專利名稱：：用于分析物檢測的協同指示系統、組分以及方法
技術領域：
：本發明的實施方案涉及使用被轉換成納米尺度的"自發信號"生物傳感器的抗體分子來檢測樣本中的分析物的方法和組合物，特別是那些能提供目標分析物的一步檢測且無需傳統測定所必要的高勞動強度步驟的方法和組合物。
背景技術：
：免疫測定是以抗體和抗原之間的特異性相互作用為基礎的。它們通常在現代臨床診斷學、藥物篩選試驗和醫學研究中是不可缺少的。在這些免疫測定法中，酶聯免疫吸附檢測(ELISA)、惻流免疫測定法和蛋白印跡測定法的應用最廣泛。ELISA和蛋白印跡技術需要孵育/洗滌步驟的多次循環，因此工作繁重并且容易出現操作錯誤。側流免疫測定法，例如標尺測定法，通常能提供更快速的檢測，但不如傳統的ELISA靈敏或精確。所有這些檢測方法都是使用異相的形式實施的，即它們都需要將抗體或抗原固定在固體表面上。相對而言，不必對抗體/抗原進行固定的均相測定法，可提供許多勝過異相測定的重要優點。首先且最重要的是，均相免疫測定法能以"混合與檢測"的方式直接在溶液中進行檢測，而不需要許多的孵育步驟或另外的信號生成部件，由此在保持測定的靈敏度和特異性的同時大大提高了測定處理量。此外，相對競爭模式而言，均相測定法優選適用于非競爭模式，因為非競爭模式敏感性通常要高幾個數量級[Ohiro等人，2002,在此以引用的方式將其全部內容并入本文]。擁有可以提供均相溶液態非竟爭免疫測定法的有效且通用的測定平臺，在檢測大批量樣品時是特別重要的，因為這種模式更適合于采用現在高處理量檢測應用中常用的機器人操作液體處理系統的自動化操作。然而，一個關鍵的技術挑戰是研發一種簡單、有效的指示機理來對抗原-抗體在溶液中的相互作用進行標記。
發明內容在一些實施方案中，本發明提供了一種測知分析物的方法，包括以下步驟提供一種生物樣本；用至少一種用于檢測分析物的協同指示試劑接觸所述樣品，其中所述指示試劑可包括親合組分、連接組分和協同指示組分；確定系統中是否存在指示樣品中存在分析物的信號；根據所述信號存在與否測知分析物，其中在不存在分析物的背景上檢測不到所述信號。在一些實施方案中，待檢測的分析物可以是例如選自由蛋白質、肽、抗原、抗體、外源凝集素、結合外源凝集素的碳水化合物、疾病標示物、細胞因子、細胞因子受體、激素、激素受體、細胞粘著分子、細胞粘著分子配體、核酸、糖鏈、脂類、細胞、病毒、胞內細胞器、小分子、低分子量化合物等組成的組中的一種物質，或者其一部分選自上組的物質。同樣，在一些實施方案中，所述連接組分可以是蛋白L連接子，其中所述蛋白L連接子可以包括蛋白L或其片段或其衍生物。所述蛋白L連接子可以包括允許或者提高衍生物與親和組分的化學結合的修飾。此外，所述蛋白L連接子還可以包括允許或者提高衍生物與指示組分的化學結合的修飾。所述蛋白L連接子可以包含具有SEQIDNo:7、8、9或10的全部或部分序列的多肽(分別對應SEQIDNo:2、3、4或5的核酸序列)。在一些實施方案中，親合組分可包括抗體或其片段或其衍生物。所述指示組分可以包括例如熒光材料、酶、酶片段、酶亞基、受體、配體、熒光蛋白、發光蛋白、非蛋白熒光體、非蛋白質化學發光化合物、熒光標記蛋白、熒光納米晶體、熒光螯合物、光敏染料和熒光淬滅劑等等。蛋白L連接子與指示組分的連接可以包含一個化學連接。蛋白L連接子可以被連接到指示組分，形成一個融和蛋白。蛋白L連接子與指示組分的連接可以包含一個非共價的相互作用。此外，蛋白L連接子與指示組分的連接還可以包括生物素-鏈霉親和素綴合。蛋白L連接子與親和組分的連接可以包括自組裝。所述自組裝可以通過氫鍵結合、鹽橋接或者它們的組合來實現。蛋白L連接子與親和組分的連接可以包括光致交聯。在各種實施方案中，所述分析物的檢測可以在均相系統中進行。同樣地，在各種實施方案中，信號可以是光信號，例如由FRET、LRET、BRET、酶片段互補、TR-FRET、發光氧通道等產生的光信號。在一些實施方案中，信號的檢測不需要使用儀器。在一些實施方案中，接觸步驟可包括用至少兩種協同指示試劑接觸樣本，其中所述協同指示試劑共同組成一個多元素協同指示系統，系統中信號的產生可以包含，在沒有至少2種試劑的連接組分之間的結合的情況下，兩種協同指示試劑之間的相互作用。在一些實施方案中，至少兩個協同指示試劑中的每一個都可以包括一個特有的親合組分，使得特有親合組分各自對同一分析物的不同部分有親合力。本發明另外的實施方案提供了一種用于檢測分析物的協同指示系統，其包括至少一個協同分子試劑，所述試劑包括親合組分、連接組分和協同指示組分，其中所述指示組分與第二指示組分協同產生信號，且其中在不存在分析物的背景上檢測不到所述信號。在一些實施方案中，所述第二指示組分與第二協同分子指示試劑相結合，而在其它的實施方案中，所述第二指示組分不與第二協同分子指示試劑相結合。在一些實施方案中，所述系統可以包括至少兩種協同分子試劑，其中第一分子試劑的連接組分相對于系統中第二分子試劑的連接組分的背景沒有任何親合力。在一些實施方案中，至少兩種分子試劑與分析物之間的結合或相互作用，會使得所述指示組分非常接近。在一些實施方案中，所述連接組分可以包括蛋白L連接子，其中所述蛋白L連接子可以包括蛋白L或其片段或其衍生物。同樣地，所述蛋白L連接子可以包括允許或者提高衍生物與親和組分的化學結合的修飾。所述蛋白L連接子可以包括允許或者提高衍生物與指示組分的化學結合的修飾。所述蛋白L連接子可以包含具有SEQIDNo:7、8、9或10的全部或部分序列的多肽(分別對應SEQIDNo:2、3、4或5的核酸序列)。親合組分可包括抗體或其片段或其衍生物。所述指示組分可以包括例如熒光材料、酶、酶片段、酶亞基、受體、配體、熒光蛋白、發光蛋白、非蛋白熒光體、非蛋白質化學發光化合物、熒光標記蛋白、熒光納米晶體、熒光螯合物、光敏染料和熒光淬滅劑等等。蛋白L連接子與指示組分的連接可以包括例如可形成融和蛋白的化學連接，可以包含一個非共價的相互作用，生物素-鏈霉親和素綴合等等。蛋白L連接子與親和組分的連接可以包括例如自組裝和光致交聯等等。在本發明的其它實施方案中，提供了用于檢測分析物的生物傳感器，其包括親合基團；協同指示物;和包括蛋白L連接子的連接組分，其中所述蛋白L連接子可以包括蛋白L或其片段或其衍生物。在一些實施方案中，所述生物傳感器可以進一步包括一個或多個附加的協同指示物。親合基團可以包括，例如抗體或其片段或其衍生物。