血小板聚集抑制劑組合物的制作方法

文檔序號：6122890閱讀：415來源：國知局

專利名稱：血小板聚集抑制劑組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽，或藥物組合物，例如，包含表達產物(重組多肽)作為活性組分的血小板聚集抑制組合物，所述表達產物由編碼該多肽的多核苷酸表達。本發明進一步涉及對膠原蛋白具有結合能力的多肽，或包含該多肽作為活性組分的藥物組合物。本發明還涉及篩選在藥物化合物中作為活性組分的化合物(例如，激動劑)的方法，所述化合物促進血小板聚集抑制活性。進而，本發明涉及具有血小板聚集抑制活性的新型多肽以及編碼該多肽的多核苷酸。
背景技術：
血小板聚集是由血管內皮細胞的損傷和其他多種因素造成的。當冠狀導管、腦導管、或外周導管被血小板血栓堵塞時，分別導致心肌梗塞，腦梗塞或慢性動脈阻塞。這種血小板活化(刺激聚集)之后血栓病的例子包括動脈硬化，缺血性腦梗塞，包括心肌梗塞和心絞痛的缺血性心臟病，慢性動脈阻塞和靜脈血栓。具有抑制血小板聚集作用的藥物用作帶有上述各種疾病作為并發癥的缺血性疾病的預防藥，以及繼高血壓、肺高壓、腦梗塞、肺梗塞和蛛網膜下腔出血之后的病理狀況的預防藥。此外，上述藥物用于預防經皮腔內冠狀動脈成型術(PTCA)和支架放置后的血栓形成，并還在通過將具有抑制血小板聚集作用的這樣一種藥物施加至支架上或包埋在支架本身中，以封裝所述藥物，從而用作支架放置后再狹窄的預防劑。同時，蚊子用其尖銳的口針刺進皮膚，所述口針在吸血時抵達外周血管，并頻繁重復被稱作探查的刺入和拔出行為，以找到外周血管。據信，蚊子同時分泌唾液，其中含有促進血管舒張使得容易探測到血管的物質。由于上述探查，外周血管通常受損，變成充血。一般而言，血管受損時，暴露出血管內皮下方組織中的膠原，二磷酸腺苷(ADP) 從破損細胞釋放，凝血因子活化形成凝血酶。凝血酶強烈活化血小板，誘導血小板附著、血小板聚集和顆粒釋放，最終通過形成纖維蛋白使血液凝結，形成堅實的血栓(止血機制)。已經知道蚊子的唾液含有抑制這種止血機制的物質(參見非專利文獻1)。蚊子的唾液腺蛋白，經最詳細的研究是腺苷三磷酸雙磷酸酶 (apyrase)。該酶為血小板聚集抑制物質，第一次是在埃及斑蚊(Aedes aegypti)的唾液里得到鑒定。腺苷三磷酸雙磷酸酶抑制血小板聚集，導致從受損血管內皮細胞、紅血球和附著的血小板釋放的ADP降解成 AMP(—磷酸腺苷)，并顯示抗止血作用。為了闡明除蚊子之外各種吸血性昆蟲的吸血行為，似乎有必要分析它們唾液物質的功能。據預測眾多唾液物質參與抑制血小板聚集，例如，已報道來自騷擾錐蝽(Triatoma infestans)的蛋白具有血小板聚集抑制活性(參見專利文獻1和2)。在來自斯氏按蚊(Anopheles stephensi)的唾液腺的蛋白中，已鑒定出具有血液凝結抑制活性的蛋白，但還沒有鑒定出具有血小板聚集抑制活性的蛋白(參見專利文獻3)。此外，已經報道了來自斯氏按蚊唾液腺的cDNA文庫克隆的33種新型蛋白，但該報道并未描述具有血小板聚集抑制活性的蛋白，并且它們中很多的功能尚未知曉(參見非專利文獻2)。本發明人先前報道了從斯氏按蚊唾液腺克隆的、具有富含GE(Gly Glu)序列的蛋白(AAPP)(參見非專利文獻3)。該蛋白具有810個堿基的可讀框(ORF)，并且是28.5kDa的蛋白，據推導由269個氨基酸殘基組成。其后發現該蛋白類似于非專利文獻2公開的30 kDa的抗原 (GenBank檢索號AY226454)，但在非專利文獻2和3中對蛋白的作用和功能(活性)沒有描述。[專利文獻1] JP 2004-121091-A公布[專利文獻2] JP 2004-121086-A公布[專利文獻3] JP 2003-116573-A公布[非專利文獻i] Riberio， J. M.， J. Exp. Biol" 108， 1-7(1984)) [非專利文獻2] Valenzuela, J.G.等，"開發斯氏按蚊的唾液腺轉錄體禾口蛋白體(Exploring the salivary gland transcriptome and proteome of the Anopheles stephensi mosquito)" , Insect Biochemistry[非專禾ll文獻3] Hiroyuki Watanabe等，Medical Entomology and Zoology 55 Suppl.， pp41, 19 (2004)發明內容本發明提供新型藥物組合物，尤其是血小板聚集抑制劑和/或血小板粘附抑制劑。本發明進一步提供包含對膠原具有結合能力的蛋白作為活性組分的新型藥物組合物。本發明還提供篩選物質諸如激動劑的方法，所述篩選方法確定該物質的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性。與本發明人早先報道的對蛋白(AAPP)的研究分開的進一步廣泛研究的結果是，本發明人在斯氏按蚊唾液腺中發現了具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的新型蛋白，成功地分離并鑒定出編碼該蛋白的DNA，并且最新發現該蛋白具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性。本發明提供特征為下列l-14項的發明。第l項.藥物組合物，包含至少一種下列(a)-(d)的多肽作為活性組分(a) 包含SEQIDNO:l的氨基酸序列的多肽；(b) 包含氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽，所述氨基酸序列在上述(a)的氨基酸序列中包含一個或多個氨基酸缺失、插入、取代或添加；(c) 包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽；以及(d) 包含氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽，所述氨基酸序列在上述(c)的氨基酸序列中包含一個或多個氨基酸缺失、插入、取代或添加。第2項.包含表達產物作為活性組分的藥物組合物，所述表達產物由至少一種下列(e)-(j)的多核苷酸表達(e) 包含SEQIDNO:2的DNA序列或其互補序列的多核苷酸；(f) 在嚴格條件下與上述(e)的多核苷酸雜交并能夠表達具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸；(g) 包含與上述(e)的多核苷酸具有80。/。或更高的同源性的DNA序列并能夠表達具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸；(h) 包含SEQIDNO:4的DNA序列或其互補序列的多核苷酸；(i) 在嚴格條件下與上述(h)的多核苷酸雜交并能夠表達具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸；和(j)包含與上述(h)的多核苷酸具有80%或更高的同源性的DNA序列并能夠表達具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸。第3項.根據第1或2項的藥物組合物，其中所述血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性是對由膠原誘導的血小板聚集的抑制活性和/或對血小板粘附至膠原的抑制活性。第4項.根據第1或2項的藥物組合物，其中所述藥物組合物對膠原具有結合能力。第5項.血小板聚集抑制劑和/或血小板粘附抑制劑，其包含第1 項所述的多肽，或第2項所述的由多核苷酸表達的表達產物。第6項.為血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性篩選激動劑的方法，其中第1項所述的多肽的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的水平在對象物質存在或缺乏下測量，并將對象物質存在下的測量值與對象物質缺乏下的測量值比較，以選出增強抑制作用的對象物質作為激動劑。第7項.為血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性篩選激動劑的方法，其中第2項所述的由多核苷酸表達的表達產物的抑制活性的水平在對象物質的存在或缺乏下測量，并將對象物質存在下的測量值與對象物質缺乏下的測量值比較，以選出增強血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的對象物質作為激動劑。第8項.篩選候選物質的方法，所述候選物質激動(agonist)第1項所述的多肽或第2項所述的表達產物的血小板抑制活性和/或血小板粘附抑制活性，所述方法包括下列步驟(l)-(4):(1)制備培養基的步驟，所述培養基包含用表達第1項所述的多肽的表達載體轉化的細胞，或包含第2項所述的表達產物的細胞，和富血小板的血漿；(2) 向上述(l)的培養基添加血小板聚集劑，以在對象物質存在或缺乏下誘導血小板聚集的步驟；(3) 在上述(2)的對象物質存在或缺乏下，測量血小板聚集水平的步驟；和(4) 當對象物質存在下的測量值大于對象物質缺乏下的測量值時，選擇該對象物質作為候選物質的步驟。第9項.為第1項所述的多肽或第2項所述的由多核苷酸表達的表達產物篩選激動劑的試劑盒，特征在于含有富血小板的血漿、第1 項所述的多肽和第2項所述的表達產物中的任一種、以及血小板聚集劑作為組分。第IO項.分離的多肽，包含SEQIDNO:l的氨基酸序列。第ll項.分離的多肽，包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。第12項.分離的多肽，包含SEQIDNO:5的氨基酸序列。第13項.多核苷酸，包含SEQ ID NO:2的DNA序列或其互補序列。第14項.多核苷酸，包含SEQIDNO:4的DNA序列或其互補序列。第15項.多核苷酸，包含SEQ ID NO:6的DNA序列或其互補序列。上述(aHd)的至少一種多肽(蛋白)下文有時稱作"SY-001"。上述 (eKJ)的至少一種多核苷酸的表達產物有時稱作"本發明的表達產物"。附圖簡述

