與fc受體結合的抗體藥物的藥效測定的制作方法

專利名稱：：與fc受體結合的抗體藥物的藥效測定的制作方法與FC受體結合的抗體藥物的藥效測定發明領域本發明涉及到一種鑒定抗體的方法，該方法適于用作包含抗體的藥物組合物批簽發的藥效測定方法，尤其適用于申請上述藥物的上市許可。發明背景當生產一種藥物組合物時，僅把原料藥制成藥品是不夠的，得到使用該藥物組合物國家的藥物監管機構的批準也很重要。美國的監管機構是美國食品藥品監督管理局(FDA)(http:〃www.fda.gov/)。歐洲例如歐洲藥品監管局(EMEA)(http:〃www.emea.eu.int/)。評審過程受到嚴格控制，為了獲得批準，監管機構要求藥物研發人員遞交大量藥物相關信息。這可能包括關于藥品藥效及其測定方法的信息。這些藥效測定可以鑒定該藥品、監測批次之間的均一性并且確保藥物的穩定性，因此這些測定方法應該足夠靈敏，可以檢測出影響藥品機制與功能的差異，并因此具有潛的臨床重要性。另外，藥效測定方法與公認的該藥品生理/藥理活性具有密切的關系。一種適當的藥效測定方法應該滿足以下基本標準-能再產品規格內測定藥效-具有檢測潛在臨床重要性差異的高靈敏度-與該產品公認的生理/藥理活性的作用機制具有密切聯系根據以上基本標準選定的藥效測定方法也要滿足以下二級標準-體外和體內測定變異性足夠低(達到所需精密度以保證藥品規格)-具有足夠的穩定性(robustness)-可應用于高通量分析重組單克隆抗體制備技術的發展促進了大量針對疾病靶的單克隆抗體治療用途的研究。全球已有數個單克隆抗體藥物被批準投放市場或正在進行臨床研究。一種抗體作為藥物的療效取決于該抗體結合抗原的能力，但常常抗體FC介導的活性在作用機制中也起著重要作用。確實，盡管一些抗體藥物只是通過該抗體結合抗原從而阻斷配體與抗原的結合，但是某些抗體藥物的作用可能還依賴于效應器功能，例如FC受體的結合作用和/或補體激活的誘導作用。扎木單抗(zanolimumab)(也稱為HuMax-CD4)是一種完全人源單克隆抗體，它具有一條IgGl重鏈和一條靶向于人CD4(EP0854917)的kappa型(IgGlK)的輕鏈。在哺乳細胞(CHO)中生產扎木單抗并經親和、離子交換和分子排阻純化。扎木單抗藥品是將該藥物以20mg/ml溶解在pH7.4磷酸鹽緩沖鹽水中制備而成。扎木單抗的作用機制之一是消除和/或滅活CD4+T細胞。這些可能通過(例如抗體)依賴的細胞介導細胞毒作用、下調T細胞表面的CD4表達和/或干擾CD4信號傳導、T細胞激活和T細胞增殖完成。所有這些類型的作用機制均依賴于位于Fab片段的扎木單抗抗原結合部分對CD4抗原的結合。另外，ADCC和CD4下調需要扎木單抗的Fc區域與Fc受體結合。ADCC誘導已被確認為扎木單抗一個重要的作用機制。Zalutumumab(也稱為HuMax-EGFr)是靶向于人EGFr的人源抗體，它有一條IgGl同型重鏈和一條kappa型(IgGlK)(WO02/100348)輕鏈。目前Zalutumumab在哺乳細胞(CHO)懸浮培養物中生產，使用GS載體系統表達Zalutumumab并用親和層析、離子交換(包括特異性病毒滅活和去除步驟)純化制得。藥品Zaltumumab(20mg/ml)是將該藥物以25mg/miZaltumumab稀釋在含有50mM磷酸鈉、50mM氯化鈉、3%(w/v)甘露醇、0.02%(w/v)聚山梨醇酯80和0.01%(w/v)EDTA的緩沖液中，并將pH調至6.0。在小鼠中少量HuMax-EGFr受體結合率也可觀察到抗腫瘤效果，這4艮可能是由于免疫效應器機制尤其是ADCC的參與。所以，HuMax-EGFr的作用機制之一ADCC是通過FC.FCR相互作用發揮的。Fc結合Fc受體的抗體藥效起著重要作用，因為通常使用生物測定來判斷該作用機制，其中被檢測的作用取決于Fc-Fc受體的結合。這些測定包括ADCC,需要抗體交聯的T細胞激活誘導或抑制，或對產生細胞因子例如白細胞介素2(IL-2)的誘導或抑制。然而，這些測定是相對繁瑣的并且變異性高，這是由細胞培養物或原代細胞的預期變異造成的。尤其適原代細胞會引起變異性這是由供體的免疫狀態、表達基因的多態性和細胞型純度的差異引起的。因此這些生物測定法不是最優選的測定批簽發的方法。因此我們需要一種快速、高效和靈敏的藥效測定方法，該方法與該抗體藥品的作用機制和公認的生理/藥理活性密切相關，該抗體藥品用于藥物組合物生產尤其是包含抗體的藥物成份并且其作用機制依賴于與Fc受體的結合。發明概述本發明提供一種包含FcR結合肽的藥品的藥效測定方法，其中，藥品FcR結合肽至少有一種作用機制是通過藥品FcR結合肽與Fc受體結合而介導，其中上述方法包括對藥品FcR結合肽與Fc受體結合的測定。附圖簡述圖1:扎木單抗批產品非還原SDS-PAGE。MEV001、MEV005、MRS-CD4-001、BN078和BOU8是具有不同重鏈糖基化的扎木單抗批產品。UNG-MRS-CD4是一個脫糖基化扎木單抗批產品(缺乏結合于抗體FcAsn297的糖類)，M0CK-MRS-CD4是一個偽脫糖基批產品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4為混合批產品，分別為90%重鏈糖基化和50%重鏈糖基化(脫糖基化和完全糖基化參比批產品的混合物)。圖2:扎木單抗批產品還原SDS-PAGE。MEVOOl、MEV004、MEV005、MRS-CD4-001、BN078和B0118是具有不同重鏈糖基化的扎木單抗批產品。UNG-MRS-CD4是一個脫糖基化扎木單抗批產品(缺乏結合于抗體FcAsn297的糖類)，M0CK-MRS-CD4是一個偽脫糖基化批產品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4為混合批產品，分別為90%重鏈糖基化和50%重鏈糖基化(脫糖基化和完全糖基化參比批產品的混合物)。圖3:扎木單抗批產品誘導ADCC的能力。圖3顯示了相對于參比批產品MRS-CD4-001的相對活性(源于基線(botom)固定曲線的ECso值)和95%置信區間的幾何均數。圖4:脫糖基化混合批產品誘導ADCC的能力。參比批產品MRS-CD4-001、偽脫糖基化批產品M0CK-MRS-CD4和混合批產品(脫糖基化和糖基化GMP#3批產品的混合物)M50-GMP#3-CD4(50%脫糖基化GMP#3)、M70-GMP#3-CD4(30%脫糖基化GMP#3)和M90-GMP#3-CD4(10%脫糖基化GMP#3)。3組實-驗(或見表格2)中一個代表性實驗的結果顯示了在一定濃度(部分)脫糖基化批產品(單一數據點)存在下CD4+T細胞的特異性溶解。圖4A:將基線設定為一個固定值采用4參數對數擬合進行曲線擬合。圖4B:限定基底水平、頂點水平和坡度，采用4參數對數擬合進行曲線擬合。GMP#3是專利批產品。圖5:扎木單抗批產品與板結合的FcYRIIIaECD176Vhis的結合。圖5顯示了相對于參比批產品MRS-CD4-001的相對藥效和95%置信區間的幾何均數。MEVOOl、MEV005、BN078和BOU8是具有不同重鏈糖基化的扎木單抗批產品。M0CK-MRS-CD4是一個偽脫糖基化批產品，M卯-MRS-CD4和M50-MRS-CD4為混合批產品(脫糖基化和完全糖基化參比批產品的混合物)，分別為90%重鏈糖基化和50%重鏈糖基化的。圖6:扎木單抗脫糖基化混合批產品與板結合的FcyRIIIaECD176Vhis的結合。參比批產品為MRS-CD4-001,MOCK-MRS-CD4是一個偽脫糖基化批產品，M50-GMP#3-CD4、M70-GMP#3-CD4和M90-GMP#3是混合批產品(脫糖基化和糖基化GMP#3批產品的混合物)。2組實驗(也見表格3的數據)中一個代表性實驗的結果顯示了在一定濃度(部分)脫糖基化批產品(三重測定數據點)存在下與FcYRHIaECD176V的結合情況。限定基底水平、頂點水平和坡度，采用4參數對數擬合進行曲線擬合。GMP#3是專利批產品。圖7:扎木單抗批產品的重鏈糖基化和與FcyRIIIaECD176VHis結合能力的關系。圖6和表格3描述的批產品(從左到右)才艮據它們的重鏈糖基化含量分類。結果顯示了相對于母體批產品GMP#3與FcyRIIIaECD176Vhis結合的相對藥效(2組實驗的平均值士SD)。圖8:扎木單抗批產品誘導ADCC能力與結合FcyRinaECD176VHis的關系。表2描述扎木單抗批產品誘導ADCC的相對藥效。圖6和表3顯示了扎木單抗批產品結合FcyRIIIaECD176VHis的相對藥效，以x-軸和y-軸繪制(相對于母體GMP弁3的藥效)。相關系數見曲線圖。圖9:扎木單抗批產品與板結合的CD4的結合。圖9顯示了相對于參比批產品MRS-CD4-001的相對藥效和95%置信區間的幾何均數。MEVOOl、MEV005、BN078和BOU8是具有不同重鏈糖基化的扎木單抗批產品，UNG-MRS-CD4是未糖基化的扎木單抗批產品，MOCK-MRS-CD4是一個偽脫糖基化批產品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4為混合批產品，分別為90%重鏈糖基化和50%重鏈糖基化(脫糖基化和完全糖基化參比批產品的混合物)。圖10:扎木單抗脫糖基化混合批產品與板結合的CD4的結合。參比批產品為MRS-CD4-001,MOCK-MRS-CD4是一個偽脫糖基化批產品，混合批產品(脫糖基化和糖基化GMP#3批產品的混合物)M50-GMP#3-CD4(50%脫糖基化GMP#3),M70-GMP#3-CD4(30%脫糖基化GMP#3)和M90-GMP#3(10°/。脫糖基化GMP#3)。2組實驗(也見表格3的數據)中一個代表性實驗的結果顯示了在一定濃度(部分)脫糖基化批產品(一式三份測定數據點)存在下與CD4的結合情況。限定基底水平、頂點水平和坡度，采用4參數對數擬合進行曲線擬合。GMP約是專利批產品。圖11:扎木單抗抑制IL-2產生的能力。MEV001、MEV005、MRS-CD4-001、BN078和B0118是具有不同重鏈糖基化的扎木單抗批產品，M0CK-MRS-CD4是一個偽脫糖基化批產品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4為混合批產品，分別為90%重鏈糖基化和50%重鏈糖基化(脫糖基化和完全糖基化參比批產品的混合物)。圖12:通過基于AlphaScreenTM的測定進行對數個扎木單抗批產品FcYRIIIaECD176VHis結合和CD4結合的篩選。圖12顯示了相對于參比批產品MRS-CD4-001的相對藥效和95%置信區間的幾何均數。MEV005、BN078和B0118是具有不同重鏈糖基化的扎木單抗批產品，UNG-MRS-CD4是未糖基化的扎木單抗批產品，MOCK-MRS-CD4是一個偽脫糖基化批產品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4為混合批產品，分別為90%重鏈糖基化和50%重鏈糖基化(脫糖基化和完全糖基化參比批產品的混合物)。圖13:扎木單抗結合細胞結合型FcYRI的能力。圖13顯示了相對于參比批產品MRS-CD4-001的相對藥效和95%置信區間的幾何均數。MEV005、BN078和B0118是具有不同重鏈糖基化的扎木單抗批產品，UNG-MRS-CD4是未糖基化的扎木單抗批產品，MOCK-MRS-CD4是一個偽脫糖基化批產品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4為混合批產品，分別為90。/。重鏈糖基化和50%重鏈糖基化(脫糖基化和完全糖基化參比批產品的混合物)。圖14:扎木單抗與板結合的FcyRI的結合能力。圖14顯示了相對于參比批產品MRS-CD4-001的相對藥效和95%置信區間的幾何均數。MEV001、MEV005、BN078和B0118是具有不同重鏈糖基化的扎木單抗批產品,，UNG-MRS-CD4是未糖基化的扎木單抗批產品，MOCK-MRS-CD4是一個偽脫糖基化批產品，M90-MRS-CD4和M50-MRS-CD4為混合批產品，分別為90%重鏈糖基化和50%重鏈糖基化(脫糖基化和完全糖基化參比批產品的混合物)。圖15:數個檢測中扎木單抗批產品誘導ADCC的能力與相關藥效的關系。將扎木單抗批產品根據重鏈糖基化水平和與數個所列檢測結果的相關性進行分類。15A:ADCC測定(圖3)。15B:CD4結合測定(圖9)。15C:FcyRI結合測定(圖13和14)。15D:FcyRinaECD176VHis結合(圖5)。15E:sCD4和FcyRinaECD176VHis結合(圖12)。圖16:在板結合的YRHIaECD176VHisELISA中比較兩種FcyRIIIaECD176Vhis來源的CH0-K1SVFc。將兩種不同的Fc7RIIIaECDi76VHis批產品(646-005-EP和655-015-EP)包被到板上并比較這些批產品與HuMax-CD4的結合情況。圖17:如實施例18中描述的FcyRinaECD176VHis批產品646-005-EP和655-015-EP的非變性電泳。圖18:未處理和脫糖基化FcyRIIIal76V的還原4-10%NupageBis-Tris分析。泳道1:未處理FcYRIIIaECD176VHis批產品646-005-EP;泳道2:脫糖基化FcyRIIIaECD176VHis批產品646-005-EP;泳道3:未處理FcyRIIIaECD176VHis批產品655-015-EP;泳道4;脫糖基化FcyRIIIaECD176VHis批產品655-015-EP。Markers(kDa)的遷移情況顯示在左邊泳道。圖19:未處理和去唾液酸化FcyRinaECD176VHis的還原4-10。/。NupageBis-Tris分析。泳道1:未處理FcyRIIIaECD176VHis批產品655-015-EP;泳道2:去唾液酸化FcyRIIIaECD176VHis批產品403-041-EP。Markers(kDa)的遷移情況顯示在左邊泳道。圖20:未處理和去唾液酸化FcyRIIIaECD176FHis的非還原電泳。泳道l:去唾液酸化FcYRIIIaECD176VHis批產品655-015-EP;泳道2:未處理FcyRniaECD176VHis批產品403-041-EP。指示markers(kDa)的遷移情況顯示在左邊泳道。圖21:在板結合的FcYRIIIaECD176Vhis結合ELISA中比較去唾液酸化和未處理的FcyRIIIaECD176VHis。將相同濃度的去唾液酸化FcYRIIIaECD176VHis(批產品403-041-EP)和未處理FcyRinaECD176VHis(655-015-EP)包被到板上并比較扎木單抗與這些批產品的結合情況。圖22:比較去唾液酸化和未處理FcyRIIIal76V的包被效率。將去唾液酸化和未處理FcyRIIIal76V的系列稀釋物包被到板上，用鼠隱抗-CD16檢測結合受體。圖23:圖23顯示了抗體HuMax-EGFr的兩個批次產品與FcYRIIIaECD176VHis的結合曲線(數據以平均值士SD表示，n=3),用抗體直接(A)(上組)包被或經過his-捕獲(抗-多聚組氨酸)抗體(B)(下組)包被FcyRinaECD176VHis。圖24:扎木單抗下調CD4+T細胞的CD4表達。A-CD4表達的劑量-反應圖，該表達在與可溶性扎木單抗溫育(在存在或缺乏單核細胞，使用或不使用IFNy的情況下)18個小時的純化的血CD4+T細胞中進行。B-CD4表達的劑量反應圖，該表達在與可溶性扎木單抗、扎木單抗的F(ab，)2片段或對照抗體HuMab-KLH在THP-1細胞存在或缺乏的情況溫育18h的CD4+CEM-NKr細胞中進行。用非竟爭抗-CD4抗體MT-477測定CD4表達。圖25:序列表序列列表筒述SEQIDNo:1-FcyRIaECDHisSEQIDNo:2-Fcy腿aECD176VHisSEQIDNo:3-Fcy腿aECDl76FHisSEQIDNo:4-引物PlSEQIDNo:5-引物P2SEQIDNo:6-引物P3SEQIDNo7-引物P4SEQIDNo8-引物P5SEQIDNo9-引物P6SEQIDNo10-引物P7SEQIDNo11-引物P8縮寫列表ADCC抗體依賴的細胞毒性作用CHO中國倉鼠卵巢細胞ELISA酶聯免疫吸附測定F(ab')2抗體可變結構域的二聚體Fc抗體恒定區FcRFc受體FcyRIa免疫球蛋白yFc受體I-AFcyRIaECDHis含有C末端His6標簽的FcyRIa胞外結構域FcYRIIIa免疫球蛋白yFc區受體III-AFcyRinal76VFcyRnia的176位是Val,從成熟、加工過的蛋白開始編號，它也被稱為FcyRIII158VFcyRinaECD176FHis具有C末端His6標簽和176F多態性的FcyRIIIa細胞外結構域FcyRIIIaECD176VHis具有C末端His6標簽和176V多態性的FcYRIIIa細胞外結構域FcyRIII158V見以上FcYRIIIal76V項下的內容Fv抗體可變結構域(抗原特異性)IgGl,k含有kappa輕鏈的免疫球蛋白GIL白細胞介素nk自然殺傷細胞PBMC外周血單核細胞PBS磷酸鹽緩沖鹽水PBSC含2。/。(v/v)雞血清的PBSPBST含0.05%(v/v)Tween-20的PBSPBSTC含0.05%(v/v)Tween-20和2%(v/v)雞血清PBSPMN多型核細胞RT室溫RZPDDeutschesResourcenzentrumfiirGenomforschungSDS-PAGESDS聚丙烯酰胺凝膠電泳TNF腫瘤壞死周子發明詳述本發明提供一種適于作為藥物組合物批簽發的藥效測定的方法，其中該藥物組合物包含可以結合Fc受體Fc結合區的肽。在本申請中這些小肽也可被稱為"Fc受體結合肽"或"FcR結合肽"。本發明提供了一種包含FcR結合肽的藥品的藥效測定方法，其中，藥品FcR結合肽至少有一種作用機制是通過藥品FcR結合肽與Fc受體結合介導，其中上述方法包括測定藥品FcR結合肽與Fc受體的結合。除非另外聲明或與申請相矛盾，本發明中的肽包括任何合適的肽，它們可以作為多肽和蛋白的同義詞，條件是讀者意識到每種含有各自的氨基酸多聚體的分子之間存在顯著差異，因此形成本發明的單個實施方案(例如，一個由多條多肽鏈組成的抗體多肽顯著不同于單鏈抗體、小肽免疫粘合素或單鏈免疫肽)。因此，本發明中的肽應該被廣泛地理解為能結合Fc受體的任何適當大小和組成的任何合適地肽(就蛋白質分子的氨基酸數量和相關支鏈的數目而言)。另外，除非另外聲明或與申請相矛盾，這里所描述地發明方法中的肽可能包含非天然產生和/或非L型氨基酸殘基。除非另外聲明或與申請相矛盾，專利中的肽(如果作為多肽和/或蛋白的單個實施例討論)也包含衍生肽分子。簡單地說，本發明中的衍生物為一個或多個氨基酸殘基被化學修飾(例如烷化、酰化、酉旨化或酰胺形成物)或與一個或多個非氨基酸的有機和/或無機原子或分子取代基(例如聚乙二醇(PEG)基團)、親脂取代基(通過間隔區殘基選擇性地與肽的氨基^列或基團例如p-丙氨酸，Y-氨基丁酸(GABA)，L/D-谷氨酸，琥珀酸等相連)、焚光基團、生物素、放射性核素結合的肽，例如見專利US4766106,US4179337,US4495285和US4609546。除非另外聲明或與申請相矛盾，一個FcR結合肽也可能包括或替代性地包括非必需、非天然和/或非L型氨基酸殘基。這些氨基酸殘基的非限制實例包括例如2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、P-丙氨酸、|3-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、鎖鏈(賴氨)素、2,2'-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥賴酸、別羥脯氨酸、3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸、鎖鏈(賴氨)素、別異亮氨酸、N-曱基甘氨酸、N-曱基異亮氨酸、6-N-曱基賴氨酸、N-甲基纈氨酸、戊氨酸、己氨酸、鳥氨酸和他汀類卣代氨基酸。因此本申請的FcR結合肽也包括融合蛋白，它可包含任何合適的氨基酸序列或組合序列，該序列能結合Fc受體的Fc結合區并且至少具有一個非同源性和典型的具有足夠非相性的氨基S^列，其中該序列具有一種可檢測生物功能并且/或是融合蛋白特有的，這一特性不僅僅屬于Fc受體特異序列(例如可能是這里描述的抗體)，例如體內半衰期的延長、熒光強度的增加、附加表位標簽、對某類型細胞的靶向性增強等等。這些融合蛋白的功能序列可被柔性鏈接肽分隔開。二級序列也可來自細胞毒素或凋亡小肽。二級序列也可具有"^斷特性。這些序列的實例包括那些來源于易顯色的酶的序列，例如辣根過氧化物酶。FcR結合肽也包括能結合Fc受體的Fc結合部分的肽，該肽與治療實體綴合。例如，這樣的治療實體包括細胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素。治療實體不必限定為傳統化學治療藥物，但可能也包括具有所需生物活性的蛋白或多肽。這些蛋白可能包括，例如，具有酶活的毒素或它的活性片段，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白例如胂瘤壞死因子或干擾素i;或生物反應修飾劑例如淋巴因子、白介素-l(IL-l)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)或其它生長因子和分離自線粒體的凋亡誘導蛋白。它也可能是細胞表面具有活性的藥物，例如具有磷脂酶活性的磷脂酶C。FcR結合肽也包括與下列物質綴合的FcR結合肽；例如放射性同位素、放射性核素、酶(例如用于檢測的酶、辣根過氧化物酶、P-半乳糖普酶、焚光素酶、堿性磷酸酶、葡萄糖過氧化物酶等)、酶的催化底物、輔因子、熒光標記(例如熒光素、熒光異硫氰酸鹽、堿性蕊香紅、丹磧酰氯、鑭磷和類似的物質等，還有^Eu標記等、異硫氰酸鹽標記、藻紅蛋白標記、藻青蛋白標記、鄰苯二醛標記或熒光胺標記或等)、化學發光標記(例如苯巴比妥標記、異苯巴比妥、芳香吖啶酯標記、。米唑標記、吖"定鹽標記、草酸酯標記、熒光素標記、焚光素酶標記、水母發光蛋白標記等)、肽標簽(例如可被第二報告基因識別的預定多肽表位，例如亮氨酸拉鏈配對序列、融合抗體的結合位點、金屬結合結構域、抗原決定表位標簽等)、磁性珠、核酸或核酸相關分子(例如核糖核酸酶、反義核酸、抑制RNA分子(例如siRNA分子)、適體、核糖酶、三聯分子、外部引導序列、免疫抑制核酸、表達腫瘤抑制基因的表達盒、抗癌疫苗、抗癌細胞因子、凋亡因子或一個或多個細胞毒性蛋白)、核酸酶、激素、免疫調節劑、螯合劑、硼化合物、光敏試劑、染料等。FcR結合肽也包括含有一個或多個》文射標記氨基酸或自旋標記分子的FcR結合肽。多肽放射性標記的非限制性實例包括3！1、"C、FcR結合肽也包括交聯FcR結合肽衍生物。例如，交聯衍生物可由兩個或多個抗體交聯產生，至少其中一個能結合到Fc受體的Fc結合區(同一種類型或不同類型，例如產生雙特異性抗體)。如果肽類似物能結合Fc受體的Fc結合區，本發明方法也能用于藥效測定。因此這些肽類似物也包括在FcR結合肽中。藥品是含有治療作用藥物的組合物，將該組合物給予需要藥物治療的病人。在一個實施方案中，所述藥品是含有抗體的藥品，例如重組生產的抗體藥物。對于重組抗體藥物而言，重組抗體藥物最初在宿主細胞中產生，經過重組DNA技術的細胞融合、收獲、純化抗體并配制成抗體藥物。本
