專利名稱：針對豆薯層銹菌和疣頂單胞銹菌的噬菌體展示植物防御肽的制作方法
針對豆薯層銹菌和疣頂單胞銹菌的噬菌體展示植物防御肽相關申請
本申請是2001年4月10日遞交的美國專利申請號09/829,549的部分繼續申請，并要求于2000年4月10日遞交的美國臨時專利申請號60/195,785的優先權。本申請還要求于2005年8月2日遞交的美國臨時專利申請第60/704,933號的權益。所有上述申請以參考的方式引入本文。
序列表
本申請附有準確再現本文描述的序列的計算機可讀的形式的序列表。
背景技術：
本公開涉及使用噬菌體展示技術來鑒別與病原真菌類結合的肽，更具體地，與疫霉菌(Phytophthora)屬、層銹菌(Phakapsora)屬和單孢銹菌(Uromyces)屬的病原真菌類結合的肽。使用簡并寡核苷酸構建隨機肽噬菌體展示庫。在其表面表達肽的噬菌體與不同生命階段的真菌相接觸，并且分離、擴增結合的噬菌體并鑒別肽。 一旦鑒別出，可基于抗真菌活性篩選肽并用于鑒別和表征在真菌上的結合位點。
疫霉菌在美國是經濟上重要的致病有機體，其導致很多農事上重要的農作物品種的巨大損失。大豆疫霉菌CP/^o/ /^oraj6y'"e)是美國大豆的第二重要的病原體(Doupnik,P/a"fD". 77:1170-1171， 1993)。辣椒疫霉菌(尸/^op/^ora ca;^c/)具有廣泛的宿主范圍并最顯著地限制高價值、茄屬的蔬菜作物的生產。控制病原體特別困難，通常需要用殺生化合物處理整個區域。雖然有效，但對這種處理方法的環境成本和經濟成本日益增長的關注需要其它替代的控制方法。
疫霉菌類CP/^叩/^ora)是適應于在宿主植物不存在的情況下長期存活于土壤中的專性寄生物。卵孢子或厚垣孢子低密度地存在于土壤中并使病原體能夠存活。在易受感染的植物存在下，病原體通過一系列產生感染和疾病周期的、精細調節的發育步驟快速發育。通過游動孢子的釋放、成嚢、萌芽和感染，由卵孢子或厚垣孢子開始的病原體發育最初看起來顯得直接了當。但生命階段的進程是受環境信號的精細調節的，尤其是那些來自于宿主植物的信號。
游動孢子是擴散至根部感染部位最重要的生命階段。主要易感部位位于根部的頂端分生組織，細胞在此處伸長。從伸長的細胞釋放出
的流出物作為引導游動孢子向該部位趨化性移動的信號(Carlile, in
浙夢、為、類夢、在夢和病理夢乂 Erwin et al.， eds., APS Press, 1983;Deacon and Donaldson, Mycol Res. 97:1153-1171, 1993)。游動孢子的趨化性反應隨根部流出物的組成變化并且是種特異性的。例如，辣椒疫霉菌、惡疫霉菌(P ca"owm)和其它種的游動孢子被吸引到糖和氨基酸的陣列中(Hickman,尸/^o; a"o/ogy, 60:1128- 1135， 1970; Khew andZentmyer，尸Ay,o; a^o/ogy， 63:1511-1517， 1973)，但大豆疫霉菌的游動孢子被吸引到特定異黃酮化合物中(Norris et al., Plant Physiol，117:1171-1178， 1998)。雖然化學吸引的確切機理是未知的，但是，Deacon和Donaldson (Mycol. Res.， 97:1153-1171, 1993)以及Carlile (in尸一op禍ora.-加歷o/ogy, !Tajcowom_y,五co/ogy awd i^/ o/ogy, Erwin et al"eds., APS Press, 1983)概括了試驗，表明了在游動孢子表面的化學受體的參與。
游動孢子在響應環境信號而接近根部表面時是被包在嚢內的。棕櫚疫霉菌CR / a/mzVora)和其它疫霉菌類的游動孢子的包嚢形成，例如，可能受局部鈣離子濃度的影響(Griffith et al.，爿rcA. M/craWo/，149:565-571, 1988; Warburton and Deacon, Fwwga/ Gewe"cs 5z'o/，25:54-62, 1998)。包嚢形成還可被高濃度的化學引誘劑或被根細胞壁成分引起。例如，大豆疫霉菌的游動孢子在高濃度的大豆異黃酮化合物存在下被包在嚢內(Morris and Ward, P/y^'o/ Mo/尸/awf尸a"o/， 40:17-22,1992)。與此對比，瓜果腐霉菌(尸;^A/i/附a/7/^mWwm^i/m)游動孢子在與水芽根部細胞表面的巖藻糖基和半乳糖基殘基接觸時被包在嚢內
6(Longman and Callow,尸—》/ Mo/尸ta ~Ao/， 30:139-150， 1987; Estrada-Garcia et al.， 41 :693-699， 1990)。 Deacon和
Donaldson (Myco/i d， 97:1153-1171, 1993)指出，在高濃度引誘劑存在 下的包嚢形成對侵染力是有害的，并因此隨時間的推移而不被選擇。 然而，他們建議，可充分濃縮根部表面的引誘物以在接觸根部表面殘 基后使游動孢子傾向于形成包嚢。
當與根部接觸時，游動孢子以特定方向形成包嚢，所以，朝著根 部方向形成了芽管。如果游動孢子在與根部接觸前形成包嚢，芽管會 在任<可方向上形成，而為了定位才艮部并感染該植物必須重新定向。在 芽管上的細胞表面的受體被認為與此根部定向過程有關。例如，Morris 等人(尸/fl"f117:1171-1178, 1998)說明了大豆疫霉菌幼體生長 對源自大豆疫霉菌的異黃酮化合物的低濃度、無毒的定向響應。 Zentmyer 133:1595-1596, 1961)報導了樟疫霉菌CP cz"wawo脂)
朝著宿主根部方向的菌絲定向，但對引誘化合物的特性沒有說明。
感染后，菌絲穿過植物組織在細胞間和/或細胞內生長，其取決于 病原體的種類(Stossel et al.， Can. J. Bot.， 58:2594-2601， 1980; Coffey and Wilson, 尸/^鄉級ora, 加 Wo/ogy, rox:owo附乂 ￡co/ogy awd 尸a/Z(o/ogy， Erwin et al., eds" APS Press, 1983; Enkerli et al., Ca". , 75:1493-1508， 1997; Hardham and Mitchell, Fimga/ Ge". 5zo/" 24:252-284, 1998; Murdoch and Hardham,尸ra鄉toma, 201:180-193， 1998)。通過某些疫霉菌類，包括致病疫霉(Coffey and Wilson, z>z 尸/^鄉涵orfl:加5z'o/ogy, 7io;o"omy,五co/ogy fl"d尸滅o/ogy， Erwin et al.， eds" APS Press, 1983)、辣椒疫霉菌(Jones et al.,,鄉^ /柳 64:1084-1090, 1974)和大豆疫霉菌 (Stossel et al., 丄5o,，
58:2594-2601,1980),形成吸器。菌絲和吸器都與宿主細胞壁和細胞膜 形成緊密的接觸。雖然缺乏直接的證據，但據推測，細胞表面的受體 對于感知植物信號很重要。細胞表面受體的間接證據來自于觀察到諸 如于吸器末梢部分出現的泡嚢(Coffey and Wilson, z'w尸/^top/^/jora:
7io:owomy五co/ogy朋d ^fW/zo/ogy, Erwin et al.， eds.， APS Press, 1983)。 Heath (Om.J.5o/" 73(Suppl.):S131-S139, 1995)論述了真菌菌絲末端生長的可能事件，包括通過離子通道和泡嚢功能與周圍環境的通 訊。
如上所述，證據指向了細胞表面受體對觸發疫霉的行為和發育步 驟的突出物。因此，細胞表面受體可提供破壞病原體發育以及由此的 感染性的方法。由于游動孢子僅有有限的時間來定位、接觸和穿入隨 生長的根部末端有效移動的感染部位，因此發育的延遲或破壞會具有 很大影響。此時間限制來源于根部組織易感染性的改變，因為，當在
伸長區域的成熟組織時，其變得明顯不易受感染影響(English and Mitchell, P/^o/ W/io/ogy, 78:1478-1483, 1988)。
"融合噬菌體"是絲狀的細菌噬菌體載體，其中，外來肽和蛋白被 克隆到噬菌體外殼基因中并作為部分噬菌體外殼蛋白而被展現。常用 的產生融合噬菌體的外殼基因為pVIII基因和pIII基因。約3900拷貝
的pvm組成管狀病毒體蛋白質外殼的主要部分。各pvni外殼蛋白與
病毒體長軸成低角度，其C-端埋在靠近DNA的內部而其N-端暴露于 外部環境。pIII外殼蛋白的5個拷貝位于每一病毒體的末端并且參與 將噬菌體附到大腸桿菌的pIII上以及在感染和復制之后對病毒的重新
組裝。作為部分pvm展示的肽被限制于其在病毒體外殼上展示的基 質中。相反，由于pin.蛋白的末端位置，作為部分pin展示的肽更具
有柔韌性性。特定噬菌體可構建為展示為6至15個氨基酸長度的肽。
將隨機的或簡并寡核苷酸插入外殼蛋白基因使之能夠產生展示隨機肽
庫的噬菌體。典型的展示庫包含多如108個隨機序列肽的10至100個
拷貝。因此，噬菌體展示對篩選具有所需結合特征的稀有肽是有幫助 的。
噬菌體展示的隨機肽庫已用于分離哺乳動物細胞上的細胞表面受 體的配體。例如，已從噬菌體展示庫將肽分離出來，該噬菌體展示庫 與跨膜整合素糖蛋白結合并涉及細胞-細胞外基質和細胞-細胞相互作
用(O'Neil et al, Pra&z7w, 14:509-515, 1992; Smith et al.， 《/5zW C7^m,， 269:32788- 32795, 1994; Healy et al.， 5zoc/^附z^o;， 34:3948-3955， 1995)。噬菌體展示的肽特異地阻斷細胞與定義的細胞外分子及其它細 胞的粘附(Koivunen et al" ■/編CA亂，268:20205-20210， 1993;Koivunen et al.， / Ce〃所o/， 124:373-380， 1994; Healy et al.， 5z'o由mz'欲j;, 34:3948-3955, 1995; Pasqualini et al" 7V齒re Wo化cA., 15: 542-547， 1997)。噬菌體展示的隨機肽庫也已^皮用于選擇區分腦組織和 腎組織的肽(Pasqualini and Ruoslahti, A^wre， 380:364-366， 1996)。在體 內，噬菌體展示的隨機肽的親和力選擇性也已被用于選擇與特異腫瘤 組織的血管內皮細胞選擇性結合的肽(Pasqualini et al.， AA^ww所o"c/l， 15: 542-547, 1997)。當這些肽與抗癌藥融合并凈皮注射到荷瘤小鼠時， 這些肽成功地將藥物靶向腫瘤血管并阻止進展期的腫瘤發育(Arap et al., S"置e， 279:377-380， 1998)。
