯著，由抗癌物質治療引發皮膚疾病，尤其是皮滲發生 的可能性將不會很高。*預測癌癥患者對用抗癌物質治療的腫瘤應答的相應方法，該方法包 括(i) 用標準方法確定第一組織探針的趨化因子表達模式，其中該探針采 集自使用抗癌物質開始治療之前的患者，所述抗癌物質直接針對利用/過表 達表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細胞，(ii) 確定源于所述患者的第二組織探針的趨化因子表達模式，其中該 探針在開始使用所述抗癌物質治療后的時間獲取，(iii) 任選的確定第三和更多的組織探針的趨化因子表達模式，其中該 探針在比步驟(ii)中各個前驅探針更晚的時間從患者獲取，(iv) 分別將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的組織探針的各個趨化因子表達 模式與步驟(i)中的組織探針表達模式做比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中 哪些趨化因子在性質和/或數量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅探針 中的趨化因子模式已經發生了變化；(v) 從所述組織探針中趨化因子模式的變化預測對使用所述抗癌物質 治療患者的腫瘤應答的可能性和強度。根據本發明，令人驚訝的發現，不僅在患者腫瘤組織而且在皮膚組織 中趨化因子模式和它的相關變化分別與腫瘤應答相關聯。*確定患者癌癥治療中抗癌物質的最適劑量的方法，該方法包括(i) 用標準方法確定第一皮膚或肺瘤組織探針的趨化因子表達模式，其 中該探針采集自使用抗癌物質開始治療之前的患者，所述抗癌物質直接針 對利用/過表達表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細胞，(ii) 確定源于所述患者的第二組織探針的趨化因子表達模式，其中該 探針在開始使用所述抗癌物質治療后的時間獲取，(iii) 任選的確定第三和更多的組織探針的趨化因子表達模式，其中該探針在比步驟(ii)中各個前驅探針更晚的時間從患者獲取，(iv) 分別將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的組織探針中各個趨化因子表達模式與步驟(i)中的組織探針表達模式做比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中 哪些趨化因子在性質和/或數量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅探針 中的趨化因子模式已經發生了變化；(v) 根據所述組織探針的趨化因子模式的變化確定向患者施用的抗癌 物質的劑量，和任選的(vi) 重復步驟(i)-(v)來優化向患者施用的抗癌物質的劑量。 如果治療開始前和治療后1到10天，優選7天的探針的趨化因子模式沒有或者沒有顯著的調節/或變化，要么放棄使用此抗癌物質的進一步治療 或者，應該提高劑量直到能夠觀察到對趨化因子模式的影響。* 一種相應的方法，其中步驟(ii)的探針在使用所述抗癌物質開始治 療后的l-10天內獲取。* 一種相應的方法，其中步驟(ii)的探針在使用所述抗癌物質開始治 療后的2-7天內獲取。* 一種相應的方法，其中該抗癌物質是EGFR抑制劑。* 一種相應的方法，其中該EGFR抑制劑是抗EGFR抗體。* 一種相應的方法，其中抗EGFR抗體是Mabc225 (西妥昔單抗)或 Mab h425 (EMD72000,馬妥珠單抗(matuzumab))。* 一種相應的方法，其中相對于沒有治療的患者而言，用抗癌物質治 療引起趨化因子如RANTES的表達增強。