利用聲學器件檢測分析物的方法和設備的制作方法

專利名稱：利用聲學器件檢測分析物的方法和設備的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測流體樣品中一種或多種分析物的方法。 發明背景對于檢測液體介質中的分析物(例如，化學和生物學物質)的系統，其顯著難點 包括介質中分析物的濃度和將分析物轉運至傳感器表面。對于生物學應用，由于這 種分析物的濃度可能較低，通常會產生濃度問題。此外，生物學分析物(例如，細 胞、細胞碎片和大分子，如蛋白質和核酸)可能較大；所以會因這些較大的分析物 在流體溶液中擴散非常慢而產生轉運問題。除細胞、細胞碎片和諸如蛋白質及核酸等分子外，檢測小分子分析物可作為 診斷疾病、監測患者中藥物的藥代動力學和篩選潛在藥物靶標的小分子文庫的有用 標記。常需要監測患者體內的許多治療性藥物，包括小分子藥物以盡可能提高藥物 的有益作用和避免可能產生的不利作用。例如，雌二醇是用于評估許多健康狀況的小分子。例如，可采用血液檢測促 卵泡激素(FSH)和雌二醇(E2)來檢查卵巢儲備(ovarian reserves)和卵子功能(egg function)是否完全。此外，可將雌二醇及其代謝物用作乳腺癌的風險決定因素。雌 二醇水平升高與患乳腺癌的風險增加有關。然而，雌二醇水平低與脊椎骨折風險增加有關。美國食品與藥品管理局已批準在某些患者中使用藥物他莫昔芬來預防乳 腺癌。然而，他莫昔芬降低血清雌二醇水平會增加脊柱骨折發生率。因此，需 要醫師能經常監測患者的雌二醇水平，從而確保雌二醇水平維持在能降低乳腺 癌風險但不會增加脊柱骨折風險的某一范圍內。還需要頻繁監測患者體內的治療劑。治療劑包括，例如免疫抑制藥物，例如 環孢菌素、他克莫司(FK-506)、雷帕霉素和麥考酚酸。免疫抑制劑的治療指數窄， 患者之間和患者體內生物利用度的差異程度高。使用免疫抑制劑需要小心、頻繁地 監測患者的樣品以平衡防止移植物排異所需的免疫抑制水平同時避免過分免疫抑
制導致的不利作用，例如毒性、感染和患癌癥風險增加。檢測小分子，例如雌二醇往往困難，不僅是因為樣品中其濃度可能低，也是 因為可用于結合小分子分析物的合適捕捉劑數量有限。這些局限性常造成難于設計 或改進已有的試驗，例如對檢測低水平小分子分析物足夠靈敏且特異的酶聯免疫吸 附測定。檢測患者樣品中的分析物通常需要在醫師診室或診所獲得樣品，轉送樣品作 分析。按照不同的分析物，分析可持續一天到數周。分析結果送至醫師處，其根據 需要用該信息調整治療方案并與患者聯系以轉告新的治療方案。分析樣品的滯后使 得醫師難于精確地制定合適的治療方案。需要能更方便地用于檢測小分子分析物，檢測低濃度分析物的改進試驗。此 外，需要改進對分析物，包括小分子分析物的檢測，從而能(按患者)定制給藥方案 來維持個體患者中藥物的療效同時降低有害副作用。此外，需要在護理時能用于檢 測生物學和/或臨床相關分析物的方法和設備，從而能減少獲得樣品和獲得試驗結 果之間的滯后。競爭試驗的關鍵度量是單位時間內累積在傳感器上的分析物量。為獲得良好的性能，累積速率(以及產生的瞬時信號(signal transient))需要快于傳感器漂移速 率。分析物檢測系統的另一關鍵性能度量是系統收集傳感器表面上的感興趣分析物 的優先程度。由于許多生物學樣品含有外來背景組分(例如，其它蛋白質、細胞、 核酸、灰塵)，需要防止這些背景組分干擾所需的檢測。因此，能將分析物選擇性 地吸引到傳感器而讓干擾性背景組分通過的轉運方法肯定有益。聯用這種方法和分 析物(例如，抗體、互補DNA鏈等)與傳感器表面的選擇性結合能高度炱敏地檢測 含大量外來背景組分的樣品中的分析物含量。已提出了各種提高分析物轉運至傳感器表面的方法，包括過濾、新型流體幾 何學(flow geometries)、聲場、電場(時變和靜態)和磁場。已用聲激勵(acoustic excitation)將細胞牽引至場節點(field node)，但單用該技 術難將物質轉運至表面。已用電場(電泳和雙向電泳)來提高轉運，但不能普遍適用于所有類型的分析物 和樣品。它們通常對于較大的分析物(例如，細胞)更有效。此外，給定種類和菌株 中的微生物電特性不同，因而難于預測系統在所有預定操作條件下的性能。有時需 要改變樣品的離子強度來提高轉運的性能。該要求與試驗的最佳結合或洗滌條件相 沖突。電場還可能消耗能量并加熱導電流體(例如，0.01M磷酸緩沖溶液)，由于加 熱會破壞生物學分析物，這是不利的。免疫磁性分離(IMS)方法是本領域已知分離樣品中分析物的方法。發明概述本發明涉及檢測樣品中是否存在一種或多種分析物的方法。在一個實施方式中，該方法包括將包被有捕捉劑的多個磁性顆粒引入流體室(fluidchamber)中，其中該流體室的至少一個表面裝有結合了第一分析物的聲學器件。多個磁性顆粒可先 與樣品接觸，然后將這些顆粒引入該室中，或者可先將樣品引入流體室，然后或同時引入顆粒。可在該聲學器件附近產生磁通量從而將所述多個磁性顆粒中的至少一 個引向所述表面。監測所述聲學器件產生的信號輸出從而能檢測樣品中是否存在一 種或多種分析物。在另一實施方式中，檢測樣品中是否存在一種或多種分析物的方法包括將多 個顆粒和競爭分子引入流體室的步驟，所述顆粒包被有能結合分析物的第一捕捉 劑。在某些實施方式中，這些顆粒是磁性顆粒。該流體室的至少一個表面裝有包被 了能結合競爭分子的第二捕捉劑的聲學器件。可在該聲學器件附近產生磁通量從而 將所述多個磁性顆粒中的至少一個引向所述表面，監測所述聲學器件產生的信號輸 出從而能檢測樣品中是否存在一種或多種分析物。多個磁性顆粒可先與樣品和競爭 分子接觸，然后將這些顆粒引入該室中，或者可先將樣品和競爭分子引入流體室， 然后或同時引入顆粒。監測所述聲學器件產生的信號輸出從而能檢測分析物。本發明也涉及確定是否要調整個體的劑量的方法。該方法包括檢測樣品中一 種或多種分析物的水平。在一個實施方式中，檢測樣品中一種或多種分析物水平的 方法包括將包被有捕捉劑的多個磁性顆粒引入流體室，其中該流體室的至少一個表 面裝有上述結合了第一分析物的聲學器件。可在該聲學器件附近產生磁通量從而將 所述多個磁性顆粒中的至少一個引向所述表面。