噬菌體展示方法僅在有限的情況下應用于植物病原體。噬菌體展 示方法幾乎已專用于鑒別植物病毒診斷的抗體(Susi et al., 尸一，,/jo/ogy, 88:230-233, 199& Ziegler et al.,尸一o; ^o/ogy, 88:1302-1305， 1998; Griep et al.， J Plant Pathol., 105:147-156 1999; Toth et al., P/^o/ fl"o/ogy, 89:1015-1021, 1999)。噬菌體展示用于選擇在病 疫疫霉(P/^o; /^ora Zw/es^^)的幼體和孢子上與表面暴露的抗原表位 有親合性的抗體的單 一 情況(Gough et al.，丄/附w頭o/. M&Ao&， 228:97-108, 1999)。對分離的噬菌體展示的、單鏈可變區片段(Fv)的 抗體片段未進行評價，因為其可能影響孢子或幼體行為。對抗體對于 孢子嚢的抗真菌活性進行測試，但是沒有發現其可檢測到的抗真菌活 性。
豆薯層銹菌(尸/^&o/wora ; ac/z,/^/)是產生大豆(4魯豆，Gfyc/wes max)銹病的真菌。該病原體已從亞洲傳播到世界上所有其它大豆生產 區域。在2004年秋季期間，豆薯層銹菌到達美國。目前，在任何大豆 品種中都沒有已知的持久抗性。疣頂單胞銹菌(C/ram_yc&s a/ ; ew&cM/齒s)是在豆類(菜豆，尸Aeaseo/ws vw/gan、)上產生銹病的真 菌。育種家正努力識別大豆中可控制為銹病抗性的基因。由于在巴西 已報導出現了豆薯層銹菌，產生大豆銹病的真菌，美國大豆生產者已 預料到它的到來。在去年秋天到達美國的豆薯層銹菌終結了這種預料， 并且，目前農場主必須對這種新疾病可能每年出現的情況作出反應。 農場主的擔心是基于在沒有成功實施控制措施時，世界上其它區域10%至80%的損失的報導。
因為在測試了超過18,000個美國大豆品種后還沒有發現對銹病持 久的、天然的抗性，大豆生產者已經在擔心了，并且，病原體，豆薯 層銹菌，可能潛在地感染產出的任何栽培種。在對銹病病原體到來的 預期中，已進行了大量的研究以確定有效的殺真菌劑，并且已獲得了 用于大豆的緊急政府許可。傳統的篩選和育種方法已#皮確定對上述病 原體沒有主要的抗性基因，并且尤其是疣頂單胞銹菌(t/. ap; e"c^cM/ato )和豆薯層銹菌的情況。
抗真菌劑將可能是多年的防衛前線，直到新的抗性基因或其它形 式的抗性被確定之前。
傳統上，抗真菌劑還沒有用在大部分的大豆生產。因此，關于此 疾病管理實踐的成本及其可能的經濟活力只有有限的信息。在密蘇里 州及其它州，這些問題已導致對于可將大豆替換為備選農作物的面積 不確定的估計。
為了保護大豆農場主以及保證產品滿足國家的需要，必須盡快開 發出替代的抗真菌劑。本公開提出了基于生物技術的新型銹病抗性。 該技術包括轉基因植物中防御肽的開發和部署，例如大豆。該技術同 .樣影響了重要領域豆類(菜豆)銹病病原體，.疣頂單胞銹菌。
作為誘導銹病的真菌，疣頂單胞銹菌和豆薯層銹菌屬于擔子菌 (Basidiomycetes )綱中的銹菌(Uredinales)目。疣頂單胞銹菌在單一宿 主植物上產生5個孢子階段。豆薯層銹菌主要通過單一宿主植物上的 夏孢子(uredospores)而復制。夏孢子負責快速傳播真菌。除了大豆，豆 薯層銹菌可感染許多豆類。
疣頂單胞銹菌的夏孢子通過葉子的氣孔口穿透。豆薯層銹菌的不 同之處在于發芽的夏孢子直接通過葉子表皮細胞層穿透。通常，落在 葉子表面的夏孢子發芽以產生附著在表面的感染墊(附著胞)。在這兩 種類型中，附著胞都產生穿透植物的菌絲突。穿入后，各真菌發育成 通過葉組織在細胞間生長的線狀結構(菌絲)。菌絲在不殺死宿主細胞 的情況下進入宿主細胞。在那里，它們形成球形結構(吸器)，從活著 的葉細胞中吸取營養。感染后不久，各真菌形成產生額外孢子的夏孢子堆。
組合的噬菌體展示庫提供大量的隨機肽陣列，并由其選擇針對感
興趣的蛋白質的配體(O'Neiletal., 1992)。噬菌體展示肽庫是絲狀噬菌 體克隆的混合物，其每一個在病毒體表面上展示單一外來肽序列 (Cwirla, 1990; Scott and Smith, 1990)。展示的肽與該噬菌體基因組中的 其編碼DNA物理連接。因此，肽可容易地且快速地被鑒別并被轉移 至其它載體系統或展示系統。典型的庫包含109種隨機肽變體。
隨機肽庫可用于分離對于哺乳動物細胞的細胞表面分子重要的配 體。例如，通過針對純化的分子進行生物淘洗，與跨膜醣蛋白，整合 素，有親和力的肽已被從庫中分離出(O.Neil et al., 1992; Smith et al., 1994;Healyeta1.， 1995)。有些肽^皮發現阻斷細胞與定義的細胞外分子 及其它細胞的粘附。肽的結合與抑制的有效性對肽序列基序是特異的 (Koi雨en et al" 1993; Koivunen et al" 1994; Healy et al" 1995; Pasqualini et al.， 1995),并且選擇的有效性對特定器官組織是特異的 (Pasqualini and Ruoslahti， 1996)。
因此，需要篩選與植物病原體特異結合的肽的快速且有效的方法。 一旦鑒別出，肽可進一步被評價其預防病原體感染植物的能力，并且， 合適的肽可直接用于植物、用于處理土壤，或者，任選地，可將編碼 肽的序列引入植物中以使植物對病原體具有免疫性或抗性。在此情況 下，可開發出控制植物病原體的經濟的并且對環境安全有效的方法。
發明概述
本發f
本領域技術。 一方面，使大豆對目前沒有持久抗性的大豆銹病有抗性。 在另 一 實例中，相同的常用技術可提供對常見銹病有抗性的菜豆。
在一實例中，鑒別對植物病原體的表面具有親和力的肽的方法。 在此方法中，通過提供編碼肽的簡并寡核苷酸構建了包含隨機肽的庫。 將該寡核苷酸插入到合適的載體中，所述載體在其表面表達編碼的肽 并能夠轉染宿主細胞。宿主細胞用載體轉染而擴增感染形式的栽體以 在載體上產生肽庫。然后將表達肽庫的載體與靶病原體接觸并使其與病原體結合。除去未結合的載體并洗脫與病原體結合的載體。然后將 洗脫的載體在合適的宿主細胞中擴增并分離插入的寡核苦酸。然后通 過任何合適的方法對該寡核苷酸測序，并且，從該寡核苷酸序列推導 出該肽的氨基酸序列。
本公開的手段的 一方面涉及作為新型的大豆及豆類抗性因子的肽 及其選擇的方法。在無需知道病原體中特定致病性目標的情況下，肽 可被方便地鑒別和選擇。由于事實上這些肽不是必須存在于天然大豆 或豆類中，病原體之前沒有暴露其中。因此，用于大豆和豆類的肽的 有效性可擴展至各種病原體種群，且其效力很可能是耐久的。
噬菌體展示肽選擇的傳統方法是基于針對特異感興趣的純化分子
的庫的淘洗，如Barbas et al.， 2001所述的實例。本方法學與先前4支術 的不同之處在于針對全細胞的庫篩選無需預先知道特定靶標或高濃度 的純化靶分子。
在所述的一個方面中，當作為腳手架蛋白的一部分展示時，稱為 肽的小分子可在轉化的植物中提供銹病抗性。在一實例中，可根據在 此公開的手段，通過對疣頂單胞銹菌和豆薯層銹菌的幼體(即發芽的孢 子)的傳染性結構的結合親和力來選擇這些肽。此結合親和力可抑制孢 子的進一步發育和致病。因此，肽表現為抑制這些真菌的致病。在具 體的實例中，細胞分裂素氧化酶可被修飾作為展示植物中所選肽的腳 手架蛋白。
經過一段時間，病原體種群能夠適應所選的賦予抗性的肽的存在。 然而，如果肽的選擇和篩選很方便，可快速選擇新的防御肽以應對改 變病原體種群的挑戰。本公開手段的具體優勢包括肽選擇方法和表型 評價的快速和簡單，肽的選擇無須知道病原體中的致病性靶標，有效 肽的高百分率的回收，快速鑒別所需新防御肽的能力，將腳手架肽用 于易感植物組織的能力以及快速修飾所需腳手架肽構建體的能力。
另一方面提供了抗真菌組合物，該組合物包含至少一種肽，其選 自ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、 ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO:24)、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31)、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4)。
另一方面是重組核苷酸，其包含編碼肽的序列，所述肽選自 ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、 ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO: 24)、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31)、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4)。
另一方面是重組載體，其包含編碼肽的核苷酸序列，所述肽選自 ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、 ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO: 24)、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31)、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4)。
還有一方面是用載體轉化的細胞，所述載體包含編碼肽的核苷酸 序列，所述肽選自ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、 ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO: 24) 、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31)、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4)。
在另一方面提供了表達盒，其包含作為可操作地連接的組分，啟 動子；編碼肽的核苷酸序列，所述肽選自ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、 ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO: 24)、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31) 、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及 AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4);以及轉錄終止信號序列。
另外的方面提供包含表達盒的重組體植物，該表達合包含啟動子； 編碼肽的核苷酸序列，所述肽選自ADPPRTVST (SEQ ID NO: 7)、
13ADRPSMSPT (SEQ ID NO: 8)、 ADITDPMGA (SEQ ID NO: 20)、 AVGTHTPDS (SEQ ID NO: 21)、 AVSPNVHDG (SEQ ID NO: 22)、 LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO: 24)、 EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO: 31) 、 LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO: 33)以及 AAPDLQDAM (SEQ ID NO: 4);以及轉錄終止信號序列。