協同指示物可以包括例如，熒光材料、酶、酶片段、酶亞基、受體、配體、熒光蛋白、發光蛋白、非蛋白熒光基團、非蛋白化學發光化合物、熒光標記蛋白、熒光納米晶體、熒光螯合物、光敏染料和熒光淬滅劑等等。蛋白L連接子可以包括允許或者提高衍生物與指示組分的化合結合的修飾。權利要求39的生物傳感器，其中蛋白L連接子可以包括允許或者提高衍生物與指示組分的化合結合的修飾。所述蛋白L連接子可以包含具有SEQIDNo:7、8、9或IO的全部或部分序列的多肽(分別對應SEQIDNo:2、3、4或5的核酸序列)。蛋白L連接子與指示組分的連接可以包括例如，可形成融合蛋白的化學連接，可以包括非共價相互作用、生物素-鏈霉親和素綴合等等。蛋白L連接子與親和組分的連接可以包括例如自組裝和光致交聯等等。圖1示意性描述了制造包含自組裝的非共價連接的指示物-蛋白L-抗體片段復合體的分子生物傳感器的過程。圖2示意性描述了制造包含共價連接的指示物-蛋白L-抗體片段復合體的分子生物傳感器的過程。圖3表示利用基于包含指示物-蛋白L-抗體片段復合體的分子生物傳感器的協同指示系統的均相非竟爭免疫測定。圖4表示利用基于包含與完整抗體分子結合的指示物-蛋白L的分子生物傳感器的協同指示系統的均相非競爭測定。圖5表示利用基于多個分子生物傳感器的協同指示系統的均相非競爭測定，每個生物傳感器包含一個指示物-蛋白L-抗體片段復合體，所述指示組分參與FRET的轉運。圖6表示協同指示系統，其中，分子生物傳感器的指示組分是酶片段，它們互相作用并且重建酶活性，以便在有目標分析物的情況下產生可檢測信號，由可檢測產物的形成來例示。圖7描述了包含兩個協同指示組分的分子生物傳感器，其中，分析物的結合產生可檢測信號，由分子內的FRET信號相互作用的改變來證明。圖8表示具有結合到第一指示組分的PpL分子、以及結合到第二指示組分的蛋白G分子的分子生物傳感器。當分析物結合生物傳感器時，指示組分的相互作用導致可檢測信號的產生或者信號的可檢測變化。圖9表示具有結合到第一指示組分的PpL分子、以及結合到第二指示組分(一個量子點)的蛋白G分子的分子生物傳感器。當分析物結合生物傳感器時，第一指示物同量子點的的相互作用，導致可檢測信號的產生或者信號的可檢測變化。圖10描述與熒光染色的目標細胞相互作用來產生可檢測信號的分子生物傳感器。沒有染色或者不與生物傳感器相互作用的細胞不產生任何可檢測信號。圖11顯示與熒光染色的蛋白相互作用來產生可檢測信號的分子生物傳感器。圖12表示具有兩個在不存在分析物的情況下會淬滅彼此的信號活性的協同指示組分的分子生物傳感器。分析物與指示組分之一相互作用的存在，會從生物傳感器中除去該組分，使得檢測信號得以恢復。圖13顯示了包括本發明的協同指示系統的非竟爭免疫測定的結果。目標分析物(GMCSF)的存在可以產生檢測信號，由相對的熒光發射的改變示例。圖14表示在蛋白LB1結構域內的結合部位。具體實施方式本發明的實施方案提供了用于迅速、靈敏的單步均相非竟爭免疫測定的新合成蛋白質，其能夠方便地將指示物分子位點特異性地共價或者非共價地偶聯到標準抗體上。這種測定模式可以在溶液中直接檢測，而不需要傳統免疫測定中必要的多個孵育步驟或者另外的信號生成部件，這樣在保持測定靈敏度和特異性的同時大大提高了測定處理量。相應地，本發明的實施方案提供了用于比傳統酶聯免疫吸附測定更快且更簡單的測定模式的轉換成品抗體的技術。與對抗體自身進行操作不同，本發明的實施方案提供了一種新方法，來將設計的指示物(生物分子接頭)偶聯到抗體的特定位點，將抗體分子轉化成適用于均相非競爭形式和競爭形式的免疫測定的無試劑型自動指示分子生物傳感器。一個有利的方面包含，通過生物分子接頭將信號發生基團偶聯到抗體上，以便在所述抗體與它們的抗原通過熒光共振能量轉移(FRET)[Sdvinl995，在此以引用的方式將其全部內容并入本文]或者酶片段互補[Wehrman等，2002，Gakmeau等，在此以引用的方式將以上每個的全部內容并入本文]結合后能產生可檢測的信號。本測定以"混合與檢測"的方式來進行，不需要多個洗滌步驟。這使得特別適應高處理量操作的簡單均相測定方法得到了發展。本發明克服的關鍵技術挑戰，是研發一種簡單、有效的指示機制，來反映溶液中抗原-抗體的相互作用。這可以通過將抗體分子轉換成自動報告分子生物傳感器的新方法來實現，其中借助于從大消化鏈球菌左旋蛋白質(PpL)免疫球蛋白(Ig)-結合域衍生的生物分子接頭。這種接頭能夠方便地將載運分子(例如指示物基團或者治療劑)位點特異性地共價偶聯到抗體或者抗體片段上。該生物分子接頭可應用于均相免疫測定的多種方法中。PpLIg-結合域(例如Bl區域)易于進行基因和化學修飾，以便與熒光指示物結合，并且可以自組裝，和被免疫球蛋白(Ig)k輕鏈可變區共價或者非共價地俘獲。然后，這些功能化的PpL-Ig蛋白復合體應用到基于均相非競爭免疫測定的FRET(熒光共振能量轉移)中。例如，當一個標有PpL-FRET供體、另一個具有PpL-FRET受體的兩個抗體分子都結合目標分子時，FRET供體和受體彼此緊密地接近，引發FRET。本發明的實施方案使用基于大消化鏈球菌蛋白L(PpL)域的生物分子接頭。大消化鏈球菌PpL包含5個同源Ig-結合域(Bl-B5)(Kastem等，1992,在此以引用的方式將其全部內容并入本文)。這些域尺寸小(72-76個氨基酸殘基)，并且對免疫球蛋白k輕鏈可變區(Vk)的親合力強(nM范圍)[DeChateau等，1993,在此以引用的方式將其全部內容并入本文]。有趣且重要地，PpL與Vk的結合不會削弱抗體的偶聯親合力[DeChateau等，1993]。野生型PpLBl域可與人、狒狒、豚鼠、小鼠、大鼠和豬IgG(KD在nM范圍)以髙親合力結合，與兔、馬和山羊IgG(Ko在亞nM范圍)的結合親合力較低[DeChateau等，1993]。參考附圖，可以通過將基于PpL的與指示組分14相連接的連接組分12以非共價或者共價方式偶聯到親合組分16上，以構建分子生物傳感器10。指示組分14可以通過例如基因融合或者化學綴合，系鏈到連接組分12上。在本發明的一些實施方案中，指示物綴合的PpL-Bl域，通過基于PpL和抗體之間的特異性氫鍵和鹽鍵的自組裝步驟，非共價地與抗體或者抗體片段偶聯在一起。該步驟如圖l所示。