圖1顯示用膠原刺激誘導實施例1， 3(1)生產的SY-001的血小板聚集抑制活性；圖2顯示用膠原刺激誘導實施例1， 3(2)生產的SY-001的血小板聚集抑制活性；圖3顯示實施例1和3生產的SY-001的血小板粘附抑制活性，其在實施例5中抑制血小板粘附至膠原；和圖4顯示實施例1和3生產的SY-001在實施例6中對膠原具有結合能力。最佳實施方式氨基酸、肽、堿基序列和核酸在此的縮寫表示法加入IUPAC-IUB 定義的"對生物命名法的IUPAC-IUB通訊"(IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature) ， Eur. J. Biochem.， 138: 9(1984)，"含堿基序列和氨基酸序列的說明書準備指南(Guideline for preparing specifications comprising base sequences and amino acid sequences)"(專利局)和本領域常用注釋。本文的多核苷酸(DNA分子)不僅包括雙鏈DNA，而且包括單鏈 DNA，含組成它們的有義鏈和反義鏈，并且不限制其長度。因此，編碼SY-001的多核苷酸包括含基因組DNA的雙鏈DNA，以及含cDNA 的單鏈DNA(有義鏈)和具有與有義鏈互補的序列的單鏈DNA(反義鏈)，及合成的其DNA片段，除非另有說明。本文的多核苷酸(DNA分子)不由功能區限定，并可包括表達抑制區、編碼區、前導區、外顯子和內含子中的至少之一。多核苷酸也包括RNA和DNA。含某種氨基酸序列的多肽和含某種DNA序列的多核苷酸包括其片段、同源物、衍生物和突變體。多核苷酸的突變體(突變DNA)包括天然發生的等位基因突變體，非天然發生的突變體，以及具有缺失、取代、添加和插入的突變體。但是，這些突變體編碼的多肽具有與由突變前的多核苷酸編碼的多肽基本相同的功能。多肽的突變(氨基酸序列修飾)不一定通過天然發生的突變發生，例如，突變或翻譯后修飾，并可以是通過利用天然存在的蛋白(例如，SY-001)人工進行的突變。多肽的上述突變包括與突變前的多肽具有至少80%，優選95%和更優選99%同源性的等位基因變體、同源物和天然突變體。多肽或多核苷酸的同源性可以通過利用FASTA程序(Clustal, V., Methods Mol. Biol., 25, 307-318(1994))測量而得以分析。作為同源性分析最優選和簡單的方法，可能例舉這樣的方法其中序列儲存在能夠被計算機讀取的介質上(例如，軟盤，CD-ROM，硬盤驅動，外盤驅動， DVD等)，然后根據公知的檢索步驟，利用存儲的序列檢索已知的序列數據庫。已知的序列數據庫的具體例子包括下列-日本 DNA 數據庫(DNA Database of Japan, DDBJ) (http:〃www.ddb.i .nig.ac.jp/);-Genebank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genebank/Index.htlm);和-歐洲分子生物學實驗室核酸序列數據庫(the European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Seqence Database, EMBL) (http:〃www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html)。同源性分析的眾多檢索算法對本領域技術人員而言是可用的。其一個例子包括稱作BLAST程序的程序。在該程序中有5個BLAST過程。其中三個(BLASTN、 BLASTX和TBLASTX)是設計用于檢査核苷酸序列。剩余兩個設計用來檢査蛋白序列(Coulson， Trends in Biotechnology, 12:76-801:543-559(1997))。此外，其他程序，例如，序列比對程序和鑒定分開更遠的序列的程序在本領域中對分析經鑒定的序列是可用的。突變DNA對由此編碼的氨基酸是沉默的(由突變的核酸序列編碼的氨基酸殘基沒有變化)或保守的。保守氨基酸取代的例子如下所示。原氨基酸殘基保守取代的氨基酸殘基AlaSerArgLysAsnGin或HisAspGluCysSerGinAsnGluAspGlyProHisAsn或GinlieLeu或ValLeulie或ValLysArg， Asn或GluMetLeu或liePheMet, Leu或TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp或PheVallie或Leu一般而言，編碼Cys殘基的一個或多個密碼子影響具體多肽的二硫鍵。通常認為影響蛋白特征的氨基酸殘基的取代包括下列a) 用親水殘基取代疏水殘基，例如，用Ser或Thr取代Leu， lie, Phe， Val或Ala;b) 用Cys或Pro取代除Cys和Pro之外的氨基酸殘基；c) 用負電殘基，例如，Glu或Asp，取代具有正電側鏈的殘基，例如，Lys, Arg或His;和d) 用沒有側鏈的氨基酸殘基，例如，Gly，取代具有極大側鏈的氨基酸殘基，例如，Phe。(1) SY-001SY-001包含SEQ IDNO:l或3的氨基酸序列，或在SEQ IDNO:l或3的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列，并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性，其抑制血小板對膠原的粘附和/或對膠原的結合能力。SY-001可以是通過基因重組技術，利用大腸桿菌(Escherichiacoli) 的蛋白表達系統或利用下文所述實施例所示的桿狀病毒(AcNPV)的蛋白表達系統表達的多肽，或通過化學合成獲得的多肽。作為SY-001的氨基酸序列的一個具體例子，可以列舉SEQ ID NO:l或3中的一個。SY-001的氨基酸序列不限于SEQ ID NO:l或3 之一，而且可以是那些與其具有一定同源性的氨基酸序列(同源氨基酸序列)。同源氨基酸序列可以包括這樣的多肽其含有在SEQ IDN0:1 或3的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列，并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性，該多肽抑制血小板對膠原的粘附和/或對膠原的結合能力。SY-001具有的血小板聚集抑制活性包括抑制或阻斷其中誘導血小板聚集的物質在人類血管(尤其在冠狀動脈，主動脈和腦動脈)中增加或在血管中血小板的聚集能力被易化的病癥的作用，或者抑制或阻斷血管中已發生損傷和血小板在受損部位過分聚集的病癥的作用。在體外試驗中，向富血小板的血漿(PRP)添加SY-OOl，通過抑制所述血漿中的血小板聚集劑所誘導的血小板聚集，可檢測血小板聚集抑制活性。更具體而言，SY-001的血小板聚集抑制活性可經下列方法確定。即，首先，通過離心從人類全血制備PRP。隨后，該制備的PRP與溶液，例如含有SY-001的PBS溶液預溫育，并向該溶液進一步加入血小板聚集劑以聚集血小板。血小板聚集劑的例子包括ADP(二磷酸腺苷)，膠原，CRP(膠原相關肽)，convulxin， TRAP(凝血酶受體活化肽)，腎上腺素，花生四烯酸，U-46619(血栓垸A2類似物，TXA2類似物)和 A23187(鈣離子載體)。所得溶液的血小板聚集率利用濁度透光率血小板聚集儀(aggregoter)(MCM HEMA TRACER 313M:由MC Medical提供) 測量，而且SY-001的血小板聚集抑制率基于不含SY-001的對照值，從得到的測量值計算。因此，能夠檢測SY-001的血小板聚集抑制活性。SY-001的血小板粘附抑制活性也可由下列方法確定。將含有給定濃度的SY-001的PBS溶液添加到包被有膠原溶液的 96孔板中，并在室溫下溫育30分鐘。溫育后，孔中加入血小板懸浮液，并在室溫下溫育45分鐘。溫育后，用吸液管從孔中取出溫育溶液，用 PBS洗孔。孔中加入含有1%SDS的PBS溶液，搖動和攪動后孔被風干。然后，孔中加入蒸餾水，利用DC蛋白分析試劑盒(BIO-RAD Laboratories) 測量各孔中的蛋白量。SY-001的血小板粘附抑制活性率基于不含 SY-001的對照值，從得到的測量值計算，并從血小板粘附曲線計算 SY-001的血小板粘附抑制活性。因此，可檢測SY-001抑制血小板對膠原的粘附的血小板粘附抑制活性。SY-001的膠原結合能力也可通過下述方法確定。300 pl封閉溶液添加至涂布膠原或未涂布膠原的各96孔板，并溫育1小時。從各孔除去溫育溶液，100 pl含有給定濃度的SY-001的溶液加到各孔中，并在室溫下溫育1小時。從各孔除去溫育溶液之后，則向各孔加入200 ^的2%蔗糖，并在室溫下溫育5分鐘。從各孔除去溫育溶液之后，干燥孔，向各孔加入100 pl重構的Ni-HRP溶液(KPP: Kirkegaard & Perry Laborator, Ltd.)，并在室溫下溫育30分鐘。以洗滌緩沖液洗滌后，向各孔加入100 )ilABTS過氧化物酶底物(KPL Ltd.), 并輕輕搖動96孔板。反應完成之后，向各孔添加100pl的l。/。SDS，然后用微量培養板讀數儀，以405-410nm處的吸光度變化，對孔進行測量。給定濃度的SY-001的膠原結合能力基于不含SY-001的對照載體的值，從所得的OD值計算，并從其膠原結合曲線計算SY-OOl的膠原結合能力。因此，可檢測SY-001的膠原結合能力。SY-001的抗血小板活性也可通過下述方法確定。即，從全血制備 PRP，所述全血是用帶有抗凝劑的注射器從健康供體采集血樣后通過離心獲得的。接著，制備的PRP以合適的緩沖液稀釋，例如，Tyrode-Hepes (134 mM NaCl， 0.34 mM Na2HP04， 2.9 mM KC1， 12 mM NaHC03 ， 20 mM Hepes, 5 mM glucose, 1 mM MgCl2, pH 7.3)，向該系列稀釋液加入給定濃度的SY-OOl，并預溫育。向該溶液加入熒光標記的抗P選凝素(selectin)抗體、識別 PAC-l(GPIIb/GPIIIa復合體)的抗體(由Becton Dickinson提供)、纖維蛋白原和膜聯蛋白(annexin) V，隨后加入血小板聚集劑，例如，ADP、膠原或TRAP，以活化血小板。因此，活化的血小板的熒光強度通過流式細胞儀測量，以評價SY-001對血小板活化的活性(對活化的抑制活性)。這種對血小板活化的抑制活性是血小板活化抑制活性。在上述方法中，如果利用識別血小板和白細胞的熒光標記抗體，則還有可能評價化合物對血小板和白細胞的相互作用(血小板一白細胞粘附)的影響。利用濁度透光率血小板聚集儀，測量SY-001對血小板聚集的抑制活性，對該方法的細節，本發明參照，例如，Born， G.V.R.， "Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal(通過二磷酸腺苷的血小板聚集及其逆轉)"，Nature, 1962, 194， 927-9和Sudo， T.等, "Potent effects of novel anti-platelet aggregatory cilostamide analogues on recombinant cyclic nucleotide phosphodiesterase isozyme activity(新型抗血小板聚集西洛酰胺類似物對重組環核苷酸磷酸二酯酶同工酶活性的有效影響)",Biochem. Pharmacol" 2000， 59, 347-56。對血小板活化的測量而言，本發明還參照，例如，Ito， H.等,"Cilostazol inhibits platelet-leukocyte interaction by suppression of platelet activation(西洛他唑通過抑制血小板活化而抑制血小板一白細胞相互作用)"，Platelets, 2004, 15， 293-301。所以，對血小板聚集具有抑制活性和/或對血小板粘附具有抑制活性的SY-001 ，通過作用于哺乳動物的血液和血管以抑制或預防血栓或栓子形成，具有作為治療劑的可能性，用于血液相關疾病及其并發癥的出現或預防。因而，對血小板聚集具有抑制活性和/或對血小板粘附具有抑制活性的SY-OOl，具有被認為可用作治療劑或預防劑的可能性，用于繼發于血栓或栓子形成引起的疾病及其并發癥的病理狀況，所述疾病及其并發癥例如，心肌梗塞，腦栓塞，慢性動脈阻塞，動脈硬化，缺血性腦梗塞，心絞痛，靜脈血栓癥，高血壓，肺高壓，腦梗塞，肺梗塞，心衰，腎炎，腎衰，和蛛網膜下腔出血。對血小板聚集具有抑制活性和/或對血小板粘附具有抑制活性的SY-OOl，還被被認為有一種可能性，用于預防PTCA和支架放置后的血栓形成，以及通過在支架上施加或在支架本身內包埋而包入含有SY-001的藥物，用作支架放置后再狹窄的預防劑。