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眾所周知生產抗體細胞類型的選才奪、修飾酶(例如糖類轉移酶)的共轉染和培養和/或工藝條件的不同可能影響所獲得抗體的藥效。重組肽的生產也同樣。重組抗體的收獲、純化和配方方法在工藝上是已知的，可能包含一步或更多步驟例如凈化、濃縮、過濾和色語層析(例如分子排阻和離子交換層析)。除了藥物以外，藥品還包含任何數量的其他例如在純化過程中添加的成份，這些成份應當是藥用上可接受的，例如載體、稀釋劑、佐劑和輔料。藥用載體或稀釋劑還有任何其他已知佐劑和輔料的實例都是本領;或已^口的，例3口Remington(TheScienceandPracticeofPharmacy,19thEdition,Gennaro，Ed"MackPublishingCo"Eastern,PA，1995)中乂>開的物質。本發明的抗體指的是免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子片段或它們的衍生物，它們能在特定的生理條件下特異性地與抗原結合顯著較長的時間，例如半衰期至少達到約30min，至少約45min，至少約lh，至少約2h，至少約4h,至少約8h，至少約12h，約24h或更多，約48h或更多，約3，4，5,6,7或更多天等或任何其他相關功能-確定期(例如足夠誘導、促進、增強和/或調節與抗體結合抗原相關的生理反應的時間)和與Fc受體結合的能力。免疫球蛋白指一類結構相關的糖蛋白，它包含兩對多肽鏈，一對低分子量輕鏈(L)和一對重鏈(H)，通常這四條鏈由二硫鍵聯接。免疫球蛋白結構已經被清楚地闡述，例如見《基礎免疫學》第7章(Paul，W.,ed.,第2版，Raven出版社,紐約(1989))。簡單地說，通常每條重鏈由一個重鏈可變區(這里簡稱為VH)和一個重鏈恒定區組成。重鏈恒定區通常由三個結構域CH1、Ch2和CH3組成。每條輕鏈特通常由一個輕鏈可變區(這里簡稱為VJ和一個輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區通常由一個結構域CL組成。VH和VL進一步細分為高度可變區(或者是在序列上高度可變和/或形成結構限定環的高度可變區)，也稱為互補決定區(CDRs)，與更保守的框架區(FRs)交替排列。每個VH和Vl通常由三個CDRs和四個FRs組成，從氨基端到羧基端按下列順序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(見Chothia和Lesk的J.Mol.Biol.巡901-917(1987))。通常這個區域的氨基酸殘基的編號是按照以下文獻中的方法進行Kabat等，《免疫學相關關蛋白序歹寸(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest)》，第5版，公眾健康服務(PublicHealthService),國家健康研究所(NationalInstitutesofHealth),Bethesda，MD.(1991)(在Kabat中或根據Kabat例如"可變結構域殘基的編號"這樣的術語指重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編號系統)。使用這種編號系統，與縮短或插入可變結構域FR或CDR相對應，一個肽的實際線性氨基酸序列可能包含更少或額外氨基酸。例如，重鏈可變結構域可能包括VHCDR2第52位氨基酸殘基之后插入的單個氨基酸(根據Kabat命名為殘基52a)和在重鏈FR氨基酸殘基82之后插入的氨基酸(例如根據Kabat命名為殘基82a,82b和82c等)。可以使用"標準，，Kabat編號序列通過對該抗體同源序列區域進行調整來確定某一抗體的Kabat殘基編號。在一個抗體中，免疫球蛋白分子的重鏈、輕鏈可變區包含一個與抗原相互作用(Fv片段)的結合結構域。抗體的恒定區(.Abs)可能介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括通過Fc受體和經典補體系統的第一補體(Clq)作用的各種免疫系統細胞(例如效應器細胞)。本發明使用的抗體可能是雙特異性抗體或類似的分子。確實，雙特異性抗體和其類似物除了與原始抗原的一部分結合之外還可能與任何適當的靶點結合，只要它們保留了能與Fc受體結合的部分力。如上所述，除非另外說明或與本申請內容相矛盾，這里的抗體包括保留了特異性結合抗原和Fc受體能力的一種抗體的片段、衍生物、變異體(包含缺失變異體)。此外，雖然Fv片段的兩個結構域和VH是由兩個獨立的基因編碼，但可以通過重組方法使用可以將他們連接成單個蛋白鏈的合成連接肽將這兩個結構域是融合，在該蛋白中VL和VH配對形成單價分子(稱作單鏈抗體或單鏈Fv(scFv),見Bird等，Science里，423-426(1988)和Huston等，PNASUSA並，5879-5883(1988))。除非另外說明或與本申請內容相矛盾，這樣的單鏈抗體也屬于抗體范疇。單鏈抗體的其它形式例如專利WO2005037989中描述的分子也屬于抗體范疇，它們共同并且獨立地成為本發明地獨特之處，顯示出不同的生物特性和效用。應當理解地是抗體也廣泛地包括多抗、單抗、例如嵌合抗體、人源化抗體、人源抗體和抗體樣多肽。抗體可以指特異性同型抗體，重鏈恒定區基因編碼的一類免疫球蛋白例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM。每個同型抗體具有獨特的氨基酸序列和具有一套可將它們彼此區別開來地的同型抗原表位。一種抗體的療效是通過抗體的高度可變區結合與抗原結合和抗體Fc區與Fc受體結合實現地。治療用肽可能也通過與Fc受體結合發揮治療作用。Fc受體屬于免疫球蛋白恒定區具有某些特定氨基酸的受體家族。每個細胞的受體表達情況依賴于受體類型。所有種類的免疫球蛋白受體已經:故闡明。它們凈皮稱為FcyR(IgG類)、FcaR(IgA類)和FcsR(IgE類)。根據與IgG結合的親和力和與IgG同型結合的相對親和力已經鑒定出多種FcyRs;更多FcyR受體方面的信息見vanSorgeNM等，TissueAntigens,a(3)，189-202(2003)。本發明4吏用的Fc受體可能是全長Fc受體或保留了與Fc區結合能力的片段，如胞外結構域。本發明使用的Fc受體也可能是任何同種型免疫球蛋白或其突變體的野生型Fc受體，其功能與Fc受體的功能相關，Fc受體結合肽在體內與其結合。本發明使用的Fc受體也可能是一種肽，它可能不是天然Fc受體(或片段或其衍生物)，這種肽可以與抗體Fc部分的Fc受體結合區域結合，其中FcR結合肽與Fc結合肽的結合內Fc受體的功能相關，在體內FcR結合肽與其結合。本發明使用的Fc受體可能如實施例部分描述的由宿主細胞瞬時表達產生或由穩定轉染細胞系或該
技術領域：
任何其它的已知方法生產。他們也可能存在于細胞表面，例如一種真核細胞，例如用表達具有穿膜結構域Fc受體核酸轉染的酵母細胞或哺乳動物細胞。這里的"宿主細胞"(或重組"宿主細胞")意指轉入重組表達載體的細胞。應當理解的是這一術語不僅僅指特定受體細胞，也指這些細胞的子代。由于突變或環境影響后代細胞可能發生某些變異，這樣的子代細胞可能不與母細胞完全相同，但仍屬于這里使用的"宿主細胞"范疇。重組宿主細胞包括轉染哺乳細胞，例如CHO細胞、NS/0細胞和淋巴細胞。如這里所示，含有肽(取決于其募集表達Fc受體細胞的作用機制)的藥品與Fc受體結合的能力與當將該肽藥品給予需要的病人時的療效密切相關。一種藥品的藥效時在一種特異性檢測中活性的量度，該檢測與療效已^皮^r測的該藥品的參比標準的活性相關。對于肽，(例如抗體)，尤其是通過與Fc受體結合發揮作用，依據本發明的某種方法適于測定肽藥品藥效，因為肽與Fc受體的結合直接指明了該肽的作用機制。因此使用本發明提供的方法能在不使用繁瑣的測定方法的條件下測定FcR結合肽的藥效，例如在測定IL-2的產生或ADCC的i秀導作用時，對藥效的測定是根據基于細胞檢測的FcR結合肽與Fc受體的結合效果而測定的，本發明使用的方法僅通過測定FcR結合肽與Fc受體的結合作用來測定藥效。本發明也提供了包含FcR結合肽的藥品的一種藥效測定方法，本方法包括「i)測定參比標準FcR結合肽與Fc受體的結合作用；ii)測定藥品FcR結合肽與上述Fc受體的結合作用；和iii)比較步驟ii)中的FcR結合與步驟i中的)FcR結合，使用比較得到的信息來評價藥品藥效。其中a)步驟ii)的Fc受體結合與步驟i)的Fc受體結合的測定方法相同，b)藥品FcR結合肽的至少有一種作用機制是通過FcR結合肽與Fc受體結合來介導，c)其中參比標準FcR結合肽和藥品FcR結合肽是相同FcR結合分子的兩種不同制劑。本方法適于分析不同批次特定FcR結合肽的生產。比較藥品FcR結合肽與Fc受體的結合與參考標準FcR結合肽和Fc受體的結合，藥品FcR結合肽的治療效果是通過其具有與參考標準FcR結合肽相同的或類似程度的與Fc受體的結合能力來評價的。參考標準FcR結合肽的藥效也可能通過使用其它方法檢測，例如用基于細胞的方法或對IL-2產生的抑制，以確定參比標準FcR結合肽確實具有期望的治療效果。根據本專利，參比標準FcR結合肽的FcR結合曲線適于指示該參比標準FcR結合肽核任何表現出與參比標準FcR結合肽相同的或大致相似的FcR結合曲線的任何FcR結合肽。藥品FcR結合肽的FcR結合曲線與參比標準FcR結合肽的FcR結合的相異程度可以在個案的基礎上確定，例如與適當的監管機構合作確定。為了FcR結合測定方法的可靠性和一致性，藥品FcR結合肽和參比標準FcR結合肽的FcR結合應該在同一個測定中進行，例如本文其它地方描述的測定方法。參比標準FcR結合肽的結合測定一般是先建立一個之后的任何FcR結合肽批產品都可以與之比較的標準。然而，參比標準FcR結合肽的結合測定也可能與藥品FcR結合肽的FcR結合測定同時進行或之后進行。本發明也提供了一種生產包含FcR結合肽的藥物組合物的方法，該方法包括a)生產包含所述FcR結合肽的藥品b)用上述方法測定包含FcR結合肽的藥品的藥效；c)使用步驟b)獲得的信息作為評價藥品是否可以作為藥物組合物來使用的部分評價依據。藥品生產可以用任何方法，包括所需要的和/或適于藥品和/或相關小肽的方法。然后用^r測藥品肽與Fc受體結合的方法測定藥品。上述方法的測定結果應作為藥品是否可以作為藥物組合物來使用的一個指標，例如，當需要注射藥品時，該藥品是否達到這一國家監管機構i殳定可以注射給病人的標準。本發明也提供上述方法，其中上述方法是作為將某種藥品作為藥物組分銷售時進行上市許可申請中的一部分。本發明也提供一種申請包含FcR結合肽的藥品的上市許可的方法，該方法包括對上述測定藥品FcR結合肽藥效的方法進行描述。在一個實施方案中，根據本發明對包含FcR結合肽的藥品進行的藥效測定用于批簽發的藥效測定。對藥品的連續生產可以得到不同批次的作為藥品的產品。生產的一個關^:特征是確保不同批次藥品達到相同標準。通常這個標準一般與監管機構協作設定。一般對每批產品都進行檢測并用足夠數量的不同檢測方法檢驗來確保該批產品質量足以被批準上市。這些檢測方法之一可能是，而且經常是測定藥品是否達到要求的藥效藥效測定。對于由重組肽組成的藥品，例如重組抗體，它們的藥效常依賴于重組生產肽的質量。對于通過與Fc受體結合介導其作用的抗體，該抗體在這方面的質量常依賴于抗體Fc部分的糖基化程度。然而，測定抗體Fc部分糖基化方法和其它已知的直接或間接的藥效測定方法都非常繁瑣或在生產過程中不能穩定地有效可信地利用，例如測定藥品激發ADCC能力的方法或測定T細胞信號傳導的方法(例如測定活化標記物的上調和/或自分泌因子的增殖和產生)。然而，如其它部分所述，本發明提供的方法適合用于測定抗體藥品的藥效，因此適合用于批簽發的藥效測定。在一個實施方案中，FcR結合肽與Fc受體的結合用以下方法來測定(i)使藥品樣品與Fc受體接觸足夠長時間使FcR結合肽與Fc受體結合(ii)檢測FcR結合肽與Fc受體結合的數量在進一步的實施方案中，使用定向于FcR結合肽的檢測抗體來檢測，其中，檢測抗體是標記抗體。在一個實施方案中，用ELISA(酶聯免疫吸附測定)檢測FcR結合肽((例如抗體))與Fc受體的結合，見MarguliesD.H.199.Inductionofimmuneresponses.InCurrentProtocolsinImmunology(Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.,Margulies,D.H.,Shevach，E.M.,Strober,W"eds.pp2,1.2-2.1.20JohnWiley&Sons,NewYork)。在一個實施方案中，用AlphaScreenTM測定FcR結合肽((例如抗體))與Fc受體的結合。簡單地說，用受體珠固定FcR蛋白，用供體珠包被相關抗原(例如sCD4)。可以使用不同包被系統，受體珠和供體珠可以互換。受體珠和供體珠大小接近(約〈200nm)以使被檢測抗體與Fc受體和抗原生物性結合。在680nm處激發時供體珠的光每文劑將環境氧(ambientoxygen)轉換為單線態。單線態氧分子擴散出與受體珠上的二曱基瘞吩衍生物反應形成化學發光。化學發光活化受體珠上的熒光基團，在520nm-620nm處產生光輻射。(http:〃www.perkinelmer.co.ip/tech/techIs/protocolcollection/asc-001.pdf)。在一個實施方案中，使用放射免疫測定FcR結合肽((例如抗體))與Fc受體的結合(Cooper,H.M.,andPaterson，Y.Determinationofthespecificantibodytiter.InCurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel，RM.，Brent,R.，Kingston,R.E.，Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith,J.A，andStruhl，K，eds.)ppll.17,1-11.17.13JohnWiley&Sons,NewYork,1993)。在一個實施方案中，使用BIAcore測定FcR結合肽((例如抗體))與Fc受體的結合。BIAcore的工作原理是表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance,SPR)，它使得能夠測定表面折光指數的變化。簡單地說，將一種相互作用劑(配體例如Fc受體)固定于感受器芯片的表面。使含有潛在結合配偶體的溶液(藥品抗體)通過固定化的表面，可以通過表面折光指數隨時間的變化觀查結合情況(反應單位(RU))(D.G.MyszkaandR.L.Rich,Implementingsurfaceplasmonresonancebiosensorsindrugdiscovery,Pharm.Sci.Technol.Today2,310"317(2000)。在一個實施方案中，使用Akubio聲學生物感受器測定FcR結合肽((例如抗體))與Fc受體的結合(更多信息見www.akubio.com/)。在一個實施方案中，使用FMAT測定FcR結合肽((例如抗體))與Fc受體的結合，例如FLISA(焚光連接免疫吸附測定)。簡單地說，用珠固定FcR蛋白(例如含有生物素化FcR的抗生物素蛋白鏈菌素珠)，再加入抗體，用Cy5綴合抗IgG檢測，用FMAT讀出數據。可以4吏用不同的包^皮和;險測系統(Miraglia，S.etal,JBiomolScreen.4,193-204(1999)。在一個實施方案中，用DELFIA測定FcR結合肽((例如抗體))與Fc受體的結合。筒而言之，在DELFIA測定中，DELFIA也稱作時間-分辨(time-resolved)焚光免疫測定，將抗體(例如使用抗人IgG)結合在微量滴定板上，通過加入生物素化FcR測定FcR結合，例如用Eu-(銪)標記地抗生物素蛋白鏈菌素檢測。在用DelfiaFluorometer例如VICTOR儀器計數前用強化溶液進行強化。VICTOR儀器采用非常廣泛的技術包括熒光、發光、時間-分辨熒光、焚光極化和UV吸收對蛋白進行直接定量。可以使用多種選擇和組合。VICTOR3多標記微量板讀數器用于定量測定細胞和微生物學測定、結合研究和DELFIA測定中的光發射或光吸收標記(http:〃www.￡mi-inc.com/BioTechLab/Wallac%20Delfia%201234%20Fluorometer.htm)。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽((例如抗體))的一種作用機制是誘導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC)。ADCC是一個免疫反應，其中FcR結合肽((例如抗體))通過包被華巴細胞，使它們易于被包括但不限于NK細胞、PMN或單細胞/巨噬細胞的免疫細胞誘導裂解。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽((例如抗體))的一種作用機制是通過例如內化、脫落，加帽或其它形式的可以影響FcR交聯地改變細胞表面上的受體重排誘導下調靶受體的表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽((例如抗體))的一種作用機制是通過募集自然殺傷細胞的介導來調節。自然殺傷細胞(NK細胞)是對抗反應和消滅另一種細胞的細胞，對該細胞沒有預先致敏作用，在某些下可能不必識別特異抗原。然而，NK細胞可能也通過抗體Fc區被活化來誘導ADCC，Fc區的抗原結合結構域于細胞表面的抗體結合。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的作用機制是通過NK細胞誘導ADCC起作用的。在本發明的一個實施方案中，至少有一個與藥品FcR結合肽(例如抗體)結合的Fc受體在NK細胞上表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一個作用^U制是通過募集多形核白細胞(PMN)介導。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一個作用機制是通過經PMNs誘導ADCC介導。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一個作用機制是通過PMN脫粒誘導調節的。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一個作用機制是通過經PMN誘導的吞噬作用介導。在本發明的一個實施方案中，至少有一個在體內與藥品FcR結合肽(例如抗體)結合的Fc受體在PMNs上表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的作用機制是誘導血小板的聚集。在本發明的一個實施方案中，FcR結合肽的作用機制是通過募集血小板介導。在本發明的一個實施方案中，至少有一個在體內與藥品FcR結合肽(例如抗體)結合Fc的受體在血小板上表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是誘導細胞因子的產生。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的治療活性是通過募集自然殺傷細胞和/或T細胞介導的。