本發明的其它的實施方案中，采用兩步法，將指示物綴合的PpLBl域共價地連接到抗體或者抗體片段(例如Fab或者Fv)鄰近抗原結合位點的部位。在第一步中，與指示物綴合的突變PpL-Bl突變域通過PpL在特定位點與Ig結合的特性與抗體形成復合體。為此，兩個重要的突變被引入PpL-Bl域。首先，對PpLBl域的兩個免疫球蛋白結合部位(已經被報告表現出相似的Ig-結合親合力[Svensson等，2004，在此以引用的方式將其全部內容并入本文])之一突變，來實現位點特異性的生物素化。生物素化的PpL和指示物標記的鏈霉親和素然后自組裝成一個緊密結合的蛋白復合體。這步驟有兩個重要的功能(1)去掉PpL的兩個Ig-結合部位之一，(2)將一個指示物基團連接到PpLBl域。在第二步中，引入另一個突變，用PeterSchultz，sgroup開發的技術將非天然的光致交聯氨基酸殘基(對苯甲酰-L-苯丙氨酸；Bpa)引入PpL-Bl域鄰近其Ig-結合位點的部位。該技術使用工程正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA對，與琥珀密碼子TAG相對應，在體內將Bpa結合到埃希氏菌屬大腸桿菌蛋白質內[Chin等,2002(a)，Chin等，2002(b)，Farrell等，2005,這里全部引用以上每個文獻]。與指示物偶聯的突變PpL-Bl突變域同Ig自組裝之后，該蛋白質復合體暴露于長波長的紫外光(360納米)，使復合體通過光致交聯形成共價連接結構。該兩步處理法如圖2所示。在本發明中，運載分子可以通過例如蛋白A或者蛋白G等抗體-結合蛋白同抗體結合。然而，與其它例如蛋白A或者蛋白G等抗體結合蛋白相比，更優選為蛋白LB1域，有如下兩個理由l)PpL在抗原連接部位附近與抗體結合(不影響抗原結合)，當標記的抗體與目標物結合時，這可以縮短FRET對間的距離，并且增強FRET信號；2)PpL可與整體IgG、Fab和Fv段、或者庫篩選的重組單鏈Fv結合，拓寬了高特異性和靈敏度的檢測器可使用的選擇范圍。如圖3所示，指示物-PpL分子接頭與Fab段在形成非競爭均相免疫測定中結合在一起。如圖4所示，也可以在形成均相免疫測定中，將指示物-PpL分子接頭應用到整個Ig分子。為了預防Ig介導的蛋白寡聚化與交聯，可以相對于目標物應用較高濃度的PpL-Ig復合體。一種稱作時間分辨FRET(或者TR-FRET)的獨特FRET技術，利用發光銪螯合物作為供體，別藻藍素或者有機染料Cy5作為受體，這樣可以在檢測靈敏度上提供超過利用傳統的供體/受體對的穩態FRET測量50多倍的改進[Selvin1995，在此以引用的方式將其全部內容并入本文]。非竟爭均相免疫測定法的例子很少，但是競爭型均相免疫測定法方面的報道很多。Bedouelle和其合作者[Renard等，2002,Renard等,2004,在此以引用的方式將以上每個的全部內容并入本文]報道了一種將抗體的可變區(Fv)轉換制成無試劑型熒光生物傳感器的方法，其中將抗原結合位點附近的一個氨基酸殘基突變成半胱氨酸，然后將環境敏感的熒光基團綴合到這個半胱氨酸殘基上。據報道，抗原的結合使得綴合物的熒光強度產生可測量的指示性變化。Ueda等[Ueda等，1999，Ohiro等，2002，Ueda等，2003，Komiya等，2004,Ueda等，2004，在此以引用的方式將以上每個的全部內容并入本文]報道了一種新均相夾層免疫測定法，其中，兩個scFvs或者一對可變的重鏈(VH)和輕鏈(VL)片段(每個都標記有熒光蛋白、化學熒光基團或者酶片段)在溶液中有靶物存在的情況下集結到一起，產生作為FRET或者酶片段互補的結果信號。在FRET中，通過非放射性的偶極-偶極相互作用，將能量從熒光供體分子轉移到受體分子。在能量轉移后，當受體熒光性增加或者致敏時，供體壽命和量子產量減少。這種能量轉移取決于供體和受體之間的距離和方向。VH/VL片段互補存在一個明顯限制，就是在沒有抗原的情況下，VH/NL間的相互作用需要足夠弱。而且，由于VH/NL片段互補，結合親合力大打折扣[Ueda等，1999，Ueda等，2003]。由于控制抗體來引入指示物基團需要對編碼這些抗體/片段的基因進行修飾，因此Bedouelle等和Ueda等提出的方法都局限于重組抗體片段。因此，這些方法不能使用非重組抗體，而非重組抗體構成了免疫測定中使用的抗體的主要部分。本發明實施方案提供了檢測樣品中一種分析物或者多種分析物22的方法和組合物。新方法通過接頭分子將至少一種指示物分子(R)連接到親合基團(A)的特異性位點，這樣就將親合基團轉換成適于測定的自動指示的、無試劑的、分子生物傳感器。在一個優選實施方案中，生物傳感器用于均相測定。在另一個實施方案中，生物傳感器用于異質測定。例如，測定在異質環境中進行，一個或多個分子生物傳感器可以固定在固體表面，通過將分子生物傳感器與樣品混合進行分析物檢測，無論在信號分析之前有或沒有隨后的洗滌步驟。本發明的實施方案中，信號分析包括信號檢測。可檢測的信號包括，例如，在背景上信號的產生、信號發射的改變、信號量級的改變、信號頻率的改變、信號波長的改變、信號淬滅和信號干擾等等。可檢測的信號也包括，例如，生物發光、化學發光、熒光等。本發明的實施方案可以利用的信號例如可以來自酶促反應產物中可檢測出的特性的產生或變化；位相的變化、固相的沉淀、樣品顏色或者光學性質的變化等等。被分析的樣品可以是從任何生物來源獲得的樣品，例如，乳汁、唾液、血液、血漿、淋巴、腦脊髓液、chime、膽汁、尿、糞便、粘液、月經、汗、淚、精液、卵、任何組織、骨頭、活組織檢查、腫塊、囊腫、食物樣品、飲料、藥品、溶菌產物/從任意生物/載培樣品當中提取或者消耗的媒介等等。被檢測的分析物22可以是選自由蛋白質、肽、抗原、抗體、外源凝集素、結合外源凝集素的碳水化合物、疾病標示物、細胞因子、細胞因子受體、激素、激素受體、細胞粘著分子、細胞粘著分子配體、核酸、糖鏈、脂類、細胞、病毒、胞內細胞器、小分子、低分子量化合物等組成的組中的一種物質，或者其一部分選自上組的物質。在一些實施方案中，包含分析物的樣品在混合并用分子生物傳感器檢測前，需要進行預處理以除去會對測定產生干擾的污染物。例如，處理選擇方案包括離心、過濾、凝膠電泳、柱層析、DNA沉淀、粗蛋白沉淀等等。在其它的實施方案中，包含分析物的樣品在混合并利用分子生物傳感器檢測之前不進行預處理。