* 一種相應的方法，其中相對于沒有治療的患者而言，用抗癌物質治 療會引起趨化因子如IL-8表達下降。* 一種相應的方法，其中涉及下列趨化因子的至少一個IL-8、 MCP-1、 RNATES和IP-IO。*早期監測癌癥治療效果的體外方法，其在患者中利用/過表達 EGFR，通過確定用抗癌物質開始治療之前和治療的最初1-10天中 腫瘤患者的皮膚組織和/或腫瘤組織和/或血清的探針的趨化因子模式進行。*早期監測皮膚刺激優選皮瘆發生的體外方法，其結合在患者中利用/過表達EGFR的癌癥治療，通過用抗癌物質，優選EGFR抑制劑， 更優選抗EGFR抗體，如Mab c225 (西妥昔單抗)或Mab h425 (EMD72000，馬妥珠單抗)在開始治療之前和治療的最初1-7天中 確定肺瘤患者中皮膚組織探針的趨化因子模式，其中優選涉及下列 趨化因子的至少一種IL-8、 MCP-1、 RANTES和IP-IO。 *趨化因子作為確定所述治療效果和/或皮膚刺激優選皮瘆發生的可 能性的診斷標記的用途，所述趨化因子是在使用抗癌物質治療癌癥 過程中體內上調或者下調的，其中所述癌癥利用/過表達EGFR， 并且所述抗癌物質是EGFR抑制劑，優選抗EGFR抗體，如Mab c225 (西妥昔單抗)或Mab h425 (EMD72000,馬妥珠單抗)。 *趨化因子用于鑒定所述趨化因子表達的上游耙標的用途，所述趨化 因子是在使用抗癌物質治療癌癥過程中體內上調或者下調的，其適 于開發和生產靶向所述靶標的藥物，通過在患者中單獨的利用/過 表達EGFR或與所述抗癌物質組合來治療癌癥，其中所述抗癌物 質是EGFR抑制劑，優選抗EGFR抗體，如Mab c225 (西妥昔單 抗)或Mab h425 (EMD72000,馬妥珠單抗)。 本發明表明，例如使用西妥昔單抗(mAb c225)或mAb h425 (馬妥珠單 抗)的單克隆抗體或者酪氨酸激酶抑制劑(吉非替尼，易瑞沙⑧)通過阻礙 EGF受體的實驗工作在初級角質細胞中干擾依賴EGFR的信號級聯。在 這些實驗中先用不同濃度的抗EGFR物質處理角質細胞，接下來用或者不 用TGFa或TNFa處理大約24小時。抗EGFR抑制劑的效果用蛋白質印 跡來評估。如
圖1所示，通過蛋白質印跡分析處理過的角質細胞來測量用抗 EGFR物質處理干擾EGFR和ERK1/2的磷酸化。如圖2所示，用抗EGFR 物質處理干擾COX-2蛋白質的誘導。此夕卜，STAT3的磷酸化隨著抗EGFR 物質的處理而被誘導。試驗結果表明初級角質細胞的處理調控體外趨化因子的表達。在用抗EGFR物質處理24小時的角質細胞的條件培養基中評估分泌的趨化因子。 評估用Luminex珠技術來進行。在這些實驗中先用抗EGFR物質處理角 質細胞，接下來用或者不用TGFa或者TNFa處理。在幾個趨化因子中， IL-8應答EGFR阻斷始終下調(圖3)，而RNATES和IP-10則上調(圖4-5)。 IL-8是促血管發生因子，提示它的下調會影響皮膚中血管的形成。相 反，RNATES和IP-10則被認為是白細胞的化學趨化因子，提示該增加的 表達(可能也有其他趨化因子)誘導白細胞向皮膚滲透，進而引起炎癥并最 終導致皮滲。根據本發明，應答在角質細胞和腫瘤組織(具有活躍的EGFR信號)中 的EGFR阻斷而調節的趨化因子表達模式導致白細胞的遷移/化學誘導， 這種現象能夠被干擾這些趨化因子的物質/藥物抑制。實驗包括趨化性測 定，其中角質細胞的條件培養基在用EGFR抑制劑處理和用或者不用 TGFa或者TNFa刺激24小時后收集。這些條件培養基被放在Boyden室 的下層室而新分離的PBMC或者粒細胞鋪于上層室。然后通過測量特定時 間(speficic times)后在下層室中PBMC或粒細胞的量來監測血細胞的趨化 現象。