監測所述聲學器件產生的信號輸出 從而能檢測樣品中一種或多種分析物的水平。根據樣品中一種或多種分析物的水平 決定是否調整藥物劑量。在還有另一實施方式中，檢測能與捕捉劑結合的分析物的方法包括將多個顆 粒引入流體室。各磁性顆粒包被有不同分析物，該流體室的至少一個表面裝有結合 了捕捉劑的聲學器件。監測上述聲學器件產生的信號輸出從而能檢測能與捕捉劑結 合的分析物。多個磁性顆粒可先與樣品接觸，然后將這些顆粒引入流體室中，或者 可先將樣品引入流體室，然后或同時引入顆粒。監測所述聲學器件產生的信號輸出 從而能檢測分析物。本發明涉及檢測樣品中的雌二醇的方法。在一個實施方式中，該方法包括將 包被了能結合雌二醇的捕捉劑的多個磁性顆粒引入流體室的步驟，其中該流體室的 至少一個表面裝有連接了雌二醇的聲學器件。多個磁性顆粒可先與樣品接觸，然后 將這些顆粒引入流體室中，或者可先將樣品引入流體室，然后或同時引入顆粒。監 測所述聲學器件產生的信號輸出從而能檢測樣品中的雌二醇。在另一實施方式中，該方法包括將多個顆粒和競爭分子引入流體室的步驟， 所述顆粒包被有能結合雌二醇的第一捕捉劑。該流體室的至少一個表面裝有包被了 能結合競爭分子的第二捕捉劑的聲學器件。多個磁性顆粒可先與樣品接觸，然后將 這些顆粒引入該室中，或者可先將樣品引入流體室，然后或同時引入顆粒。監測所 述聲學器件產生的信號輸出從而能檢測雌二醇。本發明涉及檢測樣品中一種或多種免疫抑制劑的方法。該方法包括將包被了 能結合免疫抑制劑的捕捉劑的多個磁性顆粒引入流體室的步驟，其中該流體室的至 少一個表面裝有結合了所述免疫抑制劑的聲學器件。多個磁性顆粒可先與樣品接 觸，然后將這些顆粒引入室中，或者可先將樣品引入流體室，然后或同時引入顆粒。 監測所述聲學器件產生的信號輸出從而能檢測樣品中的免疫抑制劑。在另一實施方式中，檢測一種或多種免疫抑制劑的方法包括將多個顆粒和競 爭分子引入流體室，所述顆粒包被有能結合免疫抑制劑的第一捕捉劑，其中該流體 室的至少一個表面裝有包被了能結合競爭分子的第二捕捉劑的聲學器件。多個磁性 顆粒可先與樣品接觸，然后將這些顆粒引入該室中，或者可先將樣品引入流體室， 然后或同時引入顆粒。監測所述聲學器件產生的信號輸出從而能檢測免疫抑制劑。本發明提供了分析物的改進檢測方法。在某些實施方式中，所述分析物可包 括小分子，包括但不限于雌二醇和治療性藥物。本發明的結果是，不難測定某給定 藥物的藥代動力學(參數)并更易于定制(例如，由醫師定制)給藥方案來維持藥效同 時減少不利副作用。此外，可在護理處采用本發明檢測生物學和/或臨床相關分析
物而避免延誤(例如，將樣品發送至遠離現場的測試機構而致的延誤)，從而能定制 護理(方案)并提高患者順從性水平。本文所用的術語"護理處"包括，例如醫師診 室、診所、急診室和流動治療機構(例如，救護車)。在一個實施方式中，該方法還 包括根據樣品中所述藥物的水平調整給予個體的治療性藥物劑量。治療性藥物水平 可按照所測試治療性藥物的已知治療范圍而有所不同。可根據樣品中所檢測分析物的水平利用本發明來診斷疾病或評估患病風險。 在一個實施方式中，所述疾病是乳腺癌。例如，可聯用檢測乳腺癌標記的方法與其 它診斷測試，如乳房X線照片來檢測個體的乳腺癌。在另一實施方式中，可采用 檢測乳腺癌標記的方法來測定個體患乳腺癌的可能性。此外，可利用本發明評估患 者的狀況，例如根據雌二醇水平測定患者的生育能力。可利用本發明監測患者中生 物或臨床相關物質的水平。此外，可根據患者中某給定分析物的水平，采用本發明 測定該患者是否適合接受藥物，或是否適合納入藥物研究。

圖1所示系統100因相關的效率和低操作成本而非常適合以不分批的方式操作個體樣品，而分批方式要在運行試驗前獲得許多樣品。以此方式，本發明的各實 施方式非常適合在個體基礎上分析樣品。在分析物檢測系統的一個實施方式中，分析物與磁性顆粒(例如，磁珠)結合從 而形成分析物-顆粒復合物。通過施加磁場梯度將分析物-顆粒復合物運送并固定到 傳感器件表面。磁場感應顆粒的磁性材料隨局部磁力線排列而極化。顆粒受到梯度 方向的凈力(作用)，從而導致顆粒向場強更高的區域遷移。改變磁場分布，將分析 物-顆粒復合物從樣品流中吸下，將它們沿著傳感器件表面分布。與磁性顆粒相比， 樣品中的外來背景組分(例如，細胞、蛋白質)通常磁化率很低，所以磁場不會顯著 影響它們。因此，只有極少部分的這種背景物質能與傳感器表面相互作用。在一個實施方式中，傳感器件是柔性板波(flexural plate wave)(FPW)器件，其特別能與磁性顆粒良好起作用的原因有二。第一，傳感器件表面存在磁性顆粒導致 FPW信號應答放大。分析物-顆粒復合物的組合體積和密度較大，產生的FPW信 號應答高于單一分析物。第二， FPW器件的傳感器表面由通常是數微米厚的薄膜 構成，從而能在傳感器表面產生更大的磁場和場梯度，因為場源放置得更接近樣品 流。這導致從樣品中捕獲的分析物部分更多。由于捕捉速度和效率較高，可能以較 少次數處理較大體積的樣品。
在一方面，檢測分析物的設備包括具有至少一個流體進入開口的流體室，和 界定該流體室中至少一個內表面的至少一部分的柔性板波器件。該設備還包括監測 柔性板波器件產生的至少一種信號輸出的監測器件，包被有對分析物具有親合力的 捕捉劑的多個磁性顆粒，和將磁性顆粒選擇性吸引到流體室的至少一個內表面的第 一磁通量源。在另一方面，共振器件系統的柱盒包括具有至少一個流體進入開口的流體室， 和界定該流體室的至少一個內表面的柔性板波器件。該設備還包括將磁性顆粒選擇 性吸引到流體室的至少一個內表面的第一磁通量源。在另一方面，檢測分析物的方法包括混合含分析物的流體與包被有對該分析 物具有親合力的捕捉劑的多個磁性顆粒，從而至少一些磁性顆粒與至少一些分析物結合。該方法還包括將混合流體引入第一流體室，其中柔性板波器件的至少一個表面與該第一流體室中的流體發生流體接觸(fluid communication^該方法還包括在 該柔性板波器件附近產生第一磁通量，從而將至少一些結合的磁性顆粒磁性吸引至 該柔性板波器件的至少一個表面。