在本發明的一個實施方案中，至少有一種在體內與藥品FcR結合肽(例如抗體)結合Fc的受體在自然殺傷細胞和/或T細胞中表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是通過誘導免疫負荷物的清除。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是通過募集單核細胞或巨噬細胞來介導。在本發明的一個實施方案中，至少有一種與藥品FcR結合肽(例如抗體)在體內結合的Fc受體在單細胞或巨噬細胞上表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是誘導抗體應答的下調。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是通過募集B細胞介導。在本發明的一個實施方案中，至少有一個與藥品FcR結合肽(例如抗體)在體內體內結合的Fc受體在B細胞上表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是誘導單核細胞和巨噬細胞效應器功能的抑制。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是通過募集單核細胞和/或巨噬細胞調節的。在本發明的一個實施方案中，至少有一種在體內與藥品FcR結合肽(例如抗體)結合的Fc受體在單細胞或巨噬細胞上表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一在本發明的一個實施方案中，至少有一種在體內與藥品FcR結合肽(例如抗體)結合的Fc受體在單細胞和/或巨噬細胞上表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是誘導吞噬作用。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是通過募集多形核白細胞、巨噬細胞和/或樹突狀細胞介導。在本發明的一個實施方案中，至少有一個在體內與藥品FcR結合肽(例如抗體)結合的Fc受體在多形核白細胞，巨噬細胞和/或樹突狀細胞上表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是通過單核細胞或巨噬細胞對吞噬作用的誘導來調節的。在本發明的一個實施方案中，至少有一種在體內與藥品FcR結合肽(例如抗體)結合的Fc受體在單核細胞或巨噬細胞上表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一個作用機制是誘導交聯。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一個作用機制是通過細胞和/或抗體的交聯作用來介導。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一個作用機制是誘導免疫受體基于酪氨酸的活化基序的正向信號傳導。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一個作用機制是通過募集骨髓細胞、T細胞和/或血小板介導。在本發明的一個實施方案中，至少有一種與藥品FcR結合肽(例如抗體)在體內結合的Fc受體在骨髓細胞，T細胞和/或血小板上表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是誘導經普通y,p,;鏈的正向信號傳導。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是通過募集骨髓瘤細胞，多形核單細胞，自然殺傷細胞或T細胞介導。在本發明的一個實施方案中，至少有一種在體內與藥品FcR結合肽(例如抗體)結合的Fc受體在骨髓瘤細胞，多形核細胞，自然殺傷細胞或T細胞上表達。在本發明的一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是誘導免疫受體基于酪氨酸的抑制基序的反向信號傳導。在一個實施方案中，藥品FcR結合肽(例如抗體)的一種作用機制是通過募集B細胞、巨噬細胞和/或單核細胞介導。在一個實施方案中，至少有一種與藥品FcR結合肽(例如抗體)在體內結合的Fc受體在B細胞、巨噬細胞和/或單核細胞上表達。在一個實施方案中，Fc受體是FcrRIa受體或及其保留與Fc區域結合能力的片段，例如胞外結構域。網狀內皮系統和單核巨噬細胞包括單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞組成性地表達FqRIa受體，多形核中性白細胞能誘導FcYRIa受體的表達。在一個實施方案中，Fc受體是FcyRIIa受體或及其保留與Fc區域結合能力的片段，如胞外結構域。FcyRIIa受體是數個已知的FcYRIIa受體的亞型之一，FcyRIIa是分布最廣泛的同型受體，它幾乎表達在所有骨髓瘤細胞上包括血小板。在一個實施方案中，Fc受體是FcYRIIb受體或及其保留了與Fc區域結合能力的片段，例如胞外結構域。FcYRIIb受體的表達限制于巨嗟細月包和B細月包上。在一個實施方案中，Fc受體是FcyRIIc受體或及其保留了與Fc區域結合能力的片段，例如胞外結構域。Fc7RIIc受體表達在NK細胞上。在一個實施方案中，Fc受體是FcyRIIIa受體或及其保留了與Fc區域結合能力的片段，例如胞外結構域。在進一步的實施方案中，Fc丫RIII受體是一種FcyRinal76V受體或及其保留了與Fc區域結合能力的片段，例如胞外結構域。FcyRIIIa受體是兩個已知的FcyRIII受體的亞型之一。FcYRIIIa存在于單核細胞、巨噬細胞、NK細胞和Y/ST細胞上。FcYRIIIa在176位存在遺傳多態性(Phe或Val)。這種變異體Fc7RIIIal76V(也稱為FcyRini58V，從成熟，加工蛋白的預期起點編號)見KoeneHR等.，Blood1109-1114(1997)和WuJ,等,，JClinInvest.巡，1059-1070(1997)。在一個實施方案中，Fc受體是FcYRIIIbNA1受體或及其保留了與Fc區域結合能力的片段例如胞外結構域。在一個實施方案中，Fc受體是FcYRIIIbNA2受體或及其保留了與Fc區域結合能力的片段例如胞外結構域。中性白細胞和嗜酸性粒細胞組成性地表達FcyRIIIb受體。在一個實施方案中，Fc受體是FcyRii受體或及其保留了與Fc區域結合能力的片段例如胞外結構域。FcyRii受體廣泛地分布表達在內皮細胞上。在本發明的一個實施方案中，依據發明的方法中應用的Fc受體是由一種制備方法制備得到的，該制備方法中包括的制備步驟可以得到與不包含這一步驟的制備方法制備得到的類似FC受體相比N連接糖基化上的唾液酸減少的Fc受體。可用多種方法進行脫唾液酸化。例如該Fc受體可以由唾液酸化機制缺陷的宿主細胞重組表達制備。在這種唾液酸缺陷細胞進行多肽表達(一般具有一定程度唾液酸糖基化)可以得到比同種類型的非唾液酸化缺陷細胞(非缺陷唾液酸化機制細胞)產生的多肽N連接糖基化上唾液酸更少的多肽產品。唾液酸缺陷細胞實例包括例如唾液酸轉移酶缺陷表達細胞(例如CHOLec2細胞)、唾液酸化的受體單糖如半乳糖表達缺陷細胞(例如CHOLecl和CHOLecl9細胞)或唾液酸合成酶例如UDP-GlcNAc-2差向異構酶表達缺陷的細胞(例如CHOLec3細胞)。其它干擾技術例如RNAi也能用于產生與唾液酸合成相關酶表達缺陷(例如UDP-GlcNAc-2表異構酶)，唾液酸化本身缺陷(例如2,3-唾液酸轉移酶或2,6-唾液酸轉移酶)或含有唾液酸受體半乳糖(例如N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶I)的復合型N連接多聚糖合成缺陷的細胞。這些技術已經用于多種細胞，包括SP2/0、CHO、BHK、HEK-293、NSO、JURKAT等。作為替代方法，細菌、酵母或真菌細胞也表達該蛋白，這些細胞不會在在N-連接多糖上添加入N-連接多糖(細菌)或唾液酸，例如真菌或酵母表達。N-連接糖基化具有唾液酸的Fc受體，例如非唾液酸化缺陷細胞重組表達產生的，可以使用減少唾液酸含量的方法進行脫唾液酸化處理，例如是在使用上述方法前用唾液酸酶進行處理。這些唾液酸酶的實例例如來自Arhrobacterureafaciens、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、Newcastle病病毒，HitchnerBl菌、肺炎鏈球菌或才炎狀芽孑包桿菌(Clostridiumperfringens)的神經氨酸酶。這些酶可以從它們的內源性宿主菌或其它宿主例如大腸桿菌重組表達得到。受體在非唾液酸缺陷細胞中表達后例如在純化前可以直接進行脫唾液酸處理。作為替代方法，可以在受體與用于純化的樹脂結合時或受體被純化后進行脫唾液酸化處理。作為替代方法，含有唾液酸酶DNA序列的表達質粒可以與編碼受體的表達質粒進行共轉染，這種情況下轉染細胞將分泌大量神經氨酸酶和受體，通過重組產生的唾液酸酶原位進行受體的脫唾液酸化。非唾液酸化缺陷細胞重組表達的Fc受體也可以在純化成含有唾液酸的流分和不含唾液酸的流分時被分離出來。分離過程可采用唾液酸特異性外源凝集素例如MAA(Maackiaamurensis凝集素)和SNA(SambucusnigraIagglutinin,接骨木花黑質凝集素)進行分離。分離中也可以采用陰離子交換色譜，例如DEAE瓊脂糖、瓊脂糖Q或ResourceQ。也可以通過培養表達受體的細胞和加入一種鏈烷酸例如專利WO9639488中描述的丁酸鈉到細胞培養物中進行Fc受體脫唾液酸化處理。在本發明的一個實施方案中，FcR結合肽是一種抗體。在本發明的一個實施方案中，FcR結合肽是一種單克隆抗體。在本發明的一個實施方案中，抗體是一種雙特異性二價抗體。在本發明的一個實施方案中，抗體是至少含有一個Fc-結合部分的IgG-樣分子。這里使用的單克隆抗體指的是單分子組成的抗體分子制備物。單克隆抗體組成顯示特定表位的單一結合特異性和親和性。因此，術語"人單克隆抗體，，指的是表現出單一結合特異性的抗體，它們具有來自于人種系的免疫球蛋白序列的可變區和恒定區。人單克隆抗體可以通過雜交瘤細胞產生，包括來自轉基因或轉染色體非人類動物例如轉基因小鼠的B細胞，該細胞具有包含人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組并與無限增殖細胞融合。在一個實施方案中，藥品抗體是人源抗體。這里使用的人源抗體意指包括具有來自于人種系免疫球蛋白序列可變.區和恒定區的抗體。本發明的人源抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白基因序列編碼的氨基酸殘基(例如體外隨機或定點突變或體內體細胞突變引入的突變)。然而，這里使用的術語"人源抗體，，并不包括來自另一哺乳動物種系的CDR序列移植到人骨架序列的抗體。如本專利所指，如果抗體來自使用人免疫球蛋白序列的體系，人源抗體就來自于特定的微生物種系序列，例如通過免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠或通過篩選人免疫球蛋白基因庫，其中所選擇的人抗體的氨基酸序列至少90%,例如至少95%,例如至少96%,例如至少97%，例如至少98°/。或至少99%與微生物VL或VH可變區域基因片段編碼的氨基酸序列相同。通常來自于某種人種系的VH或VL可變區基因片段序列編碼的氨基酸序列與微生物免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列的差別不超過10個氨基酸，例如不超過5個，例如不超過4、3、2或1個氨基酸差異。在一個實施方案中，藥品抗體是人源化抗體。人源化抗體是源自非人種的抗體，其中骨架區和重鏈輕鏈恒定區的某些氨基酸已被突變從而避免或消除人類的免疫反應。非人(例如鼠類)抗體的人源化形式含有源自非人免疫球蛋白的基本序列。人源化抗體大部分是人免疫球蛋白(接受抗體)，其中受體高變區氨基酸殘基被替換成非人種系(供體抗體)例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類的氨基酸殘基，這些殘基具有所需要的抗原結合特性例如特異性和親和性。在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv骨架區(FR)氨基酸殘基被替換成相應的非人源氨基酸殘基。另外，人源化抗體可能包括在受體抗體或供體抗體未種發現的氨基酸殘基。這些^奮飾是為了進一步優化抗原結合能力。一般而言，人源化抗體總共含有至少一種，一般是兩個可變結構域，其中所有的或幾乎所有的高變環是非人源免疫球蛋白一致，所有或幾乎所有的FR結構域是人免疫球蛋白序列。人源化抗體也可以至少含有已部分免疫球蛋白恒定區(Fc),通常是人免疫球蛋白上Fc區域。進一步的細節見Jones等.，Nature里，522-525(1986),Riechmann等.，Nature巡，323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2,593-596(1992)。人源化抗體也包括這樣的抗體，其中采用CDR修復進行CDR移植，將非人類來源的CDRs移植到人FR上(MarkDennis,Genentech,presentedattheTwelvthInternationalconferenceonHumanAntibodiesandHybridomas，10-12May2006，SanDiego,USA).在一個實施方案中，藥品抗體是嵌合抗體。通常嵌合抗體指的是部分重鏈和/或輕鏈與來源于特定物種的抗體的對應序列相同或同源或屬于某一類或某一亞類的抗體，而其它氨基酸與來源于另一種屬的抗體的對應序列相同或同源或屬于另一類或另一亞類的抗體，也可以是這些抗體的片段，只要它們表現出所需要的生物活性(見US4,816，567和Morrisonetal.,PNASUSAM,6851-6855(1984)。嵌合抗體可由本
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已知的重組方法生產(見Cabillyetal.，PNASUSA虹，3273-3277(1984)，Morrisonetal.，PNASUSAM，6851-6855(1984),Boulianneetal.,Nature643-646(1984),EP125023,Neubergeretal.，Nature314,268-270(1985),EP171496,EP173494,WO86/01533,EP184187,Sahaganetal.，J.Immunol.HI,1066-1074(1986),WO87/02671，Liuetal.，PNASUSA3439-3443(1987)，Sunetal，PNASUSAM,214-218(1987),Betteretal.，Science證，1041-1043(1988)和Harlowetal.，Antibodies:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,N.Y.,(1988)).。在一個實施方案中，抗體包含單價或多價抗體形式。這個抗體形式可以是由H鏈與L鏈以二硫鍵橋連接而成的二聚體(HL)。一個普通抗體是由兩個HL二聚體至少由一個二硫鍵連接形成的的二價四聚體(H2L2)。也可以產生多〗介抗體，例如使用CH區聚集(例如來自IgM的H鏈或p鏈)。這樣抗體可以是嵌合的或來自同一物種。在一個實施方案中，抗體具有Fc區骨架的改變，這些改變是為了獲得有益的特性，例如改變抗體的功能或藥代特性。例如，骨架區或恒定區的替換或其它改變(插入、缺失、加入終止序列或任意組合)可能使突變抗體的半衰期比親本抗體更長或與親本抗體相比改變突變抗體的免疫原性，提供共價或非共價結合于另一分子的位點，或改變例如補體固定物這樣的性質，例如減弱或增強Clq結合和CDC或FcyR結合和抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC)。可以在重鏈恒定區的一個或多個氨基酸殘基上例如234、235、236、237、297、318、320和322進行替換，因此與未修飾抗體相比改變了效應器功能但是保留了抗原結合能力，見專利US5624821和US5648260。更多信息可參考WO94/29351,WO99/54342,WO00/42072,WO03/011878,WO03/085119，WO04/29207，WO04/063351，WO04/065540，WO04/99249，WO05/018669，WO05/044859，US6121022和US6737056。另夕卜，Shields等.，J.Biol.Chem.里，6591-6604(2001)描述了提高FcyRIII結合能力的組合突變體，例如T256A/S298A，S298A/E333A，andS298A/E333A/K334A。在一個實施方案中，所述抗體含有突變的Fc區，這一突變可以優化與Fc受體的以增強某些效應器的功能。在一個實施方案中，抗體含有Fc糖基，它是由經過修飾的特定糖類轉移酶缺乏或活力降低的(例如FUT-8)或額外或過表達糖類轉移酶的細胞;f朱產生的。在本發明的一個實施方案中，抗體藥品是一種IgGl抗體。在一個實施方案中，抗體是IgGl,K抗體。在一個實施方案中，抗體是IgGl,X抗體。在本發明的一個實施方案中，所述肽是一種抗體，測定藥品抗體與Fc受體的結合與測定藥品抗體與其抗原結合的方法聯合使用。在一個實施方案中，使用下列方法測定所述藥品抗體與抗原的結合(i)使藥品樣品與抗原接觸一段足夠長的時間使抗體結合抗原，(ii)檢測與抗原結合的抗體含量。在進一步的實施方案中，通過使用針對藥品抗體的檢測抗體進行上述檢測。在進一步的實施方案中，上述檢測抗體是標記抗體。在一個實施方案中，使用ELISA檢測抗體與抗原的結合。在一個實施方案中檢測抗體與Fc受體結合的ELISA也應用于檢測該抗體與其抗原的結合。在一個實施方案中，使用AlphaScreenTM檢測測定抗體與抗原的結合。在一個實施方案中，用于抗體與Fc受體結合測定的AlphaScreenTM^r測也應用于測定該抗體與其抗原的結合。在一個實施方案中，使用放射免疫測定法測定抗體與抗原的結合。在一個實施方案中，用于抗體與Fc受體結合測定的放射免疫測定法也應用于測定該抗體與其抗原的結合，在進一步的實施方案中，放射免疫測定使用與Fc受體綴合的珠和可溶性貢獻放射性的(radioiodonated)抗原。如之前所述，依據本發明的方法所使用的抗體抗原特異性不影響抗體與Fc受體的結合能力。因此本發明方法適用于所有抗體(和其它FcR結合肽)，其中至少一種抗體作用機制是通過抗體與Fc受體的結合介導，與抗體的抗原特異性無關。然而，一些實施方案中使用特定抗原特異性的抗體。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人CD4結合的抗體。在一個實施方案中，抗體是如W09713852中描述的人與CD4結合的抗體。在一個實施方案中，抗體是如US5871732中描述的與人CD4結合的抗體。在一個實施方案中，抗體是如US6309880或WO9012868中描述的與人CD4結的合抗體。在一個實施方案中，抗體是溶液WO02102853中描述的與人CD4結合的抗體。在一個實施方案中，抗體是如US2001051709或WO9110722中描述的與人CD4結合的抗體。在一個實施方案中，抗體是如US6056956或US5670150中描述的與人CD4結合的抗體。在一個實施方案中，抗體是扎木單抗。在一個實施方案中，抗體是凱利昔單抗(IDEC-CE9.1，BiogenlDEC)。在一個實施方案中，抗體是克立昔單抗(IDEC-151,BiogenlDEC)。在一個實施方案中，抗體是TNX-355(Hu-5A8，Tanox/BiogenlDEC)。在一個實施方案中，抗體是TRX-1(TolerRx/Genentech)。在一個實施方案中，抗體是IOT4a(13B8.2,Immunotech),priliximab(cM-T412,Centocor)。在一個實施方案中，抗體是4162W94(GlaxoWellcome)。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人EGFR結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是如WO9640210中描述的與人EGFR結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是如WO04056847或WO02100348中描述的與人EGFR結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是西妥昔單抗(￡]:1^1^@)。在一個實施方案中，所述抗體是Zalutumumab(HuMax-EGFR)(GenmabA/S)。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人CD20結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是如WO94/11026中描述的與人CD20結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是如WO04/035607中描述或在WO申請PCT/DK2005/00270中描述的與人CD20結合的抗體。