在一些實驗中，PBMC或者粒細胞預先被體外活化，以增強其遷移 活性。根據本發明，其表明，條件培養基中的趨化因子引起PBMC或者粒細 胞的趨化現象并且這代表在皮滲中可見的部分生物反應。為顯示特異的趨化因子對趨化事件的應答，向Boyden室下層室的條件培養基中加入針對趨化因子受體的特異抑制劑，并且通過與僅有條件培 養基對比來評估趨化性。此外，已經證明趨化性是由趨化因子/趨化因子受體相互作用誘導的， 并且用趨化因子受體拮抗劑阻礙它們的相互作用能夠干擾血細胞的趨化 性。應答EGFR阻礙的受調的趨化因子表達引起白細胞向小鼠皮膚的遷 移/化學誘導。此外，分析白細胞浸潤并且與趨化因子表達有關。根據本發明，進一步證明小鼠皮膚中趨化因子水平隨著抗EGFR抑制劑處理而,皮調 控，這種調控伴隨著白細胞滲透。全身施用趨化因子受體拮抗劑已表明在 用抗EGFR治療的動物中干擾白細胞浸潤進入動物皮膚，從而減少/阻止 皮疹的發展。根據本發明可以用抗EGFR物質治療個體直到最初的皮膚毒性表征 出現，然后可以用抗趨化因子受體物質局部處理受侵襲的病變皮膚來干擾 白細胞浸潤和減少皮膚毒性。在皮膚中局部施用趨化因子受體拮抗劑減少白細胞浸潤和皮膚毒性。 建議在臨床實踐中使用這些物質治療經受抗EGFR治療的患者的皮滲。已表明皮滲與患者對抗EGFR治療的應答有關，因此趨化因子表ii^莫 式是比皮膚毒性本身更適合的應答指示并且可以用作評估患者對抗EGFR 治療的應答的診斷方法。這可以幫助在第一個治療周內準確找到可能從抗 EGFR治療獲益的患者。可以在用抗EGFR拮抗劑治療后第一周或者最初十天內分析患者皮 膚中趨化因子水平的分子變化從而找出趨化因子表達是否會應答EGFR 阻礙而被調控。這可以通過分析治療前和治療中的皮膚活組織切片來完成。 趨化因子水平應答抗EGFR治療而被調控，那么調控的程度可以用來作為 預測患者是否會響應這種治療的診斷方法。其表明，沒有或者極少的趨化 因子調控發生的患者是在以非最佳劑量的抗EGFR抑制劑治療，并被建議 應該提高劑量直到調控出現。或者，如果不這樣選擇，可以將沒有趨化因子調控發生的患者轉移到 不同的治療。由發明者發現的該調控在本文的皮滲發展過程中起著重要作用，因而 可以,皮用作*在早期時間點預測腫瘤患者中的皮疹的診斷標記物*腫瘤中有效靶標抑制的替代標記物(因而也可能是臨床成果)，尤其用于在治療開始后不久準確找到那些不大能從抗EGFR治療中受益的患者。*使用局部物質來控制皮療的新療法的開發，所述局部物質干擾由EGFR阻礙引起的趨化因子的化學誘導。由EGFR抑制劑(西妥昔單抗-c225，馬妥珠單抗=EMD72000-h425) 和其他調控腫瘤環境趨化因子、腫瘤炎癥和腫瘤生長抑制。沒有預測腫瘤患者對西妥昔單抗治療的響應的生物標記物。然而，在 由西妥昔單抗治療引起的痤瘡狀皮滲的程度和腫瘤應答之間能觀察到三個 指征，即結腸的、胰腺的和頭的鱗狀細胞癌的明顯的關系。在標準的治療 劑量下，患者表現出沒有皮滲和不同嚴重程度(I-III級)的皮滲，提示由西 妥昔單抗引起的皮膚炎癥過程的程度歸結于個體患者的免疫處置，因而也 表明西妥昔單抗的免疫調控活性是對已觀察到的腫瘤應答起作用的根本因 素。免疫細胞的傳輸和細胞表型是由趨化因子控制的，某些趨化因子表現 出細胞類型特異性的活性。本發明表明，抑制癌癥中的EGFR信號引起在這些癌癥中趨化因子環 境的改變和影響腫瘤炎癥狀況從而導致腫瘤生長抑制。根據本發明，趨化 因子在體外腫瘤細胞和初級角質細胞中以相似的方式凈皮調控。對角質細胞而言，進行的實驗表明用單克隆抗體如西妥昔單抗或EMD72000或酪氨酸 激酶受體抑制劑(吉非替尼，易瑞沙@)封閉EGF受體會在不同的腫瘤細胞 系如A431中干擾EGFR依賴的信號級聯，代表不同的腫瘤指征。