在另一方面，檢測分析物的方法包括用第一捕捉劑包被位于流體室中的柔性 板波器件某表面的至少一部分，將含有分析物的流體引入該流體室，從而使一些分 析物與位于柔性板波器件上的捕捉劑結合。該方法還包括將含有多個磁性顆粒的流 體引入該流體室，所述顆粒包被了第二捕捉劑，并在該柔性板波器件附近產生磁通 量，從而將至少一些磁性顆粒磁性吸引至該柔性板波器件的表面。與常規試驗相比，本發明的結果是可以檢測水平遠低的分析物。許多因素提 高了分析物的檢測極限。在一個實施方式中，本發明每份樣品用的顆粒較少，從而 使得顆粒上包被的分析物密度更高，即使樣品中分析物的濃度低也如此。每個顆粒 所含的分析物水平較高導致各包被顆粒對傳感表面的親合力較高。當試驗方式是競爭性試驗，即傳感表面包被有分析物時，能更有效地阻斷包 被有較高密度分析物的顆粒與傳感表面的結合，因為各顆粒含有的能自由結合傳感 表面分析物的捕捉劑分子較少。換言之，顆粒與分析物的比率較低導致樣品中的分 析物與傳感表面的分析物之間的競爭更激烈，從而能檢測樣品中濃度較低的分析 物。因此，本發明提高了系統的精確性和靈敏度，因為這些顆粒包被有更高密度的 分析物，對傳感表面的結合更強。
在另一實施方式中，按照本發明原理制造的器件以及執行的方法對于捕捉低 濃度的顆粒特別有用，因為傳感器表面薄(例如在一個實施方式中是數微米級)。一 個實施方式聯用薄表面與磁場梯度及磁性顆粒。由于傳感器表面薄，可在該傳感器 表面的一側感應大磁場梯度。磁場梯度大可將磁場聚集在傳感器表面附近而增強傳 感器表面對磁性顆粒的吸引作用。磁場梯度大可將磁場聚集在傳感器表面附近而增 強傳感器表面對磁性顆粒的吸引作用，而使樣品中的其它物質流過。以此方式可用 較低數量的顆粒而能提高該系統的檢測極限，因為磁場梯度能將顆粒聚集在在傳感 表面附近使之與結合的分析物或捕捉劑相互作用，這取決于試驗形式。在各種實施 方式中，可撤去磁場梯度，從而能洗去任何非特異性結合的顆粒。在各種實施方式 中，可撤去磁場梯度，從而能洗去任何非特異性結合的顆粒。附圖簡述當結合以下附圖閱讀時，從以下描述可更全面地理解本發明以上和其它目的、 其各種特征及發明本身，在這些附圖中圖1A顯示了按照本發明構建的分析物檢測系統的一個實施方式。 圖1B顯示了圖1A所示分析物檢測系統一部分的另一實施方式。圖2更詳細地顯示了圖1A所示的FPW傳感器。圖3顯示了聯用FPW傳感器與分析物-顆粒復合物檢測生物學分析物的通用 檢測方案。圖4顯示了一示范性檢測方案中多個FPW傳感器信號變化與時間的函數關系。圖5是顯示所檢測的最終信號變化與原始分析物濃度的函數關系的概圖。 圖6類似于圖4，顯示了一檢測方案的時間進展圖(time evolution plot)，但用的是PSA分析物。圖7是將某分析物吸引至聲學器件傳感表面的三種不同方式的示意圖。 圖8是本發明一實施方式的示意圖，其中競爭分子(例如，分析物)結合于傳感表面。圖9是本發明一實施方式的示意圖，其中競爭分子是與標簽相連的感興趣分 析物，聲學器件的傳感表面包被有能結合該標簽的捕捉劑。 圖IO是本發明一實施方式的示意圖，其中競爭分子包含載體及與載體結合的 兩種或多種感興趣的分析物分子，聲學器件的傳感表面包被有能結合該感興趣分析 物的捕捉劑。圖11顯示了多個FPW傳感器的信號變化與PSA濃度的函數關系。圖12顯示了多個FPW傳感器的信號變化與血清中雌二醇濃度的函數關系。圖13是緩沖液中FK-506的劑量反應曲線。圖14顯示了多個FPW傳感器的信號變化與緩沖液中FK-506濃度的函數關系。圖15是血清中FK-506的劑量反應曲線。圖16顯示了多個FPW傳感器的信號變化與血清中FK-506濃度的函數關系。 優選實施方式描述本發明涉及利用聲學器件檢測分析物，包括小分子分析物的方法。所述小分 子分析物通常包含一個或只包含幾個捕捉劑可識別的結合位點。由于小分子具有較 少的幾個或只具有一個結合位點，本發明的一個實施方式采用競爭性結合來檢測和 /或定量測定分析物。當分析物含有能被兩種或多種捕捉劑識別的結合位點時，可 采用例如夾心試驗，用兩種不同的捕捉劑檢測該分析物。在臨床上，內源性雌二醇增加與婦女乳腺癌流行相關。例如，業已證實乳房 造影乳腺密度(乳腺組織雌激素過度合成的臨床表現)增加的婦女有發生乳腺癌的 較高風險(Boyd， N. F.等，N. Engl. J. Med.， 347:886-94 (2002))。此外，業已證 實血清雌二醇水平處于高四分位數(upper quartile)的婦女患乳腺癌的風險高于血 清雌二醇水平處于正常下四分位數(lower quartile)的絕經后婦女(Cauley， J. A.等， Ann. Intern. Med.， 130(4部分1): 270-7 (1999))。因此，可利用檢測雌二醇的方 法檢測乳腺癌。此外，本發明方法可與其它診斷測試，如乳房X線照片聯用來檢 測個體的乳腺癌。在另一實施方式中，可利用檢測雌二醇的方法來測定個體患乳腺 癌的可能性。可利用檢測雌二醇的方法評估或開發個體的治療方案，或測定某個體對于某 具體療法、治療或臨床研究是否適合或合格。例如，可用該方法評估個體是否可作 為用他莫昔芬治療的候選對象。在另一實施方式中，可用雌二醇水平監測患者的激
素替代療法來平衡激素替代的益處與雌二醇水平升高的風險。總體上，檢測分析物是基于包被有捕捉劑(在本文也稱為第一捕捉劑)的顆粒改 變聲學器件共振頻率的能力。該捕捉劑能結合分析物。在一實施方式中，在樣品和競爭分子存在下使多個包被有捕捉劑的顆粒與聲學器件的傳感表面接觸。傳感表面 可以是本文所述流體室或通道的一部分。此外，包被顆粒可以靜態方式與傳感表面 接觸，例如可將包被顆粒引入室中并溫育一定的時間。在另一實施方式中，包被顆 粒可以非靜態方式與傳感表面接觸，例如使包被顆粒流過流體室或通道。如本文所述，驚奇地發現使用較低濃度的顆粒能檢測較低濃度的分析物。該 發現是出乎意料的，因為在傳統上，涉及通過顆粒來捕捉的試驗要用大量的顆粒以 盡可能提高捕捉效率。在本發明的競爭性結合方式中，能結合聲學器件傳感表面的顆粒的用量通常 與樣品中感興趣分析物的含量成反比。