在進一步的實施方案中，所述抗體是替伊莫單抗(Zevalir^)。在一個實施方案中，所述抗體是托西莫單抗(Bexxa產)。在一個實施方案中，所述抗體是HuMax-CD20(ofatumumab)(GenmabA/S)。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人TAC(CD25)結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是如WO04/045512中描述的與人TAC結合抗體。在一個實施方案中，所述抗體是HuMax-TAC(AB12)。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是人CD3結合抗體。在一個實施方案中，抗體是莫羅單抗(OrthocloneOJC^3)。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人CD3結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是莫羅單抗(OrthocloneOKT3)。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人GPIIb/IIIa結合的抗體。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人CD25(IL-2R)結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是達克珠單抗(Zenapax⑧)。在一個實施方案中，所述抗體是巴利昔單抗(Simulec^)。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是人TNF-a結合抗體。在一個實施方案中，所述抗體是英利昔單抗(1^11^&(^@)。在一個實施方案中，所述抗體是阿達木單抗(Humira⑧)。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人RSV結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是帕利珠單抗(3乂113^3@)。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人HER-2/neu結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是曲司珠單抗(Hercepti,)。在一個實施方案中，所述抗體是培妥珠單抗(OmnitargTM)。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人CD33結合的抗體。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人CD52結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是阿侖珠單抗(Campath-lH)。在本發明的一個實施方案中，藥品抗體是與人CTLA4結合的抗體。在一個實施方案中，所述抗體是MDX-010(Medarex,Inc.)。本發明也提供了應用于FcR結合肽與上述Fc受體結合的測定方法中的一種Fc受體的制備方法，其中上述Fc受體是用含有制備步驟的方法制備，與使用不包括本步驟的方法制備得到的類似Fc受體相比，所述步驟可產生N-連接糖基化唾液酸減少的Fc受體。在一個實施方案中，使用以下方法測定FcR結合肽與Fc受體的結合(i)使FcR結合肽與Fc受體接觸足夠長時間使FcR結合肽與Fc受體結合(ii)檢測與Fc受體結合的FcR結合肽的量在一個實施方案中，使用針對FcR結合肽的檢測抗體進行檢觀'J。在進一步的實施方案中，所述檢測抗體是標記抗體。在一個實施方案中，使用ELISAFcR結合肽與Fc受體的結合測定。在一個實施方案中，使用AlphaScreenTM檢測測定FcR結合肽與Fc受體的結合。在一個實施方案中，使用放射免疫測定測定FcR結合肽與Fc受體的結合。在一個實施方案中，使用Biacore4企測法測定FcR結合肽與Fc受體的結合。在一個實施方案中，使用FMAT測定FcR結合肽與Fc受體的結合。在一個實施方案中，使用FDELFIA測定FcR結合肽與Fc受體的結合。本發明也提供適于一種適于包被多肽分子的塑料部件，其中多肽分子與塑料部件的粘合至少部分是依賴于多肽分子與塑料部件表面之間的靜電相互作用，其中塑料部件表面已經包被脫唾液酸化多肽。在一個實施方案中，多肽分子是Fc受體。本專利其它內容描述了Fc受體的實例。在一個實施方案中，塑料部件是微孔滴定板，例如96孔微孔滴定板或類似的板子，例如Greiner板，這些都是該
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人員熟知的。在一個實施方案中，所述涂層塑料部件適用于依據本發明的一種測定FcR結合肽藥品藥效的方法。以下是本發明選擇列出的實施方案列表實施方案1一種測定含有FcR結合肽藥品藥效的方法，其中藥品FcR結合肽的至少有一個作用機制是通過藥品FcR結合肽與Fc受體結合介導，其中所述方法包括測定藥品FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案2根據實施方案1用于測定含有FcR結合肽的藥品藥效的方法包括i)測定參比標準FcR結合肽與Fc受體的結合ii)測定藥品FcR結合肽與上述Fc受體的結合iii)比較步驟ii)FcR與步驟i)FcR的結合情況，使用比較所得信息評價藥品的藥效。其中a)步驟ii)中Fc受體結合的測定方法與步驟i)中Fc受體結合的測定方法相同。b)藥品FcR結合肽的至少一種作用機制是通過FcR結合肽與Fc受體結合介導。c)其中所述參比標準FcR結合肽和藥品FcR結合肽是同種FcR結合分子的兩種制劑。實施方案3—種生產包含FcR結合肽的藥物組合物的方法，該方法包括a)該藥品含有所述FcR結合肽；b)將實施方案l或實施方案2的方法應用于所述藥品以測定含有FcR結合肽藥品的藥效；c)使用步驟b)得到的信息作為該藥品是否可以作為藥物組合物來使用的部分評價依據。實施方案4一種根據實施方案1-3中任一項的方法，其中該方法是所述藥品作為藥物組合物上市銷售許可申請的一部分。實施方案5—種申請含有FcR結合肽藥品上市許可證的方法，該方法包括對根據實施方案1-4任一項用于測定藥品FcR結合肽藥效方法的描述。實施方案6—種根據實施方案1-5中任一項的方法，其中用于測定含有FcR結合肽的藥品藥效的方法被用于批簽發的藥效測定。實施方案7—種根據實施方案1-6中任一項的方法，其中用以下方法測定FcR結合肽與Fc受體的結合(i)將藥品樣本與Fc受體充分作用使FcR結合肽與Fc受體結合，(ii)檢測與Fc受體結合的FcR結合肽的量。實施方案8—種根據實施方案7的方法，使用針對FcR結合肽的檢測抗體進行檢測。實施方案9一種根據實施方案8的方法，其中檢測抗體是標記抗體。實施方案10—種根據實施方案1-9中任一項的方法，其中用ELISA測定FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案11一種根據實施方案1-6中任一項的方法，其中用AlphaScreenTM檢測法測定FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案12—種根據實施方案1-6中任一項的方法，其中用放射免疫測定法檢測FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案13—種根據實施方案1-6中任一項的方法，其中用Biacore測定法檢測FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案14一種根據實施方案1-6中任一項的方法，其中用FMAT測定法檢測FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案15—種根據實施方案1-6中任一項的方法，其中用DELFIA測定法4企測FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案16—種根據實施方案1-15中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導抗體依賴的細胞介導細胞毒作用(ADCC)，或下調把受體的表達。實施方案17—根據實施方案1-15中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過誘導ADCC介導。實施方案18—種如才艮據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過自然殺傷細胞的補充介導。實施方案19一種根據實施方案l-18任中一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過自然殺傷細胞的補充介導。實施方案20—種才艮據實施方案l-19任中一項的方法，其中FcR結合肽的至少一種體內結合Fc受體表達在自然殺傷細胞上。實施方案21—種根據實施方案17-20中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIIIa受體或及其保留Fc區結合能力的片段。實施方案22—種才艮據實施方案21中任一項的方法，其中Fc^Rin受體是一種FcYRIIIal76V受體或及其保留Fc區結合能力的片段，例如胞外結構域。實施方案23—種根據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集多形核白細胞介導。實施方案24—種根據實施方案1-23中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過多形核白細胞對ADCC的誘導介導。實施方案25—種根據實施方案1-24中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過誘導PMN脫顆粒介導。實施方案26—種根據實施方案1-25中任一項的方法，FcR結合肽的一個作用機制是通過多形核白細胞的誘導吞噬作用介導。實施方案27—種才艮據實施方案1-17或23-26中任一項的方法，其中其中至少由一個與FcR結合肽在體內結合的Fc受體在多形核白細胞上表達。實施方案28—種根據實施方案23-27中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIIa受體或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案29—種#4居實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過誘導單核細胞或巨噬細胞的ADCC作用介導。實施方案30—種根據實施方案1-17或29中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在單核細胞和/或巨噬細胞上表達。實施方案31—種根據實施方案1-17、29或30中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIIb或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案32—種根據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導血小板聚集。實施方案33—種根據實施方案1-17,或32中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集血小板介導。實施方案34—種根據實施方案1-17、32或33中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在血小板上表達。實施方案35—種如1-17或32-34中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案36—種根據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導細胞因子的產生。實施方案37—種才艮據實施方案l-17或36中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集自然殺傷細胞和/或T細胞介導。實施方案38—種根據實施方案1-17、36或37中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在自然殺傷細胞和/或T細胞上表達。實施方案39—種如1-17或36-38中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIa或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案40—種才艮據實施方案1-17或36-38中任一項的方法，其中Fc受體是FcYRIIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案41一種根據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導清除免疫復合物。實施方案42—種根據實施方案1-17或41中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集單核細胞或巨噬細胞介導。實施方案43—種4艮據實施方案1-17，41或42中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在單核細胞或巨噬細月包上表達。實施方案44一種根據實施方案1-17或41-43中任一項的方法，其中Fc受體是FcyRIII或及其保留Fc區結合能力的片段。實施方案45—種根據實施方案1-17或41-43中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案46—種根據實施方案1-17或41-43中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIIIb或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案47—種根據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導抗體應答下調。實施方案48—種^^據實施方案1-17或47中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集B細胞介導。實施方案49一種根據實施方案1-17，47或48中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在B細胞上表達。實施方案50—種#4居實施方案1-17或47-49中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIb或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案51—種沖艮據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導單核細胞和巨噬細胞效應器功能抑制作用。實施方案52—種根據實施方案1-17或51中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過單核細胞和/或巨噬細胞的補充來調節。實施方案53—種#4居實施方案1-17，51或52中4壬一項的方法，其中FcR結合肽的至少一種體內結合Fc受體表達在單核細胞和/或巨噬細胞上。實施方案54—種根據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導吞噬作用。實施方案55—種才艮據實施方案1-17或54中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過，募集多形核白細胞、巨噬細胞和/或樹突狀細胞介導。實施方案56—種才艮據實施方案1-17、54或55中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在多形核白細胞，巨噬細胞和/或樹突狀細胞上表達。實施方案57—種根據實施方案1-17或54-56中任一項的方法，其中Fc受體是FcYRIIIb或及其保留Fc區結合能力的片段。實施方案58—種根據實施方案1-17或54-56中任一項的方法，其中Fc受體是一種FqRIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案59—種根據實施方案1-17或54中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過誘導單核細胞或巨噬細胞的吞噬作用介導。實施方案60—種#4居實施方案1-17或59中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在單核細胞或巨噬細胞上表達。實施方案61—種根據實施方案1-17、59或60中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIb或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案62—種根據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導交聯作用。實施方案63—種根據實施方案1-17、或62中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過細胞和/或抗體的交聯作用介導。實施方案64—種根據實施方案1-17、54或63中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIa或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案65—種才艮據實施方案1-17，54或63中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRII或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案66—種如1-17、54或63中任一項的方法，其中Fc受體一種FcyRffl或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案67—種根據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過一種免疫受體基于酪氨酸的活化基序來誘導正向信號傳導。實施方案68—種根據實施方案1-17，或67中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集骨髓細胞、T細胞和/或血小板介導。實施方案69—種根據實施方案1-17或67或68中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合Fc受體在骨髓細胞，T細胞和/或血小板上表達。實施方案70—種根據實施方案1-17、或67-69中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案71—種#4居實施方案1-17、或67-69中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIc或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案72—種根據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過普通Y，(3，；鏈來誘導正向信號傳導。實施方案73—種根據實施方案1-17、或72中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集骨髓細胞、多形核白細胞、自然殺傷細胞或T細胞介導。實施方案74—種根據實施方案1-17,72或73中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在骨髓細胞，多形核白細胞，自然殺傷細胞或T細胞上表達。實施方案75—種才艮據實施方案1-17、或72-74中任一項的方法，其中Fc受體是FqRIa或其保留Fc區結合能力的片段。實施方案76—種根據實施方案1-17,或72-74中任一項的方法，其中Fc受體是FcYRIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案77—種才艮據實施方案1-17、或72-74中任一項的方法，其中Fc受體是FcYRIIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案78—種才艮據實施方案1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過免疫受體基于酪氨酸的抑制基序來誘導負向信號傳導。