該方法包括提供隨機肽庫，該肽庫通過提供編碼肽的簡并寡核苷酸
而制成的；將寡核苷酸插入到合適的載體中，所述載體在其表面表達 所述肽并轉染使宿主細胞；以及用載體轉染合適的宿主細胞而擴增感 染形式的載體以在載體上產生肽庫。
然后將表達肽庫的載體與感興趣的植物病原體接觸并使其與該病 原體結合。結合后，除去未結合的載體并將結合的載體從該病原體洗 脫。將洗脫的載體在合適的宿主細胞中擴增并分離在洗脫的載體中插 入的所述寡核香酸。然后，由該寡核苦酸編碼的肽被制備出，與感興 趣的植物病原體接觸，并被觀察對傳染性的影響。在一實施方案中， 對該分離的寡核苷酸測序，從所述核苷酸序列推導出所述肽的氨基酸 序列，并且所述肽通過化學合成制備。在另一實施方案中，通過將分 離的寡核苷酸插入用于轉化合適宿主細胞的表達載體而制備肽。然后 將轉化的宿主細胞保持在適于肽的表達的條件下。
為了回收與不確定的表面蛋白的種群相結合的肽，還針對全細胞 篩選了組合庫。可對感興趣的表型評價通過這種篩選回收的肽。例如， 我們選擇了與霉菌植物病原體(疫霉)的能動的游動孢子有親和力的 肽。表型篩選產生了通過誘導未成熟的包嚢來破壞孢子正常發育的肽 的子集(Bishop-Hurleyetal., 2002)。我們還表明了，當展示為噬菌體展 示形式或當作為自由分子而合成時，親和力選擇的肽破壞游動孢子發 育(Laskey et al.， 2001; Bishop-Hurley et al.， 2002)。
附圖筒要說明
這些以及其它特征、方面和優勢通過以下說明、所附的權利要求 及附圖將變得更容易理解。其中
14
圖1顯示分為6個家族的f8肽序列的組成。左邊為樹狀圖，右邊 為肽的名稱和序列。
圖2顯示辣椒疫霉菌游動孢子響應與給定不同濃度的所述f8噬菌 體展示肽接觸的成嚢作用。百分比值表示兩個試驗的平均值。不包含 噬菌體的對照游動孢子種群的成嚢百分比在0至10%之間變化。
圖3顯示辣椒疫霉菌游動孢子響應與給定不同濃度的所述f8及 f88-4噬菌體展示肽接觸的成嚢作用。
圖4顯示所述噬菌體展示肽與辣椒疫霉菌游動孢子的結合。數值 表示3個試驗的平均值。
圖5顯示所述噬菌體展示肽與辣椒疫霉菌結合的特異性。數值表示 3個試驗的平均值。
圖6是質粒pJE-7的圖譜。AOX-P是乙醇氧化酶啟動子，Mat-a 是mat-a的分泌序列，CKX1是細胞分裂素氧化酶1序列，Pc87是示例 的肽，以及AOX-TT是乙醇氧化酶終止序列。圖下面是為編碼Pc87的、 顯示(+)鏈(5' AG CTA GCA GAT AGA CCA TCA ATG TCA CCA ACA TAG T 3'， SEQ ID NO: 46)和(-)鏈(5' CT AGA CTA TGT TGG TGA CAT TGA TGG TCT ATC TGC T 3'， SEQ ID NO: 47)的雙鏈序列。
圖7顯示包含于pJE-7中的示例插入物的^^酸序列(SEQ ID NO: 48),其中，加下劃線的核苷酸是mat-a分泌序歹'J(由Kex2酶的斷裂出現 在最后加下劃線的精胺酸)，接著是細胞分裂素氧化酶l序列。將兩個加 雙下劃線的氨基酸(KL)加入以輔助構建融合蛋白質。示例的肽Pc87的氨 基酸序列用黑體字顯示。
圖8是顯示鑒別植物防御肽的一種方法的方法流程圖，所述肽可用 于轉化植物以及對銹病病原體賦予抗性。
圖9顯示轉化的根部頂端區域附近的游動孢子的成嚢作用(左)和在 野生型根尖附近的正常游動孢子的成嚢作用模式(右)，該轉化的根部分泌 展示親和力選擇的肽的細胞分裂素氧化酶(CKX)。
圖IO顯示親和力選擇的噬菌體肽克隆19對疣頂單胞銹菌幼體生長 的抑制作用(左)，以及在非選擇的噬菌體庫存在下正常的夏孢子發芽和生 長(右)。定義
"分泌序列"是指指引新合成的分泌蛋白或膜蛋白至并且經過內質 網的細胞膜、或經細菌內膜從細胞質至周質、或從線粒體基質至內部 空間、或從葉綠體子座至類嚢體的序列。此序列融合至異源宿主中表 達的基因保證了重組體蛋白質從宿主細胞的分泌。
"幼體"是指具有自然發生的芽管的新發芽的包嚢(發芽后5-8小
時)
"TBS，，是指Tris緩沖鹽水(50 mM Tris-HCl (三羥曱基氨基甲烷鹽酸 鹽)，pH7.5, 150mMNaCl)。
"重組多核苷酸"是指多核苷酸，其不含一個或全部兩個將天然發 生的有機體基因組中多核芬酸側翼連接的核普酸序列，所述多核苷酸 是衍生自所述有機體基因組。此術語包括，例如，并入載體或表達盒、 自主復制的質粒或病毒、原核生物或真核生物的基因組的DNA的多 核苷酸及其片段，或作為獨立于其它多核苷酸的單個分子存在的多核 苷酸及其片段。其還包括作為雜交多核苷酸的一部分的重組多核苷酸， 例如，編碼多肽序列的重組多核苷酸。
"IPTG"是異丙基硫代半乳糖苷。 -
"TU"是指轉導單位。
"NAP緩沖液"是80 mM NaCl、 50 mM NH4H2P04，并用NH4OH調 節pH為7.0。
"NZY-Tc"是包含1% NZ胺A(typtone型培養液；Humko-Sheffield Chemical, Norwich, N.Y.)、 0.5%酵母提取物、0.5% NaCl、用NaOH調 節pH為7.0的細菌生長培養液。
"PCR"是指聚合酶鏈式反應。
此處用到的"多核苦酸"和"寡核普酸"可互換使用并且指的是任意 長度的核苷酸，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸，聚合的(2個或多個單 體)形式。雖然核苦酸通常通過磷酸二酯鍵結合，所述術語也包括含有 由氨基乙基甘氨酸單元組成的中性酰胺骨架鍵的多聚核苷酸。所述術語 僅指分子的一級結構。因此，該術語包括雙鏈和單鏈的DNA和RNA。其還包括已知類型的修飾，例如，標記，曱基化，"帽子"，用類似物取 代一個或多個天然發生的核苦酸，核苷酸間修飾，例如，具有不帶電荷 的鍵的修飾(例如，曱基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)， 包含懸掛部分的修飾，如蛋白質(包括，例如，核酸酶、毒素、抗體、信
號肽、聚-L-賴氨酸等)，具有嵌入劑的修飾(例如吖啶、補骨脂素等)，含 有螯合劑的修飾(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)，含有烷 化劑的修飾，具有修飾鍵的修飾(例如，a異頭核酸等)，以及多核苷酸未 修飾的形式。多核苷酸既包括有義鏈又包括反義鏈。
"序列"是指單體在聚合物中出現的線性次序，例如，M酸在多肽 中的次序或核苷酸在多核苷酸中的次序。
"肽"、"蛋白質"和"多肽"可互換使用并且是指由兩個或多個通過肽4建 方式連接的氨基酸組成化合物。
"重組體蛋白質"是指，不管包含天然的還是變異的一級氨基酸序列， 通過表達細胞中重組體DNA分子攜帶的基因而獲得的蛋白質，該細胞不 同于基因和/或蛋白質被天然發現的細胞。換句話說，所述基因與其表達 的宿主是異源的。應理解，基因的任何改變，包括添加編碼親和力純化 片段的多核苷酸，基于此定義的目的使該基因成為非天然，因此，該基 因不能在任何細胞中"天然地"發現。 .
"非免疫球蛋白肽"是指不是免疫球蛋白的肽、公認的免疫球蛋白區 域、或包含免疫球蛋白的區域。例如，免疫球蛋白的單鏈可變區被排除 在此定義之外。
"基本純的"或"基本純化的"是指物質不含其它污染的蛋白質、核酸及 其它源自有機體來源的生物材料。純度可通過標準方法測定，并且常見 為至少約40%純、更常見為至少約50%純、通常為至少約60%純、更通 常為至少約70%純、經常為至少約75%純、更經常為至少約80%純、典 型地為至少約85%純，更典型地為至少約90%純、優選為至少約95%純、 更優選為約98%純，且在還更優選的實施方案中為至少99%純。分析可 為重量或摩爾百分比，通過例如凝膠染色法、分光光度法或末端標記法 等評價。發明詳述
以下提供了詳細的描述以幫助本領域技術人員實踐本發明方法。 雖然如此，此詳細描述不應理解為過度限制本發明，因為在不偏離本 發明性的發現的精神和范疇的情況下，本領域普通技術人員可在此討 論的實施方案中做出修改和改變。
所有在本申請中引用的刊物、專利、專利申請、數據庫和其它參 考都在此以參考的方式全部引入，如同各單獨的刊物、專利、專利申 請、數據庫和其它參考被特定地且單獨地表示為通過參考而引入。
大豆生產者越來越多的關注豆薯層銹菌，大豆銹病的起因，在不 久的將來將進入北美的生產區域并傳播。此關注起因于在世界上某些
區域超過50%的農作物損失的估計。對于此病的關注隨著最近在北蟀 5度以上的巴西發現的銹病真菌而增多。很可能在不久的將來，豆薯 層銹菌的孢子將通過盛行的北風被帶入美國(Rizvi， 2004)。因為沒有已知 的對銹病有效的疾病抗性基因，目前的疾病管理計劃依賴重復的保護殺 菌劑的應用。以下的本公開提供了另外的選擇，使用新的肽技術鑒別 和遞送與豆薯層銹菌和相關銹病病原體的傳染性結構結合的防御肽以 停止銹病發展。防御肽可設計為在植物中表達并被遞送至病原體感染 和群集的部位。植物體，例如大豆.和蠶豆，可被設計為表達這些肽以產 生對銹病具有獨特抗性的植4朱系。
因此，開發的方案鑒別與傳染性的豆薯層銹菌孢子和幼體結合的 肽，評價結合的肽抑制孢子發芽和真菌生長的有效性，引入并測試植物 中候選防御肽的抗性潛力。
銹病病原體產生孢子(夏孢子)，感染大豆的葉、莖和籽皮。這些 孢子被風吹動并落在植物上，它們在該植物上發芽以產生穿透植物組 織的芽管(定義為幼體階段)。穿透之后，真菌通過產生經組織在細胞 間和細胞內蔓延的絲狀生長而進一步發育(Bonde等，1976; Koch和 Hoppe, 1988)。經過一段時間，組織群集導致另外傳染性孢子的產生， 這些孢子在風中釋放并移動到其它植物。
雖然假想了一些對大豆銹病的抗性基因，但大部分已經在野外條 件下或溫室接種試驗中失敗了。 一旦病原體到達新的地理區域，培育者面臨事實上在市售大豆品種或育成品系中沒有可用的完全的銹病抗 性的情況。對于可預知的未來，培育者將需要在每個生長季節期間周 期性地施用殺菌劑。
基因結合至市售大豆品系中預期需要很多年。以下的公開有利地加快 了這個過程。其可能性是從目前的肽技術、植物轉化技術和分子生物 學的發展得到的，將這些技術組合用于本文公開的發展。組合的肽技 術能夠對大量的、多種多樣的肽集合篩選出與植物病原體的傳染性結構 結合并在植物感染前或感染期間破壞其發育的肽。分子生物學和植物轉 化的工具能夠構建在植物的感染部位表達這些防御肽的遞送系統。
防御肽可定義為與植物和動物病原體的傳染性結構，例如孢子， 相結合來破壞該病原體正常發育的肽。結合并破壞或阻止病原體功能 的肽是通過結合對調節發育很重要的病原體表面蛋白而得到此效果 的。選作此用途的表面蛋白可以是，例如，細胞壁形成和才直物生長所 需的酶，或可能地，控制對生長必不可少的礦物的攝取的蛋白質。在 此公開的方法，示例性地說明，可有效篩選針對包含十億或更多隨機 肽組合的多種肽集合的病原體。所述技術特別應用于擊敗豆薯層銹菌 及相關病原體。 . .