樣品中分析物的水平越高，則顆粒上的捕捉 劑被樣品中分析物占據的越多，顆粒上可用于結合競爭分子的捕捉劑越少，從而影 響到與聲學器件傳感表面相互作用的顆粒的數目或數量。如下所述，競爭分子可存 在于溶液中，或可結合于聲學器件的傳感表面。在一優選實施方式中，所述顆粒是 磁性的，磁通量施加于聲學器件附近以將多個磁性顆粒中至少一個吸到傳感表面。在一實施方式中，檢測一種或多種分析物的方法包括將包被有能結合分析物 的捕捉劑的多個顆粒引入流體室，其中該流體室的至少一個表面裝有連接了能結合 分析物的聲學器件。該方式在本文中稱為夾心方式。可先使多個顆粒與樣品接觸， 再將這些顆粒引入流體室，或者可先將樣品引入流體室，然后或同時引入顆粒。監 測所述聲學器件的信號輸出，從而能檢測樣品中一種或多種分析物。微方式盡管不想局限于理論，但以小分子分析物為例，當試驗方式是競爭性試驗， 即傳感表面包被有分析物時，利用較少的顆粒或濃度較低的顆粒能使顆粒包被更高 密度的分析物。能更有效地阻斷包被有密度更高分析物的顆粒與傳感表面結合，因 為各顆粒含有的能自由結合傳感表面分析物的捕捉劑分子較少。換言之，顆粒與分 析物的比率較低導致樣品中的分析物與傳感表面的分析物之間的競爭更佳，從而能 檢測樣品中濃度較低的分析物。顆粒所用的濃度可以是約1 X 102-約1 X 107/mL。在另一實施方式中，顆粒的濃度是約5 X 103-約5 X 105/mL。圖7
顯示了聲學器件的傳感表面包被分析物的三種實施方式。在圖B中，分析物10通過化學接頭與表面12直接結合。在圖A和C中，分析物與表面間接結合。 在圖A中，表面12包被有結合對的第一成員32。連接了一個或多個分析物分 子10的該結合對的第二成員22能與包被該表面的該結合對的第一成員結合。 在圖C中，表面12包被有結合對的第一成員。該結合對的第二成員22能與連 接在表面上的該結合對第一成員結合，用結合對的第一成員32標記的捕捉劑 16能與該結合對的第二成員結合。含有連接了一個或多個分析物分子的載體的 競爭分子24能與捕捉劑16結合。如圖8所示，在一實施方式中，競爭分子包含與聲學器件的傳感表面12結合 的感興趣分析物IO(圖A)。包被有捕捉劑16的顆粒14與含有分析物18的樣品接 觸(圖B)。未與樣品的分析物結合但與顆粒結合的捕捉劑20能自由與聲學器件表 面結合的分析物結合(圖C)。如圖C和D所示，樣品中分析物的水平越高，與聲學器件傳感表面結合的顆粒越少，因為顆粒上更多的捕捉劑被樣品的分析物占據。監 測聲學器件產生的信號輸出來測定與表面結合的顆粒的數量和/或數目，從而能檢測樣品中是否存在一種或多種分析物。此外，可測定樣品中是否存在分析物或其數 量，例如通過比較信號與對照。如本文所述，在另一實施方式中，所述顆粒可以是 磁性顆粒。將各顆粒引入流體室后，在聲學器件附近產生磁通量，從而將多個磁性 顆粒中的至少一個吸到傳感表面(例如，類似于圖1A、 1B和2所述)。如圖9所示，在另一實施方式中，聲學器件的傳感表面12包被有能結合競爭 分子24的捕捉劑22(在本文中也稱為第二捕捉劑)。競爭分子可以是，例如連接有 標簽26的感興趣分析物10，第二捕捉劑能結合該標簽。如圖9所示，樣品中分析 物的水平越高，與聲學器件的傳感表面結合的顆粒14越少，因為顆粒上更多的捕 捉劑16被樣品的分析物所占據。由于第二捕捉劑能結合競爭分子的標簽部分，只 有當顆粒已結合了競爭分子時，包被顆粒才與聲學器件的傳感表面結合。如圖10所示，在另一實施方式中，競爭分子24可以是，例如與載體26結合 的兩種或多種感興趣分析物分子或部分10，第二捕捉劑40能結合該分析物。如圖 10所示，第二捕捉劑可以間接結合于聲學器件傳感表面。結合于表面與結合于顆 粒的捕捉劑可以是相同的捕捉劑。包被有捕捉劑16的顆粒14與含有分析物10和 競爭分子24的樣品接觸(圖B)。結合于顆粒但未與樣品分析物結合的捕捉劑能自 由結合競爭分子，該競爭分子進而與結合于傳感表面的捕捉劑結合(圖C)。如圖D所示，樣品中存在的分析物水平越高，與聲學器件的傳感表面結合的顆粒越少，因 為顆粒上的更多捕捉劑被樣品中分析物所占據。當分析物是只含有1個拷貝某給定 表位或結合位點的小分子時，只有顆粒己結合了競爭分子，包被顆粒才能與聲學器 件傳感表面結合。可利用本發明篩選一種或多種感興趣的小分子。在該實施方式中，將多個顆 粒引入流體室。所述多個顆粒包括包被有不同分析物的顆粒。該流體室的至少一個 表面裝有結合了捕捉劑的聲學器件，其中所述捕捉劑能結合感興趣的分析物。監測 所述聲學器件產生的信號輸出，從而檢測能與捕捉劑結合的分析物。可采用本發明方法檢測樣品中是否存在分析物和/或測定分析物的濃度或水平。采用本發明方法檢測的濃度可以是絕對濃度或相對濃度。例如，濃度可以是同 一體液樣品中存在的參比分析物濃度的相對值。可通過比較該數據與在不同時間獲 得的相似數據來獲得此濃度，從而測定實際濃度是否發生明顯變化。在本文所述的任何實施方式中，該方法提供的讀數(read-out)可以是正讀數或負讀數。在其它實 施方式中，如果檢測的是分析物的某些閾值水平，該方法可提供正讀數。對于本文所述的各實施方式，可對下述方法作出許多變化而不脫離本發明的 范圍。脂適用于本發明的樣品包括懷疑含有分析物的任何物質。可從來源直接獲得 可用的樣品，或者可按照一個或多個步驟修飾所得樣品。樣品可衍生自任何生 物學來源，例如生理學液體(例如，血液、唾液、痰、血漿、血清、眼晶體液(ocular lens fluid)、腦脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、滑膜液、腹膜液、羊水等)和 糞便。可用生物學拭子，例如鼻或直腸拭子采集樣品。此外，樣品可以是生物 活檢物質。樣品可得自人、靈長類、動物、禽類或其它合適的來源。可以在使用前預處理樣品，例如從血液制備血漿、稀釋粘稠的液體等。還 可過濾、蒸餾、提取或濃縮樣品。例如， 一些小分子藥物可滲入血細胞并與血 液中的蛋白質結合(例如，FK506)。可通過加入蛋白質沉淀劑和細胞裂解劑來提 取小分子。例如，可將硫酸鋅、聚乙二醇和甲醇的混合物加入離心后洗脫的血 液和溶劑相。