實施方案79—種4艮據實施方案1-17或78中任一項的方法，其中FcR結合肽的至少一種作用機制是通過B細胞，巨噬細胞和/或單核細胞的補充來調節。實施方案80—種根據實施方案1-17、78或79中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在B細胞，巨噬細胞，和/或單核細胞上表達。實施方案81—種#4居實施方案1-17、或78-80中任一項的方法，其中Fc受體是FcyRIIb或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案82—種根據實施方案1-17中任一項的方法，其中Fc受體是FcyRn或其保留了Fc區結合能力的片段。實施方案83—種根據實施方案1-82中任一項的方法，其中上述方法使用的Fc受體是用含有制備步驟的方法制備的，與使用不包括所述步驟的方法制備得到的相似Fc受體相比，所述步驟可產生N-連接糖基化上唾液酸數量減少的Fc受體。實施方案84—種根據實施方案83的方法，其中所述Fc受體在唾液酸化機制缺陷的宿主細胞中表達。實施方案85—種根據實施方案83的方法，其中所述Fc受體在用于上述方法前先用唾液酸酶進行處理。實施方案86—種根據實施方案1-85中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種抗體。實施方案87—種#4居實施方案86的方法，其中所述FcR結合肽是一種單克隆抗體。實施方案88—種根據實施方案86或實施方案87的方法，其中所述FcR結合肽是一種人抗體。實施方案89—種根據實施方案86或實施方案87的方法，其中所述FcR結合肽是一種人源化抗體。實施方案90—種才艮據實施方案86或實施方案87的方法，其中所述FcR結合肽是一種嵌合抗體。實施方案91一種根據實施方案86-90中任一項的方法，其中FcR結合肽是含有Fc結合部分的抗體片段。實施方案92—種根據實施方案86-91中任一項的抗體，其中FcR結合肽是一種IgGl抗體。實施方案93—種根據實施方案92的方法，其中FcR結合肽是IgGl,X抗體。實施方案94一種才艮據實施方案92的方法，其中FcR結合肽是一種IgGl，K抗體。實施方案95—種沖艮據實施方案86-94中任一項的方法，其中抗體與Fc受體結合的測定與一種測定抗體抗原結合的方法聯合使用。實施方案96—種根據實施方案95的方法，其中使用以下方法測定抗體抗原的結合(i)使抗體樣品與抗原接觸足夠長時間以使抗體與抗原的結合，(ii)檢測結合抗原的抗體量。實施方案97—種根據實施方案96的方法，其中用針對藥品抗體的檢測抗體來檢測。實施方案98—種4艮據實施方案97的方法，其中^r測抗體是標記抗體。實施方案99一種根據實施方案95-98的方法，其中使用ELISA測定抗體與抗原的結合。實施方案100—種根據實施方案99的方法，其中上述ELISA也用于測定抗體與Fc受體的結合。實施方案101—種根據實施方案95的方法，其中使用AlphaScreenTM檢測法測定抗體與Fc受體的結合。實施方案102—種根據實施方案101的方法，其中也使用AlphaScreenTM檢測法測定抗體與Fc受體的結合。實施方案103—種根據實施方案95的方法，其中使用放射免疫測定法測定抗體與抗原的結合。實施方案104—種根據實施方案103的方法，其中也使用放射免疫測定法測定抗體與抗原的結合。實施方案105—種根據實施方案104的方法，其中放射免疫測定法使用與Fc受體和貢獻放射性的抗原綴合的珠。實施方案106—種根據實施方案86-105中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人CD4結合的抗體。實施方案107—種根據實施方案106的方法，其中FcR結合肽是扎木單抗。實施方案108—種根據實施方案106的方法，其中FcR結合肽是凱利昔單抗。實施方案109—種根據實施方案106的方法，其中FcR結合肽是克立昔單抗。實施方案110—種根據實施方案106的方法，其中FcR結合肽是TNX355。實施方案111一種根據實施方案106的方法，其中FcR結合肽是TRX畫1。實施方案112—種根據實施方案106的方法，其中FcR結合肽是IOT4a。實施方案113—種根據實施方案106的方法，其中FcR結合肽是4162W94。實施方案114一種^f艮據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人EGFR結合的抗體。實施方案115—種根據實施方案114的方法，其中FcR結合肽是西妥昔單抗。實施方案116—種根據實施方案114的方法，其中FcR結合肽是HuMax-EGFR,zalutumumab。實施方案117—種根據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人CD20結合的抗體。實施方案118—種根據實施方案117的方法，其中FcR結合肽是人利妥昔單抗。實施方案119一種根據實施方案117的方法，其中FcR結合肽是替伊莫單抗。實施方案120—種根據實施方案117的方法，其中FcR結合肽是托西莫單抗。實施方案121—種根據實施方案117的方法，其中FcR結合肽是HuMax-CD20,ofatumumab。實施方案122—種根據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人TAC結合的抗體。實施方案123—種根據實施方案122的方法，其中FcR結合肽是HuMax-TAC。實施方案124—種4艮據實施方案i-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人CD3結合的抗體。實施方案125—種根據實施方案124的方法，其中FcR結合肽是莫羅單抗。實施方案126—種根據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人GPIIb/IIIa結合的抗體。實施方案127—種才艮據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人CD25結合的抗體。實施方案128—種根據實施方案127的方法，其中FcR結合肽是達克珠單抗。實施方案129—種^^艮據實施方案127的方法，其中FcR結合肽是巴利昔單抗。實施方案130—種根據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人TNF-a結合的抗體。實施方案131—種才艮據實施方案130的方法，其中FcR結合肽是英利昔單抗。實施方案132—種根據實施方案130的方法，其中FcR結合肽是阿達木單抗。實施方案133—種根據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人RSV結合的抗體。實施方案134—種根據實施方案133的方法，其中FcR結合肽是帕利珠單抗。實施方案135—種根據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是人HER-2/neu結合抗體。實施方案136—種#4居實施方案135的方法，其中FcR結合肽是曲司珠單抗。實施方案137—種根據實施方案135的方法，其中FcR結合肽是培妥珠單抗。實施方案138—種根據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人CD33的結合的抗體。實施方案139—種根據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人CD52的結合的抗體。實施方案140—種根據實施方案139的方法，其中FcR結合肽是阿侖珠單抗。實施方案141一種根據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是人VEGF的結合抗體。實施方案142—種根據實施方案141的方法，其中FcR結合肽是貝伐珠單抗。實施方案143—種根據實施方案1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是人CTLA4的結合抗體。實施方案144一種根據實施方案143的方法，其中FcR結合肽是MDX-010。實施方案145—種批準作為藥物組合物使用的含有FcR結合肽的藥品，其中根據實施方案l至144中任一項的一種方法適上市批準申請的一部分。實施方案146—種用于測定FcR結合肽與上述Fc受體結合的Fc受體的制備方法，其中所述方法使用的Fc受體是用含有制備步驟的方法制備的，與用不包括所述步驟的方法制備得到的相似Fc受體相比，所述步驟可產生N-連接糖基化上唾液酸數量減少的Fc受體。實施方案147—種#4居實施方案146的方法，其中用以下方法測定FcR結合肽與上述Fc受體的結合(i)使FcR結合肽與Fc受體的接觸足夠長時間以使抗體與抗原的結合，(ii)檢測結合抗原的抗體量實施方案148—種根據實施方案147的方法，其中使用針對FcR結合肽的檢測抗體進行檢測。實施方案149一種根據實施方案148的方法，其中檢測抗體是標記抗體。實施方案150—種才艮據實施方案146-149中任一項的方法，其中使用ELISA測定FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案151—種根據實施方案146-149中任一項的方法，其中使用AlphaScreenTM檢測法測定FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案152—種根據實施方案146-149中任一項的方法，其中使用放射免疫檢測法測定FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案153—種根據實施方案146-149中任一項的方法，其中使用Biacore檢測法測定FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案154—種才艮據實施方案146-149中任一項的方法，其中使用FMAT測定FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案155—種根據實施方案146-149中任一項的方法，其中使用DELFIA測定FcR結合肽與Fc受體的結合。實施方案156—種^f艮據本發明或實施方案1-155中任一項的方法，其中使用包被在ELISA板上的His捕獲抗體來捕獲his標記的FcR或FcR片革爻。實施方案157—種適用于包被多肽分子的塑料部件，其中多肽分子與塑料部件的粘合至少部分依賴多肽分子與塑料部件表面之間的靜電相互作用，其中塑料部件表面已經包被脫唾液酸化多肽。實施方案158—種根據實施方案157的塑料部件，其中所住多肽分子是一種Fc受體。實施方案159—種根據實施方案157或158的塑料部件，其中所述塑料部件是微量滴定板。實施方案160—種根據實施方案157-159中任一項的塑料部件，其中塑料部件適用于根據權利要求1_144中任一項的方法。實施方案161—種根據實施方案157-159中任一項的塑料部件，其中塑料部件用于根據權利要求1-144中任一項的方法。通過以下實施例進一步闡述本發明，這些事實力并不會限制本發明。實施例實施例1寡聚核苷酸引物和PCR擴增將指定引物溶解在H20中使其濃度達到100pmol/|il并貯存于-20。C。對于PCR，按照廠商的使用說明使用PfUTurbo⑧熱啟動DNA聚合酶(Stratagene,Amsterdam,TheNetherlands;產品#600322)。每個反應混合物的總體積是20|al，含有200jaM混合dNTPs(RocheDiagnostics,Almere，TheNetherlands;產品#1814362)、6.7pmol正向和反向引物、約lng模板DNA和1個單位PfuTurboHotstartDNA聚合酶，均溶解在PCR反應緩沖液(與聚合酶一起提供)中。PCR反應在TGradientThermocycler96(WhatmanBiometra,Goettingen,Germany;產品#050-801)上進行，使用30個循環的程序95。C變性2min;30個循環的95。C變性30s、45-65。C梯度(或使用另一特定的退火溫度)退火30s和72。C延伸2min;最終72°C延伸10min。如果合適的話，可將PCR反應混合物貯存在4。C用于進一步分析或處理。實施例2PCR篩選細菌菌落使用HotStarTaqMaster混合試劑盒(Qiagen;產品#203445)和特定正向反向引物通過菌落PCR篩選含有預期序列載體的細菌菌落。用20pl吸管頭輕觸選出的菌落，并簡單地接種于2mlLB中(Luriabroth)進行小量培養，然后重懸于PCR混合物中。PCR反應在儀器TGradientThermocycler96(WhatmanBiometra，Goettingen，Germany;產品弁050-801)上進行，使用具有35個循環地程序95。C變性15min,35個循環的94。C變性30s，55。C退火30s，72。C延伸2min;最終72。C延伸10min。如果合適的話，將PCR反應混合物貯存在4°C用于瓊脂糖凝膠電泳分析。實施例3FcrRIaECDHis的生產pEE13.4Fc丫RIaECDHis的構建分離RZPD菌4朱IRATp970F1154D6(DeutscheRessourcenzentrumfiirGenomforschung(RZPD,柏林，德國)的質粒DNA并用作PCR中的模版，該PCR按照實施例1所描述的程序使用引物P1(SEQIDNo:4)和P2(SEQIDNo:5),PCR擴增人FcyRIa的胞外編碼結構域(氨基酸序列1-292)并引入適當的用于克隆到載體pEE13.4(LonzaBiologies,Slough，UK)的限制酶切位點、一個理想的Kozak序列(GCCGCCACC)和C末端His6標簽。用凝膠純化PCR片l殳并克隆到pEE13.4。其中，用限制酶尸y723n和Zmal消化PCR產物并純化。用限制酶尸j23n和消化pEE13.4載體并純化載體片段。將FcyRIa片段和pEE13.4尸y23II-Zmal載體連接并轉化入感受態DH5a-TlR細胞(Invitrogen)。根據實施例2所描述的程序，使用菌落PCR(使用引物P3(SEQIDNo:6)和P4(SEQIDNo:7))驗證8個克隆，結果得到2個插入片段大小正確的克隆。將這兩個陽性克隆在2ml培養基中培養。分離質粒DNA，對其中1個構建菌抹的插入序列進行測序分析后發現是正確的。最后構建的重組載體命名為pEE13.4FcyRIaECDHis。FcrRIaECDHis在Hek-293F細胞中的瞬時表達Freestyle293-F(—種已適應懸浮生長和化學限定Freestyle培養基的HEK-293亞克隆，例如HEK-293F)細胞購自Invitrogen，并按照廠商的操作規程使用293fectin(Invitrogen)用pEE13.4FqRIaECDVHis轉染細胞。根據廠商的操作規程培養轉染子，按照以下描述的方法取1升細胞培養上清進行純化。在BDTALONspin(0.5ml)Talon柱上進行FcyRIaECDVHis的純必BDTALONspin柱購自Clontech(MountainView,CA,USA)。將珠從柱子中取出，用pH7.0的lx平衡/洗滌緩沖液(50mM磷酸鈉和300mMNaCl)平衡珠。與1升細胞培養上清液于4。C孵育過夜。在洗脫FcyRIaECDVHis(用pH5,0的lx洗脫緩沖液(SOmM磷酸鈉、300mMNaCl和150mM咪唑)后，重新平衡樹脂并加入前期純化的流出物中。繼續孵育過夜，再次洗脫FcyRIaECDVHis。收集第1和第2次的洗脫流分，收集的FcyRIaECDVHis在PD-10柱上脫鹽，將緩沖液換成PBS。終產物的體積為3.7ml。通過280nm處的吸光度來測定濃度，結果為117jag/ml,得到433嗎FcYRIaECDHis(SEQIDNo:l)。經SDS-PAGE判定終產物的純度約為95%。實施例4FcyRIHaECD176VHis的生產pEE13.4FcYRIIIaECD176His的構建分離RZPD菌才朱IRAKp961H1749Q2(DeutscheRessourcenzentrumflirGenomforschung(RZPD，Berlin,Germany))的質粒DNA并用作PCR中的模版，該PCR按照實施例1所描述的程序使用引物P5(SEQIDNo:8)和P6(SEQIDNo:9)，PCR擴增人Fc丫RIIIa的胞外編碼結構域(氨基酸序列1-200)并引入適當的用于克隆到載體pEE13.4的限制酶切位點、一個理想的Kozak序列(GCCGCCACC)和C末端His6標簽。用凝膠純化PCR片段并克隆到pEE13.4。其中，用限制酶&oRI和消化PCR產物并純化。用限制酶五coRI和A7nal消化pEE13.4載體并純化載體片段。將FqRIa片段和pEE13.4五coRI載體連接并轉化入感受態DH5a-TlR細胞(Invitrogen)。根據實施例2所描述的程序，使用菌落PCR(使用引物P3和P4)驗證4個克隆，結果得到2個插入片段大小正確的克隆。將這兩個陽性克隆在2ml培養基中培養。分離質粒DNA，對其中1個構建菌林的插入序列進行測序分析后發現是正確的。插入片段為FcYRIIIa的176V同種異型體。最后構建的重組載體命名為pEE13.4FcyRIIIaECD176His。FcYRIIIaECD176His在Hek-293F細胞中的瞬時表達Freestyle293-F(—種已適應懸浮生長和化學限定Freestyle培養基的HEK-293亞克隆，例如HEK-293F)細胞購自Invitrogen，并按照廠商的操作規程使用293fectin(Invitrogen)用pEE13.4FcyRinaECD176VHis轉染細胞。根據廠商的操作規程培養轉染子，按照以下描述的方法取200ml細胞培養上清進行純化。在BDTALONspin(0.5ml)Talon柱上進行Fc丫RJIIaECD176VHis的純化BDTALONspin柱購自Clontech(MountainView,CA，USA)。將珠從柱子中取出，用pH7.0的lx平衡/洗滌緩沖液(50mM磷酸鈉和300mMNaCl)平衡珠，與200ml細胞培養上清液孵育。用lx平衡/洗滌緩沖液洗滌珠以除去非特異性吸附蛋白，用pH5.0的lx洗脫緩沖液(50mM磷酸鈉，300mMNaCl和150mM咪哇)洗脫His標記蛋白。在洗脫FcyRIIIaECD176VHis(用pH5.0的lx洗脫緩沖液(50mM磷酸鈉、300mMNaCl和150mM咪哇)后，重新平衡樹脂并加入前期純化的流出物中。收集第1和第2次的洗脫流分。在PD-1.0柱上用PBS將收集的流分脫鹽。通過測定280nrn處的吸光度4吏用由FcYRIIIaECD176VHis(SEQIDNo:2)氨基酸序列計算得到的理論吸光系數測定純化蛋白的產率。純化之后的產率為2.5mg/200ml，濃度為771pg/ml。SDS-PAGE顯示了一條4艮寬的蛋白遷移帶(表明一種非常異質的糖基化蛋白)和兩條更高分子量的小帶。純度估計約為90%。實施例5FcYRIIIaECD176FHis的生產將。EE13.4Fc7RIIIaECD176VHis進行突變構建pEE13.4Fcy畫aECD176FHis使用定點突變使載體pEE13.4FcyRinaECD176VHis上編碼FcyRIIIal76V的Val176的密碼子突變為編碼Phe的密碼子。使用QuickChangeIIXL定點突變試劑盒(Stratagene,Amsterdam,TheNetherlands)根據廠商說明書進行定點突變。該方法包括引入一個silentextrai^yl88III位點篩選成功突變的突變子。簡而言之，將5pl10x反應液、1.25pi寡聚核苷酸P7(100ng/pl)(SEQIDNo:10)、1.25(il寡聚核苷酸P8(125ng/pl)(SEQIDNo:11)、1jildNTP混合物、3plQuicksolution、1(il質粒pEE13.4FcyRIIIaECD176VHis(50ng/(al)和1(ilPfuUltraHFDNA聚合酶混合至終體積50pl并在TGradientThermocycler96(WhatmanBiometra，Goettingen，Germany;產品#050-801)上進行PCR反應，使用18個循環的程序95。C變性1min;18個循環的程序是95。C50s、60°C50s、68。Cl0min。將PCR混合物貯存在4。C用于進一步處理。然后，將PCR反應混合物與1pi在37。C溫育60min以酶切載體，貯存于4。C用于進一步處理。根據廠商說明書(Invitrogen)將2|il反應混合物轉化到OneShotDH5a-T1R感受態大腸桿菌細胞中。用菌落PCR和//pyl88in酶切(突變過程中引入silentextra///^18811I位點)篩選出16個克隆，其中15個克隆顯示含有正確的核苷酸變化。將兩個陽性克隆過夜培養，分離質粒DNA并測序以驗證是否引入正確的突變。結果兩個克隆都含有正確的序列，將其中一個進一步持續培養，并命名為pEE13.4FcyRIHaECD176FHis。為了排除在突變過程中？)