修飾的程度和位置，即上述(b)和(d)所示的SY-001中氨基酸殘基的"缺失，插入，取代或添加"不受特別限制，只要包含修飾的氨基酸序列的多肽(等同物)與包含SEQ ID NO:l或3的氨基酸序列的多肽基本上具有相同的活性。優選的是，上述修飾通常在約1至幾個氨基酸殘基處進行。在本發明中，"多個氨基酸的缺失，插入，取代或添加"是指2 個以上和20個以下的氨基酸已被缺失、插入、取代或添加。多個氨基酸優選2個以上和IO個以下，更優選2個以上和7個以下，還更優選 2個以上和5個以下。該修飾的氨基酸序列與SEQ ID NO:l或3的任一氨基酸序列具有，例如，約70%以上，優選約80%以上，更優選約95% 以上，還更優選約98%以上的同源性。本發明藥物組合物中活性組分的多肽(SY-001)的具體例子如下文所述的實施例所示。SY-001具有固有的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性。SY-001還具有固有的膠原結合能力。所以，含有SY-001作為活性組分的本發明藥物組合物可用作治療劑或預防劑，用于由血栓或栓子形成引起的疾病及其并發癥之后的病理狀態，所述疾病及其并發癥例如，急性冠脈綜合征，心肌梗塞，腦栓塞，慢性動脈阻塞，動脈硬化，缺血性腦梗塞，心絞痛，靜脈血栓癥，高血壓，肺高壓，腦梗塞，肺梗塞，心衰，腎炎，腎衰，和蛛網膜下腔出血。本發明的藥物組合物還可用于預防PTCA和支架放置后的血栓形成，以及通過在支架本身上施加該藥物組合物，用作支架放置后再狹窄的預防劑。(2)編碼SY-001的多核苷酸(DNA分子)編碼SY-001的多核苷酸(有時稱作"SY-001的DNA分子")的一個具體例子包括的多核苷酸(DNA分子)含有SEQ ID NO:2或4的DNA序列或其互補序列。SY-001的DNA分子的另一個例子包括的多核苷酸，其在嚴格條件下與包含SEQ ID NO:2或4的DNA序列的互補序列的多核苷酸雜交，并能夠表達具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽。這里的"嚴格條件"可包括的條件，其中雜交發生在50°C下含有 0.1% SDS的2XSSC中，并通過60°C下在含有0.1% SDS的1XSSC中洗滌而不分離。此外，SY-001的DNA分子(多核苷酸)的另一個例子包括的多核苷酸包含這樣的DNA序列，該DNA序列與包含SEQ ID NO:2或4的DNA序列或其互補序列的多核苷酸中最密切相關的一個具有80%以上，優選95%以上，更優選約98%以上的同源性，并能夠表達具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽。對于能夠表達具有期望作用的其他實施例所示的多肽的DNA分子(有時稱作修飾的DNA分子)而言，基本的要求是，由DNA分子編碼的氨基酸序列多肽能表達血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性(尤其是，由膠原誘導的對血小板聚集的抑制活性和/或對血小板粘附至膠原的抑制活性)。換言之，條件是，用已插入多核苷酸(修飾的DNA 分子)的重組表達載體轉化的轉化體能夠表達具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的蛋白作為其表達產物。上述修飾的DNA分子包括這樣的DNA分子，該DNA分子包括編碼SEQ ID NO:l或3的氨基酸序列、尤其是具有一個或多個氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列(修飾的氨基酸序列)的DNA序列，以及編碼其互補序列的DNA序列。該修飾的DNA可以是利用它檢測修飾前本發明DNA分子的那些。與SY-001的DNA分子中所含的多核苷酸(SY-001的DNA或其片段)同源并包含SEQ ID NO:2或4的DNA序列的DNA分子，意味著一系列相關的DNA分子，其與SEQ ID NO:2或4的DNA序列具有序列同源性，并通過它們的結構特征被認作一個DNA分子家族，且它們的表達模式具有共性，以及它們的生物功能具有相似性。這種同源DNA分子可以是那些基于天然存在的DNA分子人工制備的(例如，SY-001的DNA片段)。該人工步驟的例子包括基因工程技術，諸如位點特異性突變[Methods in Enzymology, 154, 350， 367-382(1987); 同上，100， 468(1983) ; Nucleic Acids Res., 12, 9441(1984)); "Zoku Seikagaku Jikken Kouza 1"，由日本生化協會編輯(the Japanese Biochemical Society)的('Idenshi Kenkyuho II，， , pi05 (1986)]，化學合成步驟，諸如磷酸三酯法和亞磷酰胺法[J. Am. Chem. Soc.， 89， 4801(1967);同上，91, 3350(1969); Science, 150, 178(1968); Tetrahedron Lett.， 22， 1859(1981);同上，24， 245(1983)]及其組合。更具體而言，DNA分子也可通過亞磷酰胺法或磷酸三酯法合成，并且也可利用市售的全自動寡核苷酸合成儀合成。通過合成互補鏈并用化學合成的單鏈在合適條件下使該互補鏈退火，或利用DNA聚合酶以合適的引物將互補鏈加至化學合成的單鏈，可獲得雙鏈片段。SEQ ID NO:2或4的DNA序列作為SY-001的DNA分子的一個具體實施方式
，是編碼多肽的氨基酸殘基的密碼子的一個組合例子，所述多肽包含SEQ ID NO:l或3的氨基酸序列。SY-001的DNA分子不限于帶有這種特殊DNA序列的DNA分子，并能夠具有任選密碼子的組合和為各氨基酸殘基選定的DNA序列。密碼子可根據標準方法選擇。此時，可考慮密碼子在所用宿主中的使用頻率[Nucleic Acids Res.， 9， 43(1981)]。(3) SY-001的DNA分子的生產基于在此公開的編碼SY-001的多核苷酸的核酸序列信息進行合成，或在SY-001的氨基酸序列信息的基礎上直接合成對應編碼氨基酸序列的核酸序列的DNA分子(化學DNA合成)，可容易地生產和獲得 SY-001的DNA分子。通用基因工程技術可適用于該生產[例如，參見分子克隆第2版(Molecular Cloning 2d Ed)， Cold Spring Harbor Lab. Press(1989);日本生化協會編輯的"Zoku Seikagaku Jikken Kouza 1 "， "Idenshi Kenkyuho II" (1986)]。作為直接合成SY-001的DNA分子的化學DNA合成方法，可舉例說明的是通過亞磷酰胺法的固相合成方法。全自動合成儀可用于該合成法。通過基因工程技術生產SY-001的DNA分子可以更特定地實施，方法是根據標準方法，通過從已表達SY-001的DNA分子的合適來源制備cDNA文庫，并利用對SY-001的DNA分子特異的合適探針或抗體，從該文庫選擇所需的克隆[Proc. Natl. Acad. Sci.， USA., 78, 6613(1981); Science, 222， 778 (1983)]。在上文中，作為cDNA來源，可舉例說明的是表達SY-001的DNA 分子的各種細胞和組織以及從中衍生的培養細胞。具體而言，希望的是使刺客蟲斯氏按蚊的唾液腺成為來源。從來源提取和分離總RNA，分離和純化mRNA，以及獲得和克隆cDNA全部可根據標準方法實施。利用通過提取、分離和純化唾液腺mRNA獲得的斯氏按蚊的唾液腺cDNA文庫，可生產SY-001的DNA分子。除此之外，利用通過提取上述唾液腺mRNA，向RNA添加poly A，然后收集帶poly A的RNA，用反轉錄酶生產cDNA，并且隨后在cDNA兩端添加限制性酶位點，所述cDNA摻入噬菌體中制備噬菌體文庫，利用該噬菌體文庫也可生產 SY-001的DNA分子。從cDNA文庫篩選SY-001的DNA分子的方法不受特別限制，并可根據標準方法進行。作為具體方法，可舉例說明的是其中利用對 cDNA生產的蛋白特異的抗體(例如，抗一斯氏按蚊唾液抗體)，經免疫篩選選擇對應的cDNA克隆的方法；利用選擇性結合至目的DNA序列的探針的噬斑雜交方法；集落雜交方法；及其組合。上述各雜交方法中所用的探針通常是基于SY-001的DNA分子的 DNA序列信息而化學合成的DNA片段。已經獲得的SY-001的DNA 分子及其片段可有利地用作上述探針。而且，基于SY-001的DNA分子的DNA序列信息所獲得的有義引物和反義引物也可用作上述篩選的探針。用作探針的DNA(核苷酸)是對應SY-001的DNA序列的部分 DNA(核苷酸)，并包括至少15個連續DNA，優選至少20個連續DNA，和更優選至少30個連續DNA。用于上述生產本發明DNA分子的陽性克隆自身可用作探針。當獲得SY-001的DNA分子時，可適當利用通過PCR的DNA/RNA 的擴增方法[Science, 230， 1350(1985)]。具體而言，當難以從文庫中獲得全長cDNA時，可合適地采用RACE法[快速擴增cDNA末端(Rapid amplification of cDNA ends); Jikken Igaku， 12(6)， 35(1994)]，尤其是5，-RACE法[M. A. Frohman等，Proc. Natl. Acad. Sci., USA.， 8， 8998(1988)]。用于PCR方法的引物可任選基于后文實施例所述的SY-001的 DNA分子的序列信息而設計，并根據標準方法合成。作為該引物，還可能利用在載體質粒的cDNA兩端添加的DNA部分(SP6啟動子引物和 T7終止子引物)，所述載體質粒中已如后文實施例所述摻入了 SY-001 的cDNA。經PCR方法擴增的DNA/RNA片段可根據標準方法，例如凝膠電泳方法，而分離和純化。如上所述獲得的SY-001的DNA分子及其各種DNA片段可根據標準方法，例如二脫氧法[Proc. Natl. Acad. Sci.， USA., 74， 5463(1977)] 或Maxam-Gilbert法[Methods in Enzymology, 65， 499(1980)]，或簡單利用可商購的測序試劑盒而進行測序。(4)基因工程生產本發明的表達產物根據普通的基因工程技術[例如，Science, 224， 1431(1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130， 692(1985); Proc. Natl. Acad. Sci" USA., 80， 5990(1983)]，利用SY-001的DNA分子的序列信息，本發明的表達產物(重組SY-001)作為該DNA分子的表達產物或含該表達產物的蛋白，可容易和穩定地大量生產。更具體而言，通過制備能夠在宿主細胞中表達編碼所需蛋白的重組DNA(表達載體)，用該載體轉化宿主細胞以獲得轉化體，培養轉化體并從所得培養物中收集目的蛋白，能夠獲得本發明的表達產物。在本發明表達產物的生產中，任何原核生物和真核生物可用作宿主細胞。例如，作為宿主的原核生物可以是大腸桿菌(Escheridiiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtms)等常用生物中任一種，適當的是大腸桿菌，尤其可用大腸桿菌K12菌株。真核生物的宿主細胞包括來自脊椎動物和酵母的細胞。前者的合適例子包括猴子COS細胞[Cdl， 23: 175(1981)]、中國倉鼠卵巢細胞及其二氫葉酸還原酶缺失系[Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216(1980)]，而后者的合適例子包括屬于酵母菌 (Saccharomyces)屬的酵母細胞。