通過以下實例的方式將表明如何鑒別與傳染性豆薯層銹菌孢子和 幼體以及相關的或類似的病原體的孢子相結合的肽。產生肽的集合并確 認與病原體的傳染性孢子或芽管(幼體)相結合。為了鑒別結合的肽，將孢 子或幼體與隨機肽的集合，通常稱為庫，相混合，該隨機肽在細菌噬菌
體(病毒)顆粒上展示，例如，如Wilson等，1998所述。通過此方法，示例 性說明，孢子和幼體可暴露于十億隨機肽中。廣泛的很多種適合的肽庫 是本領域公知的。在某些庫中，肽僅包含8個氨基酸，而在其它庫中， 每個肽包含15個氨基酸。
在混合與適當培養的暴露之后，洗滌可除去所有與孢子和幼體粘 合不牢固的肽。可處理所述孢子和幼體以釋放附著的肽，增加其數量， 并重復篩選過程。在幾個反復的篩選步驟后，其中，每個步驟確定了 前一步驟中結合肽的結合親和力，回收確定為與蛋白質及孢子與芽管表面的其它組分粘合非常牢固的很多種肽。在一個實例中，3個或4 個連續篩選步驟是足夠提供此結果的。
只要肽的結合親和力如上述方法確定，就可以評價結合肽抑制孢 子發芽和真菌生長的有效性。 一旦很多肽被鑒別出來，就可以選擇對 病原體功能有影響的肽。尤其感興趣的是阻止孢子發芽和幼體生長的 肽。這兩種破壞性行為的任一種都將導致阻止或減少的病原體感染和 疾病。高通量測定可用于檢測在疫霉、豆薯層銹菌或類似病原體中阻止 或減慢孢子發芽或植物生長的能力的大量的肽。經驗表明很大比例的測 試的肽可能對病原體發育有影響。
一旦鑒別出防御肽，在不被植物的酶降解的情況下將其遞送至植 物內的感染處。獲得此遞送的一種方法是將所述肽附在由植物天然產 生的并且在被病原體群集的組織中產生的蛋白質上。在一個實例中， 細胞分裂素氧化酶已被成功用于此目的。此蛋白質是由植物天然產生 的，且其參與植物生長激素(細胞分裂素)的調節。防御肽可附于此蛋 白質上，并且用于改變病原體功能。在一個實例中，這已在疫霉中實 現。
防御肽可與由細胞天然分泌于細胞間隙的細胞分裂素氧化酶及其 它蛋白質融合，其中它們能夠與群集的銹病病原體接.觸。或者，此融 合可包括屬于植物細胞壁組分的蛋白質。這些蛋白質也被置于細胞間 和細胞內與病原體互相作用的位置。市售的蛋白質組數據庫為可用作 CKX替代物的候選肽載體蛋白質提供多種多樣的基因序列。可使用用 于防御肽的最佳表現或展示的常規結構蛋白質組算法分析這些載體蛋白 質的結構。
候選的蛋白質-肽構建體可首先在酵母、畢赤酵母中表達和分泌。 此宿主促進濃縮或純化蛋白質或多肽，以及測試它們對病原體孢子發芽 或幼體生長的抑制作用。
只要確定了最好的防御肽以及在載體蛋白質上展示的最好的模式 就可確定地在植物，如大豆或蠶豆中，形成遺傳構建體。外源基因的 植物轉化和表達的方法在本領域是眾所周知的。
特別惡性的和危險的病原體，如豆薯層銹菌，是被政府規章限制的。通過利用最初的肽選擇方案而釆用銹病病原體的替代物或類似物可避免
此危險以;SJ見章的復雜性。Hollier和King, 1985已凈艮導了導致南方玉米 銹病的真菌病原體，多堆柄銹菌(A/cc/"/a ;w/"ora)。此病原體沒有限制 容易獲得，并且可在標準試驗室條件下操作。
在一實施方案中，通過將編碼6至15個氨基酸長度的肽的核酸序 列插入到合適的載體中而構建肽庫，盡管可使用為更長的編碼肽的序 列。被核苷酸編碼的肽事實上可以是完全隨機的或者可以限制其組成 以滿足結構上或功能上的需要。例如，而不是限制，半胱氨酸橋可插 入肽中。在一實施方案中，核酸序列不編碼免疫球蛋白(抗體)或公認 的免疫球蛋白區，如可變區。可使用表達插入的寡核苷酸的任一載體。 優選使用導致在細胞或病毒表面的、或在細胞或病毒的細胞內隔室或 細胞器表面表達肽庫的載體。在此情況下，表達的肽可用于與潛在的 靶分子或細胞相互作用，所述分子或細胞與包含所述肽的表面相接觸。 正如對本領域普通技術人員顯而易見的，如果肽在細胞內隔室或細胞 器的表面表達，所述潛在的靶標也必須存在于細胞內，或者細胞器或 細胞內隔室，必須通過諸如細胞的溶解暴露于外部環境。
產生寡核苷酸并將其插入載體的方法對本領域普通技術人員是公 知的，并僅在此簡單回顧。最普通地，使用Beaucage和Caruthers的亞 磷酸三酯方法在固相支持物上合成寡核香酸(r"raAMraw丄e仏 22:1859-1862, 1981;同時參見美國專利號4,973,679和4，458，066)。大量 的固相支持物可用，包括可控孔玻璃珠、聚苯乙烯共聚物、硅膠和纖維 素紙。寡核苦酸的制備開始于第一個核苷酸的3'-羥基基團與固相支持物 的鍵合。包含核苷酸的固相支持物是從商業來源可得的。寡核苷酸是從 3'位至5'位合成的，并且，鏈通過在可溶的5'-保護結構單元的、活化的 3'磷酸酯或亞磷酰胺上固定的寡核苷酸的5'-羥基的親核攻擊而延長。形 成的中間體二核香亞磷酸酯必須在鏈延長之前緊接著被氧化為更穩定的 磷酸酯。重復此過程直到已加入了所需數量的核苷酸。有市售的自動化 設備來合成寡核苷酸。此外，很多商戶提供定制寡核苷酸合成服務。
任何能夠表達肽庫中的肽的載體系統均可用在此處的實踐中，并且 很多載體系統在本領域是公知的(參見，例如Wilson and Findlay， Om. /Mz'cra&o/, 44:313-329, 1998)。當肽作為部分pVIII展示時，適合的噬菌體 系統包括8型、88型和8+8型。當使用pVIII時，適合的噬菌體系統包 括3型、33型和3+3型。當肽^^皮插入pVI中時，適合的噬菌體系統包括 6型、66型和6+6型。此外，可使用噬菌體T7和噬菌體T8載體系統。 在一優選實施方案中，文庫中的肽表達為與絲狀細菌噬菌體的外殼蛋白 融合，以便所述肽在病毒體表面表達并可與靶分子或細胞表面受體相互 作用。在一優選實施方案中，使用了 f8-l文庫，其中，隨機8-mer肽與 pVin的外殼蛋白融合。在另一優選實施方案中，使用f88-4文庫，其中， 隨機15-mer肽與pVIII的外殼蛋白融合。fB8-4文庫中的噬菌體展示了沒 有任何M酸存在偏好的肽。f8-l文庫中的噬菌體是無偏好的，除了在第 一位的丙氨酸和第二位的四個殘基之一。所有其它位置都被任意氨基酸 占用。
生產f8-l噬菌體展示肽庫的方法已在先前描述(參見，Petrenko等， 9:797-801， 1996以及其中引用的參考文獻)。所述文庫 在主要外殼蛋白pVIII的3900個拷貝的每一拷貝上展示異源肽。肽的表 達無須由IPTG的誘發。用于8-氨基酸插入的簡并寡核苷酸是GCA GNN (NNN)7，其中N是任一核苷酸。因此，第一氨基酸是丙氨酸(A)且第二氨 基酸是纈氨酸(V)、丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或甘氨酸(G)。肽 中其余的氨基酸完全隨機排列。
同樣地，生產f88-4噬菌體展示肽庫的方法也已在先前描述(Zhong 等，丄歷o/. C7z亂269:24183-24188, 1994; Smith和Scott, Me麵s zw 五"2^mo/ogy， 217:228-257， 1993; Smith, 128:1-2， 1993以及其中引用
的參考文獻)。此文庫在主要外殼蛋白pVin的150至300個拷貝上展示 15-氨基酸異源肽。pVIII亞基的3900個拷貝的剩余部分源自野生型pVIII。
因此，該噬菌體基因組具有編碼兩種不同類型的pvni分子的兩種pvni
基因。 一種pVIlH艮示異源15-mer肽的重組體，而另一種是通常存在 于噬菌體上的野生型pVIII。重組pVin的表達是由IPTG誘導型tac啟動 子/操縱子驅動的。由于兩種pVIII基因的存在，所述f88病毒體是由野生 型和重組pVIII亞基的鑲嵌形式組成的。
用于15-merM酸插入物的寡核苷酉^列是(NNK:h5，其中N為A、T、 C或G且K表示G或T。因此，圍繞該15-mer氨基酸插入物的區域 是LVPMLSFA(X)15PAEGDDPAKA (SEQ ID NO: 1),其中X是凈皮密碼 子NNK編碼的任何氛基酸。
噬菌體顆粒可用于基于其與感興趣的化合物及細胞的結合能力來篩 選在病毒體上表達的隨機肽。在一優選實施方案中，噬菌體展示肽庫用 于篩選與植物病原體結合的肽。在另一優選實施方案中，對肽與病原真 菌類的結合能力進行篩選。還有另一優選實施方案，對噬菌體展示肽與 疫霉菌屬成員結合的能力進行篩選。當研究多于單一生命階段的病原體 時，優選研究每個生命階段，因為隨著發展階段的改變，在數量、類型 和與結合部位的親和力上可能出現顯著差異。
例如，當研究疫霉菌屬的成員時，將約105至106的有機體與約108 至109的噬菌體展示肽相混合，并孵育一段足夠使其結合的時間。對于本 領域普通技術人員顯而易見的，取決于諸如病原體、噬菌體和肽的種類 的因素，根據本公開可使用有機體和展示肽的其它濃度。某些情況下， 預孵育展示肽與相同有機體的其它生命階段是需要的，目的是鑒別僅與 特定生命階段結合的肽。孵育后，有機體經過多次洗滌以除去未結合的 和不牢固地結合的肽。對疫霉游動孢子的情況，使用約50 mM的LiCl 溶液進行洗滌。洗滌后，洗脫結合的噬菌體展示肽，優選在低pH下，并 且在合適的宿主中擴增洗脫的噬菌體。在一實施方案中，宿主是饑餓的 K91大腸桿菌。在大腸桿菌中擴增細菌噬菌體的方法在本領域是公知的 并可見于，例如，Smith and Scott, Afe/Aoc/s /"五"zy/wo/ogy, 217:228-257， 1993; Ausubel et al. eds.，幼oW尸rafoco/s Mo/ecw/ar 5z.o/ogy， 2nd ed., Wiley & Sons, 1995; and Sambrook et al., Mo/ea//ar C7o/n."g， CoW ^pn'wg //aA0r丄ak rato7/Ves;y， 1989。在一實施方案中，至少一次重復篩選過程 以使高親和力的噬菌體展示肽富集。在另一實施方案中，3次重復篩選過 程。
一旦鑒別出高親和力的肽展示的噬菌體，擴增該噬菌體，優選在大 腸桿菌中，并且該噬菌體DNA的分離使用標準方法，例如在以下文獻中 見到的方法Smith and Scott, Afc^o^s 五w^ymo/ogy， 217:228-257, 1993; Ausubel et al. eds.，幼oW/w Mo/ecw/ar 5/o/ogy， 2nd ed., Wiley &Sons, 1995; and Sambrook et al., Mo/m//ar C7ow/ g， 2wJ Co/d <Spn'wg /fwZw丄W0rato71989。 一旦分離出噬菌體DNA,使用與用于插 入寡核苷酸的相同的限制性內切酶將插入的寡核苦酸從DNA裂解，而限 制性內切酶的片段則從DNA的剩余物中分離。然后，可使用任何標準方 法對寡核苷酸測序。測序可通過任何合適的方法進行，例如，雙脫氧測 序法(Sanger et al., Prac. A^/.」cc^. C75^, 74:5463-5467， 1977)、化學測 序法(Maxam and Gilbert,TVa,/. f/&4， 74:560-564, 1977)或
其任何改變，包括使用自動測序。在一實施方案中，使用ABI Prism 377 型自動測序儀(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)。 一旦知道了寡核普 酸的序列，使用遺傳密碼可容易地推導出編碼的肽的氨基酸序列。