入額外的突變，對pEE13.4FcyRIIIaECD176FHis的完整FcYRIIIa編碼區基因進行重新測序，結果發現無額外突變。最終獲得的重組載體命名為pEE13.4Fc7RIIIaECD176FHis。FcyRHIaECD176FHis在Hek-293F細胞的瞬時表達Freestyle293-F(—種已適應懸浮生長和化學限定Freestyle培養基的HEK-293亞克隆，例如HEK-293F)細胞購自Invitrogen，并使用293fectin(Invitrogen)按照廠商的操作規程用pEE13.4FcyRniaECD176FHis轉染細胞。根據廠商的操作規程培養轉染子，根據以下描述的方法取200ml細胞培養上清液進行純化。在BDTALONspin(0.5ml)Talon柱上進行FcYRIIIaECD176FHis的純化BDTALONspin柱購自Clontech。將珠從柱子中取出，用pH7.0.的lx平衡/洗滌緩沖液(50mM磷酸鈉和300mMNaCl)平衡，將珠與200ml細胞培養上清液孵育。用lx平衡/洗滌緩沖液洗滌珠以除去非特異性結合蛋白，用pH5.0.的lx洗脫緩沖液(50mM磷酸鈉，300mMNaCl和150mM咪唑)洗脫His標記蛋白。在洗脫FcyRIIIaECD176FHis(用lx洗脫緩沖液)后，將樹脂重新平衡并加入到前期純化的流出物中。收集第l和第2次的洗脫流分。在PD-IO柱上用PBS將收集的流分脫鹽。通過測定280nm處的吸光度使用由FcyRinaECD176FHis(SEQIDNo:3)氨基酸序列計算得到的理論吸光系數測定純化蛋白的產率。純化后的產率為1.5mg/200ml濃度為613|Lig/ml。SDS-PAGE顯示是一條寬帶，表明它是它是單一、純的糖基化蛋白。實施例6不同扎木單抗批產品的糖基化水平重鏈糖基化水平為了研究重鏈CH2結構域N連接糖基化基團的存在，用SDS-PAGE和高pH陰離子交換劑脈沖電流計檢測(HPAEC-PAD)對幾批具有潛在重鏈糖基化差異的扎木單抗批產品(MEV001，MEV004,MEV005,MRS-CD4-001,BN078,B0118)進行分析。制備對照批產品進行比較脫糖基化扎木單抗批產品UNG-MRS-CD4、偽脫糖基化扎木單抗批產品MOCK-MRS-CD4(直接來自MRS-CD4-001)和混合批產品(脫糖基化和完全糖基化參比批產品的混合物)M90-MRS-CD4[90°/。重鏈糖基化]和M50-MRS-CD4[50%重鏈糖基化]。非還原SDS-PAGE(圖1)檢測顯示所有批產品包括UNG-MRS-CD4是完整的。還原SDS-PAGE(圖2)證實批產品UNG-MRS-CD4是完全脫糖基化的。批產品MRS-CD4-001和BN078含有少量未糖基化重鏈(<10%)，批產品B0118含有約10%未糖基化的重鏈。MEV001含有少量未糖基化重鏈。MEV004和MEV005含有未糖基化重鏈，其中MEV004的含量最高(約30%)，其次是MEV005(約15%)。重鏈糖基化類型為了研究重鏈糖基化類型，用HPAEC-PAD分析扎木單抗批產品(表1)。這些批產品都沒有大量的帶電多聚糖。幾乎檢測不到含有兩個半乳糖(G2或G2F)的復合型多聚糖。MRS-CD4-001(作為參比批產品)和MEV005具有相似數量的寡聚甘露糖-5型多聚糖(M5)，但MEV005比MRS-CD4-001具有更少的非核心巖藻糖基化多聚糖。在所有批產品中，MEV005無半乳糖的核心巖藻糖基化多聚糖(GOF)含量最高，比參考批產品MRS-CD4-001約高20°/。。糸匕產品BN078與參比批產品MRS-CD4-001具有可比性，它們的具有相似含量的GOF、含有一個半乳糖(GIF)的核心巖藻糖基化多聚糖和非核心巖藻糖基化多聚糖，盡管BN078含有更多的M5。BO11869的特征是與MRS-CD4-001相比G0F含量增加，非核心巖藻糖基化多聚糖含量減少。不出所料，MRS-CD4-001于MOCK-MRS-CD4具有高度可比性(MOCK-MRS-CD4直接來自參比批產品MRS-CD4-001)。批產品UNG-MRS-CD4被確認不含有多聚糖(數據未顯示)。表1用HPAEC-PAD測定扎木單抗批產品多聚糖含量一覽<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>A:中性多聚糖百分比B:無半乳糖的核心巖藻糖基化多聚糖百分比(GOF;總峰面積百分比)C:含有一個半乳糖的核心巖藻糖基化多聚糖百分比(GIF;總峰面積百分比)D:寡聚甘露糖5型結構百分比(M5，總峰面積百分比)E:非核心巖藻糖基化多聚糖百分比(總峰面積百分比)。根據公式計算非核心巖藻糖基化多聚糖+GOF'X)"OO，其中GO是非核心巖藻糖基化多聚糖百分比，GOF'是經過(3-半乳糖苦酶處理后的核心巖藻糖基化多聚糖百分比(G0F+G1F)。Ns未顯示Nt未檢測實施例7糖基化差異與ADCC活性的關系I用流式細胞術研究數個扎木單抗批產品(見實施例6)對原代CD4+T細胞的由NK細胞介導的ADCC的誘導能力(圖3)。通過靜脈穿刺收集健康志愿者(知情同意后)的外周人血并以暗黃層(Sanquin，Utrecht,TheNetherlands)的形式提供。在人血中加入無菌PBS，采用淋巴細胞制備密度離心(淋巴細胞分離介質，BioWMttaker，viaCambrexVenders,比利時；產品#17-829E)分離夕卜周血單核細胞(PBMC),800xg20min(制動0次)離心分離20min。除去梯度介面的PBMC并在重懸于RPMI前用PBS洗滌3次(400xg7min,制動3次)。根據廠商的操作規程使用DynalCD4+T細胞陰性分離試劑盒(DynalBiotechGmbH，漢堡，Germany;產品#113.11)分離CD4+T細胞。根據廠商的操作規程使用DynalCD4+T細胞陰性分離試劑盒(DynalBiotechGmbH,漢堡，Germany;產品#113.15)分離NK細胞。根據廠商的操作規程用焚光細胞膜標記PKH26(PKH26才示i己i式劑盒,Sigma-AldrichChemie,Zwijndrecht,TheNetherlands;產品#PKH26-GL)標記分離的CD4+T細胞。然后將PKH26標記的CD4+T細胞轉移至96孔圓底板，2.5-5xl04個細胞/孔，每孔50^(根據分離后NK細胞的產率，調整每孔的T細胞數量使效應器細胞革巴細胞達到10:1)。然后，將稀釋的扎木單抗批產品(稀釋范圍據圖表所示)加到50(il中，于4。C溫育10min。之后，將100(JNK細胞以2.5-5xl()S個細胞/孔加入，使細胞旋轉下沉，然后將沉降細胞在37。C溫育4h。為了達到自發裂解，在無NK細胞的情況下將靶細胞于培養基溫育。然后在進行分析前用TO-PRO-3對細胞染色(染色滲透細胞；分子探針，萊頓，荷蘭；產品弁T3605;最終稀釋度為1:100000)。使用流式細胞儀，用FACSCalibur和具有適當補償設置的CellQuestPro軟件(BectonDickinson)測定細胞相關熒光。用PKH26+細胞群中TO-PRC^-3+細胞數除以PKH26+細胞總數計算細胞裂解百分率。由于允許頂點水平可變的四參數對數分析顯示并不是所有的曲線達到相似的頂點水平，所以用基線固定曲線的ECso值來計算批產品的活性和相對活性(而不是藥效)。就ADCC誘導活性而言，BN078、B0118、MOCK-MRS-CD4和M90-MRS-CD4顯示出與MRS-CD4-001(作為參考批產品)的可比性。MEV005和M50-MRS-CD4顯示出比參比批產品MRS-CD4-001更低的NK細胞介導的ADCC的誘導效率。對參比和對照批產品的研究結果顯示重鏈糖基化水平和誘導ADCC能力存在明顯聯系。完全糖基化參比批產品顯示出最大的ADCC活性，然而批產品M50-MRS-CD4(含有50%非糖基化的扎木單抗)顯示出的ADCC誘導活性顯著減少。批產品M90-MRS-CD4(含有10%非糖基化的扎木單抗)與參比批產品具有相似的誘導ADCC的能力。對批產品的檢測結果與以下內容符合含有一定數量未糖基化重鏈的批產品MEV005和B0118顯示出減弱的誘導ADCC能力。對批產品MEV005和B0118分析顯示這些批產品還具有增加的巖藻糖基化，這可能說明巖藻糖基化引起這些批產品的ADCC誘導能力減弱(Shields,R.L.etal.,JBiolChem277,26733(2002),andOkazaki,A.etal.,JMolBiol1^，1239(2004))。實施例8糖基化差別與ADCC活性的關系II用流式細胞術研究數個脫糖基化混合批產品對原代CD4+T細胞的由NK細胞介導的ADCC的誘導能力(見實施例7)。3個實驗中的一個代表性實驗的結果(見圖4的數據)以一定濃度范圍(部分)脫糖基化批產品(單個數據點)存在下的CD4+T細胞的特異性裂解表示。將基線固定于一個共同值(commonvalue)(圖4A)，用4參數對數擬合進行曲線擬合。此外，在限制基線水平、頂點水平和坡度的情況下使用4參數對數擬合進行曲線擬合(圖4B)。使用頂點、基線和坡度固定曲線的EC5o值計算相對于MRS-CD4-001的藥效。此外，計算相對于母體GMP#3批產品(該批產品用于制備脫糖基化和混合批產品)的相對藥效(表2)。與MRS-CD4-001相比，GMP#3批產品和MOCK-GMP#3-CD4,偽脫糖基化GMP#3的ADCC活性《叛弱增加。M50-GMP#3-CD4、M70-GMP#3-CD4和M90-GMP#3混合批產品(脫糖基化和未脫糖基化GMP#3批產品的混合物)分別具有50%、30%和10%的脫糖基化GMP#3，相對于GMP#3的藥效為0.31、0.59和0.87，顯示出ADCC活性隨著重鏈糖基化的增加而減少。總之，重鏈糖基化水平和誘導ADCC能力存在著明顯的關系。表2脫糖基化混合批產品誘導ADCC的能力扎木單抗批產品相對藥效(ADCC)Exp1Exp2Exp平均值±SDMRS-CD4-001/GMP#11.001.001.001.00GMP#30.981.301.451.24±0.24(1.00)*MOCK-GMP#3-CD41.381.551,421.45±0.09(1.17)*M50-GMP#3-CD40.140,640.390.39±0.25(0.31)*M70-GMP#3-CD40.371.030.790.73±0.33(0.59)*M90-GMP#3-CD40.74U81.331.08±0.31(0.87)**相對于GMP#3批產品的藥效，被檢測批產。17。均來自于GMP#3顯示了相對參比批產品MRS-CD4-001的相對藥效(由限制了基線水平、頂點水平和坡度時的曲線EC50值計算得到)和平均值±SD(標準偏差)。括號內為相對于母體GMP#3的相對藥效。實施例9FcrRIHal76V結合ELISA和與ADCC的關系I檢測數個扎木單抗批產品(見實施例6)與Fc丫RIIIal76V的結合情況。用100pl2.5pg/mlFcyRinal76V(按照實施例4制備)包被Greiner板，于4。C溫育過夜。用200plPBST(含有0.05%Tween-20(Sigma-AldrichChemieB.V.，Zwijndrecht，，NL;產品目錄號63158)的PBS)和100pl系列稀釋的扎木單抗樣品(扎木單抗的濃度為300、75、18.75、4.69、0.29、1.17、0.07和0.02ng/ml)將板洗涂3次。將板置于RT振蕩溫育60min,然后用200plPBST洗滌3次，再加入綴合物，即1:4000稀釋的與過氧化物酶偶聯的親和純F(ab，)2片,殳G-a-Hu-IgQF(ab，)2特異性片4殳((JacksonImmunoResearch，BrunschwigChemieB,V.，阿姆斯特丹，荷蘭)。將板子再次置于RT振蕩溫育60min,然后用200plPBST洗滌3次，加入100(ilABTS(Roche,catnr1112597)，將板子在振蕩條件下溫育30min。加入100pl2%草酸終止反應，在405nm處測定吸光值。結果如圖5所示。由于使頂點水平可變的四參數對數分析顯示所有曲線達到相似的頂點水平，使用固定基線水平、頂點水平和坡度固定的曲線EC5()值計算批產品的藥效合相對藥效。BN078和MOCK-MRS-CD4與參比批產品MRS-CD4-001相比具有相似的與板結合的FcyRIIIal76V結合的能力。批產品MEVOOl、MEV005、B0118、M50-MRS-CD4和M90-MRS-CD4顯示出更低的與板結合的FcYRHIal76V的結合藥效。就與板結合的Fc7RIIIai76V的結合而言，批產品MEV001、MEV005、、B0118和M50-MRS-CD4具有可比性，相對藥效為0.4-0.5。M90-MRS-CD4與預期的不同，相對結合藥效約0.7(預期值為0.9)。對參比和對照批產品的研究發現重鏈糖基化水平與FcyRinal76V結合能力之間存在明顯的關系。完全糖基化參比批產品顯示出最大FcYRIIIal76V結合力，而M50-MRS-CD4的結合能力顯著降低，M90-MRS-CD4顯示了中等的結合能力。檢測批產品的結果與以下內容符合具有30%和10%未糖基化重鏈的MEV005和B0118顯示出顯著降低的Fc了RIIIal76V結合能力。出乎意料的是批產品MEV001也顯示出顯著降^f氐的Fcyinal76V結合能力，雖然SDS-PAGE并未檢測出MEV001含有未糖基化重鏈。從以上內容可以得出ADCC誘導(圖3)和與純化FcYRIIIal76V(圖5)的結合力之間存在聯系。實施例10FcYRJIIal76V結合ELISA和與ADCC的關系II檢測數個扎木單抗脫糖基化混合批產品(見實施例8)與FcyRIIIal76V的結合能力。用100pl2.5ng/mlFc/腿al76V(按照實施例4制備)包被Greiner板，于4。C溫育過夜。用200jilPBST(含有0,05%Tween-20(Sigma-AldrichChemieB.V.，Zwijndrecht,,NL;產品目錄號63158)的PBS)和100^tl系列稀釋扎木單抗樣品(扎木單抗的濃度是300，75，18.75,4.69，0.29，1.17，0.07和0.02jag/ml)將板洗滌3次。將板在RT上振蕩溫育60min,然后用200(alPBST洗滌3次，再加入綴合物，即1:4000稀釋的過氧化物酶偶聯親和純F(ab，)2片段G-a-Hu-IgQF(ab，)2特異性片段((JacksonImmunoResearch,BrunschwigChemieB.V.，阿姆斯特丹，荷蘭)。將板又在振蕩條件下溫育60min，然后用200|ilPBST洗滌3次，加入100|ilABTS(Roche,catnr1112597)，將板在振蕩條件下溫育30min。加入100pi2%草酸終止反應，在405nm處測定吸光值。結果如圖6所示。限制基線水平、頂點水平和坡度，使用四參數對數擬合進行曲線擬合(圖6)。使用固定頂點、基線水平和坡度的曲線的ECso值計算相對于MRS-CD4-001的相對藥效。此外，計算相對于母體GMP#3批產品(用于制備脫糖基批產品和混合批產品)的相對藥效(表3)。扎木單抗批產品與板結合的FcYRIIIal76V的結合扎木單抗批產品相對藥效(FcyRinal76V結合)Exp1Exp2平均值±SDMRS-CD4-001/GMP#1LOO1.00LOOGMP#31.121.121.12±0.00(1.00)*UNG-GMP#3-CD4Nd雨-MOCK-GMP#3-CD41.231.231.23±0.00(1.09)*M50-GMP#3-CD40.500.600.55±0.07(0.49)*M70-GMP#3-CD40.710.880.80±0.12(0.71)*M^-GMP#3-CD40.911.161.04±0.18(0.93)*顯示了相對于參比批產品MRS-CD4-001(來自基線水平、頂點水平和坡度受限的曲線的EC50值)的相對藥效和平均值士SD，括號內是相對于給定母體GMP#3的相對藥效與MRS-CD4-001批產品、GMP#3批產品和MOCK-GMP#3-CD4批產品相比，偽脫糖基化GMP#3批產品與FcyRinal76V的結合能力略有增加。M50-GMP#3-CD4、M70-GMP#3-CD4和M90-GMP#3混合批產品(脫糖基化和糖基化GMP#3批產品的混合物)分別含有50%、30%和10%脫糖基化GMP#3，相對于GMP#3的結合藥效分別為0.49、0.71和0.93,顯示出隨著重4連糖基化含量的減少與FcyRIIIal76V的結合能力也減弱。總之，重鏈糖基化水平和FcYRIIIal76V結合能力之間存在明顯的關系(圖7)。又一次表明ADCC和FcyRIIIal76V結合之間確實存在明顯的關系(圖8)。實施例11與抗原結合I用ELISA研究扎木單抗批產品與純化的CD4蛋白的結合(圖9)。通過4。C溫育過夜將sCD4(《免疫診斷學(ImmunoDiagnostics)》，Woburn，MA，USA,catnr7001-10)以PBS中0.5pg/ml(100pl/孔)的濃度包被平底96孔板(Greiner,Alphena/dRijn,NL,catnr655092。棄去板中溶液，用200jil/孔PBSC(含有2%(v/v)雞血清的PBS(Invitrogen,Breda，NL,catnr16110-082))在RT振蕩器lh封閉殘余的非特異結合位點。制備扎木單抗批產品稀釋物，在PBSTC(含有0.05%(v/v)Tween-20(Sigma-AldrichChemieB.V"Zwijndrecht，NL;cat。158的PBS)和2%(v/v)雞血清)中進行系列4倍稀釋，濃度范圍從2000ng/ml到0.49ng/ml。棄去板中溶液，加入100pl稀釋液到包被板中，在RT振蕩溫育2h。棄去板中溶液并用PBSTlx(200p1/孔)洗滌3次。將綴合物羊抗HulgGF(ab，)2特定HRP(JacksonImmunoResearch)在PBSTClx中按1:10.000進行稀釋，每孔加入100pl。將板在RT上振蕩溫育lh。棄去板中溶液并用PBSTlx(200^d/孔)洗滌3次。在吸水紙上拍板以除去所有殘余液體。將一片ABTS底物(50mg羅氏診斷學NL,Almere,NL，catnr1122422)溶解在50mlABTS緩沖液中(羅氏，catnr1112597),每孔加入100pl。用鋁箔包裹板子在RT振蕩溫育30min。用100(il/孔2%草酸(Sigma-AldrichChemieB.V.)終止反應。用分光光度計在405nrn處讀取吸光度(ELISA-EL808，BeundeRonde,Abcoude，NL)。由于使頂點水平可變的四參數對數分析顯示所有曲線達到相似的頂點水平，使用固定基線水平、頂點水平和坡度固定的曲線EC50值計算批產品的藥效合相對藥效。與參考MRS-CD4-001相比，盡管所有其它批產品的糖基化程度明顯不同，但是它們具有與板結合的sCD4相似的結合力。應該注意的是該測定方法具有相對較高的可變性。實施例12抗原結合n用EUSA研究扎木單抗混合批產品(見實施例8)與純化CD4蛋白的研究(圖10)。用100pi2.0|ig/mlsCD4(免疫診斷學((ImmunoDiagnostics)，Woburn，MA,USA，產品#7001-10)包被Greiner板并于4。C溫育過夜。用200jilPBST和100pl系列稀釋的扎木單抗樣品(扎木單抗的濃度為1000、250、62.5、15.62、3.9、0.98、0.24和0.06ng/ml)洗板3次。將板子于RT振蕩溫育60min,然后用200plPBST洗滌3次，再加入以1:20000稀釋的過氧化物酶偶聯親和純G-a-Hu-IgG，F(ab，)2特異片段(JacksonImmunoResearch，BrunschwigChemieB.V,，阿姆斯特丹，荷蘭)綴合物。再次將板子于RT振蕩溫育60min，然后用200nlPBST洗滌3次。加入lOOiilABTS(羅氏，catnr1112597),將板子振蕩溫育30min。用100^12%草酸終止反應，在405nm讀取吸光值。由于使頂點水平可變的四參數對數分析顯示所有曲線達到相似的頂點水平，使用固定基線水平、頂點水平和坡度固定的曲線EC50值計算批產品的藥效合相對藥效(表4)。表4扎木單抗脫糖基化混合批產品與板結合的CD4的結合<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>顯示了相對于參比批產品MRS-CD4-001(來自基線水平、頂點水平和坡度受限的曲線的EC50值)的相對藥效和平均值士SD。GMP弁3是專利批產品與參比批產品MRS-CD4-001相比，盡管所有其它批產品的糖基化程度具有明顯差異，但它們與板結合的sCD4具有相似的結合能力。實施例13IL-2生產的抑制通過嵌套測定法(T細胞活化測定，然后進行IL-2ELISA)研究扎木單抗批產品(見實施例6)通過活化的PBMC抑制IL-2產生的能力，在嵌套測定法中按照廠商說明書使用來自U-CyTech(烏德勒支，荷蘭；產品CT202)或來自BD生物科學(AlphenaandeRijn，荷蘭，產品#55061l)的人IL-2細胞因子ELISA試劑盒。在系列稀釋(或所選系列)的參比抗體或檢測樣品存在下，用板結合的抗-CD3(100ng/ml)和可溶性抗-CD28(100ng/ml)在平底96孔板中激活PBMC(每孔105個細胞)。38-42h以后，收獲細胞懸浮液，在稀釋液中稀釋并轉移到96孔ELISA板中。使用含有IL-2標準品的人IL-2ELISA試劑盒通過ELISA測定pg/ml水平的IL-2濃度。