在一些實施方案中，生物傳感器和/或系統可以直接用于疾病標簽的檢測，例如腫瘤標簽。腫瘤標簽可以是與腫瘤疾病或其它腫瘤類型相關的特有差異性表達抗原。同樣地，疾病標簽可以是與任何疾病相關的可檢測分析物。相應地，疾病標簽可以是例如:蛋白質、抗體、受體或者受體配基、細胞外基質分子、片段或組分、聚糖或者其它的碳水化合物以及細胞壁片段等，這些分析物與疾病的存在相關，例如，由腫瘤生長、病毒感染、細菌或者真菌感染、寄生蟲所引起疾病、自身免疫疾病和朊病毒病等。親合基團16可以是例如抗體、雙特異抗體(diabody)、微抗體(minibody)(Presta2003，在此以引用的方式將其全部內容并入本文)、抗體衍生的單鏈Fv、螺旋穩定化的Fv、Fv、Fv的一部分、F(ab，)2、Fab、以及它們的突變體等，它們分別識別分析物中的不同位點。指示組分14可以是熒光材料、酶、酶片段、酶亞基、受體、配體、熒光蛋白、發光蛋白、非蛋白熒光體、非蛋白質化學發光化合物、熒光標記蛋白、熒光納米晶體、熒光螯合物、光敏染料和熒光性泮滅劑等中的任何材料。在一個實施方案中，指示組分包含參與在分析物被檢測到時產生信號的熒光共振能量轉移(FRET)相互作用的熒光物質。FRET相互作用表明其可以作為可檢測信號，例如包括，在背景上信號的產生，信號發射的改變，信號量級的改變，信號頻率的改變，信號波長的改變，信號的淬滅等。這些可檢測信號可以通過FRET對產生，例如異硫氰酸熒光素(FITC)和四甲基羅丹明異硫氰酸鹽(TRITC);Alexa488和Cy3;Cy3和Cy5;藍色熒光蛋白(BFP)和綠色熒光蛋白(GFP);BFP和黃色熒光蛋白(YFP);青色熒光蛋白(CFP)和YFP;以及CFP和紅色熒光蛋白(dsred)[美國專利申請號11/083,461，公開號US2006/0068502Al,在此以引用的方式將其全部內容并入本文]。其它的有益實施方案包括FRET協同組分的利用，例如，"LANCE"銪螯合物和別藻藍素(APC)或Cy5熒光基團，其用于時間分辨(TR)-FRET,并且通常提供較高的測定靈敏度[Zhang等，2005，在此以引用的方式將其全部內容并入本文]。指示組分包括"傳遞(relay)"FRET組分，例如熒光-放射量子點(QDs)、熒光基團、熒光蛋白等[Medintz等，2003,Clamme和Deniz，2005,在此以引用的方式將以上每個的全部內容并入本文],也是本發明的有益實施方案。包括傳遞FRET的實施方案如圖5所示。為了產生如圖6所示的信號，本發明的實施方案可以使用蛋白質或者酶片段互補作為FRET的替代。一個酶片段通過PpL域限定到專用于被檢測分析物的單克隆抗體上，另一個酶片段限定到識別同一分析物的不同抗原決定簇的第二單克隆抗體上。兩個抗體與目標分析物結合起來后，酶片段在不同底物的催化轉化下，重組以產生可檢測信號。這種酶活性可以催化能產生生物發光的、化學發光的和熒光等可檢測信號的反應。這種信號也能由于酶促反應產物的可檢測特性的形成或變化而產生。酶互補系統的實施方案包括P-半乳糖苷酶、|3-內酰胺酶、熒光素酶、泛素、和鼠科動物二氫葉酸還原酶(mDHFR)(Deo2004，在此以引用的方式將其全部內容并入本文)。在一個實施方案中，酶片段或者亞基通過長度適當的柔韌性或者剛性連接元件系鏈到生物傳感器上。所述連接元件可以由肽、核酸、糖鏈、蛋白、及其復合體等組成。在另一個實施方案中，酶片段或者亞基通過化學鍵直接系鏈到生物傳感器上。本發明的實施方案也利用指示組分中的熒光蛋白片段的互補，其中，當熒光蛋白片段緊密地接近彼此時，熒光信號將在它們重新組合后出現。熒光蛋白片段互補的實施方案包括分裂綠色熒光蛋白和黃色熒光蛋白。在第三實施方案中，指示組分包含受體或配體，其在分析物存在時參與受體-配體相互作用。分析物的檢測可以通過產生可檢測信號的分析物與指示物的相互作用來完成。檢測信號可以以位相變化、固相沉淀、樣品顏色或者光學性質改變的方式顯示自身。在本發明一個優選實施方案中，接頭分子包括基于蛋白L的連接子，后者包括蛋白L或其片段或其衍生物。蛋白L可以被修改，以導入允許連接到指示組分的元素。在一個實施方案中，A20C突變在兩個抗體結合部位之一處被引入到蛋白LBl區域，半胱氨酸殘基就被引入到了氨基酸序列(SEQIDNO:6)。在其它實施方案中，T30C突變被引入到蛋白LBl結構域(SEQIDNo:7)。突變可以降低抗體與恃異性位點的結合，同時允許對該位點通過修飾來使蛋白L可以與至少一個指示組分進行自組裝。在一個優選方案中，自組裝包括生物素-鏈霉親和素綴合，其中，鏈霉親和素分子，例如可以容易地用多個化學熒光基團標記成有效的指示物。在其它實施方案中，自組裝可以包括定位的化學偶聯(例如通過硫醇反應綴合)、蛋白質相互作用、弱的化學相互作用等等。指示組分也可以通過另外的連接元件連接到蛋白L上。例如，熒光蛋白或者酶片段可以通過基因融合以共價形式連接到PpL上(圖1)。PpL分子也可以直接地通過化學熒光基團被標記出來(圖1)。包含適當的反應氨基酸殘基(例如賴氨酸或者半胱氨酸)的肽標簽可以通過基因融合與PpL融合，來提高PpL指示物標記的程度(圖1)。此外，可以將具有鉸鏈-彎曲性能的肽連接臂24(例如，許多蛋白質(包括抗體)包含絞鏈區)融合到PpL的N端或者C端，并且在連接臂末端引入FRET供體或者受體。與抗原目標結合，抗原可以使連接臂上的FRET標記接近或者遠離與PpL另一個端點連接或者與結合部位之一結合的相對應FRET標記，并且使FRET發生改變(圖7)。在一個實施方案中，附加的連接元件是融合到蛋白LC端的肽。在另一個實施方案，這種連接元件是融合到蛋白LN端的肽。在其它的實施方案中，這種連接元件可以由一端連接于蛋白L、另一端連接于指示物分子的物質組成，例如核酸、糖鏈、蛋白及其復合體等。蛋白L也可以被修飾，以導入允許連接親合基團的元件。例如，非天然氨基酸殘基可以被引入到鄰近其抗體(Ig)結合部位的蛋白LB1域。在一個優選實施方案中，該非天然氨基酸殘基是對苯甲酰基-L-苯基丙氨酸(Bpa)。在大腸桿菌(E.coli)蛋白質表達宿主內，Bpa被用工程正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA對引入蛋白L。在一個實施方案中，蛋白LB1域的T39位點被作為突變點。在另一個實施方案中，蛋白LBl域的k41位點被作為突變點。