另一種制備方法是加入含有蛋白質消化酶和洗滌劑的混合物以破 壞蛋白質和細胞，從而釋放小分子。離心后，洗脫液相并分析以測定原始樣品 中的小分子濃度。也可處理樣品以滅活或修飾樣品中可能干擾分析物或檢測過程的某些活性(物質)。例如，可將解復合拮抗劑(decomplexingantagonist)加入樣 品以使分析物與可能結合的捕捉劑和/或可干擾捕捉劑結合分析物的其它分子 解離。這種拮抗劑可以是，例如甾體拮抗劑。以雌二醇檢測為例，可加入達那 唑來處理樣品，使雌二醇與性激素結合蛋白質解離。對于進行環境或食品試驗，可使用除生理學液體以外的其它液體樣品，例 如水、食品等。此外，懷疑含有分析物的固體物質可用作測試樣品。可修飾固 體測試樣品(例如，勻漿、提取或固化)來形成液體介質或釋放分析物。樣品體積可以少至10pL或多至250 mL。在一個實施方式中，樣品體積可 以少至50pL或多至5mL。在一個實施方式中，樣品體積是約1-約5 mL。在一個實施方式中，可用下述一個柱盒運行一份樣品。此外，為測試含一 種或多種分析物的一組對象，可將一份樣品分成兩等份或多等份。可測試各等 份試樣中的不同分析物，例如對于每種要測試分析物利用不同的柱盒。以此方 式，可以個體為基礎(g卩，從患者獲得時)而不是以分批模式，例如，累積多份 樣品從而同時或在同一次儀器運行中分析樣品。薪娜本發明所用的合適捕捉劑包括能結合感興趣分析物的任何分子。術語"捕 捉劑"包括能結合感興趣分析物的分子或多分子復合物。捕捉劑優選以基本上 特異性的方式結合它們的結合伴侶。優選解離常數(KD)小于約10'6的捕捉劑。 捕捉劑也可以是，例如多肽、核酸、碳水化合物、核蛋白、糖蛋白、糖脂和脂 蛋白。抗體或抗體片段極其適合用作捕捉劑。能結合所選擇分析物的抗體可以 商品化購得或可采用產生抗體的標準方法制備。抗原也可用作捕捉劑，因為它們能結合抗體。結合配體的受體是可能的捕 捉劑的另一個例子。應知道，蛋白質捕捉劑不限于通過非共價相互作用只與它 們的結合伴侶相互作用的物質。捕捉劑也可任選共價連接于其所結合的蛋白 質。例如，捕捉劑可在結合后用光激發交聯于其結合伴侶。術語"抗體"包括無論天然產生的或完全或部分合成產生的任何免疫球蛋 白。該術語也包括保留與感興趣分析物結合能力的抗體衍生物。該術語還包括
含有與某免疫球蛋白結合結構域同源或大部分同源的結合結構域的任何蛋白 質。這些蛋白質可得自天然來源、完全或部分合成產生。抗體可以是單克隆或多克隆的。抗體可以是任何一類免疫球蛋白，包括IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。當已知分析物能與某載體蛋白結合時，所述抗體可以對該分析物的游離形式或 該分析物的載體結合形式特異。能結合所選擇分析物的抗體可以商品化購得或 采用產生抗體的己知方法制備。術語抗體也包括抗體片段。術語"抗體片段"指小于全長的任何抗體任何 衍生物。抗體片段優選至少保留了結合感興趣分析物的能力。抗體片段的例子包括但不限于Fab、 Fab'、 F(ab')2、 scFv、 Fv、 dsFv雙抗體(diabody)和Fd片段。可用任何方式制備抗體片段。例如，可通過酶促或化學方法片段化完整的 抗體來制備抗體片段，或用編碼部分抗體序列的基因重組產生抗體片段。或者， 可以完全或部分合成產生抗體片段。抗體片段可以任選是單鏈抗體片段。或者， 該片段可包含通過(例如)二硫鍵連接在一起的多條鏈。該片段也可任選是多分 子復合物。功能性抗體片段通常含有至少約50個氨基酸，更常見含有至少約 200個氨基酸。單鏈Fv (scFv)是只含有由多肽接頭彼此共價相連的輕鏈(VO可變區和重鏈(VH)可變區構成的重組抗體片段。Vl或VH可以是NH2-末端結構域。多肽接頭的長度和組成可以不同，只要所述兩個可變區經橋連而沒有嚴重空間干擾。接 頭通常由間插有一些谷氨酸或賴氨酸殘基的甘氨酸和絲氨酸殘基延伸段構成 而易溶解。"雙抗體"是二聚的scFv。雙抗體的成分中含有的肽接頭通常短于 大多數scFv，它們顯示優先結合成二聚體。"Fv"片段是只含通過非共價相互 作用連接在一起的一個VH結構域和一個VL結構域構成的抗體片段。本文所用 的術語"dsFv"指含有工程改造的分子間二硫鍵而穩定Vh-Vl配対的Fv。 "F(ab')2"片段是基本上等同于pH 4.0-4.5時，用胃蛋白酶消化免疫球蛋白(一 般是IgG)獲得的抗體片段。可以重組產生該片段。"Fab"片段是基本上等同 于通過還原F(ab')2片段中連接兩條重鏈的一條或多條二硫鍵獲得的抗體片段。 可以重組產生Fab'片段。"Fab"片段是基本上等同于用胃蛋白酶消化免疫球蛋 白(一般是IgG)獲得的抗體片段。可以重組產生Fab片段。Fab片段的重鏈區段 是Fd。
合適的多肽捕捉劑實際上也包括能結合感興趣分析物或小分子，例如小有 機分子的任何肽、多肽或蛋白質。在一個實施方式中，捕捉劑是能結合感興趣 分析物的抗體。在優選的實施方式中，捕捉劑能結合小分子。例如，可以商品 化購得、采用重組方法、采用合成制備方法或從天然來源純化獲得合適的多肽 捕捉劑。多肽包括，例如細胞表面和可溶性受體蛋白，例如淋巴細胞表面受體、 類固醇受體、核蛋白、信號轉導分子、轉錄因子、變構酶抑制劑、凝血因子、 酶(如蛋白酶和胸苷酸合成酶、絲氨酸/蘇氨酸激酶、蘇氨酸激酶、磷酸酶、細菌酶、真菌酶和病毒酶)、DNA和/或RNA合成或降解相關的蛋白質等。如下 文詳述的，當使用多種捕捉劑時，捕捉劑可以是，例如彼此的同種型。捕捉劑也可以是核酸，例如RNA或DNA或肽核酸。在一個實施方式中， 核酸或肽核酸能與核酸或肽核酸分析物雜交。此外，捕捉劑可以是適體， 一種 能結合非核苷酸分析物(例如，蛋白質、小有機分子或無機分子)的核酸。本文 所用的"適體"可以是由天然產生或修飾的核苷酸構成的RNA或DNA鏈。合適的捕捉劑還包括結合對的成員。合適的結合對包括，例如生物素與親 和素或生物素與親和素的衍生物(例如，鏈霉親和素和中性親和素(neutravidin))。捕捉劑可以結合于下述表面或珠上，或采用連接多肽、核酸等標準技術結 合于表面。分析激本文所用的術語"分析物"指，例如捕捉劑所識別的分子結構。例如，術 語"分析物"指抗體所識別的表位，或者可以包括配體的與受體結合部分。術 語"分析物"也包括含有捕捉劑所識別分子結構的較大分子。分析物可以是細 胞的一部分，例如細胞表面蛋白。分析物可以是使用者選擇的(例如，預先選擇 的)感興趣分析物。可以根據分析物與感興趣捕捉劑結合的能力來選擇，例如在 小分子文庫中篩選。如本文所述，可利用本發明檢測一組分析物中的一種或多種分析物。該組 分析物可包含可用本文所述競爭性形式檢測的一種或多種分析物。該組分析物 可包含可用本文所述夾心試驗方式檢測的一種或多種分析物。在一個實施方式 中，分別用下述柱盒檢測各分析物。為測試一種或多種分析物的一組對象，可 將一份樣品分成兩等份或多等份試樣。可測試各等份試樣的不同分析物，例如