由于使頂點水平可變的四參數對數分析顯示所有曲線達到相似的頂點水平，使用固定基線水平、頂點水平和坡度固定的曲線EC50值計算批產品的藥效合相對藥效；由于UNG-MRS-CD4沒達到相同的基線水平，將該批產品排除此分析之外。使用兩個MRS-CD4-001曲線的平均ECs。值計算相對藥效。對每個板分別進行計算。如上所述測定扎木單抗批產品抑制IL-2產生的能力。結果顯示了一式兩份樣品上清液中IL-2的濃度。用四塊板子一全測全組扎木單抗批產品，每個實驗測定兩次。圖11顯示兩個實驗中的其中一個。如上所述測定扎木單抗批產品抑制IL-2產生的能力。表5顯示了兩組實驗相對于參比批產品MRS-CD4-001(2條MRS-CD4-001曲線的平均EC5o值)的相對活性(由基線固定曲線的ECM)值計算得到)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>所有被檢測的扎木單抗批產品，除了對照批產品UNG-MRS-CD4，都可抑制IL-2的產生。批產品MOCK-MRS-CD4、M90-MRS-CD4、BN078和MEV005與參比批產品MRS-CD4-001的抑制方式相似。B0118抑制程度更高，批產品M50-MRS-CD4和MEVOOl抑制程度較低。不同實驗之間和實驗中存在高度變異性。當用參比和對照批產品的結果進行研究時，重鏈糖基化水平顯示出在一定程度上與通過活化T細胞抑制IL-2產生的能力相關。完全糖基化參比批產品顯示出最大活性，然而M50-MRS-CD4抑制IL-2產生的能力顯著降低。M90-MRS-CD4具有與參比物相似的抑制IL-2產生的能力。含有30%未糖基化重鏈的被檢測批產品MEV005抑制IL-2產生的能力降低。然而未顯示含有未糖基化重鏈的批產品MEVOOl抑制IL-2產生的能力也降低，而含有10%未糖基化重鏈的批產品B0118可以很好地抑制IL-2的產生，即使略高于參比查品。實施例14通過基于AlphaScreenTM的分析法篩選數個扎木單抗批產品的FcR結合和CD4結合使用單一基于Al。haScreenTM的分析法檢測數個扎木單抗批產品(見實施例8)與FcyRIIIal76V和CD4的結合。將His標記FcYRIIIal76V偶聯到Ni受體珠上。洗滌珠除去未結合的His標記FcyRIIIal76V。將sCD4-生物素偶聯到SA供體珠上。洗滌i朱除去未結合的sCD4-生物素。制備參比批產品MRS-CD4-001和H-IgG的稀釋樣品(范圍90、30、3、1、0.3、0.03和0jig/ml)。將可變體積的His標記FcyRIIIal76V-Ni-受體珠加入384孔光學板(optiplate)的孔中，然后加入固定體積的扎木單抗或H-IgG和固定體積的sCD4-生物素-SA-供體珠。在暗處于室溫溫育lh后，用帶有"a篩選標記"的EnVisionTM儀器分析珠/抗體混合物。圖12證明兩個實驗具有相似的相對結合能力趨勢。根據預期值，M50-MRS-CD4的平均結合能力為參比批產品的53%。M90-MRS-CD4顯示出約75%的結合能力，略低于預期值。批產品B0118和BN078顯示相似的結合能力(88%和89%)。批產品MEV005和MOCK-MRS-CD4的結合能力略低(84%和81%)。實施例15與細胞結合的FcyRI的結合檢測數個扎木單抗批產品(見實施例8)與細胞結合的FcyRI的結合。收獲IIA1.6和1IA1.6-FcyRI纟田月包(由L.Bevaart女生(免疫治療部門，烏德勒支醫療中心大學，烏德勒支，荷蘭)惠贈)并用臺盼藍排除法計數。在RT中將細胞于500g旋轉5min，棄去上清,3夸細月包以lx106個/ml重懸于染色液(含有1。/。v/vBSA(羅氏，Almere，NL)的PBS)和0.01%v/v疊氮化合物(Sigma-AldrichChemieB.V.))并以100fil/孑Li專爭詳多至96孑LV形底斧反(Greiner,Frickenhausen,Germany,cat#651101)。在染色液中以2倍系列稀釋制備扎木單抗批產品稀釋液，濃度范圍從10000ng/ml到9.8ng/ml。向細胞加入100pl樣品、陰性對照IgG2(結合位點，伯明翰，英國，cat弁BP080)或染色液，于4°C溫育30min。用150pl染色^7孔洗滌細胞3次，RT旋轉500g5min。向細胞沉淀物加入100孔的F(ab，)2抗人-IgG-F(ab，)rFITC(Jackson，賓夕法尼亞，美國，產品#109-096-097;1:IOO染色液稀釋)，于4。C溫育30min。用150pl染色液洗滌細胞3次，RT旋轉500g5min。將細胞重懸于150pl染色緩沖液中并轉移至1.3ml的試管中。用FACSCalibur(BD)或FACScan(BD)分析細胞。與參比批產品MRS-CD4-001相比，大部分批產品與細胞結合Fc7RI的結合數量略低，盡管批產品之間的糖基化存在差異。應該注意的是這種測定方法的變異相對較高。而且含有50%糖基化重鏈的批產品M50-MRS-CD4的結合力更低。批產品UNG-MRS-CD4很難與板結合的FqRI結合(圖13)。實施例16與板結合的FcYRI的結合檢測數個扎木單抗批產品(見實施例8)與板結合的FcyRI的結合。用His標記的重組FcyRI(GenmabB.V.，trecht,NL，批產品#EX2005-0403-016-TVE)以1.5jig/ml(100)il)包被平底％孔板，在PBS中于4。C溫育過夜。用PBS洗板3次，倒空并用200(ji/孔的PBSC在RT封閉非特異性結合位點1h。制備扎木單抗批產品稀釋液，用PBSTC進行2倍系列稀釋，濃度范圍從4000ng/ml到31.25ng/ml。加入100^1稀釋樣品，在RT溫育2h。棄去板中溶液，用PBSTlx(200jil/孔)洗滌3次。用lxPBSTC以1:10.000稀釋的羊[F(ab，)2片段]抗人IgGF(ab，)2特異HRP綴合物(Jackson,catnr109-096-097)(在EX2005-0505-008-MVO中使用羊抗人IgGF(ab，)2特異HRPJacksoncatnr109-035-097綴合物)，每孔加入100|al綴合物。將板子在RT溫育lh。棄去板中溶液，用PBSTlx(200pl/孔)洗滌3次。在吸水紙上拍板除去殘余液體。將一片ABTS底物(50mg(羅氏i貪斷學(RocheDiagnostics)NL,Almere，NL，catnr1122422)》容解在50mlABTS;容液中(羅氏，catnr1112597),每孔加入100p!。用鋁箔包裹板子在RT溫育30min。用100pl/孔2。/。草酸[Sigma-AldrichChemieB.V.]終止反應。用分光光度計在405nm處讀取吸光值[ELISA-EL808，BeundeRonde，Abcoude，NL]。與參比批產品MRS-CD4-001相比，大部分批產品與細胞結合FcyRI的結合能力略低，盡管批產品之間存在糖基化差異。應該注意的是這個測定方法的變異相對較高。而且僅含有50°/。糖基化重鏈的批產品M50-MRS-CD4底結合能力顯著降低。UNG-MRS-CD4未顯示與FqRI包被板很強的結合能力(圖14)。實施例17扎木單抗批產品誘導ADCC的能力和與CD4、FcyRI、FcYRIIIal76V或CD4和FcrRIIIal76V聯合結合中測定的相對藥效的關系檢測數批扎木單抗(見實施例8)與板結合的FcyRI的結合。根據重鏈糖基化水平和與數個測定方法的潛在聯系將參比產品和扎木單抗混合批產品(不同重鏈糖基化)分類。與參比批產品MRS-CD4-001相比，批產品UNG-MRS-CD4、M50-MRS-CD4和M90-MRS-CD4都與CD4的結合能力類似(圖15B;也見圖9)，然而與FcyRI(圖15C;也見圖13和14)和FcYRIIIal76V(圖15D;也見圖5)的結合能力不同，這與重鏈糖基化水平相關。在AlphaScreen測定法(圖15E;圖12)和功能ADCC(圖15A;也見圖3)中也確實存在這種關系。這些數據顯示與Fc丫R的結合確實與抗體Fc介導的活性相關，該活性在作用機制發揮關鍵作用。實施例18FcYRIIIal76V脫唾液酸化可提高FcYRIIIal76V結合ELISA的性能檢測源自CHO-K1SV細胞的兩個FcyRIIIal76V批產品是否適用于板結合的FcyRIIIal76V結合ELISA(如上所述)。用100pl2.5jig/mlFcyRinal76V批產品646-005-EP或655-015-EP包被Greiner板，于4。C溫育過夜。用200plPBST(含有0.05%Tween-20的PBS)洗板3次，加入100pl系列稀釋扎木單抗樣品(扎木單抗的濃度為300、75、18.75、4.69、0.29、1.17、0.07和0.02pg/ml)。將板子在RT振蕩溫育60min，加入200plPBST洗滌3次，再加入以1:4000稀釋的綴合物過氧化酶親和純F(ab，)2片段G抗人IgG,F(ab，)2特異性片段((JacksonImmunoResearch，BrunschwigChemieB.V.,阿姆斯特丹,荷蘭)。再次將板子在RT振蕩溫育60min,然后用200plPBST洗滌3次。加入100jilABTS(羅氏，catnr1112597)并將板子在振蕩條件下溫育30min。用100pl/孔2。/。草酸[Sigma-AldrichChemieB.V.]終止反應，測定405nm處的吸光值。結果如圖16所示。批產品646-005-EP表現出較好的劑量反應曲線，頂點值較高，然而批產品655-015-EP的曲線更加平緩，頂點值較低。先前已注意到非變性電泳顯示這些批產品帶有不同的負電荷，例如批產品655-015-EP比批產品646-005-EP含有更多的負電荷(圖17)。此外，這兩個批產品在還原SDS-PAGE上遷移行為不同，但在用酶脫糖基化后它們遷移到相同位置(圖18)。這表明分子量差異是由N連接糖基化的差異造成的。將批產品655-015-EP去唾液酸，在Fc丫RIIIal76V結合ELISA中比較脫唾液酸受體與未處理受體。為了除去唾液酸，將批產品655-015-EP(在磷酸鹽緩沖液中)與產脲節4干菌(JW/zraZ^c&rwea/ac/era義唾液酸酶(羅氏，目錄號10269611001;約1mgFcyRinal76V中含有80mU唾液酸酶)于37。C溫育72h。溫育后，用TALONTM珠純化脫唾液酸受體并使用實施例5描述的PD-10柱子將緩沖液交換成磷酸緩沖液，得到1.2ml濃度為0.45mg/ml(batch403-041-EP)的純化脫唾液酸FcYRIIIal76V。然后用SDS-PAGE(圖19)和非變性凝膠電泳(圖20)分析未處理655-015-EP和脫唾液酸批產品403-041-EP。與未處理FcYRIIIal76V相比，脫唾液酸批產品的負電荷顯著較少，分子量略小。這表明受體已被成功地脫唾液酸。在板結合的FcYRIIIal76V結合ELISA中比較脫唾液酸和未處理FcyRIIIal76V。兩種制備物都以2.5|ig/ml包被到板上，按上述方法與扎木單抗結合。圖21清楚地顯示了受體脫唾液酸化顯著提高了板結合測定的性能。為了確定這是否由脫唾液酸FcYRIIIal76V與板結合能力提高引起的，將兩倍系列稀釋脫唾液酸FcYRIIIal76V(批產品403-041-EP)和未處理FcyRinal76V(655-015-EP)包被到板上。起始濃度為10^g/ml。用PBTS洗板，用羊-抗-CD16-FITC(BD生物科學，目錄號555406)然后用羊-抗-FITC-HRP(羅氏，目錄號11426356910)檢測結合的FcyRnial76V。用ABTS顯示反應結果。圖22顯示了與未處理FcYRIIIal76V相比，脫唾液酸FcYRIIIal76V與板的結合能力確實有所提高。實施例19用包被于ELISA板上的his捕獲抗體捕獲his標記FcyRIIIal76V可以l是高ELISA的壽文感性。比較將his標記FcyyRinaECD176VHis直接包被于ELISA板和用his捕獲抗體捕獲his標記FcyRIIIaECD176VHis。用100pilpg/mlFcyRIIIal76V批產品弁0646-005-EP或用抗多聚組氨酸mAb(羊-抗-多聚組氨酸IgGlmAb克隆AD1.1.10,R&D,產品#MAB050,0.5mg/mlPBS/5o/。海藻糖,批號弁AEJ175(B1)包被Greiner板，于4。C溫育過夜。用200plPBST(含0.05%Tween-20的PBS)洗板3次，用含有1%BSA的PBS封閉60min。將抗多聚組氨酸mAb包被板與100pil^ig/mlFcYRIIIal58V批產品進一步在RT振蕩溫育60min,然后用200)ilPBST洗滌3次。將兩種類型的包被板與100jul系列稀釋的HuMax-EGFr樣品(HuMax-EGFr的濃度是300、75、18.75、4.69、0.29、1.17、0.07和0.02|ig/ml;批產品1#095-03-01F和批產品2#P247740)在RT振蕩溫育60min，然后用200jalPBST洗滌3次，再加入綴合物以1:10，000稀釋的過氧化物酶偶聯親和純F(ab，)2片#殳G抗人'IgG，F(ab，)2特異片I5:(JacksonImmunoResearch,BrunschwigChemieB.V.，阿姆斯特丹，荷蘭)。將板子在RT振蕩溫育60min,用200plPBST洗滌3次。加入100plABTS并在振蕩條件將板子溫育20min。加入100(il2%草酸終止反應，測定405nm處的吸光值。圖23顯示了兩批抗體HuMax-EGFr與FcyRIIIa176V的結合曲線(數據以平均值士SD,n=3顯示)，直接包被(上組圖)或使用his捕獲mAb(下組圖)。使用his捕獲的包被可以使HuMax-EGFr—FcYRIIIa176V相互作用的親和力更高，約比直接包被FcYRIIIal76V的親和力高4倍。由于解離得更慢，所以更高親和力也是有利的。因此，使用his捕獲抗體來捕獲his標記FcyRIIIal76V的方法可以提高結合ELISA的敏感性。顯著地，兩個被檢測HuMax-EGFr批產品的EC50比率對于兩種ELISA形式都是相同的(平均約2),這表明這個測定形式與測定相對藥效相當。實施例20扎木單抗對CD4+T細胞CD4受體的Fc依賴性下調用源自PBMC的CD4+T細胞(純化見實施例7)或SUP-T1細胞，在加入或不加入源自PBMC的單核細胞(根據Dynal單核細胞陰性分離試劑盒進行分離)或TPH-1細胞的條件下研究效應器細胞存在時扎木單抗下調CD4的能力。將PBMC或SUP-T1細胞與一定濃度范圍的扎木單抗、扎木單抗-F(ab，)2片段(SUP-T1)、扎木單抗-Fab(SUP-T1)或陰性對照HuMab-KLH溫育。在適當的時候將效應器細胞以效應器細胞和耙細胞比率為10:1、5:l或4:1力。入。加入IFN-y(濃度范圍125-1000嗎/ml)，將細胞溫育過夜。然后，將細胞染色用焚光標記M-T477(來自BD的非竟爭Ab)檢測細胞CD4和靶細胞篩選標記(區分靶細胞和其它細胞)。用流式細胞儀評價細胞相聯焚光強度。圖24顯示了使用新鮮分離的CD4+T細胞或SUP-T1T細胞用帶有非竟爭CD4單克隆抗體的流式細胞儀檢測的扎木單抗誘導CD4下調的能力。純化的原代CD4+T細胞(圖4A)或SUP-T1T細胞(圖4B)中對CD4表達的扎木單抗劑量依賴型下調分別需要單核細胞或單核細胞的存在。結果顯示18-24h后CD4表達水平減少了50-80%。由于不論在有無輔助細胞的情況下與F(ab，)2片段溫育不會引起CD4表達減少(圖4B)所以下調為Fc依賴性的。在高mAb濃度下，可溶扎木單抗不能下調CD4，可能由于單體結合導致交聯減少。通過固定化聯也下調CD4(數據未顯示)。所有這里引用的參考文獻，包括出版物、專利應用和專利都以參考文獻的形式被完整引用，與每一篇參考文獻被單獨和特別指出以參考文獻被引用的程度相同。這里使用的所有標題和副標題僅僅是為了方便起見，不應該以任何形式限制本發明。除非這里另外說明或與專利內容相互矛盾，以上所述內容的任何可能變體的任何組合都包括在本發明中。除非這里另外說明或與專利內容相互矛盾，在描述本發明的內容中所使用的術語"一"、"該"和類似指示代詞包括單數和復數形式。除非這里另外說明，這里列舉的數值范圍僅為指出在這一范圍內的每一個單獨數值的簡便方法，每個單獨的數值都包含在規格中，就像它們在這里被單獨引用。除非另有說明，這里提供的所有精確數值代表相應的近似數值(例如也可認為這里提供的與某一具體因素或測定相關的精確示例數值也提供了相應的近似測定，適當時用"約"來修飾)。除非這里另外說明或與專利內容相互矛盾，這里描述的所有方法可以按任何合適的順序進行。這里提供的所有實施例或示例性語言(例如"例如")僅僅是為了更好地闡明本專利，除非特別指出，不會限制本專利的范圍。規格里的語言都不應該指明任何一個元素對于實施本發明是必須的。這里對專利文件的引用僅僅是為了方便起見，不反應出任何對這些專利文件的有效性、可專利性和/或強制性的觀點。本發明使用的與一元素或許多元素相關的例如"組成"、"具有"、"包括"或"含有"這樣的術語對任何實施方案的描述意在支持由這一元素或許多元素"組成的""主要組成的"或"被包括在內的"本發明的相似實施方案。(例如，這里描述的包含某一元素的一種組合物應理解為描述了由該種元素組成的一種組合物，除非另外說明或與專利內容明顯矛盾)。本發明在法律允許的最大范圍內包括這里的實施方案中引用的主題的所有變體和等價物。這里引用的所有專利、待審批專利應用和其它出版物均以參考文獻的形式被完整引用。權利要求1.一種測定含有FcR結合肽藥品藥效的方法，其中藥品FcR結合肽的至少一種作用機制是通過藥品FcR結合肽與Fc受體結合介導，其中所述方法包括測定藥品FcR結合肽與Fc受體結合的方法。2.—種根據權利要求1的用于測定含有FcR結合肽藥品藥效的方法，該方法包括-i)測定參比標準FcR結合肽與Fc受體的結合ii)測定藥品FcR結合肽與上述Fc受體的結合iii)比較步驟ii)FcR與步驟i)FcR的結合情況，使用比較得到的信息評1介藥物的藥效；其中a)步驟ii)中與Fc受體的結合與步驟i)中與Fc受體的結合以相同的方式測定，b)藥品FcR結合肽的至少一種作用機制是通過FcR結合肽與Fc受體結合介導，c)其中參比標準FcR結合肽和藥品FcR結合肽是同種FcR結合分子的兩種不同制劑。3.—種生產含有FcR結合肽藥物組合物的方法，該方法包括a)生產含有上述FcR結合肽的藥品；b)將權利要求1或權利要求2中的方法應用于上述藥品，測定含有FcR結合肽藥品的藥效；c)使用步驟b)得到的信息作為該藥品是否可以作為藥物組合物來使用的部分評價依據。4.一種根據權利要求1-3中任一項的方法，其中所述方法是所述藥品作為藥物組合物銷售的上市許可申請的一部分。5.—種申請含有FcR結合肽藥品上市許可的方法，該方法包括對根據權利要求l-4任一項中用于測定藥品FcR結合肽藥效測定方法的描述。6.—種根據權利要求l-5任一項的方法，其中用于測定含有FcR結合肽藥品藥效的方法被用于批簽發的藥效測定。7.—種根據權利要求1-6任一項的方法，其中用以下方法測定FcR結合肽與Fc受體的結合(i)使藥品樣品與Fc受體接觸足夠長的時間以使FcR結合肽與Fc受體結合，(ii)檢測與Fc受體結合的FcR結合肽的量。8.—種根據權利要求7的方法，其中用針對FcR結合肽的檢測抗體進^f于^r測。9.一種根據權利要求8的方法，其中檢測抗體是標記抗體。10.—種根據權利要求1-9中任一項的方法，其中用ELISA測定FcR結合肽與Fc受體的結合。11.一種根據權利要求1-6中任一項的方法，其中用AlphaScreenTM測定法檢測FcR結合肽與Fc受體的結合。12.—種根據權利要求1-6中任一項的方法，其中用放射免疫測定法檢測FcR結合肽與Fc受體的結合。13.—種根據4又利要求1-6中任一項的方法，其中用Biacore測定法檢測FcR結合肽與Fc受體的結合。14.一種根據權利要求1-6中任一項的方法，其中用FMAT測定法檢測FcR結合肽與Fc受體的結合。15.—種根據權利要求1-6中任一項的方法，其中用DELFIA測定FcR結合肽與Fc受體的結合。16.—種根據權利要求1-15中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC)。17.—種根據權利要求1-15中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過誘導ADCC或靶受體的下調介導。18.—種根據權利要求1-17的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集自然殺傷細胞介導。19.一種根據權利要求1-18中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過誘導自然殺傷細胞的ADCC介導。20.—種根據權利要求1-19中任一項的方法，其中至少一種在體內結合FcR結合肽的Fc受體在自然殺傷細胞上表達。21.—種根據權利要求17-20中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRina受體或其保留了Fc區結合能力的片段。22.—種根據權利要求21的方法，其中FcyRIII受體是一種FcYRIIIal76V受體或其保留了Fc區結合能力的片段，例如胞外結構域。23.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集多形核白細胞介導。