這種突變的蛋白L可以同親合基團發生自組裝。在一個優選方案中，這種蛋白L-親合基團復合體可以通過在長波紫外線(大約360nm)下曝光的方法形成共價連接，以形成光致交聯復合體(見圖2)。蛋白L可以修飾，以允許與親合基團和至少一個指示組分連接。分子生物傳感器具有至少一個系鏈到其上的協同指示組分。在一個實施方案中，分子生物傳感器只有一個同其連接的協同指示組分。在有分析物存在的情況下，通過結合分析物，生物傳感器緊密的靠攏，這樣，第一生物傳感器的第一指示物與至少一個第二生物傳感器的第二指示物的相互作用就產生了可檢測信號。(見圖3和圖4)。在一個實施方案中，第一生物傳感器的第一指示物與第二生物傳感器的第二指示物相互作用產生可檢測信號。在另一個實施方案中，第一生物傳感器的第一指示物分別與第二生物傳感器的第二指示物和第三生物傳感器的第三指示物相互作用，產生可檢測信號。在三個指示物之間的相互作用是同時發生的。可選地，也可以包括一個"傳遞(relay)"相互作用，第一指示物與第二指示物相互作用，隨后再與第三指示物相互作用，產生可檢測信號，如圖5所示[Medintz等，2003，Watrob等，2003，Galperin等，2004，在此以引用的方式將以上每個的全部內容并入本文]。在另一個實施方案中，第一生物傳感器的第一指示物與三個或以上另外分別連接在不同生物傳感器的指示組分相互作用，產生可檢測信號。在四個或以上組分之間的這種相互作用可以同時發生，或者在指示組分之間"傳遞(relay)"相互作用。在其它實施方案中，分析物可以作為協同指示物同生物傳感器指示組分相互作用，來產生可檢測信號。(見圖10和圖11)。例如，分析物可以包括熒光染料染色的細胞、熒光染料染色的蛋白質、熒光染料染色的生物材料等。本發明的實施方案使用在協同指示物系統20中包含至少兩個協同指示組分的分子生物傳感器，在存在分析物的情況下，其彼此相互作用產生可檢測信號。在一個實施方案中，生物傳感器包含兩個可以彼此淬滅的指示組分，這樣，在沒有分析物存在時，不會有信號被檢測到。在存在分析物的情況下，分析物與生物傳感器相互作用，這樣，指示組分分離，信號發射恢復，就產生了可檢測信號。熒光材料，例如EDANS(5-(2'氨基乙基)氨基萘-l-磺酸)、熒光素和若丹明都可以通過DABCYL(4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸)淬滅[Vet等，1999,在此以引用的方式將其全部內容并入本文]。對非常接近熒光物質的淬滅劑的清除，可以恢復可檢測信號的放射(圖12)。附加的FRET淬滅物質，例如那些在美國專利11/083,461(公開號U.S.2006/0068502B1)中提到的，也適合本發明的實施方案。在另一個實施方案中，在沒有分析物的情況下，兩個指示組分產生基底信號。當分析物存在時，它與生物傳感器相互作用，這樣，兩個指示物之間的相互作用由于抗體分子在絞鏈區的構造變化而發生改變，結果產生了表現為相對于基底放射的信號改變的可檢測信號。[Lichlyter，2003，在此以引用的方式將其全部內容并入本文]。(見圖8和圖9)。在第三實施方案中，在沒有分析物的情況下，兩個指示組分互相不發生作用。當分析物被引入到樣品時，其與生物傳感器相互作用，兩個指示組分可以很接近的靠攏,在基底信號之上產生一個可檢測信號。例如，檢測信號可以通過FRET對產生，例如在美國專利11/083,461(公開號U.S.2006/0068502B1)中描述的。本發明的實施方案可以使用包含三個或以上的協同指示組分的分子生物傳感器，在有分析物存在的情況下，彼此相互作用產生檢測信號。指示組分可以同時互相作用，或者以"傳遞(relay)，，的方式互相作用，其中，第一指示物與第二指示物相互作用，隨后與第三指示物相互作用，直到最后一次相互作用發生。在有分析物存在的情況下，生物傳感器可以結合分析物，這樣，檢測信號從分子內的指示組分的相互作用中產生。檢測信號可以包括信號淬滅、信號干擾、信號產生和信號改變等等。在一些實施方案中，親合基團通過蛋白L與至少一個指示組分連接，此外，親合基團可以通過其它抗體結合蛋白(例如蛋白質A、G、H、和M)連接到至少一個另外的指示組分上(見圖8和圖9)。在與目標分析物結合后，指示組分可以彼此相互作用產生檢測信號。這是基于這樣的事實在與抗原結合后，抗體在鉸鏈區經歷構象變化，產生檢測信號[Lichlyter等，在此以引用的方式將其全部內容并入本文]。檢測信號可以作為FRET相互作用來顯示本身，其中，包括在背景以上信號的產生、信號發射的改變、信號量級的改變、信號頻率的改變、信號波長的改變、信號的淬滅和信號干擾等等；作為產生生物發光的、化學發光的、熒光的可檢測信號的酶促反應，結果使樣品的光譜特性發生改變等等。或者作為位相的改變、固相沉淀、樣品顏色或者光學性質的改變等等。(圖8和圖9)。如圖9所示，當PpL接頭與形成具有量子點的FRET對的指示物基團偶聯在一起時，抗體分子可以被作為FRET供體或者受體的、固定在量子點[Medintz等，2003，在此以引用的方式將其全部內容并入本文]的、結合Fc的鏈球菌蛋白G-Bl域的捕獲。在結合目標物后，這種自組裝、自發信號的抗體可以由于抗體在鉸鏈區的構象變化而顯示改變的FRET活性。在一些實施方案中，利用分析物的存在來進行的信號檢測，需要使用儀表，例如熒光計、光度計、陣列二級管光度計、平板讀取器等。在另外的實施方案中，信號檢測不需要使用儀表，并且肉眼可見。現有技術以及本發明用到的通常與生物傳感器、免疫測定技術有關的方法和材料，都在美國專利5,891,199、美國專利6，162，903、美國專利6,884,629B2和美國專利申請10/475,540(公開號US2004/0110245A1)中有描述，在此以引用的方式將以上每個的全部內容并入本文。表1:提供了與本發明的PpLBl連接組分有關的核苷酸和氨基酸序列列表<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例實施例l:為在特定位點與指示組分連接而對消化鏈球菌屬蛋白L(PpL)的修飾大消化鏈球菌PpLBl域具有兩個IgK輕鏈的結合位點，它們與(3折疊的兩端相對應[Svenssonetal.2004,此處以引證的方式將其全部內容并入本文中](圖14)。