實驗工作表明處理腫瘤細胞系(如A431)調控趨化因子的體外表達。用 抗EGFR物質處理肺瘤細胞受體，接下來用TGFa或TNFcx處理。在24 小時后在獲得的腫瘤細胞的條件培養基中評估分泌的趨化因子。用 L體inex珠技術來進行評估。與在初級角質細胞中得到的數據相似，在腫瘤細胞中應答EGFR阻斷 幾個趨化因子被調控。IL-8 (白介素8)被持續下調(圖6)，而RNATES和 IP-10在用EGFR抑制劑處理的腫瘤細胞中被上調(圖7-8)。這些數據一起表明EGFR抑制劑在肺瘤細胞和角質細胞中引起相似 的信號通路調控。這確證了皮膚、角質細胞和更精確的趨化因子水平可以 -波用作預測在癌癥患者中有效的抗EGFR治療的替代品的想法。IL-8在不同肺瘤細胞系的欄目中被評估并且發現其應答EGFR阻斷 而持續下調(圖9)。這表明IL-8的水平是有效的抗EGFR治療的生物標記。 期望評估正在進行抗EGFR治療的患者血液中的IL-8水平，并且使用減 少的水平作為監控抗EGFR物質的藥效的診斷方法。如前面提到的，腫瘤組織中(有活躍的EGFR信號)應答EGFR阻斷引 起的受調的趨化因子表達模式導致白細胞遷移/化學誘導。實驗包括趨化性測定，其中在經過EGFR抑制劑處理后再用TGFoc 或TNFot刺激24小時后收集腫瘤細胞的條件培養基。該條件培養基被放 于下層室而新分離的PBMC或粒細胞被置于Boyden上層室。然后通過測 量特定時間后在下層室中PBMC或粒細胞的量來監測血細胞的趨化現象。 在一些實驗中，PBMC或者粒細胞預先被體外活化，以增強其遷移活性。 這些實驗表明在條件培養基中的趨化因子引起PBMC和粒細胞的趨化性。作為本發明的一個結果，將特異的趨化因子(其負責趨化事件)、對趨 化因子受體的特異性抑制劑加入到條件培養基中置于Boyden室的下層室， 并且與僅條件培養基評估趨化性。通過趨化因子/趨化因子受體相互作用誘 導趨化性，并且通過趨化因子受體拮抗劑阻礙這種相互作用干擾血細胞的 趨化性。實驗包括用抗EGFR物質處理腫瘤攜帶小鼠的體內研究。在用抗 EGFR物質處理后的第 一個星期內分析腫瘤中趨化因子水平的調控。趨化 因子水平以與體外觀察到的相同的方式被調控。此外，分析腫瘤中的白細 胞浸潤，抗EGFR物質誘導白細胞向腫瘤的浸潤以及它們的活性/分化狀 態。可以用細胞活化/分化標記的IHC來監測后者。由于皮滲和響應治療 間的關系，其提示趨化因子的調控發生于皮膚和癌癥周圍，并且這促成抗 EGFR物質的作用機制。根據本發明，認為在腫瘤+Z-EGFR抑制中趨化因子表達模式的改變的 廣泛監測和將這些變化與免疫系統中趨化因子已知的細胞特異性相匹配提 供了關于腫瘤內的趨化因子和白細胞可能有助于免疫控制腫瘤生長的第一 線索。基于這一信息，可能在控制趨化因子表達通路的上游鑒定出除EGFR之外能誘導免疫介導的抗腫瘤功效而不依賴于EGFR阻斷的新的治療靼 點，或者4吏提高抗EGFR治療方法的抗腫瘤效果的目標成為可能。因此， 闡明腫瘤中在EGFR信號抑制之后發生的趨化因子表達模式的變化成為 可能。在抗EGFR治療中觀察到的變化的趨化因子表達才莫式有一定的肺瘤 特異性。附圖簡述 圖1.角質細胞中EGFR依賴的信號通路的抑制。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理角質細胞， 并且用或者不用不同的生長因子(TGFoc或TNFoc)刺激。24小時后，裂解 細胞并用蛋白質印跡分析。分析表明用EGFR抑制劑處理導致以劑量依賴 的方式阻礙EGFR驅動的信號級聯。用EGFR抑制劑處理阻礙EGFR (Tyr 1068)和ERK1/2 (Thr 202/204)的磷酸化。圖2.角質細胞中EGFR依賴的信號通路的抑制。