24.—種根據權利要求1-23中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過誘導多形核白細胞的ADCC介導。25.—種根據權利要求1-24中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過誘導PMN脫顆粒作用介導。26.—種根據權利要求1-25中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過誘導多形核白細胞的吞噬作用介導。27.—種根據權利要求1-17或23-26中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在多形核白細胞上表達。28.—種根據權利要求23-27中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIIa受體或其保留了Fc區結合能力的片段。29.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過誘導單核細胞或巨p藍細胞的ADCC介導。30.—種根據權利要求1-17或29中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在單核細胞和/或巨噬細胞上表達。31.—種根據權利要求1-17、29或30中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIb或其保留了Fc區結合能力的片段。32.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導血小板聚集。33.—種根據權利要求1-17或32中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集血小板介導。34.—種根據權利要求1-17、32或33中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在血小板上表達。35.—種根據權利要求1-17或32-34中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。36.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導細胞因子的產生。37.—種根據權利要求1-17或36中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集自然殺傷細胞和/或T細胞介導。38.—種根據權利要求1-17、36或37中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在自然殺傷細胞和/或T細胞上表達。39.—種根據權利要求1-17或36-38中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIa或其保留了Fc區結合能力的片段。40.—種根據權利要求1-17或36-38中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。41.一種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導清除免疫復合物。42.—種根據斥又利要求1-17或41中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集單核細胞或巨噬細胞介導。43.—種根據權利要求1-17、41或42中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體表達在單核細胞或巨噬細胞上。44.一種根據權利要求1-17或41-43中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIII或其保留了Fc區結合能力的片段。45.—種根據權利要求1-17或41-43中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRina或其保留了Fc區結合能力的片段。46.—種根據權利要求1-17或41-43中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIIb或其保留了Fc區結合能力的片段。47.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導抗體應答下調。48.—種根據權利要求1-17或47中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集B細胞介導。49.一種根據權利要求1-17、47或48中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在B細胞上表達。50.—種根據權利要求1-17或47-49中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIb或其保留了Fc區結合能力的片段。51.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導單核細胞和巨噬細胞效應器功能抑制作用。52.—種根據權利要求l-17或51的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集單核細胞和/或巨噬細胞介導。53.—種根據權利要求1-17、51或52中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在單核細胞和/或巨噬細胞上表達。54.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導吞噬作用。55.—種根據權利要求1-17或54中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集多形核白細胞、巨噬細胞和/或樹突狀細胞介導。56.—種根據權利要求1-17、54或55中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在多形核白細胞、巨噬細胞和/或樹突狀細胞上表達。57.—種根據權利要求1-17或54-56中4壬一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIIIb或其保留了Fc區結合能力的片段。58.—種根據權利要求1-17或54-56中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。59.—種根據權利要求1-17或54中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過誘導單核細胞或巨噬細胞的吞噬作用介導。60.—種根據權利要求1-17或59中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在單核細胞或巨噬細胞上表達。61.—種根據權利要求1-17、59或60中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIb或其保留了Fc區結合能力的片段。62.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是誘導交聯作用。63.—種根據權利要求1-17或62中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過細胞和/或抗體的交聯作用介導。64.—種根據權利要求1-17、權利要求54或權利要求63中任一項的方法，其中Fc受體是一種FqRIa或其保留了Fc區結合能力的片段。65.—種根據權利要求1-17、54或63中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRII或其保留了Fc區結合能力的片段。66.—種根據權利要求1-17、54或63中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIII或其保留了Fc區結合能力的片段。67.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過免疫受體基于酪氨酸的活化基序來誘導正向信號傳導。68.—種根據權利要求1-17或67中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集骨髓細胞、T細胞和/或血小板介導。69.—種根據權利要求1-17或67或68的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在骨髓細胞、T細胞和/或血小板上表達。70.—種根據權利要求1-17、或67-69中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。71.—種根據權利要求1-17、或67-69中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIc或其保留了Fc區結合能力的片段。72.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用^L制是通過普通Y、(3、；鏈來誘導正向信號傳導。73.—種根據權利要求1到17、或72中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過募集骨髓細胞、多形核白細胞、自然殺傷細胞或T細胞介導。74.—種根據權利要求1-17、72或73中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽的Fc受體在骨髓細胞，多形核白細胞，自然殺傷細胞或T細胞上表達。75.—種根據權利要求1-17或72-74中任一項的方法，其中Fc受體是一種FqRIa或其保留了Fc區結合能力的片段。76.—種根據權利要求1-17或72-74中任一項的方法，其中Fc受體是一種FqRIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。77.—種根據，K利要求1-17或72-74中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRIIIa或其保留了Fc區結合能力的片段。78.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中FcR結合肽的一個作用機制是通過免疫受體基于酪氨酸的抑制基序來誘導負向信號傳導。79.—種根據權利要求1-17或78中任一項的方法，其中FcR結合肽的一種作用機制是通過募集B細胞、巨噬細胞和/或單核細胞介導。80.—種根據權利要求1-17、78或79中任一項的方法，其中至少一種在體內與FcR結合肽結合的Fc受體在B細胞、巨噬細胞和/或單核細力包上表達。81.—種根據權利要求1-17、或78-80中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcyRIIb或其保留了Fc區結合能力的片段。82.—種根據權利要求1-17中任一項的方法，其中Fc受體是一種FcYRn或其保留了Fc區結合能力的片段。83.—種根據權利要求1-82中任一項的方法，其中上述方法使用的Fc受體是用含有制備步驟的方法制備，與使用不包括所述步驟的方法制備得到的相似Fc受體相比，所述步驟可產生N-連接糖基化上唾液酸數量減少的Fc受體。84.—種根據權利要求83的方法，其中Fc受體在唾液酸化機制缺陷的宿主細胞中表達。85.—種根據權利要求83的方法，其中Fc受體在用于上述方法之前用唾液酸酶處理。86.—種根據權利要求1-85中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種抗體。87.—種根據權利要求86的方法，其中FcR結合肽是一種單克隆抗體。88.—種根據權利要求86或87的方法，其中FcR結合肽是一種人抗體。89.—種根據權利要求86或87的方法，其中FcR結合肽是一種人源化抗體。90.—種根據權利要求86或87的方法，其中FcR結合肽是一種嵌合抗體。91.一種根據權利要求86-90中任一項的方法，其中FcR結合肽是含有Fc結合部分的抗體片段。92.—種根據4又利要求86-91中任一項的抗體，其中FcR結合肽是一種IgGl抗體。93.—種根據權利要求92的方法，其中FcR結合肽是一種IgGl，X抗體。94.一種根據權利要求92的方法，其中FcR結合肽是一種IgGl,K抗體。95.—種根據權利要求86-94中任一項的方法，其中所述抗體與96.—種根據權利要求95的方法，其中使用以下方法測定抗體與其抗原的結合(i)使抗體樣品與抗原接觸足夠長的時間以使抗體與抗原結合，(ii)檢測結合抗原的抗體量。97.—種根據權利要求96的方法，其中使用針對藥品抗體的檢測抗體進行檢測。98.—種根據權利要求97的方法，其中所述檢測抗體是一種標記抗體。99.一種根據權利要求95-98中任一項的方法，其中使用ELISA測定抗體與其抗原的結合。100.—種根據權利要求99的方法，其中上述ELISA也用于測定抗體與Fc受體的結合。101.—種根據權利要求95的方法，其中使用AlphaScreenTM檢測法測定抗體與其抗原的結合。102.—種根據權利要求101的方法，其中也使用AlphaScreen檢測法測定抗體與Fc受體的結合。103.—種根據權利要求95的方法，其中使用放射免疫檢測法測定抗體與其抗原的結合。104.—種根據權利要求103的方法，其中也使用放射免疫檢測法測定抗體與Fc受體的結合。105.—種根據權利要求104的方法，其中放射免疫測定法使用與Fc受體和貢獻放射性的抗原綴合的珠。106.—種根據權利要求86-105中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人CD4結合的抗體。107.—種根據權利要求106的方法，其中FcR結合肽是扎木單抗。108.—種根據權利要求106的方法，其中FcR結合肽是凱利昔單抗。109.—種根據權利要求106的方法，其中FcR結合肽是克立昔單抗。110.—種根據權利要求106的方法，其中FcR結合肽是TNX355。111.一種根據權利要求106的方法，其中FcR結合肽是TRX-l。112.—種根據權利要求106的方法，其中FcR結合肽是IOT4a。113.—種根據權利要求106的方法，其中FcR結合肽是4162W94。114.一種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人EGFR結合的抗體。115.—種根據權利要求114的方法，其中FcR結合肽是西妥昔單抗。116.—種根據權利要求114的方法，其中FcR結合肽是HuMax-EGFR。117.—種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與人CD20結合的抗體。118.—種根據權利要求117的方法，其中FcR結合肽是人利妥昔單抗。119.一種根據權利要求117的方法，其中FcR結合肽是替伊莫單抗。120.—種根據權利要求117的方法，其中FcR結合肽是托西莫單抗。121.—種根據權利要求117的方法，其中FcR結合肽是HuMax-CD20。122.—種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是與一種人TAC結合的抗體。123.—種根據權利要求122的方法，其中FcR結合肽是HuMax-TAC。124.—種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種與人CD3結合的抗體。125.—種根據權利要求124的方法，其中FcR結合肽是莫羅單抗。126.—種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種與人GPIIb/IIIa結合的抗體。127.—種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種與人CD25結合的抗體。128.—種根據權利要求127的方法，其中FcR結合肽是達克珠單抗。129.—種根據權利要求127的方法，其中FcR結合肽是巴利昔單抗。130.—種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種與人TNF-a結合的抗體。131.—種根據權利要求130的方法，其中FcR結合肽是英利昔單抗。132.—種根據權利要求130的方法，其中FcR結合肽是阿達木單抗。133.—種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種與人RSV結合的抗體。134.—種根據權利要求133的方法，其中FcR結合肽是帕利珠單抗。135.—種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種與人HER-2/neu結合的抗體。136.—種根據權利要求135的方法，其中FcR結合肽是曲司珠單抗。137.—種根據權利要求135的方法，其中FcR結合肽是培妥珠單抗。138.—種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種與人CD33的結合的抗體。139.—種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種與人CD52結合的抗體。140.—種根據權利要求139的方法，其中FcR結合肽是阿侖珠單抗。141.一種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種與人VEGF的結合的抗體。142.—種根據權利要求141的方法，其中FcR結合肽是貝伐珠單抗。143.—種根據權利要求1-94中任一項的方法，其中FcR結合肽是一種與人CTLA4結合的抗體。144.一種根據權利要求143的方法，其中FcR結合肽是MDX-010。145.—種被批準作為藥物組合物使用的含有FcR結合肽的藥品，其中一種根據權利要求1-144任一項的方法是上市許可申請中的一部分。146.—種在測定FcR結合肽與上述Fc受體結合的方法中使用的Fc受體的制備方法，其中上述Fc受體是用含有制備步驟的方法制備的，與使用不包括所述步驟的方法制備得到相似Fc受體相比，所述步驟可產生N-連接糖基化唾液酸it量減少的Fc受體。147.—種根據權利要求146的方法，其中用以下方法測定FcR結合肽與上述Fc受體的結合(i)使FcR結合肽與Fc受體接觸足夠長的時間以使抗體與抗原結合，(ii)檢測與Fc受體結合的FcR結合肽的量。148.—種根椐權利要求147的方法，其中使用針對FcR結合肽的才企測抗體進行纟企測。149.一種根據權利要求148的方法，其中所述檢測抗體是一種標記抗體。150.—種根據權利要求146-149中任一項的方法，其中使用ELISA測定FcR結合肽與Fc受體的結合。151.—種根據權利要求146-149中任一項的方法，其中使用AlphaScreenTM檢測法測定FcR結合肽與Fc受體的結合。152.—種根據權利要求146-149中任一項的方法，其中使用放射免疫檢測法測定FcR結合肽與Fc受體的結合。153.—種根據權利要求146-149中任一項的方法，其中使用Biacore;險測法測定FcR結合肽與Fc受體的結合。154.—種根據權利要求146-149中任一項的方法，其中使用FMAT測定FcR結合肽與Fc受體的結合。155.—種根據權利要求146-149中任一項的方法，其中使用DELFIA測定FcR結合肽與Fc受體的結合。156.—種根據本發明或權利要求1-155中任一項的方法，其中使用包一皮在ELISA板上的His捕獲抗體來捕獲his標記的FcR或FcR片段。157.—種適用于用多肽分子包被的塑料部件，其中多肽分子與塑料部件的粘附至少部分依賴于多肽分子與塑料部件表面之間的靜電相互作用，其中塑料部件表面已經包凈皮脫唾液酸化多肽。158.—種根據權利要求157的塑料部件，其中所述多肽分子是一種Fc受體。159.—種根據權利要求157或158的塑料部件，其中所述塑料部件是微量滴定板。160.—種根據權利要求157-159中任一項的塑料部件，其中所述塑料部件適用于權利要求1-144中任一項的方法。161.—種根據權利要求157-159中任一項的塑料部件，其中所述塑料部件可用于權利要求1-144中任一項的方法。全文摘要本發明涉及一種鑒定抗體的方法，該方法適于用作包含抗體的藥物組合物批簽發的藥效測定法，尤其適用于所述藥物組合物上市許可的申請。所提供的測定法是一種測定含有FcR結合肽藥品藥效的方法，其中藥品FcR結合肽的至少一種作用機制是通過藥品FcR結合肽與Fc受體的結合介導，其中上述方法包括測定藥品FcR結合肽與Fc受體的結合。文檔編號G01N33/566GK101268372SQ200680034421公開日2008年9月17日申請日期2006年7月21日優先權日2005年7月21日發明者C·E·G·哈夫尼思,P·帕倫,P·范伯克爾,T·文克申請人:根馬布股份公司