為了形成所需的l:l比例的PpL/Ig-K復合體(如圖2中所示)，定點突變和生物素/鏈霉親和素(SA)介導的蛋白質組裝的組合，被用于封閉與Ig《結合的位點l。A20C變異可通過例如美國專利號6，713,285(此處以引證的方式將其全部內容并入本文中)中所描述的定點誘變方法，使用突變引物(正向引物5'-ATCCACACAAACTTGCGAATTCAAAGGAACATTTG畫3，；反向引物5'-TTCCTTTGAATTCGCAAGTTTGTGTGGATCCATTTGC漏3，)引入到含有Y47W變異(SEQ.IDNO:1和6，由Drs.UlfSjobring和DavidBaker提供)的PpLBl域中。所述引物在位點1的中心引入單個的半胱氨酸[Svenssonetal.2004]。A20C變異(SEQ.IDNO:2和7)使得位點1中心的PpL位點被特異性標記有硫醇活性的生物素分子(例如馬來酰亞胺PE(n-生物素(Pierce，Rockford,IL),—種水溶性硫氫活性生物素酰化試劑)，然后與標記有鏈霉親和素分子的指示物連接。可選擇地，A20C變異可以用硫醇活性熒光染料(例如馬來酰亞胺熒光基團衍生物)進行標記。編碼PpLBl域的A20C變異的基因可以用pET21載體表達為組氨酸標簽蛋白，用金屬鰲和親和色譜柱進行純化。除了A20C變異以外，使用突變引物(正向引物5'-ATTTGAAAAAGCATGCAGTGAAGCTTATGCAGATGCAGATAC-3';反向引物5'-ATAAGCTTCACTGCATGCTTTTTCAAATGTTCC國3')的T30C變異(SEQ.IDNO:3和8)提供一種破壞與PpL結合的位點2的可選方案[Svenssonetal.2004]。實施例2:為與親合基團的共價連接而對消化鏈球菌屬蛋白L(PpL)的修為了能使PpLB1域共價結合到IgK的輕鏈可變區，在PpLBl域與Ig結合位點的附近，一個非天然光致交聯氨基酸殘基(對苯甲酰基-L-苯基丙氨酸或Bpa)被引入到帶有His標簽的PpLBl域突變體(例l)，使用工程正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA對，與琥祐密碼子TAG相對應，在體內將Bpa合成到埃希氏菌屬大腸桿菌蛋白質內[Chinetal.2002(a),Chinetal.2002(b),Farrelletal.2005，在此以引用的方式將前述每一個的全部內容并入本文]。在PpLBl域結構內接近其兩結合位點處，T39(圖14A中標記為粉色)和K41(在圖14B中標記為青色)就是分別將結合位點l和2突變到Bpa的位點所在。為了引入Bpa，使用了兩種質粒(1)基于pl5A的質粒(pDULE)，表達正交tRNA和合成酶對(從PeterSchultz醫生獲得)，和(2)含琥珀變異的PpLBl域的質粒(SEQIDNO:4，5,9,和10)。大腸桿菌用這兩種質粒進行轉化并在Bpa存在的培養基中培養。在與抗體一起孵育以將它們連接在一起之前，結合Bpa的PpLBl用標準蛋白純化工藝(實施例l)進行純化。實施例3:連接指示組分到修飾的PpLBl分子上帶有生物素化組氨酸標簽的PpLBl突變體(實施例l、實施例2)固定在Ni-NTA柱中，熒光基團標記的鏈霉親和素(SA)被泵入流過所述柱中，以形成與PpL突變體的l:l的復合體。在柱上形成的蛋白復合體然后用咪唑清洗、透析以除去可濾掉的鎳離子和過剩的咪唑，并經凝膠過濾層析以進一步提純和分析，來檢查它們的分子大小分布。這種方法中，PpLBl域分子的分離管可以進行單獨地標記，以制造出各種供本發明測定所用的銜接子。實施例4:共價連接抗體到修飾的PpLBl分子上結合Bpa的PpLBl(實施例2)與抗GMCSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)的整個單克隆抗體和/或Fab抗體在室溫下孵育l小時，以獲得抗體與修飾的PpLBl分子的自組裝。可以使用的一個非必需步驟是將PpL/Ab復合體暴露在360nm的紫外線中進行交聯。不與抗體結合的PpLBl分子可通過使用離心或標準膜超濾或者凝膠過濾工藝從標記的抗體中分離出來。在使用指示物-PpL-Ab復合體進行GMCSF(目標分析物)的免疫分析前，可使用標準ELISA法對蛋白質復合體與GMCSF的結合性能進行測定，并與未標記的抗GMCSF抗體的性能進行比較。指示物-PpL-Ab復合體的形成可進一步通過調整以下參數進行優化，例如蛋白質濃度、緩沖液離子強度、pH、結合溫度。實施例5:PpL-指示物融合蛋白的合成熒光蛋白質(例如綠色熒光蛋白質和其變體)可通過有或沒有肽連接子參與的串聯基因融合連接到PplBl域的N端或C端(圖l)。適合的肽，例如E/K巻曲螺旋(coiledcoil)(Lindhoutetal.2004,在此以引用的方式將其全部內容并入本文)或四半胱氨酸標簽(Adamsetal.2002，在此以引用的方式將其全部內容并入本文)也被融合到PpL中，以便于位點特異性的指示物標記。標準的基于PCR的分子克隆方法可用于制備這種重組分子。實施例6:適過鉸鏈彎曲連接子結合到第二指示物的PpL的合成標準的基于PCR的分子克隆方法可用于將具有鉸鏈彎曲性質[Lichlyteretal.2003]的肽連接子引入到PpLBl變體的N端或C端(實施例l-4)上。FRET供體或受體經由基因融合或化學綴合方法引入到連接子的端部。一旦結合到抗原目標物上，所述抗原推動連接子上的FRET標記靠近或進一步遠離綴合到突變的Ig結合位點之一(位點1或位點2)上的相對FRET標記，引起FRET信號的改變(圖7)。實施例7:用于檢測人體粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)的分子生物傳感器的制備在大腸桿菌中生產C端融合有6個組氨酸標簽、N端融合有富含賴氨酸K3(KEKIAAL)3螺旋肽標記的蛋白LB1域融合蛋白，并用金屬鰲和親和層析柱(IMAC)來純化。采用標準的標記方法，部分PpLBl融合蛋白用異硫氰酸熒光素(FITC)進行化學標記，而另一部分的PpLBl融合蛋白用四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標記。