對于所測試的每種分析物利用不同的柱盒。以此方式，可測試多組不同分析物 而無需獲得多份樣品和/或用不同類型設備來檢測不同的分析物。在一個實施方式中，感興趣的分析物是小分子。小分子包括分子量級別約為1000 g/mol或更低的有機或無機分子。小分子分析物通常含有一個或只有幾 個結合位點。由于小分子具有幾個或只有一個結合位點，本發明采用競爭性結 合來檢測和/或定量測定小分子分析物。然而，應知道可用夾心試驗形式檢測一些小分子。例如，可通過夾心免疫 測定用固定在傳感器表面的一種捕捉劑或蛋白質相互作用伴侶和磁頭上的另 一種捕捉劑或蛋白質伴侶來檢測雷帕霉素。負責結合雷帕霉素的兩種蛋白質是 12-kD FK506結合蛋白(FKBP)和稱為FKBP-雷帕霉素結合結構域(FRB)的雷 帕霉素哺乳動物耙標(mTOR)的100-氨基酸結構域。業已證實在沒有雷帕霉素 存在下，FKBP和FRB彼此沒有明顯親合力。小分子可以包括，例如類固醇、脂質、碳水化合物、肽和雜環化合物(例 如，堿，包括輔因子，如FAD和NADH)。分析物(例如，小分子)可以是小有 機分子文庫的一部分，包括醛、酮、肟、腙、半卡巴腙、卡巴腙、伯胺、仲胺、 叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、硫酯、二硫化物、羧酸、酯、 酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、縮酮、硫酮(thioketal)、乙縮醛、硫代乙縮醛 (thioacetal)、芳鹵、磺酸芳酯、垸鹵、磺酸垸酯、芳族化合物、雜環化合物、 苯胺、烯烴、炔烴、二醇、氨基醇、噁唑垸、嗯唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、 磺胺、環氧化物、氮丙啶、異氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物和/或酰氯，優選醛、 酮、伯胺、仲胺、醇、硫酯、二硫化物、羧酸、乙縮醛、苯胺、二醇、氨基醇 和/或環氧化物，最優選醛、酮、伯胺、仲胺和/或二硫化物和它們的組合。在一具體實施方式
中，分析物是雌二醇。術語"雌二醇"包括雌二醇和所 有可檢測的雌二醇代謝物。因此，術語"雌二醇"可包括雌酮-3-葡糖苷酸(E3G)、 雌二醇-3-葡糖苷酸、雌二醇-17-葡糖苷酸、雌三醇-3-葡糖苷酸、雌三醇-16-葡 糖苷酸和雌酮-3-硫酸酯。在一個實施方式中，可利用雌二醇水平測定患者的卵巢儲備狀態和/或預測 患者的生育能力。可用本發明檢測一部分或一組分析物來測定卵巢儲備狀態或 生育力狀態。分析物對象組可包括，例如雌二醇和FSH。本領域已知的預測方 法，例如Buyalos等，Fertil Steril 68:272-277， 1997中所述，其內容全文納入 本文作為參考。本發明分析物也可以是生物學分析物，例如多肽、核酸、碳水化合物、核 蛋白、糖肽或糖脂。有用的分析物包括，例如酶、類固醇、激素、轉錄因子、 生長因子、免疫球蛋白、類固醇受體、核蛋白、信號轉導組分、別構酶調節劑 等。例如，可以商品化購得、重組、合成或從天然來源純化來獲得感興趣的分 析物。在優選的實施方式中，感興趣的分析物與具體人疾病或病癥相關。合適 的生長因子包括細胞因子，例如促紅細胞生成素/EPO，粒細胞集落刺激受體， 粒細胞巨噬細胞集落剌激受體，血小板生成素(TPO)， IL-2， IL-3， IL-4， IL-5， IL-6， IL-IO， IL-ll， IL-12，生長激素，催乳素，人胎盤催乳激素(LPL)， CNTF 和octostatin。合適的類固醇包括但不限于雌二醇、孕酮、睪酮和它們的衍生 物。合適的其它分析物包括，例如胰島素、胰島素樣生長因子1 (IGF-1)、表皮 生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、胎盤生長因子(PLGF)、 TGF-a 和TGF-p，其它激素和受體，例如骨形態發生因子、促卵泡激素(FSH)和黃體 激素(LH)、組織壞死因子(TNF)、凋亡因子-l和-2(AP-l和AP-2)和mdm2。 生物學分析物還包括細胞分析物，其包括，例如合適的可檢測標記，如表面受 體。在一個實施方式中，分析物是乳腺癌標記。乳腺癌標記包括，例如上述雌 二醇及其代謝物。此外，乳腺癌標記包括但不限于授予Watkins等的US 6,936,424中描述的蛋白質，該篇專利的內容全文納入本文作為參考。感興趣的分析物還可以是治療性藥物，其可用于檢測患者樣品中的藥物水 平，例如為藥物治療目的。合適的治療性藥物包括但不限于蛋白酶抑制劑和 免疫抑制劑。合適的蛋白酶抑制劑包括安瑞那韋(ageneraser)、瑞塔滋(reyataz)、 lexiva、夫沙那韋(telzir)、印地那韋、kaletra、奈非那韋(viracep)、 norvi、沙奎 那韋、aortovase、替拉那韋(aptivus)等。合適的免疫抑制劑包括環孢菌素、他克 莫司(FK-506)、雷帕霉素、麥考酚酸等。在一個實施方式中，采用競爭性試驗 檢測感興趣的治療性藥物。在另一實施方式中，用夾心試驗形式檢測治療性藥物。如上所述，治療性 藥物可與載體或結合蛋白結合，可用能結合載體的捕捉劑通過夾心試驗檢測所 述治療性藥物。在另一實施方式中，治療性藥物是生物學療劑。