當然，宿主細胞并不限于此。當原核細胞用作宿主時，利用能夠在宿主細胞中復制的載體，可能的是合適利用下述表達質粒，該質粒的獲得是在本發明的基因上游處摻入起始蛋白合成所需的啟動子、SD(Shain和Dalgarano)和起始密碼子(例如，ATG)，從而能在該載體中表達所述基因。作為上述載體，通常利用的質粒是例如衍生自大腸桿菌pET-16b， pET-32， pBR322， pBR325， pUC12和pUC13。不受限于此，可利用公知的多種載體。利用大腸桿菌用于表達系統的可商購載體的例子包括 pGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech), pMAL-C2， pMAL-P2(New England Biolabs), pET-16, pET-32, pET-21, pET-21/lacq(Invitrogen)和 pB AD/His(Invitrogen)。當脊椎動物細胞用作宿主時，表達載體包括位于待表達的本發明基因上游具有啟動子、RNA的剪接位點、多腺苷酸化位點和轉錄終止序列的那些。如果需要，這些載體可進一步具有復制起點。具體而言，表達載體的例子包括具有SV40早期啟動子的pSV2dhfr [Mol. Cell. Biol.， 1: 854(1981)]。除上述之外，可利用可商購的多種公知載體。利用動物細胞用作表達系統的可商購載體的例子包括用于動物細胞的載體，諸如pEGFP隱N, pEGFP-C (Clontreeh)， pIND (Invitrogen)禾口 pcDNA3.1/His (Invitrogen)，以及用于昆蟲細胞的載體，諸如pFastBac HT (GibciBRL), pAcGHLT (PharMingen), pAc5/V5-His, pMT/V5-ffis和 pMT/Bip/V5-His (Invitrogen)。作為昆蟲細胞載體，可能的是舉例說明其中已摻入SY-001的 cDNA的桿狀病毒載體(Takara)。具體而言，本發明的表達產物可通過將其中已摻入SY-001的cDNA的桿狀病毒表達載體導入培養的細胞 BmN4或蠶(Bombyxmori)的幼蟲中，利用蠶的核型多角體病毒(BmNPV) 表達，并經色譜從培養基或蠶的體液分離而獲得。本發明的表達產物也可通過將SY-001的cDNA摻入到苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica)的核型多角體病毒(AcNPV)中，在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9細胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的Tn5細胞中表達，并且同樣經色譜從培養物的上清液純化而獲得。當酵母細胞用作宿主時，表達載體的具體例子包括帶有酸性磷酸酶基因啟動子的pAM82 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA.， 80: 1(1983)]載體。用于酵母細胞的可商購表達載體的例子包括pPICZ (Invitrogen)禾口 pPICZa (Invitrogen)。啟動子不特別受限。當屬于埃希氏菌屬(Escherichia ge皿s)的細菌用作宿主時，可優選利用色氨酸(trp)啟動子，lpp啟動子，lac啟動子， recA啟動子和PL/PR啟動子。當宿主屬于芽孢桿菌時，優選SP01啟動子，SP02啟動子，penP啟動子等。當酵母用作宿主時，利用pH05 啟動子，PGK啟動子，GAP啟動子，ADH啟動子等可能是合適的。當動物細胞用作宿主時，優選的啟動子是衍生自SV40的啟動子，逆轉錄酶病毒啟動子，金屬硫蛋白啟動子，熱休克啟動子，巨細胞病毒啟動子， SRa啟動子等。當昆蟲細胞用作宿主時，可例舉p10桿狀病毒啟動子，多角體蛋白啟動子等。作為SY-001的DNA分子的表達載體，優選可利用融合蛋白的表達載體。載體的具體例子包括pGEX(Promega)，用于表達成與谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)—起的融合蛋白。作為對應成熟多肽的編碼序列的多核苷酸序列，其幫助多肽從宿主細胞的表達和分泌，可舉例說明的是分泌序列和前導序列。這些序列包括標記序列(六組氨酸標記，組氨酸標記)，例如動物細胞情形下的血凝素標記，用于純化細菌宿主中的融合成熟多肽。將所需的重組DNA(表達載體)導入宿主細胞的方法，以及以此轉化的方法不受特別限制，并可利用多種通用方法。所得的轉化體可根據標準方法培養，并且通過培養，在胞內或胞外或在轉化體的細胞膜上表達和生產(累積和分泌)按需設計的由SY-001的DNA分子編碼的目的蛋白(表達產物)。作為用于培養的培養基，可任選不同的常用培養基。在適合宿主細胞生長的條件下，也可進行培養。以此方式獲得的本發明的表達產物(重組蛋白)，可通過多種分離操作[參見，Biochemistry Data Book II，第1175-1259頁，第1版，第1次印刷，Tokyo Kagaku Dojin于1980年6月23日出版；Biochemistry, 25(25)， 8274(1986); Eur. J. Biochem., 163, 313(1987)]，利用其所需的物理和化學性質，而分離和純化。這類方法具體包括通常的重排處理，蛋白沉淀劑處理(鹽析)，離心，滲壓震擾，超聲處理，超濾，多種液體層析，諸如分子篩層析(凝膠過濾)、吸收層析、離子交換層析、親和層析和高效液相色譜(HPLC)，透析及其組合。特別優選的方法包括利用己結合了 SY-001特異性抗體的柱的親和層析。當設計編碼SY-001的多核苷酸時，可利用SEQ ID NO:2的SY-001 的DNA分子的DNA序列。在該序列中，還可按需任意選擇、改變和利用各氨基酸殘基的密碼子。在SY-001的氨基酸序列中，當部分氨基酸殘基或氨基酸序列通過取代、插入、缺失或添加而修飾時，可采用多種方法，諸如上述位點特異性突變。(5)本發明藥物組合物活性組分的本發明表達產物本發明的表達產物(以及用于本發明篩選方法的相同表達產物)，是本發明藥物組合物的活性組分，可通過上述(4)所示的基因工程技術獲得。本發明表達產物對血小板聚集的抑制活性與上文(l)所述的對 SY-001的血小板聚集抑制活性的定義相同。該抑制活性可根據公知的血小板聚集測試法而確定，例如利用濁度透光率血小板聚集儀，通過富血小板血漿(PRP)的聚集測定法。更具體而言，利用濁度透光率血小板聚集儀，在存在或缺乏SY-001 下，向人血制備的PRP中加入血小板聚集劑，測量血小板聚集水平，并從其血小板聚集曲線計算SY-001的血小板聚集抑制率，從而確定和評價本發明表達產物對血小板聚集的血小板聚集抑制活性。本發明的表達產物對血小板粘附的抑制活性與上文(l)所述的對 SY-001的血小板粘附抑制活性(即，抑制血小板對膠原的粘附)的定義相同。根據公知的血小板粘附至膠原的測試法，例如利用Dc蛋白分析試劑盒(BIO-RAD Laboratories),通過血小板粘附至膠原的測定法，能夠確定該抑制活性。更具體而言，利用Dc蛋白分析試劑盒，在存在或缺乏SY-001下，通過加入人血制備的血小板懸浮液，測量血小板與膠原的粘附水平，并從其血小板粘附曲線計算SY-001的血小板粘附抑制活性，能夠確定和評價本發明的表達產物對血小板粘附至膠原的血小板粘附抑制活性。本發明的表達產物對膠原結合的膠原結合能力與上文(l)所述的對SY-001的膠原結合能力(S卩，SY-OOl與膠原結合)的定義相同。根據公知的膠原結合的測試法，例如利用微量培養板讀數儀在405-410 nm處的吸光度變化，通過膠原結合能力的測定方法，能夠確定該膠原結合能力。更具體而言，利用微量培養板讀數儀在405-410 nm處的吸光度變化，在存在或缺乏膠原下，通過加入給定濃度的SY-001 ，測量SY-001 的膠原結合能力的水平，并從其膠原結合曲線計算SY-001的膠原結合能力，能夠確定和評價本發明的表達產物對膠原結合的膠原結合能力。本發明的組合物基于包含本發明表達產物作為活性組分，通過本發明表達產物對血小板聚集和/或血小板粘附的抑制活性，可用作由血栓或栓子形成引起的疾病及其并發癥之后的病理狀況，所述疾病及其并發癥例如，急性冠脈綜合征，心肌梗塞，腦栓塞，慢性動脈阻塞，動脈硬化，缺血性腦梗塞，心絞痛，靜脈血栓癥，高血壓，肺高壓，腦梗塞，肺梗塞，心衰，腎炎，腎衰，和蛛網膜下腔出血的治療劑或預防劑。本發明的組合物用于預防PTCA和支架放置后的血栓形成，以及通過在支架上施加該藥物組合物或在支架自身中包埋該藥物組合物從而包入該藥物組合物，用作支架放置后再狹窄的預防劑。(6)作為本發明藥物組合物活性組分的SY-001的化學合成作為本發明藥物組合物的活性組分，多肽(SY-001)也可根據SEQ IDNO:l或3的氨基酸序列信息，通過通用的化學方法生產。所述方法包括通過常用液相方法或固相方法的肽合成方法。肽合成方法包括所謂的逐步延長方法，其中各氨基酸順序合成，并一個接一個結合以延長鏈，還有片段縮合方法，其中合成包含幾個氨基酸的片段，然后連接各個片段。SY-001可由任兩者之一合成。肽合成采用的縮合方法也可根據標準方法進行。標準方法的例子包括疊氮化物方法，混合酸脫水方法，DCC方法，活性酯方法，氧化和還原方法，DPPA(二苯基磷酰基疊氮化物)方法，DDC+加成(l-羥基苯并三唑，N-羥基琥珀酰胺，N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二羧基亞酰胺)方法和Woodward方法。在上述肽合成反應之后，未參與反應的氨基酸或肽的羧基通常可通過酯化作用作為低級烷基酯，諸如甲酯、乙酯和叔丁酯，以及芳烷基酯，諸如節酯、對甲氧基芐酯和對硝基芐酯被保護。氨基酸，諸如在側鏈帶有官能團的酪氨酸殘基，其羥基可以用乙酰基、芐基、芐氧基羰基或叔丁基保護，但并不一定總是要保護。此外，例如，精氨酸殘基的胍基可以用合適的保護基保護，諸如硝基，甲苯磺酰基，對甲氧基苯磺酰基，亞甲基-2-磺酰基，芐氧基羰基，異冰片基氧基羰基，或金剛烷基氧基羰基。作為最終獲得的本發明藥物組合物的活性組分，帶有保護基的氨基酸、肽和多肽中的這些保護基的脫保護反應可根據常用方法進行，諸如接觸還原法，以及利用液氨/鈉，氟化氫，溴化氫，氯化氫，三氟乙酸，乙酸，甲酸，甲磺酸等的方法。以此方式獲得的SY-001，作為本發明藥物組合物的活性組分，可任選根據多種方法純化，諸如利用離子交換樹脂、分配層析和凝膠層析的方法，以及肽化學領域中常用的逆流分布法。(7)本發明的藥物組合物對本發明的藥物組合物而言，重要的是含有SY-001或本發明的表達產物作為活性組分。所述藥物組合物可用作藥物組合物，尤其是用作血小板聚集抑制劑，用于抑制或阻斷誘導血小板聚集的物質在人血管(尤其在冠狀動脈，大動脈和腦動脈)中增加或者血小板的聚集能力在血管中得以促進的狀況，或者血管中已發生損傷并且血小板在受損部位過分聚集的狀況。所述藥物組合物還尤其可用作血小板粘附抑制劑，用于抑制或阻斷血小板與作為聚集劑的物質的粘附，所述作為聚集劑的物質諸如膠原，其中誘導與人血管(尤其是冠狀動脈，大動脈和腦動脈)中的血小板粘附的物質或血小板的粘附能力在血管中得以促進，或者用于抑制或阻斷其中血管中已發生損傷并且血小板在受損部位過分聚集的狀況。