標記后，未標記的熒光基團使用10kD的截止膜，通過離心超濾從標記的PpLBl融合蛋白質中分離除掉。然后用FITC和TRITC標記的PpLB1融合蛋白分別與鼠抗GMCSF單克隆抗體3209克隆和6804克隆共同孵育(R&DSystems,Minneapolis,MN),每種識別GMCSF抗原的一種決定簇，以形成自組裝的指示物-連接臂-抗體復合體。熒光基團標記PpLBl和抗體之間的摩爾比，優化到大于2:1,以提高每個抗體分子接受兩PpLBl分子的概率。隨后，沒有結合到抗體上的PpLBl分子被用10KD的截止膜通過離心超濾從標記的抗體中分離(注意PpL遠小于抗體分子)。實施例8:以均相非競爭性試驗來檢測人體粒細胞巨噬細胞集落刺激因子眼CSF)在室溫下，用三種含不同的濃度GMCSF的液體樣本與分子生物傳感器復合體共孵育(實施例7)30分鐘。之后，收集液體樣本的熒光光譜，并使用標準FRET分子技術估算FRET度。隨著樣本中GMCSF的濃度的增加，FRET信號增強(如580nm處增強的峰值強度所示)(圖13)。實施例9:制備檢測分析物用的生物樣本生物樣本可從樣品中獲得，并在含Tris鹽的冷緩釋溶液中稀釋，其濃度范圍為50nM-lM,PH值范圍為7.5-8.0。在混合物中可選擇性地加入洗滌劑如Tween80或TritonX-lOO,最終濃度在0.1。/o-4。/。v/v之間。可選擇性地4。C、1000Xg離心5分鐘，以從所述混合物中清除出固體。清除過的上層清液移出并保存，用于免疫測定過程。實施例10:在基于FRET的均相非競爭性免疫試驗中的指示物-PpL-親合基團復合體示例使用一對包含復合到PpL上的抗GMCSF單克隆抗體整體和/或Fab的分子生物傳感器來實施GMCSF的檢測，所述PpL連接在異硫氰酸熒光素(FITC)或者四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)上。在1.5mL微量離心管中，將濃度范圍為0-200nM的GMSCF與含兩個標記熒光基團分子的生物傳感器溶液中混合。將混合物在4"C到室溫的范圍避光培養30分鐘到1小時。在培養期后，將每個樣本注入熒光分光度計的槽中，收集熒光光譜并估算FRET度。可選擇地，使用不同的FRET對在樣本上完成時間分辨(TR)-FRET。例如，銪螯合物和別藻藍素(APC)/Cy5等熒光基團可用于(TR)-FRET中，其通常具有較高的試驗靈敏度(Zhang等.2005,在此以引用的方式將其全部內容并入本文)。實施例ll:在基于裂解酶的均相非競爭性免疫測定中的指示物-PpL-親合某團復合體示例使用一對包含復合到PpL上的抗GMCSF單克隆抗體整體和/或Fab的分子生物傳感器來實施對模擬分析物GMCSF的檢測，所述PpL連接到(3內酰胺酶的Aa片段上或者p內酰胺酶的Aco片段上。酶片段使用標準的PCR分子克隆方法通過與適當的肽連接子基因融合而連接到PpL上，以形成這樣的重組分子。在微量離心管中,將含濃度范圍為0-200nM的GMSCF的液體樣本與含兩個酶片段標記的生物傳感器相混合。CCF2/AM熒光底物也加入到混合物中，其在DMEM中最終濃度為2pM。混合物在室溫下靜置30分鐘到1小時。在培養期后，通過眼睛或熒光計對樣本藍色到綠色熒光發射比例的改變進行檢測以確定GMCSF的存在及濃度。實施例12:用指示物-PpL-親合基團復合體來檢測基于FRET的均相非競爭性免疫試驗中的熒光著色生物材料示例使用FITC標記的分子生物傳感器來對含混合微生物種群的液態樣本中的植物病原菌茄科雷爾氏菌(^a/sto"/c^o/a"acearam的檢測。微生物培養樣本裝有CC1熒光底物，其是細菌中普遍發現的一種酶，卩內酰胺酶的酶底物。CC1產物能在550nm處被激發并在585nm發出紅色熒光信號[Gaoetal2003，在此以引用的方式將其全部內容并入本文中]。此處可使用CC1酶底物來對微生物細胞著色。通過加載CC1的茄科雷爾氏菌".w/朋"c^n/m,和分子生物傳感器之間的結合可確定樣本中病原體的存在。所述分子生物傳感器含有連接到茄科雷爾氏菌(/.M/fl朋cean^^特定抗體上的FITC標記的PpL配合體。分子傳感器與加載有酶底物病原體的結合會發出由FITC指示物和CCI產物之間FRET相互作用所產生的信號。實施例13:用于檢測基于FRET干擾的均相非競爭性免疫試驗中的分析物的可自組裝的多組分指示物-PpL-親合基團復合體示例源自三個不同抗鏈霉親和素單克隆抗體克隆的Fab片段，分別識別抗原上的不同的抗原決定簇。Fab片段可用于形成三個基于PpL的分子生物傳感器。基于PpL的生物傳感器中的指示組分可進行選擇，以能夠接替FRET，例如Alexa488/TMRlCy5。復合體的制備公開在實施例l-4中。在測定抗原存在的試驗中，將三個分子生物傳感器用含有濃度范圍為0-200nM的鏈霉親和素的液體樣本在室溫下避光培養l小時。在培養期后，在熒光計中測量每個樣本并收集熒光光譜。鏈霉親和素存在時，接替FRET發生，會產生樣本熒光發射光譜的改變。參考文獻Adams,S.R.etal.2002.Newbiarsenicalligandsandtetracysteinemotifsforproteinlabelinginvitroandinvivo:synthesisandbiologicalapplications.JAmChem20SOC.124(21):6063-76.Chin,J.W.etal.2002(a).ProcNatlAcadSciUSA99:11020-11024.Chin，J.W.andP.G.Schultz.2002(b).Chembiochem3:1135-1137.Clamme，J.-P.andAshokA.Deniz.2005.Three-ColorSingle-MoleculeFluorescenceResonanceEnergyTransfer.ChemPhysChem6:74-77.DeChateau,M.etal.1993.ScandJlmmunol37:399畫405.Deo，S.K.2004.Exploringbioanalyticalapplicationsofassistedproteinreassembly.AnalBioanalChem379:383-390.Farrell,I.S.etal.2005.NarMethods2:377-384.Galarneau,A.etal.2002.NatBiotechnol20:619-622.Galperin，E.etal.2004.Three誦chromophoreFRETmicroscopytoanalyzemultiproteininteractionsinlivingcells.NatureMethods1(3》209-217.Gao，W.etal.2003.NovelFluorogenicSubstratesforImagingbeta-LactamaseGeneExpression.