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理角質細胞， 并且用或者不用不同的生長因子(TGFot或TNFa)刺激。24小時后，裂解 細胞并用蛋白質印跡分析。分析表明EGFR抑制劑處理導致以劑量依賴的 方式阻礙EGFR驅動的信號級聯。用EGFR抑制劑處理誘導COX-2的表 達并阻礙STAT3的磷酸化。圖3,角質細胞中分泌的IL-$水平的調控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理角質細胞， 并且用或者不用不同的生長因子(TGFoc或TNFa)刺激。24小時后，收集 細月包上清并且用Luminex技術定量IL-8的水平。分析表明用EGFR抑制 劑處理以劑量依賴的方式下調IL-8。圖4.角質細胞中分泌的RANTES水平的調控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理角質細胞， 并且用或者不用不同的生長因子(TGFoc或TNFa)刺激。24小時后，收集 細胞上清并且用Luminex技術定量RANTES的水平。分析表明用EGFR 抑制劑處理以劑量依賴的方式上調RANTES。圖5.角質細胞中分泌的IP-10水平的調控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理角質細胞， 并且用或者不用不同的生長因子(TGFa或TNFa)刺激。24小時后，收集 細胞上清并且用Luminex技術定量IP-10的水平。分析表明EGFR抑制劑 處理以劑量依賴的方式上調IP-IO。圖6.A431中分泌的IL-8水平的調控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗、馬妥珠單抗或易瑞沙)處理A431，并且 用或者不用不同的生長因子(TGFot或TNFoc)刺激。24小時后，收集細胞 上清并且用Luminex技術定量IL-8的水平。分析表明EGFR抑制劑處理 以劑量依賴的方式下調IL-8。圖7.A431中分泌的RANTES水平的調控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗，馬妥珠單抗或易瑞沙)處理A431，然 后用或者不用不同的生長因子(TGFoc或TNFa)刺激。24小時后，收集細 胞上清并且用Luminex技術定量RANTES的水平。分析表明用EGFR抑 制劑處理以劑量依賴的方式上調RANTES。圖8.A431中分泌的IP-10水平的調控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗，馬妥珠單抗或易瑞沙)處理A431，然 后用或者不用不同的生長因子(TGFoc或TNFoc)刺激。24小時后，收集細 胞上清并且用Luminex技術定量IP-10的水平。分析表明EGFR抑制劑處理以劑量依賴的方式上調IP-IO。 圖9.在不同腫瘤細胞系中分泌的IL-8水平的調控。用EGFR抑制劑(西妥昔單抗或馬妥珠單抗)處理不同的腫瘤細胞系 (DiFi、 HT29、 A431、 MCF-7、 PC-3和U87MG)，并且用TGFoc刺激。 24小時后，收集細胞上清并且用Luminex技術定量IL-8的水平。分析表 明EGFR抑制劑處理在研究的所有腫瘤細胞系中以劑量依賴的方式下調 IL-8。腫瘤細胞Cmab％對照MmabV。對照DiFi1628HT292430A4311315MDA MB 468tbdtbdMCF-73149PC-35376U87MG6358應答西妥昔(Cmab)或馬妥珠單抗(Mmab)的IL-8水平。 用100 ng/ml Cmab或Mmab處理細胞并且用100 ng/ml TGF oc刺激; 實驗次數=權利要求