本發明的藥物組合物可用作治療劑或預防劑，通過利用其對血小板聚集和/或血小板粘附的抑制活性，用于繼血栓或栓子形成引起的疾病及其并發癥之后的病理狀態，所述疾病及其并發癥例如，急性冠脈綜合征，心肌梗塞，腦栓塞，慢性動脈阻塞，動脈硬化，缺血性腦梗塞，心絞痛，靜脈血栓癥，高血壓，肺高壓，腦梗塞，肺梗塞，心衰，腎炎，腎衰，和蛛網膜下腔出血。鑒于SY-001預計對血小板聚集和/或血小板粘附的抑制活性，該藥物組合物可用于預防PTCA和支架放置后的血栓形成，以及通過在支架上施加或包埋于支架自身從而包入該藥物組合物，用于預防支架放置后的再狹窄。SY-001或本發明的表達產物，作為本發明藥物組合物中的活性組分，對血小板聚集和/或血小板粘附具有抑制活性，并通過利用該作用或活性，可用于與靶細胞或組織中的血小板聚集和/或血小板粘附有關的疾病的程序。受這種血小板聚集和/或血小板粘附影響的靶細胞的例子可包括血細胞和血小板。含這些細胞的組織的例子可包括冠狀動脈血管，腦動脈血管，頸動脈血管，動脈血管，靜脈血管，外周動脈血管，外周靜脈血管，腎動脈血管和肝動脈血管。根據本發明藥物組合物具有的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性或抑制靶細胞中血小板聚集的作用和/或抑制血小板粘附的作用，可治療或預防繼血栓或栓子形成引起的疾病及其并發癥之后的病理狀態，所述疾病及其并發癥例如，心肌梗塞，腦栓塞，慢性動脈阻塞，動脈硬化，缺血性腦梗塞，心絞痛，靜脈血栓癥，高血壓，肺高壓，腦梗塞，肺梗塞，心衰，腎炎，腎衰，和蛛網膜下腔出血。根據SY-001對血小板聚集和/或血小板粘附的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性，可預防PTCA和支架放置后的血栓形成，以及通過在支架上施加或包埋于支架自身從而包入它，預防支架放置后的再狹窄。用于預防支架放置后的再狹窄的本發明藥物組合物可用作環糊精包合物(clathrate)。也可通過在作為支架材料的生物可降解樹脂上施加(厚涂或噴霧)或在包埋在支架自身中，利用本發明的藥物組合物。作為本發明藥物組合物活性組分的SY-001或表達產物，也包括其可藥用的鹽。這種鹽的例子包括無毒的堿金屬鹽諸如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋇和銨，堿土金屬鹽和銨鹽。這些鹽可依據標準方法生產。上述鹽還包括通過SY-001或本發明的表達產物與合適的有機酸或無機酸反應獲得的無毒的酸加成鹽。代表性的無毒酸加成鹽的例子包括鹽酸鹽，氫溴酸鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽，乙酸鹽，草酸鹽，戊酸鹽，油酸鹽，月硅酸鹽，硼酸鹽，苯甲酸鹽，乳酸鹽，蘋果酸鹽，對-甲苯磺酸鹽(甲苯磺酸鹽)，檸檬酸鹽，富馬酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，磺酸鹽，乙醇酸鹽，抗壞血酸鹽，苯磺酸鹽和萘磺酸鹽。本發明的藥物組合物通過使SY-001、本發明的表達產物或其鹽為活性組分，并含有藥物有效量，與合適的藥物載體或稀釋劑一起，制成藥物制劑形式。作為用于制備藥物制劑的藥物載體，可舉例說明的有賦形劑和稀釋劑，諸如，填料，增稠劑，粘合劑，潤濕劑，崩解劑，表面活性劑，和滑潤劑。這些載體根據所得制劑的單位劑型任意選擇和利用。尤其優選的藥物制劑是任選利用用于通常蛋白制劑的各種成分制備的，例如，穩定劑，殺菌劑，緩沖劑，等滲劑，螯合劑，pH調節劑，表面活性劑等。上述穩定劑的例子包括人血清白蛋白，常見L-氨基酸，糖類，和纖維素衍生物。這些可單獨使用，或與表面活性劑組合使用。尤其是，通過該組合，活性組分的穩定性在某些情況下進一步提高。L-氨基酸不特別受限，可利用甘氨酸、半胱氨酸、谷氨酸等中的任一種。糖類不特別受限。例如，可利用單糖，諸如葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖；糖醇，諸如甘露醇、肌醇和木糖醇；二糖，諸如，蔗糖、麥芽糖和乳糖；多糖，諸如，右旋糖苷、羥丙基淀粉、硫酸軟骨素和透明質酸，及其衍生物。表面活性劑不特別受限，可利用任一離子表面活性劑和非離子表面活性劑。其具體例子包括基于聚氧乙二醇山梨聚糖烷基酯、基于聚氧乙烯垸基酯、基于山梨聚糖單酰基酯、和基于脂肪酸甘油酯的表面活性劑。纖維素衍生物不受特別限制。可利用甲基纖維素，乙基纖維素，羥乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，和羧甲基纖維素鈉等。上述糖類的添加量相對1 fig活性組分為約0.0001 mg以上，和優選約0.01-10 mg。表面活性劑的添加量相對1嗎活性組分為約0.00001 mg以上和優選約0.0001-0.01 mg。人血清白蛋白的添加量相對1 pg活性組分為約0.0001 mg以上和優選約0.001-0.1 mg。 L-氨基酸的添加量相對1 )ig活性組分合適的是約0.001-10 mg。纖維素衍生物的添加量相對1 pg活性組分為約0.0001 mg以上和優選約0.001-0.1 mg。本發明藥物組合物中所含的活性組分的量寬范圍任意選擇。適當的是制劑中活性組分的量通常約0.00001-70重量％和優選約0.0001-5 重量％。多種添加劑，諸如緩沖劑、等滲劑、和螯合劑，可添加至藥物制劑中。緩沖劑的例子包括硼酸，磷酸，乙酸，檸檬酸，s-氨基己酸，谷氨酸和/或其鹽(例如，堿金屬鹽，諸如鈉、鉀、鈣和鎂鹽，以及堿土金屬鹽)。等滲劑的例子包括氯化鈉，氯化鉀，糖類和甘油。螯合劑的例子包括依地酸鈉和檸檬酸。藥物制劑可制備成溶液制劑，并另可制備成通過凍干藥物制劑獲得的凍干劑型，該劑型通過溶解于含鹽的緩沖劑以用時合適的濃度制備。藥物制劑的單位劑型可根據治療意圖任意選擇。其代表性例子包括固體劑型，諸如片劑、丸藥、粉末藥物、粉劑、顆粒和膠囊，以及液體劑型，諸如溶液、懸浮液、乳液、糖漿和酏劑。這些根據給藥途徑進一步分類成口服劑、腸胃外劑、鼻用劑、陰道劑、栓劑、舌下劑、和膏劑，并可根據常用方法組合、模制和制備。如果需要，著色劑、防腐劑、香料、調味劑和甜味劑和其他藥物也可包含于本發明的藥物制劑中。所述藥物制劑的給藥方法不受特別限制，并根據不同的劑型、患者的年齡、性別、其他病癥和疾病的嚴重性而確定。例如，片劑，藥丸，液體，懸浮液，乳液，顆粒和膠囊經口服給藥。可注射劑單獨或在與常見流體置換劑諸如葡萄糖和氨基酸的混合物中經靜脈給藥，如果需要，則經肌內、皮內、皮下或腹膜內單獨給藥。栓劑由直腸內給藥。陰道劑經陰道給藥，鼻用劑鼻內給藥，舌下劑在口腔中給藥，以及膏劑經皮下局部給藥。藥物制劑的劑量不受特別限制，并根據所需的治療效果、給藥方法、治療周期、患者的年齡、性別和其他病癥，任意選自寬的范圍。一般而言，優選的是確定劑量，使得活性組分的量通常約每kg體重每天0.01 ng-10mg，優選約0.1 fig-l mg。制劑可以分成每天1次至幾次給藥，或間歇給藥。(8)篩選促進對血小板聚集和/或血小板粘附的抑制活性的物質(激動劑)本發明還提供用于篩選促進對血小板聚集和/或血小板粘附的抑制活性的候選化合物的方法。所述方法的特征在于，在存在或缺乏對象物質下，對于包含SEQID NO:l或3的氨基酸序列的多肽，或包含在SEQ ID NO:l或3的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽，測量它們的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的水平；并通過比較對象物質存在下的測量值與對象物質缺乏下的測量值，選擇影響血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的對象物質作為激動劑。血小板聚集抑制作用的水平可通過血小板聚集抑制率而獲得，所述血小板聚集率是從利用濁度透光率血小板聚合儀獲得的測量值計算出的。更具體而言，利用帶有抗凝劑的注射器，采集人血樣品，并從收集的全血通過離心制備富血小板的人血漿(PRP)。將早先溶解于PBS 的純化SY-001溶液添加至PRP,然后在37。C預溫育。隨后，向其中加入作為血小板聚集劑的膠原溶液(由NYCOMED提供)，以聚集血小板，持續溫育給定的時間段。其后，利用濁度透光率血小板聚集儀(MCM HEMA TRACER 313M:由MC Medical提供)，測量溶液的透光率，以制得血小板聚集曲線。在SY-001或SY-001+對象物質的每種情形下，血小板聚集抑制率可從該曲線計算得到。作為上述聚集劑，除膠原之外，還可利用ADP， CRP， convulxin， TRAP,腎上腺素，花生四烯酸， U-46619， A23187等。血小板粘附抑制活性的水平也可通過血小板粘附抑制率獲得，所述抑制率從利用Dc蛋白分析試劑盒(Lowry方法Lowry， O.等， J.Biol.Chem.，193， 265(1951)] BIO-RAD Laboratories)獲得的測量值計算得到。更具體而言，利用帶有抗凝劑的注射器，采集人血樣品，并從離心全血獲得的PRP制備血血小板懸浮液。將早先溶解于PBS的純化 SY-001溶液添加至涂布有膠原的96孔板，并在室溫下溫育30分鐘。溫育之后，孔中加入血小板懸浮液，并在室溫下溫育45分鐘。溫育之后，溫育液用吸液管從孔中取出，并以PBS洗滌。將含1% SDS的PBS溶液加到孔中，該孔在搖動和攪動之后風干。其后，孔中加入蒸餾水，并利用Dc蛋白分析試劑盒(BIO-RAD Laboratories)測量各孔的蛋白量，SY-001的血小板粘附抑制率基于不含 SY-001的對照值從獲得的測量值計算，并從其血小板粘附曲線計算 SY-001的血小板粘附抑制活性。在SY-001或SY-001 +對象物質的每種情形下，血小板粘附抑制率從該曲線計算得到。作為上述血小板粘附誘導劑，可利用膠原。本發明還提供篩選增加SY-001的血小板聚集抑制活性的候選物質的方法，包括下列步驟(l)-(4):(1) 制備培養基的步驟，所述培養基包括用SY-001的表達載體轉化的細胞，以及富血小板的血槳(PRP);(2) 在對象物質的存在或缺乏下，向上述(l)的培養基中添加血小板聚集物質，誘導血小板聚集的步驟；(3) 在上述(2)中對象物質存在下或對象物質缺乏下，測量血小板聚集抑制水平的步驟；和(4)當對象物質存在下的測量值大于對象物質缺乏下的測量值時，篩選該對象物質作為候選物質的步驟。本發明還提供篩選增加本發明表達產物的血小板聚集抑制作用的候選物質的方法，包括下列步驟(l)-(4):(1) 制備培養基的步驟，所述培養基包括含本發明表達產物的細胞，以及富血小板的血漿(PRP);(2) 在對象物質的存在或缺乏下，向上述(l)的培養基添加血小板聚集物質，誘導血小板聚集的步驟； .(3) 在上述(2)的對象物質存在下或對象物質缺乏下，測量血小板聚集抑制的水平的步驟；和(4) 當對象物質存在下的測量值大于對象物質缺乏下的測量值時，選擇該對象物質作為候選物質的步驟。本發明還提供篩選測定SY-001的血小板粘附抑制活性的候選物質的方法，包括下列步驟(l)-(4):(1) (在孔上)制備培養基的步驟，所述培養基包括用SY-001的表達載體轉化的細胞，以及涂布有血小板粘附物質(即，膠原)的孔板；(2) 在對象物質的存在或缺乏下，向上述(l)的培養基添加血小板懸浮液，誘導血小板粘附的步驟；(3) 在上述(2)的對象物質存在下或對象物質缺乏下，測量血小板粘附抑制的水平的步驟；和(4) 當對象物質存在下的測量值大于對象物質缺乏下的測量值時，選擇該對象物質作為候選物質的步驟。