高親和力的噬菌體展示肽可就其改變病原體的發育、生長和/或傳染 性的能力進一步篩選。在此實施方案中，孵育噬菌體展示肽與目標病原 體一段足夠使其結合的時間。結合之后，可觀察到病原體在其發育或感 染宿主的能力上的改變。在一實施方案中，約200個疫霉菌屬成員中的 游動孢子與培養皿中的以恒定體積兩倍連續稀釋的蒸餾水中噬菌體展示 肽結合。噬菌體的濃度范圍可變化，但通常在1至10xl(f病毒體/Ml之間。 在每一篩選步驟中都包括不包含噬菌體的陰性對照。在室溫下，通常為 20分鐘的孵育時間之后，測定在每個噬菌體濃度下包在嚢內的游動孢子
特有的受體介導的功能反應的誘導進行評價，該功能反應如游動孢子的
的感染。
本方法還可用于表征在植物病原體表面上結合受體的肽。在此實施 方案中，被標記的肽展示噬菌體(測試噬菌體)與不同有機體的并在不同發 育階段的細胞進行培養。然后，標記的噬菌體的相對結合親和力可通過 竟爭結合與Scatchard分析進行測定。在竟爭結合分析中，使恒定濃度的 測試噬菌體與靶病原體結合，然后加入一定濃度范圍下的未標記的刺激 噬菌體。該刺激噬菌體可與測試噬菌體相同或不同。然后洗滌靶病原體 以除去非特異地或不牢固地結合的噬菌體，并通過測量存在于靶細胞上 的標記的量來測定結合的測試噬菌體的量。竟爭的程度可通過需要抑制50%的測試噬菌體的結合(1(:5。)的刺激噬菌體的濃度來測試。竟爭測試的 結果可用于測定細胞表面受體隨時間的數量、類型和親和力的變化。
重組寡核苷酸在公開的手段的范圍內，其通過此處所述的方法被發 現，并編碼具有抗真菌活性的肽。這些重組寡核苷酸可用于產生通常用 作克隆或表達載體的重組多核苷酸，盡管其它用途是可能的。克隆載體 是作為轉移DNA片段至宿主細胞的自我復制的DNA分子。克隆載體的 三種最普通的類型是細菌質粒、噬菌體以及其它病毒。表達載體是經設 計以便插入在特定部位的編碼序列將被轉錄且翻譯為蛋白質的克隆栽 體。
克隆載體和表達載體都包含使載體在一個或多個適合宿主細胞中復 制的核普酸序列。在克隆載體中，此序列通常是使載體能夠獨立于宿主 細胞染色體進行復制，并且還包括復制起點或自主復制序列。很多細菌 和病毒的復制起點對本領域技術人員是眾所周知的并包括，但不限于 pBR322質粒起點、2jti質粒起點以及SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV和 BPV的病毒起點。
本公開的寡核苷酸序列可通過使用含有寡核苷酸序列的重組表達載 體用于產生抗真菌肽。適合的表達載體包括染色體的、非染色體的和合 成的DNA序列，例如SV40衍生物、細菌質粒、噬菌體DNA、桿狀病 毒、酵母質粒、由質粒和噬菌體DNA的組合衍生的載體、以及病毒DNA， 例如牛痘、腺病毒、雞痘病毒和偽狂犬病毒。此外，可使用任何在宿主 中可復制且有生存力的其它載體。
通過多種方法可將感興趣的核苷酸序列插入載體中。在最常見的方 法中，使用通常對于本領域技術人員已知的、并在例如以下的文獻中詳 述的方法Sambrook et al.， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, (1989) and Ausubel et al.， Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed" John Wiley & Sons 50 (1992),可將序列插入合 適的限制性內切酶位點。
在表達載體中，將感興趣的序列可操作地連接至由宿主細胞識別以 指導mRNA合成的適合的表達控制序列或啟動子。啟動子是通常位于從 結構基因的起始密碼子上游的100至lOOO石威基對(bp)處的非翻譯序列，啟動子在在其控制下調節核酸的轉錄和翻譯。啟動子通常分為誘導型的 或組成型的。誘導型啟動子是這樣的啟動子，其作為對環境中的某些變 化的反應，例如養料的存在或不存在或者溫度的變化，促使在其控制下
引發DNA轉錄水平增加。與此相反，組成型啟動子維持相對恒定的轉錄 水平。
當核 列處于與另 一核 列的官能關系時，其被可操作地連接。 例如，前序列或分泌引導者的DNA與多肽的DNA可操作地連接，如果 該多肽DNA表達為參與多肽分泌的前蛋白；啟動子與編碼序列可操:作地 連接，如果該啟動子影響序列的轉錄;或者核糖體結合部位與編碼序列 可操作地連接，如果該核糖體被置于方便翻譯的位點。通常，可操作地 連接的序列是鄰接的，并且對于分泌引導者的情況是鄰接的且在閱讀相 中。結合是通過在限制性內切酶部位的拼接而實現的。如果沒有合適的 限制性位點，則可使用對本領域技術人員公知的合成寡核苷酸接頭或連 接物(adapter or linker)。 Sambrook et al.， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed.， Cold Spring Harbor Press, (1989) and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed,， John Wiley & Sons (1992)。
用于表達載體的常見啟動子包括，但不限于，LTR或SV40啟動子、 大腸桿菌lac或tip啟動子以及噬菌體XPL啟動子。有效的誘導型植物啟 動子包括熱休克啟動子(Ou-Lee et al. (1986) Proc. Natl Acad. Set USA 83: 6815; Ainley et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14: 949)、源自菠菜亞硝酸還原酶 基因的硝酸鹽誘導型啟動子(Back et al. (1991)Plant Mol Biol. 17: 9)、激素 誘導型啟動子(Yamaguchi-Shinozaki et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 905; Kares et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 905)以及與RuBP羧化酶的小亞單 位和LHCP基因家族相關的光誘導型啟動子(Kuhlemeier et al. (1989) Plant Cell 1 : 471; Feinbaum et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 226: 449; Weisshaar et al. (1991) EMBOJ. 10: 1777; Lam and Chua (1990) Science 248: 471; Castresana et al. (1988) EMBOJ. 7: 1929; Schulze-Lefert et al. (1989) EMBOJ. 8:651)。可使用已知的在原核或真核細胞中控制基因表達的、本 領域技術人員公知的其它啟動子。表達載體也可包含翻譯起始的核糖體 結合部位以及轉錄終止子。該載體還可包含用于擴增基因表達的序列。表達載體和克隆載體可以，且通常是，包含選擇基因或選擇標志物。 典型地，此基因編碼對于被載體轉化的宿主細胞的生存和生長必要的蛋
白質。適合的標志物的實例包括真核細胞的二氫葉酸還原酶(DHFR)或新 霉素的抗性以及大腸桿菌對四環素或氨千青霉素的抗性。植物中的選擇 標志物包括對博來霉素、慶大霉素、甘草膦、潮霉素、卡那霉素、氨曱 喋呤、腐草霉素、膦絲菌素(phosphinothricin)、放線壯觀素、鏈霉素、磺 酰胺和磺酰脲的抗性。Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology 0直 物分子生物學方法)，Cold Spring Harbor Press, 1995, p. 39。
此外，表達載體還可包含與蛋白質的核苷酸序列可操作地連接的、 為用作標志物的編碼其他蛋白質的標志物序列。其結果為包含兩個連接 的且不同的蛋白質的雜化或融合蛋白質。所述標志物蛋白質可為由表達 載體產生的重組體蛋白質提供，例如，免疫的或生物酶的標志物。合適 的標志物包括，但不限于，堿性磷酸酶(AP)、 myc、血凝素(HA)、 j8-葡糖 醛酸糖苷酶(GUS)、熒光酶以及綠色熒光蛋白(GFP)。
本公開的多核苷酸序列也可以是表達盒的部分，該表達盒至少包括， 可操作地在5'至3'位方向上連接，諸如啟動子的調節序列、編碼本公開的 肽的多核苷酸以及在宿主細胞中起作用的轉錄終止信號序列。所述啟動 子可以是任何此處所述的類型，例如，組織特異性啟動子、.種子特異性 啟動子、質粒特異性啟動子等。所述表達盒可進一步包含可操作地連接 的靶向、運輸或能夠引導產生的蛋白質的傳輸的分泌肽編碼區。所述表 達盒還可進一步包含編碼篩選標志物和/或純化部分的核苷酸序列。
更具體地，本公開包括重組構建體，其含有編碼本公開的抗真菌肽 的分離的多核苷酸序列。所述構建體可包載體，例如質粒載體或病毒栽 體，所述序列正向或反向已被插入其中。該重組構建體可進一步包含調 節序列，包括，例如，與序列可操作地連接的啟動子。許多適合的載體 和啟動子對本領域技術人員是公知的并且是市售的。
本公開進一步的實施方案涉及包含構建體的轉化宿主細胞，該構建 體含有本公開的寡核苷酸序列。所述宿主細胞可以是更高級的真核細胞， 例如哺乳動物細胞或植物細胞，或是更低級的真核細胞，例如酵母細胞， 或者宿主可以是原核細胞，例如細菌細胞。將所述構建體引入宿主細胞可通過多種方法實現，包括磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、 1,5-二曱基-1,5-二氮十一亞曱基聚甲溴化物、原生質體融合、脂質體、直 接顯微注射到細胞核、刮研裝載以及電穿孔。在植物中，可使用多種不 同的方法將轉化/表達載體引入到植物原生質體、細胞、愈傷組織、葉盤 等，以產生轉基因植物。這些方法包括，例如，土i裏桿菌-介導的轉化、 基因槍傳輸、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇-介導的原生質體轉化、脂質 體-介導的轉化等(Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 42: 205)。
通過本公開的多核苷酸的表達產生的肽可通過以下步驟獲得通過 任何前述的方法轉化宿主細胞，在適合條件下生長宿主細胞；誘導多核 苷酸的表達以及分離感興趣的蛋白質。如果蛋白質是保留在宿主細胞內 的，則可通過宿主細胞的溶解而獲得該蛋白質，而如果蛋白質是分泌性 蛋白質，則可從培養基中分離。有一些方法可提純蛋白質并且對本領域 普通技術人員是公知的。這些方法包括沉淀，例如硫酸銨沉淀或乙醇沉 淀，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層 析，親和層析，羥磷灰石層析，外源凝集素層析，高效液相色譜(HPLC), 天然或變性條件下的電泳，等電聚焦以及免疫沉淀反應。
.或者，由本公開的多核苷酸編碼的肽可通過使用固相肽合成或經典 的溶液肽合成(也稱為液相肽合成)的化學合成法產生。在寡聚體支持的液 相合成中，生長的產品附在大的可溶聚合物基團上。因此，基于相對很 大的附于聚合物上的產品與未反應的反應物在尺寸上的巨大不同，每個 合成步驟的產品可從未反應的反應物中分離。這樣使反應能夠在均相的 溶液中發生，并且消除了與傳統液相合成相關的繁瑣的純化步驟。寡聚 物支持的液相合成還可適應肽的自發液相合成。