1.預測在患者中與癌癥治療相關聯或有關的皮膚刺激的發作和強度的方法，該方法包括(i)用標準方法確定第一皮膚組織探針的趨化因子表達模式，其中該探針取自使用抗癌物質開始治療之前的患者，所述抗癌物質直接針對利用表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細胞，(ii)確定源于所述患者的第二皮膚探針的趨化因子表達模式，其中該探針從使用所述抗癌物質治療開始之后的時間獲取，(iii)任選的確定第三和更多的皮膚探針的趨化因子表達模式，其中該探針在比步驟(ii)的各個前驅探針更晚的時間從患者獲取，(iv)將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的皮膚探針的各個趨化因子表達模式與步驟(i)的皮膚探針表達模式比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中哪些趨化因子在性質和/或數量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅探針中的趨化因子模式已經發生了變化；(v)從趨化因子模式的變化預測由使用所述抗癌物質治療引發的在其后時間的皮膚疾病的強度和發生。
2. 權利要求l的方法，其中所述皮膚刺激是皮滲。
3. 預測患癌癥患者對使用抗癌物質治療的腫瘤應答的方法，該方法包 括..(i) 用標準方法確定第一組織探針的趨化因子表達模式，其中該探針采 集自使用抗癌物質治療開始之前的患者，所述抗癌物質直接針對利用 表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細胞，(ii) 確定源于所述患者的第二組織探針的趨化因子表達^^式，其中該 探針在開始使用所述抗癌物質治療后的時間獲取，(iii) 任選的確定第三和更多的組織探針的趨化因子表達模式，其中該 探針在比步驟(ii)的各個前驅探針更晚的時間從患者獲取，(iv) 將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的組織探針的各個趨化因子表達模式與步驟(i)的組織探針的表達模式比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中哪 些趨化因子在性質和/或數量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅探針的趨化因子模式已經發生了變化；(v)從所述組織探針的趨化因子模式的變化預測患者對使用所迷抗癌 物質治療的腫瘤應答的可能性和強度。
4. 確定用于治療癌癥的抗癌物質在患者中的最適劑量的方法，該方法 包括(i) 用標準方法確定第一組織探針的趨化因子表達模式，其中該探針采 集自使用抗癌物質治療開始之前的患者，所述抗癌物質直接針對利用 表皮生長因子受體(EGFR)的腫瘤細胞，(ii) 確定源于所述患者的第二組織探針的趨化因子表達模式，其中在 開始使用所述抗癌物質治療后的時間獲取該探針，(iii) 任選的確定第三和更多的組織探針的趨化因子表^^莫式，其中在 比步驟(ii)的各個前驅探針更晚的時間從患者獲取該探針，(iv) 將步驟(ii)和任選的步驟(iii)的組織探針的各個趨化因子表達模式 與步驟(i)的組織探針表達模式比較，并且確定在探針(ii)和(iii)中哪些 趨化子在性質和/或數量上相對于(i)的參考探針或者各個前驅探針 中的趨化因子模式已經發生了變化；(v) 根據所述組織探針的趨化因子模式的變化確定向患者施用的抗癌 物質的劑量，和任選的(vi) 重復步驟(i)-(v)以優化向患者施用的抗癌物質的劑量。