本發明進一步提供篩選測定本發明表達產物的血小板粘附抑制作用的候選物質的方法，包括下列步驟(l)-(4):(1) (在孔上)制備培養基的步驟，所述培養基包括含本發明表達產物的細胞，以及涂布有血小板粘附物質(g卩，膠原)的孔板；(2) 在對象物質的存在或缺乏下，向上述(l)的培養基添加血小板懸浮液，誘導血小板粘附的步驟；(3) 在上述(2)的對象物質存在下或對象物質缺乏下，測量血小板粘附抑制的水平的步驟；和(4) 當對象物質存在下的測量值大于對象物質缺乏下的測量值時，選擇該對象物質作為候選物質的步驟。本發明的篩選方法可通過實際應用高通量篩選技術而實施。根據該技術在例如，篩選血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的加速劑中的實際應用，在存在或缺乏待篩選的對象物質下，將帶有合成反應混合物、細胞級分、和血液級分例如富血小板的血漿或血小板懸浮液中任一種的制劑(包括SY-001和該多肽的標記配體)溫育。通過結合的標記配體的降低而檢測對象物質是激動SY-001的作用還是拮抗 SY-001的作用。SY-001的活性水平可通過比色標記的報道系統(不限于此)、摻入對多核苷酸或多肽的活性變化負責的報道基因、或本領域公知的結合分析而檢測。下述競爭性分析可用于篩選候選化合物作為血小板聚集抑制活性的加速劑，在所述競爭性分析中，SY-001或其他變體[例如， SY-001(151-269)， SY-001(21-269)]以及其他血小板聚集抑制齊lJ(例如，乙酰水楊酸，西洛他唑(cilostazol))同與它們結合的化合物相組合。下述競爭性分析可用于篩選候選化合物作為血小板粘附抑制活性的加速劑，在所述競爭性分析中，SY-001或其他變體[例如， SY-001 (151 -269)， SY-001 (21 -269)]以及其他血小板粘附抑制劑(例如，噻氯匹定(Ticlopidine))同與它們結合的化合物相組合。通過本發明篩選方法篩選的對象物質(候選化合物)極可能是 SY-001的激動劑，作為血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的加速劑。激動劑可以是在本發明的篩選系統中，其存在下測量的增強血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的物質。這些對象物質的具體例子包括寡肽，蛋白，抗體，RNA分子，siRNA，非肽化合物(合成化合物)，發酵產物，細胞提取物(植物提取物，動物提取物)和血漿。這些物質可以是那些新開發的或已知的物質。血小板聚集抑制物質和/或血小板粘附抑制物質的例子包括無機或有機低分子化合物，天然發生或合成的肽和多肽，或通過基因重組技術制備的肽和多肽，這些物質通過與SY-001的結合增強SY-001的活性。用于編碼SY-001的DNA分子、直接體內給藥、或以插入重組載體的形式給藥的有義DNA分子，也包括在上述血小板聚集抑制物質和/或血小板粘附抑制物質中。根據本發明篩選方法篩選的具有活性來增強血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的候選物質評價如下。即，與對照(缺乏對象物質)比較，增加或促進血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性約20%以上，優選約30%以上，和更優選約50%以上的候選物質可被評價為促進血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的化合物。促進血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的化合物被認為可用作繼血栓或栓子形成引起的病癥及其并發癥之后的病理狀態的治療劑或預防劑，所述病癥及其并發癥例如，心肌梗塞，腦栓塞，慢性動脈阻塞，動脈硬化，缺血性腦梗塞，心絞痛，靜脈血栓癥，高血壓，肺高壓，腦梗塞，肺梗塞，心衰，腎炎，腎衰，和蛛網膜下腔出血。在通過本發明篩選方法獲得的促進血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的物質中，據推想還有自身就具有抑制由血小板聚集物質體內誘導的血小板聚集、和/或抑制由血小板粘附物質體內誘導的血小板粘附的活性的物質，此種物質被認為可用作多種領域、包括藥物領域中的血小板聚集抑制劑和/或血小板粘附抑制劑。(9)篩選試劑盒本發明能提供用于篩選SY-001的激動劑的試劑盒，其特征在于，包含富血小板的血漿、SY-001(包括本發明表達產物)、以及血小板聚集劑作為組成成分。本發明的篩選試劑盒包含(1)SY-001(例如，具有SEQIDNO:l或3 的氨基酸序列的多肽)或本發明的表達產物(例如，編碼SY-001的DNA 分子的、SEQ ID NO:2或4的DNA序列的表達產物)，(2)包含富血小板血漿的細胞培養基，以及(3)血小板聚集劑作為必要成分。與此種類型的篩選試劑盒類似，試劑盒可包含多種試劑，諸如細胞培養基，反應稀釋劑，染色劑，緩沖劑，固定液和洗滌液，作為其他任選成分。本發明試劑盒的具體例子包括那些含下列組分1-3的試劑盒組分h細胞(表達SY-001的細胞，培養細胞，包括用編碼SY-001 的多核苷酸(DNA分子)轉化的大腸桿菌細胞或昆蟲細胞)，利用含 EGTA-Na的MOPS緩沖液，在5% <302禾口 37°C下以0.5-1 乂105細胞/ 孔在60 mm培養皿中培養；組分2:誘導血小板聚集的物質(例如，膠原，ADP);和組分3:富血小板的血漿。在利用本發明篩選試劑盒的篩選方法中，血小板聚集抑制率在富血小板的血漿中以孔的每孔單位視野檢測，在所述孔中已加入測試物質(對象物質，藥物候選物質)。接著，血小板聚集抑制率在未加入測試物質的孔中檢測。隨后，測試前者抑制率和后者抑制率之間的顯著差異。這些測量和評價可根據標準方法實施。本發明也可提供篩選SY-001激動劑的試劑盒，其特征在于，含有血小板粘附劑(即，膠原)、SY-001(包括本發明的表達產物)以及血小板懸浮液作為組分。本發明的篩選試劑盒包含(1)SY-001(例如，具有SEQIDNO:l或3 的氨基酸序列的多肽)或本發明的表達產物(例如，編碼SY-001的DNA 分子SEQ ID NO:2或4的DNA序列的表達產物)，(2)血小板粘附物質 (即，膠原)，以及(3)血小板懸浮液作為必要成分。與此種類型的篩選試劑盒類似，該試劑盒可包含多種試劑，諸如細胞培養基，反應稀釋劑，染色劑，緩沖劑，固定液和洗滌液，作為其他任選成分。本發明試劑盒的具體例子包括那些含下列組分1-3的試劑盒組分1:細胞(表達SY-001的細胞，培養細胞，包括用編碼SY-001 的多核苷酸(DNA分子)轉化的大腸桿菌細胞或昆蟲細胞)，利用PBS緩沖液，在5%(:02和37。C下以0.5-1乂105細胞/孔在60mm培養皿中培養；組分2:誘導血小板粘附的血小板粘附物質(例如，膠原，ADP);和組分3:血小板懸浮液。在利用本發明篩選試劑盒的篩選方法中，血小板粘附抑制率以孔的每孔單位視野的血小板對膠原的粘附水平檢測，在所述孔中已加入測試物質(對象物質，藥物候選物質)。接著，血小板粘附抑制率在未加入測試物質的孔中檢測。隨后，測試前者抑制率和后者抑制率之間的顯著差異。這些測量和評價可根據標準方法實施。實施例本發明將參照下列實施例更詳細描述。這些實施例僅用于舉例說明，并不限制本發明。<實施例1>1. 從斯氏按蚊唾液腺制備cDNA文庫使羽化后3-7天的雌性斯氏按蚊(SDA500品系)吮吸小鼠(購自 CLEA Japan Inc.的BALB/c品系)的血。從吮吸血液后6小時的蚊子取下翅、足、頭部和腹部，僅將包括唾液腺的胸部存儲在液氮中。在收集了 300個蚊子的胸部時，利用RNeasy Midi試劑盒(QIAGEN)抽提 RNA。通過收集添加PolyA的RNA，利用反轉錄酶制備cDNA，在兩端處添加限制性酶切位點(EcoRI和HindIII位點)，并摻入X SCREEN-1 克隆試劑盒(Novagen)而制備文庫。2. 免疫篩選唾液腺的cDNA文庫大腸桿菌(ER-1647, Takara)用上述文庫的各個噬菌體感染，并利用抗-斯氏按蚊唾液腺抗體作為探針進行篩選。抗斯氏按蚊唾液腺抗體通過用斯氏按蚊唾液腺與弗氏佐劑的勻槳一起免疫兔子而制備。通過篩選獲得的陽性克隆感染至大腸桿菌ER-1647并擴增。然后，取出噬菌體，利用CreMediated質粒切除(CreMediated Plasmid Excision, Novagen)，將插入部分克隆至質粒pSCREEN-lb(+)(Novagen)。插入部分的堿基序列利用在pSCREEN的兩端添加的DNA部分(SP6啟動子引物SEQ ID NO:IO，產品編號TKR3867, Takara Bio,和T7終止子引物 SEQIDNO:ll，產品編碼NV432, Novagen)，用ABI提供的310基因分析儀(Genetic Analyzer)進行測序。堿基序列分析的結果，發現克隆的基因片段含有終止密碼子，但是缺失起始密碼子。為了獲得SY-001cDNA缺失的5'區，利用抽提自唾液腺cDNA文庫的入篩選噬菌體DNA作為模板，并且利用引物、SP6 啟動子引物(SEQ ID NO:10)和SEQ ID NO: 12的pAnS-1引物，進行 5'陽RACE方法[Frohman, M. A.等，PNASC， 8, 8998-9002(1988)]，克隆約 470 bp的DNA片段。該DNA片段與上述篩選所得的DNA片段重疊，并進一步含有起始密碼子。兩個DNA片段連接，以確定編碼SY-001 的DNA分子的整個堿基序列。cDNA中發現的ORF編碼28.5 kDa推導蛋白的269個氨基酸殘基，并含有807 bp。該蛋白預測是作為唾液分泌的蛋白，因為從推導的氨基酸序列預測出該蛋白是p^3.8的酸性蛋白，N端的21個氨基酸殘基是疏水性的，并顯示信號肽樣序列，并且C端沒有膜錨定區。該推導的氨基酸序列示于SEQ ID NO:5中。編碼氨基酸序列的 DNA分子的堿基序列示于SEQ ID NO:6。3.通過重組DNA表達SY-001及其純化 (1)生產SY-001 (22-269)編碼SY-00122-269位氨基酸殘基(SEQ ID NO:5)的DNA片段通過 PCR擴增。上述1所示的唾液腺cDNA用作模板。所用的引物 pAnSG-F7(SEQ ID NO:13)在從5'端的第3至第8位具有Ncol位點 (CCATGG)，并且所用的引物pAnSG-Rl(SEQ IDNO:14)在從5'端的第 2至第9位具有Notl位點(GCGGCCGC)。然后，將該DNA片段克隆至 pENTR/D-TOPO(Invitrogen)，以構建質粒pENTR-SY-001-外顯子1-4。隨后，用Ncol和Notl切割pENTR-SY-001-外顯子1-4所得的 SY-001 DNA片段(約760 bp)插入pET32-b(+)(Novagen)的NcoI/Notl位點，以構建質粒pET32-SY-001-外顯子1-4。用該 pET32-SY-001-外顯子 1-4 轉化大腸桿菌 BL21(DE3)(Novagen)，所得的轉化體37°C下振蕩培養在6 mL含有50 (ag/mL氨節青霉素的LB培養基(LBA)中15小時。然后，將培養基加到 600 mLLBA中，之后在37°C下振蕩培養4小時。隨后，向培養基中加入6 mL 100 mM IPTG， 37°C下進一步振蕩培養4小時。所得培養基以6，000Xg離心15分鐘，除去上清液。所得沉淀通過向其加入40mL 6M鹽酸胍而裂解。所得細菌溶液以30，000Xg離心25分鐘，收集上清液。向其中加入1.8 mL Ni-NTA(QIAGEN)，然后4°C下攪拌15小時。混合物以3,000Xg離心3分鐘，除去上清液，并收集Ni-NTA。