對于固相肽合成，此過程引起適合的氨基酸的順序裝配為所需序列 的肽，而生長的肽的末端與不溶載體相連接。通常，肽的羧基端與聚合 物相連接，并在解離劑處理時可從所述聚合物釋放。在常見方法中，氨 基酸與樹脂顆粒結合，并且，通過逐步添加保護的氨基酸以產生氨基酸 鏈的步進式產生肽。通常使用由Merrifield描述的修改的此技術(參見， 例如，Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 96: 2989-93, 1964)。在自動固相法中，通過將羧基端的氨基酸裝載到有機連接劑(例如，PAM， 4-氧代曱基苯基 乙酰胺曱基)上而合成肽，所述有機連接被共價地連接到與二乙烯基苯交 聯的不溶聚苯乙烯樹脂上的。通過用叔丁氧羰基來阻擋可保護末端氨。 羥基和M基團通常可通過利用O-千基基團來阻擋得到保護。在自動肽 合成器中完成合成，有很多市售的合成器。合成后，可從樹脂上脫去產 物。通常#4居已有方法(例如，Bergot and McCurdy， Applied Biosystems Bulletin, 1987)使用氫氟酸或三氟曱磺酸脫去保護基團。分離和純化之后， 通常得到約60%至70%的收率。完成產物肽的純化是通過，例如，從有 機溶劑例如曱基丁基醚中使肽結晶，然后溶于蒸餾水，以及使用透析(如 果肽的分子量大于約500道爾頓)或反向高壓液相色i普(例如，使用0.1% 三氟乙酸和乙腈作為溶劑的C18柱)如果肽的分子量小于500道爾頓。純 化的肽可被凍干并以干態儲存備用。可使用常見的高壓液相色i普(HPLC) 和電噴射質譜(ES-MS)分析方法完成所得態的分析。
通常，包含含有本公開多核苷酸的細胞的轉基因植物可通過任何前 述方法生產；篩選在選擇性培養基中轉化的植物細胞；使已被轉化的植 物細胞再生以產生分化的植物；以及選擇轉化的植物，其以所需水平表 達由本公開的多核苷酸編碼的蛋白質。轉化多種雙子葉植物并獲得轉基 因植物的具體方法在文獻中很好的記錄了 (Gasser and Fraley， Science 244:1293, 1989; Fisk and Dandekar, Scientia Horticulture 55:5， 1993;及其 引用的文獻)。
轉化和植物再生已在多種單子葉植物中獲得成功。具體實例如下 ,夢(As/ ara， Oj^dwafc; Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345)、大麥(i/o^fewm vw/garae; Wan and Lemaux (1994) Plant Physiol. 104: 37)、玉米(Zea map; Rhodes et al. (1988) Science 240: 204; Gordon-Ka匪et al. (1990) Plant Cell 2: 603; Fro醒et al. (1990) Bio/Technology 8: 833; Koziel et al. (1993) Bio/Technology 11: 194)、燕麥 (^ve"fl sa"ra; Somers et al. (1992) Bio/Technology 10: 1589)、野茅(￡^6^/& g/omerato; Horn et al. (1988) Plant Cell Rep. 7: 469)、大米((9，a她va， including indica and japonica varieties; Toriyama et al. (1988) Bio/Technology 6: 10; Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep. 7: 379; Luo andWu (1988) Plant Mol， Biol Rep. 6: 165; Zhang and Wu (1988) Theor. Appl. Genet. 16: 835; Christou et al, (1991) Bio/Technology 9: 957)、黑麥(Seca/e cerea/e; Dela Pena et al. (1987) Nature 325: 274)、高粱(Sorg/zwm Cassas et al. (1993) Proc. Natl Acad. Scl USA 90: 11212)、甘蔗CSaccAan/m ■sp/ .; Bower and Birch (1992) Plant J. 2: 409)、 高羊茅(Fe她ca anm&"ac叫 Wang et al. (1992) Bio/Technology 10: 691)、草沖草(v4gms^ / a/^^^; Zhong et al. (1993) Plant Cell Rep. 13: 1)以及小麥(7W"cwm aeWvw附；Vasil et al. (1992) Bio/Technology 10: 667; Weeks et al. (1993) Plant Physiol. 102: 1077; Becker et al. (1994) Plant J. 5: 299)。
在一優選實施方案中，采用編碼本公開的抗真菌肽的重組多核苷酸 轉化植物，其中該多核普酸形成由植物分泌的肽。在另一優選實施方案 中，轉基因植物的根分泌出抗真菌的肽。分泌抗真菌肽的植物可通過上 述方法構建，使用了將指引肽分泌的分泌序列引入的表達盒。或者，可 采用核普S吏序列轉化植物，該核苷酸序列編碼由本公開的抗真菌肽及通 常被植物分泌的蛋白質構建的融合蛋白質。例如，在抗真菌肽和細胞分 裂素氧化酶可產生融合蛋白質。細胞分裂素氧化酶是表現為降解可干擾 植物生長控制的外源細胞分裂素的防衛性酶。通過將抗真菌肽與控制分 泌的細胞分裂素氧化酶基因區域融合，抗菌素肽將被轉化植物分泌出， 從而提供免受病原體真菌的保護。
在融合蛋白質用于轉化植物之前，可使用本公開的噬菌體展示的方 法對包含抗真菌肽的融合蛋白質的活性進行篩選。通常，融合蛋白可以 是包含以下的物質的結構抗真菌肽；蛋白質的分泌控制部分，例如細 胞分裂素氧化酶；以及pVIII或pIII噬菌體外殼蛋白。然后，可使用本公 開的方法篩選如此構建的噬菌體展示融合蛋白質以選擇那些與靶病原體 真菌結合并且導致限制致病性的變化的融合蛋白質。
實施例
以下實施例的目的是提供本公開的應用的說明。以下實施例不是為 了完全定義或用其它方式限制本發明的范圍。
30實施例l:真菌種類和游動孢子的產生
使用的真菌菌抹為辣椒疫霉菌(尸.ca戸/ci)(ATCC 15399)、大豆疫霉菌 (尸.so力e)(菌才朱7-6-1,類別25) (A. F. Schmitthe皿er, Ohio State University) 和寄生疫霉(P/^o/ /^ora / araw'"ca)。所有培養物都作為菌絲體保持在 15 °C下的利馬豆瓊脂平澤反(大豆疫霉菌)或玉米4分瓊脂平斧反(Difco， USA) (辣椒疫霉菌和寄生疫霉)上。通過將菌絲栓(5 mmx5 mm)轉移至包含澄清 的10% V8⑧蔬菜汁(Campbe11 Soup Co.， USA)的瓊脂平板上制得菌絲體拷 貝。每個板上有3個栓在25 。C下生長3至6天。通過修整所述平板并在 25。C、光照下培養，在辣#^疫霉菌中可引起孢子嚢的產生。l至2天后， 通過無菌水沖洗所述平板20至30分鐘可引發游動孢子的釋放。寄生疫 霉游動孢子的產生與辣#^疫霉菌的產生相同，除了在25。C、光照下培養 前用無菌水洗滌所述平板2分鐘。從大豆疫霉菌孢子嚢中引發游動孢子 的釋放是通過用無菌水以30分鐘的間隔沖洗平板4次。游動孢子在2至 4小時內釋放。在其釋放之后，通過4層粗濾布過濾游動孢子以除去孢子 嚢殼以及菌絲體碎片。懸浮液的樣品渦流30秒以引發成嚢，然后在顯樣史 鏡下用血細胞計數器對包嚢計數。
實施例2:.作為轉換單位的饑餓的K91kan大腸桿菌細胞和Titerinz噬菌 體的制備
在文庫篩選前，才艮據開的方法(Smith & Scott, Methods in Enzymology, 217:228-257, 1993; Yu and Smith, Methods in Enzymology, 267:3_27, 1996)，將噬菌體作為饑餓的KWBluKan (卡那霉素抗性)大腸桿 菌中的四環素轉換單位(TU)進行濃度測定。轉換單位是測量噬菌體傳染 性的有效方法，并通常表示為噬菌體的TU/ml。簡言之，K91BluKan細 胞在20 ml的超級肉湯(superbroth)中、37 。C、激烈搖動(約170 rpm) 下(Smith and Scott， Methods in Enzymology, 217:228-257， 1993)生長為中 期指數階段(OD,約0.45)。然后將該細胞在輕柔搖動下培養另外的5分 鐘以使任何修剪過的F pill再生。在4 。C下的Sorvall SS34轉子中，將該 細胞在無菌的50 ml圓底旋蓋(Oak Ridge)管中以2，200 rpm離心分離10 分鐘。傾倒出上清液，然后將該細胞再懸浮于20 ml的80 mM NaCl中，置于125 ml培養并瓦并在70 rpm、 37 °C下輕柔搖動45分鐘。然后如上離 心分離該細胞并再懸浮于l ml冷NAP緩沖溶液中。饑餓的細胞在4 。C 下保存且保持傳染性3至5天。
將噬菌體作為在大腸桿菌K91BluKan中饑餓細胞(如上制備)的轉換 單位(TU)進行濃度測定。使用TBS/凝膠作為稀釋劑對噬菌體進行分析測 定。10微升的各噬菌體稀釋物以液滴形式沉積在與水平面成10。角i殳置 的15ml無菌一次性管的內壁上。將IO微升饑餓的大腸桿菌K91BluKan 細胞加入各噬菌體液滴并在室溫下將其培養10分鐘以允許噬菌體感染濃 縮的細胞的時間。IO分鐘后，將包含0.2 mg/ml四環素的1 ml超級肉湯 加入至所述細胞并在搖動下、37 。C培養20至40分鐘。為了 f88-4/15 mer 噬菌體的擴增，該超級肉湯還包含1 mM IPTG以誘導重組體pVIII的表 達。然后將感染的細胞在包含40 mg/ml四環素的Luria-Bertani (LB)平板 上展開(200 ml每個平板)。然后在37 °C培養該平板約24小時。
實施例3:結合噬菌體的游動孢子的選擇
將f8-l文庫中10U轉換單位(TU)的等分試樣(Petrinko et al., Protein Engineering, 9:797-801， 1996)在室溫下加入至4 ml的50 mM LiCl中106 新釋放的辣椒疫霉菌游動孢子中，然后在室.溫、輕柔攪拌下培養30分鐘。 除了使用大豆疫霉菌的游動孢子的情況(Soj克隆)，對fB8-4文庫使用相 同的方法。用150 pd的50 mL LiCl洗滌包含結合噬菌體的游動孢子10 次，然后以1000xg離心分離45秒鐘以除去未結合的噬菌體。IO次洗滌 后，用200 j[d的洗脫緩沖液(O.l NHCl，足夠使pH為2.2的甘氨酸，1 mg/ml 牛血清清蛋白)洗脫結合的噬菌體。通過感染如上所述的饑餓的大腸桿菌 K91BluKan細胞將洗脫的噬菌體擴增。然后通過如下所述的與聚乙二醇 沉積的方法純化該擴增的噬菌體，并如Smith和Scott所述的方法將其再 懸浮于TBS緩沖液中(Methods in Enzymology, 217:228-257, 1993)。純化 噬菌體小份等分試樣隨后再用于新釋放的游動孢子中，如上所述用于總 共3次親和力純化和2次擴增步驟。如Smith和Scott所述(Methods in Enzymology, 217:228-257, 1993),通過計算每一輪選擇后的百分收率監測 結合游動孢子的噬菌體的選擇性富集。該計算是通過計算用于游動孢子