5. 權利要求3或4的方法，其中所述探針衍生自腫瘤組織。
6. 權利要求3或4的方法，其中所述探針衍生自皮膚組織。
7. 權利要求l-6的任一項的方法，其中步驟(ii)的探針在開始使用所述 抗癌物質治療后l-10天內獲取。
8. 權利要求7的方法，其中步驟(ii)的探針在開始使用所述抗癌物質治 療后5-7天內獲取。
9. 權利要求1-8的任一項的方法，其中抗癌物質是EGFR抑制劑。
10. 權利要求9的方法，其中EGFR抑制劑是抗EGFR抗體。
11. 權利要求10的方法，其中抗EGFR抗體是Mab c225 (西妥昔單抗) 或Mab h425 (EMD72000,馬妥珠單抗)。
12. 根據權利要求l-ll的任一項的方法，其中與未治療的患者相比使 用抗癌物質治療引起趨化因子的表達增加。
13. 根據權利要求l-ll的任一項的方法，其中與未治療的患者相比使 用抗癌物質治療引起趨化因子的表達減少。
14. 權利要求1-13的任一項的方法，其中涉及下列趨化因子的至少一 種IL-8、 MCP-1、 RANTES和IP-IO。
15. 對患者中利用EGFR的癌癥的治療有效性進行體外早期監測的方 法，所述方法在用抗癌物質治療開始前和治療期間的最初1-10天通過 確定腫瘤患者的皮膚組織和/或腫瘤組織和/或血清的探針中趨化因子 模式進行。
16. 對患者中與利用EGFR癌癥的治療有關的皮膚刺激發生進行體外 早期監測的方法，所述方法通過在用抗癌物質治療開始前和治療期間 的最初1-7天內確定腫瘤患者的皮膚組織探針的趨化因子模式進行。
17. 權利要求15或16的方法，其中抗癌物質是EGFR抑制劑。
18. 權利要求17的方法，其中EGFR抑制劑是抗EGFR抗體。
19. 權利要求1S的方法，其中抗EGFR抗體是Mab c225 (西妥昔單 抗)或Mab h425 (EMD72000，馬妥珠單抗)。
20. 根據權利要求15-19的任一項的方法，其中與未治療的患者相比 使用抗癌物質治療？ 1起趨化因子的表達增加。
21. 根據權利要求15-19的任一項的方法，其中與未治療的患者相比 使用抗癌物質治療引起趨化因子的表達減少。
22. 根據權利要求15-21的任一項的方法，其中涉及下列趨化因子中 的至少一種IL-8、 MCP-1、 RANTES和IP-IO。
23. 趨化因子用作確定所述治療的有效性、和/或伴隨所述治療的皮膚 刺激發生的可能性的體外診斷標記的用途，所述趨化因子在用抗癌物質治療癌癥期間是體內上調或下調的，其中所述癌癥利用EGFR并且所述抗癌 物質是EGFR抑制劑。
24. 趨化因子用于鑒定所述趨化因子表達的上游耙標的用途，所述趨 化因子在用抗癌物質治療癌癥期間是體內上調或下調的，所述靶標適用于 開發和制備靶向所述靶標的藥物用于單獨的或與所述抗癌物質組合的治療 利用EGFR的癌癥，其中所述抗癌物質是EGFR抑制劑。
25. 權利要求23或24的用途，其中所述抗癌物質是Mab c225 (西妥 昔單抗)或Mab h425 (EMD72000,馬妥珠單抗)。
全文摘要
本發明涉及通過化學抑制劑或單克隆抗體對利用表皮生長因子(EGFR)的腫瘤的診斷和治療。本發明還涉及與使用抗癌物質治療利用EGF受體的腫瘤細胞相關聯的皮膚刺激，優選皮疹。本發明還涉及在基于使用EGFR抑制劑，尤其是抗EGFR抗體的治療中預測患者中腫瘤治療/腫瘤應答的有效性的方法。本發明還涉及在EGFR相關腫瘤的治療中確定抗癌物質最適劑量的方法。
文檔編號G01N33/50GK101283275SQ200680037726
公開日2008年10月8日 申請日期2006年10月11日 優先權日2005年10月11日
發明者A·蘇特, J·拜倫斯 申請人:默克專利有限公司