生物學療劑的 例子包括單克隆抗體、酶、激素和其它蛋白質。由于這些分子很大，它們通 常具有多個表位并可用夾心試驗檢測。通常給移植患者開的處方是聯用免疫抑制藥物。例如，神經鈣蛋白抑制劑， 例如環孢菌素和他克莫司常與麥考酚酸一起開處方。此外，可單用雷帕霉素(西 羅莫司)或與他克莫司和環孢菌素聯用。因此，對一位患者進行一系列檢測來協助醫師確定改進他們的藥物水平是有益的。 一組分析物可包括小分子和生物物 質(在本文中也稱為生物標記)。 一組分析物可包括，例如一種或多種處方治療 性藥物和任選的免疫應答標記，例如一種或多種炎性細胞因子。此外，可聯合 檢測治療性藥物和生物標記，從而能監測感染或排異。對于其它患者病癥和療 劑可采用類似的方法。感興趣的分析物可以是病原體或微生物，例如細菌或細菌孢子、病毒、寄 生蟲、朊病毒或其它病原體或他們的細胞壁或表面組分，例如革蘭陽性肽聚糖、 脂磷壁酸和磷壁酸，和革蘭陰性內毒素，例如脂多糖。細菌分析物包括，例如 志賀菌屬(S/n'ge〃a )，如痢疾志賀菌0S/n'ge//a ^^e/^en'ae);彎曲桿菌屬 (Cam;7_y/o6ctc/er 5p.)， 如空腸彎曲桿菌(Camp_y/o6a"er J力.wm〕； 腸球菌屬 CEV7fen9coccMj1 w.)， 如糞腸球菌(五"&rococctw y^ecaZ/s); 炭疽桿菌(5ac〃/zw flW/zrac/"; 鼠疫耶爾森菌(yeM/m'a ; 百日咳博得特菌CSoWefe〃o/ e由肌's); 鏈球菌(5Y， ococca/ 5T ec/e5); 金黃色葡萄球菌(iS啤一ococcws ；結核分枝桿菌(Afyco6fl"eW,勵ercw/057-s); 艱難梭菌(C7o欲W, ^j^c〃e);破傷風梭菌(C7oWnWwm 肉毒梭菌(C/oWnW/wm 6ofw/^7Mm); 大腸桿菌CEscAer/c/n.a co//); 鼠f另寒 少門菌(Sa/mo"e〃a ^y/ /n'm"r/m); 腸^!^門菌 (Sfl/mo"e〃a ewfer,cfl); 衣原體(C7z/amyc /fl ■spec/es); 蒼白密螺方走體(7Ve; o"ema pa〃/t/w/w) ; ^林病奈瑟菌(A^/i^eWa go"o/r/zoeae); 布氏疏蟲累方定體OBorz-g/Za 6wrgctor/en'); 霍舌L弧菌(P76n'o c/zo/erae); 白喉棒狀桿菌(Cor_y"e6acfeWwm ^p/^/zm'ae)和幽門螺旋桿菌(ife//co6a"er ;^/oW)。寄生蟲包括，例如賈第蟲、 瘧原蟲和隱孢子蟲。病毒分析物包括，例如鼻病毒、黃熱病毒、B群柯薩奇病 毒(CB1、 CB2、 CB3、 CB4、 CB5和CB6)、犬細小病毒(CPV)， 1型單純皰 疹病毒(HSV1)、牛痘病毒、T4-樣病毒、腺病毒、乙型流感病毒、甲型流感病
毒、禽流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒(如SARS)、人免疫缺陷病毒(HIV)、肝 炎病毒、皰疹病毒、西尼羅病毒和埃博拉病毒。如上所述，在一些實施方式中，檢測了多種分析物。在一些實施方式中， 分析物具有相同的分子結構。分析物可以是，例如相同的感興趣分子。在另一實施方式中，不同的分析物(在本文中也稱為第一和第二分析物)是較大分子的 一部分。因此，分析物可以是與較大分子相連或其所含的特定結合位點(例如， 表位)。因此，檢測的不同分析物可以是不同分子的一部分。如下所述，分析物可以結合于表面或珠或采用結合小分子、多肽、核酸等 標準技術結合于各表面。在一個實施方式中，分析物間接結合于表面。例如， 分析物可通過結合對第一成員包被表面而間接結合于表面。分析物與該結合對 第二成員結合或相連，然后分析物通過該結合對的第一和第二成員之間的相互 作用而結合于該表面。合適的結合對包括，例如生物素與親和素或生物素與親 和素的衍生物，例如鏈霉親和素與中性親和素。按照本發明方法的一個實施方式，可采用各種不同形式使所述多個顆粒與 樣品接觸。例如，在一個實施方式中，多個顆粒與樣品接觸后引入流體室。可 先濃縮樣品，再將與樣品接觸的顆粒引入流體室。例如，可通過取出溶液中的 珠并重懸在較小體積的液體中來濃縮樣品。在另一實施方式中，先將樣品引入流體室，再引入多個顆粒。在還有另一 實施方式中，先將多個顆粒引入流體室，再將樣品加入該流體室。如上所述，在另一實施方式中，使多個顆粒與樣品和競爭分子接觸。可采 用多種不同方式使多個顆粒與樣品和競爭分子接觸。例如，在一個實施方式中， 使多個顆粒與樣品和競爭分子接觸，再引入流體室。在另一實施方式中，先將 樣品和競爭分子引入流體室，再引入多個顆粒。在還有另一實施方式中，先將 多個顆粒引入流體室，再向該流體室中加入樣品和/或競爭分子。如上所述，在本發明的一個實施方式中，將多個磁性顆粒和競爭分子引入 流體室。用能結合分析物的第一捕捉劑包被磁性顆粒，流體室的至少一個表面 裝有聲學器件，該聲學器件包被有能結合競爭分子的第二捕捉劑。在一個實施方式中，所述競爭分子包含與標簽相連或結合的分析物，所述第二捕捉劑能結 合該標簽。該標簽可以是能被捕捉劑識別的任何部分。在一個實施方式中，該 標簽是結合對成員之一，該捕捉劑是該結合對的另一成員。例如，標簽可以是 生物素，捕捉劑可以是親和素、鏈霉親和素或中性親和素。在該實施方式中， 采用連接分子與生物素的已知方法連接生物素與分析物，從而形成競爭分子。 可以采用任何合適方法用結合對的第二成員包被所述表面。例如，可如下所述 用生物素包被該表面，然后使該生物素化的表面與親和素或親和素的衍生物接 觸。在另一實施方式中，競爭分子包含兩個或多個與載體相連的分析物分子， 第二捕捉劑能結合該分析物。載體可以是能與兩個或多個分析物分子相連或結 合的任何分子。載體可以是蛋白質、核酸或其它聚合物。在一個實施方式中， 載體是白蛋白，例如牛血清白蛋白。在另一實施方式中，載體是辣根過氧化物 酶。在該實施方式中，可如下所述將兩個或多個分析物分子與載體相連，或者 可采用己知的連接技術形成競爭分子。如下所示，可用捕捉劑包被表面。