32的總噬菌體(表示為轉換單位)以及測量從游動孢子再生的噬菌體(作為轉 換單位)的總產量來進行，并以百分比表示該結果。每一輪的篩選后從游
動孢子中洗脫的噬菌體的收率是在10"V。至1(rV。之間，表明所述方法在 篩選與游動孢子結合的噬菌體上是成功的。洗滌步驟后游動孢子是完好 無缺的、球形的，表明在篩選過程期間幾乎沒有出現成嚢。
實施例4:噬菌體純化
-故噬菌體感染的大腸桿菌K91BluKan細胞在20 ml超級肉湯(含有40 mg/ml的四環素)中、37。C、 170rpm下過夜生長。將該培養液在SS34轉 子中以5，000x g離心分離IO分鐘以沉淀該大腸桿菌細胞(含噬菌體)。移 除上清液并將其置于新的圓底旋蓋管中，然后以150 l每ml上清液的比 例加入PEG/NaCl (16.7%聚乙二醇/3.3 M NaCl)以沉積噬菌體。在4 。C下 將噬菌體過夜沉積，然后通過在SS34轉子的50 ml圓底旋蓋管中以 10,000 ipm離心分離20分鐘來沉淀。將沉淀噬菌體再懸浮于1 ml的Tris 緩沖生理鹽水(TBS)中。通過加入150 ml的PEG/NaCl將其再次沉積并 在4 。C下過夜。通過在臺式離心機上的離心分離將噬菌體沉淀并將此沉 淀再懸浮于TBS中。
實施例5: DNA分離、測序和分析
才艮據Smith和Scott的方法(Methods in Enzymology， 217:228- 257, 1993)將用于測序的DNA從單獨的噬菌體克隆中分離。使用ABI Prism 377型自動測序儀(Applied Biosystems， Foster City, Calif.)按照廠商方案對 單鏈DNA從3'端進行測序。用于f8克隆的引物是5'-GGAGCCTTTAATTGTATCGG-3' (SEQ ID NO: 2)。用于f88克隆的引物 是5'-AGT AGC AGA AGC CTG AAG A-3' (SEQ ID NO: 3)。
使用ExPASy分子生物學服務器(網址http:〃www.expasv,ch/)的"翻 譯"程序對DNA序列進行翻譯。使用標準算法(即)FASTA (Lipman and Person, Science, 227:1435-1441, 1985)和BLAST (Altschul et al.， J. Molecular Biol., 215:403-410， 1990)命令對序列與存儲于序列數據庫 (GenBank， EMBL， dbEST， SwissProt， PIR)的核酸和蛋白質序列進行比較。使用ClustalW (Thompson et al., Nuc. Acid Res" 22:4673-4680， 1994)以及 PAM250重量表對肽序列進行比對，并使用TreeView (Page, Computer Applic. Biosci.， 12:357-358, 1996)對觀察樹狀圖。獲得的f8-merDNA序列 編碼19個預期的肽序列(表1)。多數的肽包含預期為強a-螺旋形成者(即 Glu、 Ala和Leu)和a-螺旋破壞者(即Gly和Pro)的氨基酸殘基。盡管缺少 共用基序，ClustalW多序列比對程序用于將類似的肽以樹狀圖的形式簇 集。由匹配的肽構建的樹狀圖表明f8-mer肽序列可分組為6個主要的家 族群，如圖1和表1所示。由f88-4/15 mer文庫挑選的序列如表2所示。
實施例6:成嚢檢測
根據Sm池和Scott的方法分離挑選的噬菌體克隆(Methods in Enzymology, 217:228-257, 1993)，并除了噬菌體再懸浮于蒸餾水中而不是 TBS，如上所述使用聚乙二醇對其進行兩次純化。通過在八269測量吸光 度計算該病毒體的濃度(Smith and Scott, Methods in Enzymology， 217:228-257, 1993)。將包含約400個新釋放的游動孢子的約20 jtd的水滴 與噬菌體培養，該噬菌體經兩倍連續稀釋以便其包含含有肽的噬菌體濃 度為lx1010、 5xl09、 2.5xl()9或1.25xl()9病毒體/i^水滴。陰性對照沒有 得到噬菌體并用于監測在游動孢子種群中自發成嚢的量。室溫下培養20 分鐘后，使用100x放大率的顯微鏡對成嚢的游動孢子的數量進行計數。 根據Smith和Scott (Methods in Enzymology, 217:228-257， 1993)計算噬菌 體的病毒體濃度。
f8肽誘導未成熟包嚢的效力隨著序列家族以及噬菌體濃度而變化(圖 2)。濃度為^101()病毒體//|1(64]1^)時，很多肽的家族對誘導包嚢是有效 的。然而，濃度為2.5乂109病毒體時，在產生高水平成嚢作用(Pc42、 Pc78、 Pc87和Pc64)的肽與產生低水平成嚢作用(Pcl5B、 Pc56和Pc45)的肽間具 有3至5倍的差別。濃度為1.25xl09 (8 /iM)時，所有肽的家族都對誘導 成嚢作用具有最低限度的效力。野生型噬菌體也對辣椒疫霉菌游動孢子 產生成嚢作用；然而，在所有試驗中，由選擇的噬菌體產生成嚢的游動 孢子的部分大于由野生型噬菌體的成嚢的部分2至7倍。辣;f權疫霉菌選 擇的、含肽的噬菌體未成熟地將游動孢子包在嚢內的能力對辣椒疫霉菌
34是特有的。當大豆疫霉菌與寄生疫霉游動孢子與lxl(T病毒體/zil的含肽 噬菌體培養時，幾乎沒有觀察到成嚢，其中所述濃度對辣椒疫霉菌游動 孢子產生幾乎100%的成嚢。對于f88-4 15mer肽得到相似的結果。有代 表性的15mer肽產生未成熟成嚢的能力與f-8克隆Pc87的比較如圖3所 示。
實施例7:結合特異性
比較具有高和低成嚢誘導能力的噬菌體展示肽的結合辣椒疫霉菌游 動孢子的能力。隨機選擇噬菌體克隆Pc87和Pc45作為分別誘導高和低 水平的成嚢作用的代表性克隆(圖2)。引入噬菌體載體作為對照處理。噬 菌體克隆通過大腸桿菌感染擴增并如上所述被純化。對于每個結合反應， 5xl01G TU的噬菌體與200,000的辣椒疫霉菌游動孢子一起培養。如實施 例3中的噬菌體選擇進行結合反應和洗滌。對從游動孢子種群洗脫的噬 菌體在大腸桿菌K91BluKan細胞中進行濃度測定并作為全部轉換單位來 表示。使用類似的過程確定選擇的噬菌體是否與辣椒疫霉菌包嚢結合。
噬菌體載體與克隆Pc45和Pc87不同地結合辣椒疫霉菌游動孢子。 30分鐘的孵育之后，超過107 TU的噬菌體Pc87從游動孢子上被洗脫， 而只有約50,000 TU的噬菌體Pc45或噬菌體載體^M目同條件下被洗脫(圖 4)。此外，結合對游動孢子的階段時特有的少于1(^Pc87TU從包嚢上 被洗脫-在對照載體噬菌體觀察到大約相同的背景結合(圖5)。
實施例8:分泌融合蛋白的構建
通過將合成的寡核苦酸連接至載體pJE-6的限制性內切酶位點， HindIII和Xbal,構建羧基末端的DNA融合來編碼感興趣的肽。質粒載 體pJE-6是由源于質粒pPICZ-alpha (Invitrogen， Carlsbad, Calif.)的尸/c/n'a ; flWo〃's表達構建體pROM-46構建的，如前述(Cregg et al.， Bio/Technology: 11: 905-910， 1993; Rosenfeld, Methods in Enzymology， 306:154-169， 1999)。 質粒pROM-46用限制性內切核酸酶(Hindin)消化，用Klenow酶和dNTP's 補平，用T4DNA連接酶再連接。這些步驟消除了存在于pPICZ-alpha質 粒序列內的HindIII限制性位點，并且質粒^皮指定為pJE-4。通過PCR將在編碼序列3'端的序列突變以采用限制性內切位點HindIII取代終止密碼 子。此質粒指定為pJE-6。編碼代表性的肽(Pc87， ADRPSMSPT, SEQ ID NO: 8)的合成寡核苷酸與用HindIII和Xbal消化的質粒pJE-6連接。此質 粒指定為pJE-7 (圖6)。對pJE-7質粒測序以確定插入，并且結果如圖7 所示。
表1
家族克隆氨基酸序列SEQ ID NO
1Pc56AAPDLQDAM4
2APcl9ADRLNSDAG5
Pc36ADRPSTTSL6
Pc78ADPPRTVST7
Pc87ADRPSMSPT8
PcllADRTSNAST9
2BPc76ADKSYIPSS10
Pc65AVRNPSHHS1
Pc44ADPTPRGHS12
Pc58ADPTRQPHS13
3AP.c45AEHQNSAGP14
Pcl4ADARSAGAIS15
Pc39ADSKNAGPM16
Pc53AETKFSGSA17
Pcl5AADPKGSGVT18
3BPcl5BA饑TSPNDM19
Pc43/PC64ADITDPMGA20
4PC29BAVGTHTPDS21
Pcl2/Pc42AVSPNVHDG22表2
氨M岸歹'廠— ■ SEQIDNO.
如上所述，蛋白質腳手架可設計為在肽轉化入植物時展示所述肽。. 出于說明的目的，細胞分裂素氧化酶(CKX)可用作肽傳輸腳手架。源自玉 米的CKX家族的成員(Moms， 1997)可以，例如，用作傳輸分子。CKX 是內源性地產生的，具有從細胞分泌的肽信號序列，并且在蛋白酶存在 于細胞間區域的情況下被充分糖基化以提供穩定性(Moms et al.， 1999)。
基于已知的CKX的三維結構，如Malito et al., 2004報導，可將CKX 工程化為在暴露的C-末端展示肽。例如，可表達腳手架構建體并從酵母 中將其分泌出。在最初的試驗中，所選肽的抑制能力是顯著的，并獲得 80%至90%的游動孢子成嚢。在水的對照組中，疫霉菌游動孢子成嚢為 250/。或更低(Fangeta1.，2004)。例如，可利用這種構建體產生番茄發根， 并且在這種情況下，發現腳手架蛋白被分泌至根際，其中，腳手架蛋白 在其于根部表面聚集之前在所述根際誘導游動孢子成嚢，因此阻止了感 染。如圖9所示。
除了以上的工作但通過相同技術的擴展，從與疣頂單胞銹菌的夏孢
37
VAAFSLVWATHLMLS 23
LTRCLVSTEMAARRP 24
SAPYLPYFDLLHFPI 25
PSSYEASRRPEHWXF 26
SATDTTLP廳TAIRS 27
TRLSPMESXAMLLAP 28
LLPVSPPFAPNASST 29
MSNFPTSHAPCPVEI 30
EFRXNYPSAAPLIPR 31
PXVHGSIPLTPPLGF 32
LFXCYPPCTYSYCLS 33
MSNFPTSHAPCPVXI 34
PEWKSSWSPCTPRCP 35
AMSRWLRPRE(M/I)NAPP 36
THTTFXVTVXLHEPP 37
MTSPRNSQLIVPFCL 38
PTLGRFNRPSCSIIV 39
APQCHPHLPFDMIHV 40
NHNSLPAQYLVXILR 41
DdPCTPSPDVSFYRS 42
VAAPSHWLKPSLDCF 43
肌YKNPPPRVAMCL 44