向收集的Ni-NTA加入含有10mM咪唑的6M尿素-TBS溶液(6 M尿素，150 mM NaCl， 50 mM Tris-HCl [pH7.5])。所得混合物以3,000 X g離心3分鐘，除去上清液。所得Ni-NTA裝填至柱子中。SY-001外顯子l-4蛋白從柱子上如下洗脫。即，2mL含有20mM、 50 mM、 100 mM和200 mM咪唑的6M尿素-TBS溶液分別按序流過柱子，并收集相應級分。各級分的部分在12% SDS-PAGE上電泳，然后用考馬斯染色來確定含有SY-001外顯子1-4蛋白的級分。該級分對PBS 透析48小時。蛋白量利用BCA蛋白分析試劑盒(PIERCE)定量，產量為5.0 mg。以此方式獲得的重組蛋白的氨基酸序列示于SEQIDNO:7。 1-162 位的氨基酸序列和410-420位的氨基酸序列分別是衍生自硫氧還蛋白和含有His標記序列的pET32-b(+)的氨基酸序列。本發明的SY-001的氨基酸序列(22-269)位于162-409位。(2)生產SY-001(148-269)利用引物pAnSG-F8(SEQ ID NO:15)和pAnSG-Rl (SEQ ID NO:14)，以上述(l)制備的pET32-SY-001外顯子1-4作為模板進行PCR。所得DNA片段(382 bp)克隆至pENTR/D-TOPO(Invitrogen)中，以構建質粒pENTR-SY-001外顯子3-4。質粒pENTR-SY-001外顯子3-4用 NcoI/Notl切割，從而獲得372 bp的DNA片段。該片段插入 pET32(b)+(Novagen)的NcoI/Notl位點，以構建質粒pET32-SY-001外顯子3-4。用上述獲得的pET32-SY-001-外顯子3-4轉化大腸桿菌 BL21(DE3)(Novagen)，所得轉化體37°C下振蕩培養在6 mL含有50 fig/mL氨芐青霉素的LB培養基(LBA)中15小時。然后，將培養基加到 600 mLLBA中，之后37°C下振蕩培養4小時。隨后，向培養基中加入6 mL 100 mM IPTG， 37°C下進一步振蕩培養4小時。所得培養基以 6，000Xg離心15分鐘，除去上清液。所得沉淀通過加入40mL6M鹽酸胍而裂解。所得細菌溶液以30，000Xg離心25分鐘，收集上清液。向其中加入1.8 mLNi-NTA(QIAGEN)，然后4°C下攪拌15小時。混合物以3,000Xg離心3分鐘，除去上清液，并收集Ni-NTA。向收集的 Ni-NTA加入含有IO mM咪唑的6 M尿素-TBS溶液(6 M尿素，150 mM NaCl， 50 mM Tris-HCl [pH7.5])。所得混合物以3,000 X g離心3分鐘，除去上清液。所得Ni-NTA裝填至柱子中。SY-001外顯子3-4蛋白從柱子上如下洗脫。S卩，2 mL分別含有 20mM、 50mM、 100 mM和200 mM咪唑的6M尿素-TBS溶液按序流過柱子，并收集相應級分。各級分的部分在12% SDS-PAGE上電泳，然后用考馬斯染色來確定含有SY-001外顯子3-4蛋白的級分。該級分對PBS透析48小時。蛋白量利用BCA蛋白分析試劑盒(PIERCE)定量，產量為1.8 mg。以此方式獲得的重組蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:8，并具有含293個氨基酸殘基的氨基酸序列。在此氨基酸序列中，l-160位的氨基酸序列和283-293位的氨基酸序列分別是衍生自硫氧還蛋白和含有His標記序列的pET32-b(+)的氨基酸序列。SY-001的氨基酸序列 (148-269)位于161-282位。實施例2利用桿狀病毒表達系統生產重組SY-001(21-269) (1)生產桿狀病毒SY-001(21-269)編碼SY-00121 -269位的多肽(SEQ ID NO: 1)的DNA片段利用實施例1.1所示的唾液腺cDNA作為模板通過PCR擴增。所用引物 pAnSG-F10(SEQ ID NO:16)在5'端的第5至第10位點具有BamHI位點 (GGATCC)和在第12位G至第41位A具有FLAG序列。所用引物 pAnSG-Rl(SEQ ID NO:14)在5'端第2至第9位點具有Notl位點(GCGGCCGC)。將DNA片段克隆至pENTR/D-TOPO(Invitrogen)，以構建質粒pENTR-SY-001-外顯子1-4。隨后，用BamHI/Notl切割pENTR-SY-001-外顯子1-4獲得的 SY-001片段(780 bp)插入pBACgus-l(Novagen)的BamHI/Notl位點，以構建桿狀病毒轉移載體質粒pBACgus-SY-001-外顯子1-4。利用重組桿狀病毒制備試劑盒(BacVector-2000轉染試劑盒， Novagen)，用上述桿狀病毒轉移載體質粒pBACgus-SY-001-外顯子1-4 和BacVector-2000 DNA共轉染Sf9細胞，制備重組桿狀病毒。制備的重組桿狀病毒命名為AcNPV-SY-001-外顯子1-4。艮P， Sf9細胞以1X1(^個細胞/I50mm陪替氏培養皿培養，在感染復數約5時用AcNPV-SY-001-外顯子1-4感染。3-4天后，從10個150 mm陪替氏培養皿收集約250 mL培養上清液，向其中加入1.5 mL Ni-NTA(QIAGEN)，然后4°C下攪拌15小時。混合物以3,000Xg離心 3分鐘，棄去上清液。收集Ni-NTA,向其中加入50mL含10mM咪唑的TBS溶液(150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl [pH7.5])。所得混合物進一步以3，000Xg離心3分鐘，棄去上清液。所得Ni-NTA裝填在柱子中。SY-001外顯子1-4蛋白從柱子如下洗脫。艮卩，2 mL分別含有20 mM、 50mM、 100 mM和200 mM咪唑的TBS溶液按序流過柱子，并收集相應級分。各級分的部分在12% SDS-PAGE上電泳，然后用考馬斯染色來確定含有SY-001外顯子1-4蛋白的級分。該級分對PBS透析 48小時。蛋白量利用BCA蛋白分析試劑盒(PIERCE)定量，產量為0.8 mg。以此方式獲得的重組蛋白SY-001的氨基酸序列(21-269)示于SEQ IDNO:9。在此氨基酸序列中，1-10位的序列為FLAG序列，11-259位的氨基酸序列為SY-001的序列(21-269)，以及260-270位的序列為衍生自pBACgus-l 、含有His標記序列的序列。實施例3利用濁度透光率血小板聚集儀，通過測量富血小板的血漿(PRP) 中的血小板聚集，評價SY-001對血小板聚集的抑制作用。方法概要如下。即，首先，利用帶有抗凝劑的注射器，從健康供體采集血樣，通過離心采集的全血，制備富血小板的血漿(PRP)。制備的PRP與SY-001溶液[PBS溶液，其中己溶解實施例1.3-(1)制備的具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的SY-001]或作為對照的PBS混合并預溫育，隨后加入血小板聚集劑使血小板聚集。作為血小板聚集劑，分別采用ADP(Sigma提供)，膠原(NYCOMED提供)，CRP(Peptide Institute Inc.提供)，convulxin(Alexis提供)，TRAP(Sawaday Technology Co.提供)，腎上腺素(Daiichi Pharmaceutical Co.， Ltd.提供)，花生四烯酸(Sigma提供)，U-46619(Cayman提供)或A23187(Sigma提供)。接著，血小板聚集率利用濁度透光率血小板聚集儀(MCM HEMA TRACER 313M: MC Medical提供)測量5分鐘，并在5分鐘測量中獲得最大聚集率。SY-001的血小板聚集抑制率(％)根據下式計算。血小板聚集抑制率(％) = (1 - As/Ac)X 100As:帶有SY-001的PRP中最大血小板聚集率Ac:僅PRP作為對照中最大血小板聚集率上述操作的細節如下列(a)-(c)所示。(a)首先，利用帶有6 mL 3.8%檸檬酸鈉作為凝血劑(coagulant) 的注射器，從健康供體采集60mL血液。隨后，該血液以1,100rpm離心10分鐘，將上層富含人血小板的血漿(PRP)層轉移至另一個試管。剩余的下層部分以3,000 rpm離心10分鐘，所得上層清亮黃色層(貧血小板的血漿，PPP)轉移至另一個試管。混合上述得到的PRP和PPP，制備血小板數已經調節到3xlOs/mL的混合物，并用于隨后的測量中。該混合物在下列測量中稱作"PRP測量樣品"。設定血小板聚集儀的血小板聚集率，使得ppp的透光率為100% 的血小板聚集率，而PRP的透光率為0%的血小板聚集率。(b) 確定膠原濃度和測量血小板聚集抑制活性首先，已加入200 pL不含SY-001的PRP測量樣品的聚集管放置在血小板聚集儀中，并在37。C下溫育2分鐘。隨后，向其中加入22.2 ^;L膠原溶液(NYCOMED GmBH， Moriya Sangyo提供)，血小板聚集率在37°C下持續測量5分鐘。5分鐘內最高的血小板聚集率為最大血小板聚集率。在膠原溶液中，采用5-20(ig/mL濃度(PRP測量樣品中的終濃度為0.5-2 (ig/mL)作為次最大濃度，此時誘導了最大血小板聚集率的 70%。(c) 接著，(i)分別制備30 nM、 100 nM和300 nM的SY-001 (22-269)[具有實施例1， 3-(l)制備的SEQIDNO:7的氨基酸序列]，(ii) 分別制備100 nM、 300 nM和1000 nM的SY-001(148-269)[具有實施例 1, 3-(2)制備的SEQ DINO:8的氨基酸序列]或(iii)PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KC1， 8.1 mM Na2HP04， 1.5 mM 1012 04)作為對照，加入到已加入200 ^LPRP測量樣品的各管中。各混合物放置在血小板聚集儀中， 37。C下溫育2分鐘。隨后，向其中加入22.2 pL上述確定的給定濃度的膠原溶液，血小板聚集率自加入起測量5分鐘。通過膠原刺激誘導的SY-001(22-269)的血小板聚集抑制活性的結果示于圖1。通過膠原刺激誘導的SY-001(148-269)的血小板聚集抑制活性的結果示于圖2。在各圖中，水平軸代表自加入膠原前30秒的時程(-0.5至5分鐘)，而縱軸代表血小板聚集率(％)。在圖1中，曲線(l)顯示加入300 nM濃度SY-001(22-269)的情形下的結果，曲線(2)顯示SY-001(22-269) 100 nM時的結果，曲線(3)顯示 SY-001(22-269) 30 nM濃度時的結果，以及曲線(4)顯示對照的結果。在圖2中，曲線(l)顯示以1000nM濃度加入SY-001(148-269)情形下的結果，曲線(2)顯示SY-001(148-269) 300 nM時的結果，曲線(3)顯示SY-001(148-269) 100 nM時的結果，以及曲線(4)顯示對照的結果。從這些圖所示結果顯而易見的是，已經顯示隨著添加量增加，本發明的SY-001減少通過膠原刺激誘導的血小板聚集，即，SY-001具有血小板聚集抑制活性。利用實施例2的桿狀病毒表達系統生產的重組蛋白 SY-001(21-269)，進行與上述相同的試驗。結果得到與圖l所示基本相同的結果。因此，顯然，本發明的SY-001顯然具有血小板聚集抑制活性。在利用上述SY-001(21-269)的試驗中，通過將SY-001(21-269)的濃度從3 nM改變到1000 nM,獲得血小板聚集率。然后，利用SAS軟件(SAS Institute, Japan, Release 8.1)，對SY-001(21-269)的血小板聚集抑制活性(IC5o)進行log-logit分析。結果，SY-001(21-269)的ICso計算為 25 nM。從上述結果，已推測出，在SEQ ID N0:5的SY-001的氨基酸序列148和269位之間，存在于C端側的抗原表位部分可能有助于本發明SY-001的血小板聚集抑制活性。實施例4合成SY-001變體通過固相合成方法，利用Fmoc(9-荷甲氧羰基)法，SY-001合成如下。