■/CTzew.125(37):11146-11147.Kastem，W.etal.1992.StructureofpeptostreptococcalproteinLandidentificationofarepeatedimmunoglobulinlightchain-bindingdomain.J.5/o/.C/2柳.267,12820-5.Komiya,N.etal.2004.爿朋/5z'oc/zem327:241-246.Lichlyter，D.Jetal.2003.萬z'ase"j19:219-226.Lindhout，D.A.etal.2004.NMRsolutionstructureofahighlystabledenovoheterodimericcoiled-coil.5/opo/，era75(5):367畫75Medintz，I丄.etal.2003.M^Mwter2:630-638.Ohiro，Ketal.2002.」脂/Oze/w74:5786-5792.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>權利要求1.一種檢測分析物的方法，包括以下步驟提供一個生物樣本；用至少一個協同指示試劑接觸所述樣本以檢測所述分析物，其中，所述指示試劑包括親合組分、連接組分和協同指示組分；從系統中確定信號存在或不存在，其中，所述信號表明樣本中存在所述分析物；根據所述信號存在或不存在測知分析物，其中，在不存在分析物的背景上檢測不到所述信號。2.權利要求i所述的方法，其中，待檢測的分析物是選自由蛋白質、肽、抗原、抗體、外源凝集素、結合外源凝集素的碳水化合物、疾病標示物、細胞因子、細胞因子受體、激素、激素受體、細胞粘著分子、細胞粘著分子配體、核酸、糖鏈、脂類、細胞、病毒、胞內細胞器、小分子、低分子量化合物等組成的組中的一種物質，或者其一部分選自上組的物質。3.權利要求2所述的方法，其中，所述連接組分包括蛋白L連接子，其中所述蛋白L連接子包括蛋白L或其片段或其衍生物。4.權利要求3所述的方法，其中，所述蛋白L連接子可以包括允許或者提高衍生物與親和組分的化學結合的修飾。5.權利要求3所述的方法，其中，所述蛋白L連接子可以包括允許或者提高衍生物與指示組分的化學結合的修飾。6.權利要求3所述的方法，其中，所述蛋白L連接子包括由SEQIDNo.2所示的核苷酸序列編碼的多肽。7.權利要求2所述的方法，其中，所述親合組分包括抗體或其片段或其衍生物。8.權利要求2所述的方法，其中，所述指示組分包括選自熒光材料、酶、酶片段、酶亞基、受體、配體、熒光蛋白、發光蛋白、非蛋白熒光體、非蛋白質化學發光化合物、熒光標記蛋白、熒光納米晶體、熒光螯合物、光敏染料和熒光性淬滅劑組成的組中的一種組分。9.權利要求3所述的方法，其中，蛋白L連接子與指示組分的連接包括化學連接。10.權利要求3所述的方法，其中，蛋白L連接子連接到指示組分上形成融合蛋白。11.權利要求3所述的方法，其中，蛋白L連接子與指示組分的連接包括非共價的相互作用。12.權利要求3所述的方法，其中，蛋白L連接子與指示組分的連接包括生物素-鏈霉親和素的結合。13.權利要求3所述的方法，其中，蛋白L連接子與親合組分的連接包括自組裝。14.權利要求13所述的方法，其中，所述自組裝通過氫鍵合、鹽橋接或者它們的組合實現。15.權利要求3所述的方法，其中，蛋白L連接子與親合組分的連接包括光致交聯。16.權利要求2所述的方法，其中，所述分析物的檢測是在均相系統中進行。17.權利要求2所述的方法，其中，所述信號是光信號。18.權利要求16所述的方法，其中，所述光信號是由FRET、LRET、BRET、酶片段互補、TR-FRET、發光氧通道產生的光信號。19.權利要求16所述的方法，其中，所述信號的檢測不需要使用儀器。20.權利要求l所述的方法，其中，所述接觸的步驟包括用至少兩種協同指示試劑接觸樣本，所述協同指示試劑組成一個多元素協同指示系統，在系統中，信號的產生包括在未發生所述至少兩種試劑的連接組分之間的連接的情況下，兩種協同指示試劑之間的交互作用。21.權利要求20所述的方法，其中，所述至少兩種協同指示試劑中的每一種都包括一個特有的親合組分，使得每種特有親合組分對同一分析物的不同部位有親合力。22.—種檢測分析物的協同指示物系統，包括至少一個協同分子試劑，所述試劑包括親合組分、連接組分和協同指示組分，其中，所述指示組分與第二指示組分協同產生信號，且在不存在分析物的背景上檢測不到所述信號。23.權利要求22所述的系統，其中，所述第二指示組分與第二協同分子指示試劑結合。24.權利要求22所述的系統，其中，所述第二指示組分不與第二協同分子指示試劑結合。25.權利要求22所述的系統，包括至少兩個協同分子試劑，其中，系統中第一分子試劑的連接組分對于第二分子試劑的連接組分的背景沒有任何親合力。26.權利要求25所述的系統，其中，所述至少兩個分子試劑與分析物的結合，使所述指示組分緊密靠近。27.—種檢測分析物的生物傳感器，包括親和基團；協同指示物；和包含蛋白L連接子的連接組分，其中所述蛋白L連接子包括蛋白L或其片段或其衍生物。28.權利要求27所述的生物傳感器，還包括至少一個附加的協同指示物。全文摘要本發明涉及使用被轉換成納米尺度的“自發信號”生物傳感器的抗體分子來檢測樣本中的分析物的方法和組合物。本發明尤其涉及那些能提供目標分析物的一步檢測且無需傳統測定所必要的高勞動強度步驟的方法和組合物。文檔編號G01N33/58GK101278194SQ200680026914公開日2008年10月1日申請日期2006年5月23日優先權日2005年5月23日發明者維文·蘇申請人:夏威夷大學