LIFRYAPPPLFLRPP 45子牢固結合的組合文庫中選擇15-mer的肽。此真菌用作豆薯層銹菌的替 代物或是經選擇的類似物，其中，接近豆薯層銹菌之處被嚴密控制以 保留此病原體。此篩選鑒別出很多在最初的孢子發芽后抑制生長的肽， 例如，如圖10所示。所述肽在微摩爾級的濃度是有效的。防御肽在 CKX中的發育可使其能夠傳輸至穿入葉子細胞間的真菌菌絲的表面。
實施例9:肽選擇方法學
圖8是表明肽選擇的方案800的方法流程圖。首先，起始的噬菌體 展示肽庫可在步驟802與植物提取物混合以除去與植物蛋白質及其它因 子發生作用的肽。如此除去肽的產物^皮指定為子庫1。
子庫i與發芽的夏孢子或幼體通過公知的生物淘洗技術混合804。
結合的噬菌體展示肽從幼體中回收806。各回收的噬菌體展示肽的濃 度通過大腸桿菌中的擴增808而增加。噬菌體展示肽擴增后回收再生 810并與植物提取物混合812以再次確保除去與植物蛋白質和其它因 子發生作用的肽。如此除去肽的產物被指定為子庫2。
步驟814確定是否以上步驟已進行了足夠的次數以保證選擇候選 植物防御肽的嚴緊性。從子庫2開始，子庫3、 4和5是通過重復步驟 806至步驟812的n次連續反復產生的。在使用生物淘洗的情況下， 每次反復使最新產生的子庫，例如，子庫2，與發芽的夏孢子或幼體 混合。結合的噬菌體展示庫從幼體中回收。每次回收的噬菌體展示肽 的濃度通過在大腸桿菌中擴增而增加。
根據處理過程設計， 一旦所述過程已重復了 n次，可對從子庫n 中(或從任一其它的n個子庫中)隨機選擇的噬菌體克隆測試816其抑 制幼體(即發芽的夏孢子)生長的能力。表現出成功抑制作用的候選肽 可作為將植物防御肽與植物表面蛋白基因(例如CKX)結合的融合基因 構建體而提供818，在中間宿主(例如Pichia)中被擴增820，以及最終用 于轉化822大豆或^H也蠶豆以賦予銹病抗性。
前述方法的具體實施方案可按5個部分來描述，A至E。
部分A涉及通過除去與植物組分發生作用的肽而制備子庫1。將 3.0 g的斑豆葉與7 ml緩沖液(20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA， pH 7.0)混合，然后將此混合物磨碎以提供勻漿。在2ml微管中，將0.9ml該勻 漿與O.l ml 10"噬菌體(f88-4/15-mer)合并以提供總計1013的病毒體。在 約23 。C的室溫下，將所得混合物在軌道式震蕩器(約500 rpm)孵育30分 鐘。使用常規的離心機在高速下將孵育的混合物離心5分鐘。將上清液 回收、保存、然后再次離心。該上清液用于噬菌體擴增。
部分B涉及第一輪的生物淘洗。來自所選病原體約1.5百萬孢子在 20C下、0.01。/。吐溫20和25ppmB-紫羅酮中培養5小時。加入1012 TU 噬菌體。將該混合物分到總體積為3 ml的2個微管中。將包含孢子/噬菌 體混合物的微管在約23 。C的室溫下、在軌道式震蕩器上(約500 rpm)孵 育30分鐘。離心分離孵育的混合物；除去上清液；加入0.5ml的水；以 及將剩余物合并到一個微管中。將合并的物質離心分離；除去上清液； 以及用lml水洗滌該沉淀物。將此上清液去除的離心分離步驟和洗滌重 復10次。將150 |il的洗脫i爰沖液加入包含噬菌體和孢子的所述沉淀物11 中。將所述洗脫緩沖液混合均勻并在室溫下靜置該混合物5分鐘。然后 將該混合物離心分離并保存上清液。將75 pl洗脫緩沖液加入并混合以進 行如前所述的另外的離心分離。合并所有上清液。使用210 ial洗脫緩沖 液進行重復。加入44 pl的1 M Tris-HCl (pH 9.0)以中和洗脫的上清液。 將中和的上清液擴增以產生子庫1。
部分C涉及制備子庫2。使用部分B中第一輪生物淘洗的擴增的子 庫1產生子庫2。其完成是通過使用子庫1而不是部分A中最初的 f88-4/15-mer庫，但在其它方面仿效部分A的方案。
部分D涉及通過使用包括2、 3和4輪的更多生物淘洗輪次產生其他 的子庫。部分B纟皮重復3次
1. 對第2輪生物淘洗，使用來自第2子庫的4.2xlO"TU噬菌體以 產生子庫3;
2. 對第3輪生物淘洗，使用從第2次生物淘洗擴增的5.6xl()UTU 噬菌體以產生子庫4;以及
3. 對第4輪生物淘洗，使用從第3次生物淘洗擴增的5.1xl()HTU 噬菌體以產生子庫5。
將來自第4輪生物淘洗的菌落采集、測序并測試其對幼體生長的抑制。部分E涉及測試對夏孢子生長的抑制。將3 x 1012的30 pl發芽的孢 子(約250)在20 C過夜孵育。評價真菌胚芽管生長(即幼體生長)并與作為 對照的水和f88，即沒有任何展示肽的單獨的噬菌體，進行比較。
實施例10:通過阻止幼體(發芽的孢子)發育抑制疣頂單胞銹菌生長的肽 對病原體疣頂單胞銹菌可重復實施例9的方法學。表3和表4顯示 可用于抑制從這些病原體發芽的夏孢子(幼體)生長的肽。
表3
顯示對疣頂單胞銹菌的生長很強抑制作用的肽
噬菌體肽克隆 序列 序列ID號:
Pp 15 ADPCHMPPRMPPLPI 49
Pp 19 NHVSTLKTRHRLIPF 50
Pp 18 SSNAPPLSYPPIXVP 51
Pp31 TMARPIPTFLPPPSL 52
Pp 6 TVAPTTHRHYVWSMD 53
Pp 16 VFTPMNLSPPFMQPP 54
顯示對疣頂單胞銹菌的生長中等抑制作用的肽:
噬菌體肽克隆序列序列ID號:
Pp55AAGPNIPPPHRASTW55
Pp28AHLYSGASLYRVYRS56
Pp56GPPSILLAIGTLSLT57
Pp50LSSPYACALFVVKGA58
Pp39RGWSVSHHSLLMPVP59
Pp21RSTASPQALNPLVAS60
Pp53SLFFEVSRMLVRIXS61
Pp2SRWWRCVTMTQPCTT62
Pp37WAL證GWSPLRPPG63
實施例11:使用細胞分裂素氧化酶作為蛋白質腳手架以傳輸所選肽至疣 頂單胞銹菌感染豆類(菜豆)組織的部位
將CKX如上述修飾以融合表3和表4中的防御肽。進行土壤桿菌國介導的菜豆的轉化以提供表達每種肽的植物。轉化的植物暴露于疣頂單 胞銹菌中。感染的比例和嚴重程度與對照植物比較以確定防御肽針對病 原體的效力。
實施例12:使用細胞分裂素氧化酶作為蛋白質腳手架以傳輸所選肽至豆 薯層銹菌感染大豆(櫓豆)組織的部位
將CKX如上述修飾以融合表3和表4中的防御肽。進行土壤桿菌-介導的大豆的轉化以提供表達每種肽的植物。轉化的植物暴露于豆薯層 銹菌中。感染的比例和嚴重程度與對照植物比較以確定防御肽針對病原 體的效力。
結論
根據本發明的詳細描述以及上述實施例，可理解，已實現了本發明 的幾個方面。
應理解，通過說明和實施例已詳細描述了本發明，目的是使本領域 其他技術人員熟悉本發明、其原理以及其實際應用。本發明具體的制劑 和方法并不限于提出的具體實施方案的描述，而寧可說是根據所附權利 要求書及其等價物看待這些描述和實施例。當以上的某些實施例和描述 包含某些關于本發明可能起作用的方式的結論時，本發明者并不意欲受 那些結論和作用約束，而僅作為可能的解釋將其提出。
應進一步理解，本發明提出的具體實施方案并不意味著是無遺漏的 或者限制本發明的，而根據前述實施例和詳細描述，其很多替換、修飾 和變化對本領域普通技術人員將是顯而易見的。因此，本發明的意圖是 包括所有那些落在以下權利要求的精神和范疇內的替換、修飾和變化。
41參考文獻
以下文獻以引用的方式并入本文，如同本文將其全部內容公開的程
度一樣
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4權利要求
1. 鑒別對真菌表面有親和力的非免疫球蛋白肽的方法，其包括(a)通過以下構建肽庫，(i)制備隨機寡核苷酸；(ii)將所述寡核苷酸插入適合的載體，所述載體在它的表面表達由所述隨機寡核苷酸編碼的肽并能夠轉染宿主細胞；(iii)用所述載體轉染適合的宿主細胞來擴增感染形式的所述載體以在所述載體表面上產生肽庫；(b)將表達所述肽庫的所述載體與靶真菌接觸并除去未結合的載體；(c)從所述真菌洗脫結合的載體；(d)擴增所述結合的載體；(e)對包含于所述洗脫的載體中的寡核苷酸測序；(f)推導被包含于所述洗脫的載體中的所述寡核苷酸編碼的肽的氨基酸序列；以及(g)選擇非免疫球蛋白肽。
2. 如權利要求1所述的方法， 一次。
3. 如權利要求1所述的方法,
4. 如權利要求1所述的方法， 白的部分而表達。進一步包括重復步驟(b)至(d)至少其中所述載體是融合噬菌體載體。 其中所述肽作為所述載體的外殼蛋
5. 如權利要求1所述的方法，其中所述靶真菌包括疫霉菌屬 (P一op禍ora)的成員。
6. 如權利要求1所述的方法，其中所述靶真菌包括辣椒疫霉菌
7. 如權利要求1所述的方法，其中所述靶真菌包括豆薯層銹菌
8. 如權利要求1所述的方法，其中所述靶真菌包括疣頂單胞銹菌
9. 如權利要求l所述的方法，其中所述靶真菌包括銹病病原體。
10. 重組多核苷酸，其包含編碼植物防御肽的序列，所述肽選自 SEQIDNO:49、 SEQIDNO:50、 SEQIDNO:51、 SEQIDNO:52、 SEQ ID NO: 53 、 SEQ ID NO: 54及其組合。
11. 如權利要求10所述的重組多核苷酸，進一步編碼附于所述植物 防御肽的植物多肽以將植物防御肽提呈至靶病原體。
12. 如權利要求10所述的重組多核苷酸，其中所述植物多肽包括 CKX。
13. 權利要求10所述的重組多核苷酸轉化的細胞。
14. 包含編碼肽的核苷酸序列的重組載體，所述肽選自SEQ ID NO: 55、 SEQ ID NO: 56、 SEQ ID NO: 57、 SEQ ID NO: 58、 SEQ ID NO: 59、 SEQ ID NO: 60、 SEQ ID NO: 61 、 SEQ ID NO: 62、 SEQ ID NO: 63及其組合。
15. 權利要求14所述的重組多核苷酸轉化的植物。
16. 如權利要求14所述的重組多核苷酸，進一步編碼附于所述植物防御肽的植物多肽以提呈所述植物防御肽至靶病原體。
17. 如權利要求18所述的重組多核苷酸，其中所述植物多肽包括CKX。
18. 基于影響真菌發育的能力來篩選肽的方法，其包括(a) 通過以下構建肽庫，(i) 制備隨機寡核苷酸；(ii) 將所述寡核苷酸插入適合的載體，所述載體在其表面表達 由所述隨機寡核苷酸編碼的肽并能夠轉染宿主細胞；(iii) 用所述載體轉染適合的宿主細胞而擴增感染形式的所述 載體以在所述載體上產生肽庫；(b) 將表達所述肽庫的所述載體與靶真菌接觸并除去未結合的載體；(c) 從所述真菌洗脫結合的載體；(d) 擴增所述結合的載體；(e) 分離包含于所述洗脫的載體中的所述寡核苷酸；(f) 產生由包含于所述洗脫的載體中的所述寡核苷酸編碼的肽；.(g) 將所述肽與靶真菌接觸；以及(h) 測定所述肽對所述真菌的影響。
19. 如權利要求18所述的方法，進一步包括至少一次地重復步驟(b) 到d)。
全文摘要
本發明提供了鑒別與真菌表面有親和力的肽的方法，同時也是鑒別能夠影響真菌發育的肽的方法。還提供了包含使用本發明方法鑒別的肽的組合物。此外，提供了能夠表達根據本發明方法鑒別的肽的分離的多核苷酸、載體、表達盒以及轉化的細胞。
文檔編號G01N33/53GK101473226SQ200680036777
公開日2009年7月1日 申請日期2006年8月2日 優先權日2005年8月2日
發明者加里·斯泰希, 弗朗西斯·J·施米特, 方志偉, 詹姆士·T·英格利希 申請人:密蘇里大學管委會