具有從SEQ ID NO:5的氨基酸序列的N端至C端的所需數目氨基酸殘基的合成多肽，可利用TBTU[2-(lH-苯并三唑-l-基)-l，l，3,3-四甲基脲四氟硼酸酯]和HOBt[l-羥基苯并三唑水合物]作為活性劑，通過連續流模式反應而獲得。
如果需要，可將所得的合成多肽溶解于二甲基亞砜，并進一步以乙腈稀釋。
制劑實施例1
(1) 制備本發明藥物組合物的可注射制劑是在0.01 M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中加入并混合100 lig/mL SY-001(具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列)、0.01 mg/mL Tween 80(聚氧乙烯(20)山梨聚糖單油酸酯；聚山梨醇酯80)、 15 mg/mL右旋糖苷40、 0.1 mg/mL半胱氨酸和1.0 mg/mL HSA(人血清白蛋白)，(利用0.22 過濾膜)過濾混合物，然后無菌分配過濾液，每小瓶lmL，并冷凍干燥。該制劑使用時可通過溶解于1 mL鹽水中使用。
(2) 制備本發明藥物組合物的可注射制劑是在每瓶注射用蒸餾水中加入10 (ig/0.1 mL SY-OOl(具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列)，5 mg半胱磺酸和lmg人血清白蛋白(HSA)，每瓶過濾所得溶液lmL，并冷凍干燥。
AAPP對血小板粘附至膠原的作用
將3, 10, 30, 100， 300, 1000 or 3000 nM的SY-001溶液(50 ^L)添加至涂布有40 fig/mL膠原(NYCOMED GmBH)的96-孔板，并在室溫下溫育30分鐘。溫育之后，向各孔加入50 ^iL血小板懸浮液(6xl()8/mL細胞)，并在室溫下溫育45分鐘。溫育之后，用吸液管取出各孔中的溶液，并以200 nLPBS洗孔。隨后，向各孔加入20 jiL含有1% SDS的PBS，接著振蕩攪動并在45°C下風干。其后，向各孔加入5 pL蒸餾水，利用Dc蛋白分析試劑盒(BIO-RAD)測量孔中的蛋白濃度。
結果示于圖3。
如圖3所示，經鑒定，本發明的SY-001以劑量依賴方式抑制血小板對膠原的粘附，尤其在劑量300 (ig/mL以上時，SY-001顯示對血小板粘附的有效抑制作用。
SY-001與膠原的結合能力
向涂布有膠原的96-孔板(NUNC， 152038)或未涂布的96-孔板 (NUNC， 260895)的各孔中加入封閉溶液(300 pL)，室溫下溫育1小時。取出各孔中的溶液，并向各孔加入100 |iL的3， 10， 30， 100 or 300 nM SY-001蛋白溶液，室溫下溫育1小時。取出各孔溶液，向孔中加入200 mL2。/。蔗糖，室溫下溫育5分鐘。取出各孔溶液，干燥孔。隨后，向各孔加入100 (iL重構的Ni-HRP溶液(ExpressDetector Nickel-HRP， KPL)，室溫下溫育30分鐘。用洗滌緩沖液洗滌之后，向各孔加入100 ABTS 過氧化物酶底物，輕輕振蕩混合。反應終止后，加入100 nL 1% SDS，利用微量培養板讀數儀測量波長405-410 nm處的吸光度。
結果示于圖4。三角形代表作為對照的空載體的反應曲線。如圖4 所示，經鑒定，SY-001對膠原具有結合能力。
如上所述，可以鑒定，本發明的SY-001不僅對血小板聚集具有抑制作用，而且對血小板與膠原的粘附具有抑制作用。還能鑒定，本發明的SY-001對膠原具有結合能力。
從這些結果可以看出，包含本發明的SY-001作為活性組分的藥物組合物可以是有用的藥物組合物，作為心肌梗塞，肺栓塞，腦梗等的治療劑和預防劑。重組AAPP的血小板粘附抑制作用和膠原結合能力圖3: AAPP抑制血小板與膠原的粘附。
圖4: AAPP具有對膠原的結合能力。
序列表自由內容
SEQ ID NO: 10代表SP6啟動子引物序列，SEQ ID NO: 11代表 T7終止子引物序列，SEQ ID NO: 12代表pAnS-l引物序列，SEQ ID NO: 13代表pAnSG-F7引物序列，SEQ ID NO: 14代表pAnSG-Rl引物序列， SEQ ID NO: 15代表pAnSG-F8引物序列，以及SEQ ID NO: 16代表 pAnSG-F10引物序列。
工業實用性
根據本發明，可提供含有SY-001或本發明表達產物作為活性組分的藥物組合物。本發明的組合物據認為可用作治療劑或預防劑，用于繼各種疾病之后的病理狀況，所述疾病例如由血栓或栓子引起的疾病和并發癥，例如急性冠脈綜合征，心肌梗塞，腦栓塞，慢性動脈阻塞，動脈硬化，缺血性腦梗塞，心絞痛，靜脈血栓癥，高血壓，肺高壓，腦梗塞，肺梗塞，心衰，腎炎，腎衰，和蛛網膜下腔出血，其中涉及 SY-001和編碼SY-001多肽的多核苷酸(DNA分子)。
此外，本發明的組合物據認為可用于預防PTCA和支架放置后的血栓形成，并且通過在支架上施加SY-001或在支架本身中包埋SY-001 而包入SY-001，用于預防支架放置后的再狹窄。
通過利用由本發明提供的SY-001和編碼SY-001的DNA分子，
可篩選用于多肽或DNA分子的表達產物(本發明的表達產物)的激動劑，g卩，篩選具有下列活性的物質作為候選化合物促進這些蛋白對血小板聚集和/或血小板粘附的固有抑制活性。
權利要求
1. 藥物組合物，包含至少一種下列(a)-(d)的多肽作為活性組分(a)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽；(b)包含在上述(a)氨基酸序列中含一個或多個氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽；(c)包含SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽；以及(d)包含在上述(c)氨基酸序列中含一個或多個氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽。
2. 包含表達產物作為活性組分的藥物組合物，所述表達產物由至少一種下列(e)-(i)的多核苷酸表達(e) 包含SEQ ID NO:2的DNA序列或其互補序列的多核苷酸；(f) 在嚴格條件下與上述(e)的多核苷酸雜交并能夠表達具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸；(g) 包含與上述(e)的多核苷酸具有80。/。或更高的同源性的DNA序列并能夠表達具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸；(h) 包含SEQ ID NO:4的DNA序列或其互補序列的多核苷酸；(i) 在嚴格條件下與上述(h)的多核苷酸雜交并能夠表達具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸；和(j)包含與上述(h)的多核苷酸具有80%或更高的同源性的DNA序列并能夠表達具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽的多核苷酸。
3. 根據權利要求1或2的藥物組合物，其中所述血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性是對膠原誘導的血小板聚集的抑制活性和/或對血小板粘附至膠原的抑制活性。
4. 根據權利要求1或2的藥物組合物，其中所述藥物組合物對膠原具有結合能力。
5. 血小板聚集抑制劑和/或血小板粘附抑制劑，其包含權利要求l 所述的多肽，或權利要求2所述的由多核苷酸表達的表達產物。
6. 篩選血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的激動劑的方法，其中權利要求1所述的多肽的血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的水平在對象物質的存在或缺乏下測量，并將對象物質存在下的測量值與對象物質缺乏下的測量值比較，選擇增強抑制作用的對象物質作為激動劑。
7. 篩選血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的激動劑的方法，其中權利要求2所述的由多核苷酸表達的表達產物的抑制活性的水平在對象物質的存在或缺乏下測量，并將對象物質存在下的測量值與對象物質缺乏下的測量值比較，選擇增強血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的對象物質作為激動劑。
8. 篩選候選物質的方法，所述候選物質激動權利要求1所述的多肽或權利要求2所述的表達產物的血小板抑制活性和/或血小板粘附抑制活性，所述方法包括下列步驟(l)-(4):(1) 制備培養基的步驟，所述培養基包括用表達權利要求1所述的多肽的表達載體轉化的細胞或含權利要求2所述的表達產物的細胞，以及富血小板的血漿；(2) 向上述(l)的培養基添加血小板聚集劑，以在對象物質的存在或缺乏下誘導血小板聚集的步驟；(3) 在上述(2)的對象物質存在或缺乏下，測量血小板聚集水平的步驟；和(4) 當對象物質存在下的測量值大于對象物質缺乏下的測量值時，選擇該對象物質作為候選物質的步驟。
9. 用于篩選權利要求1所述的多肽或權利要求2所述的由多核苷酸表達的表達產物的激動劑的試劑盒，特征在于含有富血小板的血漿，權利要求1所述的多肽和權利要求2所述的表達產物的任一種，以及血小板聚集劑作為組分。
10. 分離的多肽，包含SEQIDNO:l的氨基酸序列。
11. 分離的多肽，包含SEQIDNO:3的氨基酸序列。
12. 分離的多肽，包含SEQIDNO:5的氨基酸序列。
13. 多核苷酸，包含SEQIDNO:2的DNA序列或其互補序列。
14. 多核苷酸，包含SEQIDNO:4的DNA序列或其互補序列。
15. 多核苷酸，包含SEQIDNO:6的DNA序列或其互補序列。
全文摘要
本發明提供藥物組合物，包含至少一種下列(a)-(d)的多肽作為活性組分(a)包含SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽；(b)包含在上述(a)的氨基酸序列中含一個或多個氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽；(c)包含SEQ ID NO3的氨基酸序列的多肽；以及(d)包含在上述(c)的氨基酸序列中含一個或多個氨基酸缺失、插入、取代或添加的氨基酸序列并具有血小板聚集抑制活性和/或血小板粘附抑制活性的多肽。
文檔編號G01N33/50GK101273128SQ20068003529
公開日2008年9月24日申請日期2006年11月2日優先權日2005年11月4日
發明者吉田榮人, 周藤俊樹申請人:學校法人自治醫科大學;大塚制藥株式會社

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