如上所述，可用本發明篩選小分子文庫中一種或多種感興趣的小分子。可 通過本領域熟知的技術形成可用于本發明方法的小分子文庫類型，或者可以商品化購得(例如，從網址為chembridge.com的化學橋公司(ChemBridge)購得)。 小分子文庫包括組合文庫。組合文庫可以是含有大量(一般在103-106之間)不同 序列寡聚物(其特征通常在于亞單位的序列不同)，或不同序列的側鏈和連接鍵 或不同取代基化合物組合的分子文庫。已知制備小分子文庫的各種固相或液相 合成方法。在一個方法中，交替混合與分離含有形成文庫的靶化合物的連續前 體的珠，在各步驟向各組分離的珠中加入選擇的多種試劑之一(Furka等，Int.J. Pept. Protein Res. 37:487-493 (1991); Chen等，J. Am. Chem. Soc. 116:2661-2662 (1994); Pham等,WO 9513538 (1995); Dillard等，WO 9408051 (1994))。在該 實施方式中，各珠只含有一種化學物質。可采用上述已知的方法在各顆粒表面 上合成分析物來制備多個顆粒。 一個實施方式在各顆粒上合成不同分析物。在一個實施方式中，該方法包括制備結合有不同分析物的多個顆粒。在一 個實施方式中，多個顆粒含有兩組或多組顆粒，其中各組顆粒包被有不同分析 物。可將不同組顆粒與不同分析物接觸來制備顆粒，從而使得各組中的顆粒包 被有不同分析物。然后可將各組顆粒用于本發明方法，或先將它們混合，再用 于本發明方法。
對照信號/標準化在另一實施方式中，將聲學器件對接觸樣品起反應而產生的信號輸出與對 照信號比較，或按照對照信號標準化。可由使用者提供或從使用者獲得對照信 號。例如，對照信號可以是使用者根據具體分析物、捕捉劑、具體模型或所用 器件的型號或形式而提供的數值。在一個實施方式中，根據許多原理獲得對照 信號。例如，對照信號可以是代表使用者獲得的許多具體分析物的信號。代表 性信號可以在，例如樣品測試前、測試中或之后通過實驗獲得。在一些實施方 式中，對照信號是通過，例如用特定捕捉劑和特定型號的聲學器件分析已知量 的分析物而獲得的標準曲線。在另一實施方式中，根據用途獲得對照信號。例如，當每次用特定聲學器 件測試特定分析物和/或捕捉劑時可獲得獨特的對照信號。然而，在沒有樣品存 在下， 一個實施方式可用相同的分析物和/或捕捉劑獲得對照信號。可通過將第 二份多個顆粒引入包被有捕捉劑的流體室來獲得對照信號。該流體室的至少一 個表面裝有結合了第二分析物的聲學器件。監測所述聲學器件產生的信號輸出 來測定用于隨后測試的對照信號。蘆學器斧聲學器件主要通過該器件與流體之間的聲學相互作用而與流體偶聯。典型 的聲學器件包括表面聲波器件、柔性板波器件、蘭姆波器件和懸臂器件(cantilever device)。聲學器件也通過該器件與流體之間的一些粘性相互作用而 與流體偶聯，然而，所述偶聯主要是聲學偶聯。粘性相互作用器件主要通過該 器件與流體之間的粘性相互作用而與流體偶聯。典型的粘性相互作用器件包括 石英微量天平(QCM)器件、剪切諧波表面聲波器件(shear harmonic surface acoustic wave devices)禾口聲學板模式器件(acoustic plate mode device)。術語"表 面聲波"指器件結構中攜帶能量的方式，而不是器件如何與流體偶聯的方式。 聲學器件是流體在器件平面的實際區域上相互作用的器件。聲學器件對實際上 平面外并與該器件平面附近的流體(即，動能、勢能以及損耗主要蘊含在流體中) 聲學偶聯的運動起反應。粘性相互作用器件主要對平面內但不與該器件平面附 近的流體聲學偶聯的運動起反應。
對于涉及，例如檢測和定量測定流體中生物或化學物質的應用，聲學器件與流體之間的偶聯通常(發生在)相對于該器件的平面厚約100 nm-約10 pm之 間，而粘性相互作用器件與流體之間的偶聯通常(發生在)相對于該器件的平面 厚約10 nm-約100 nm之間。表面聲波器件和剪切諧波表面聲波器件可以類似方式在它們各自結構中 攜帶能量。表面聲波器件明顯與流體聲學偶聯，而剪切諧波表面聲波器件主要 通過粘性相互作用與流體偶聯。圖1A示出了根據本發明構造的分析物檢測系統100的一個實施方式。該系統100包括通道網絡102，用于通過FPW器件104傳輸各種測試溶液(也稱 為"測試溶液"或"流體")。納入本文作為參考的以下美國專利和專利申請 描述了適合用在本發明的各種類型的FPW器件的示例美國專利5,129,262， 美國專利5,189,914，美國專利6,688,158 B2，美國專利申請10/324,685，美國 專利5,668,303，美國專利5,836,203，美國專利申請20040038195。例如，美國專利5,129,262描述了一種超聲波傳感器，它具有用于形成蘭 姆(Lamb)波傳播介質的薄平面材料片。蘭姆波也稱為板-模式波，僅能穿透 厚度有限的材料。表面聲波(SAW)要求傳播介質的厚度是正傳播的SAW的 波長的幾百倍，與表面聲波相比，蘭姆波要求傳播介質最多僅是幾個波長那么 厚，并且通常僅是正傳播的蘭姆波的波長的幾分之一。上述材料片的厚度不大 于約20微米。蘭姆波發生器在平面材料片中產生蘭姆波，并且輸出設備產生 一個用于表示蘭姆波沿材料片傳播時的傳播特性的電信號。測量設備測量所選 出的輸出電信號的特性。該平面材料片的一些物理特性取決于作用于該材料片 的被測物理量的值，結果，那些物理特性決定了沿該材料片傳播的蘭姆波的傳 播特性。因為來自輸出設備的電信號代表了傳播特性，所以該電信號也代表了 作用于該材料片上的被測物理量的值。美國專利5，129,262所描述的蘭姆波設備可以用于生物感測。上述平面材 料片可以預先包被抗體分子，使得在浸入含相應抗原的液體中或與這種液體相 接觸后該設備的頻率發生改變。傳播介質表面處的抗原-抗體結合使得材料片中 的蘭姆波的波速發生改變。波速變化使振蕩頻率按該設備的延遲線振蕩器形式 發生改變。此外，為了加速抗原-抗體結合，該材料片可以由多孔且可穿透的材
料制成，從而允許抗體包被該材料片的更大表面區域，還讓含抗原的液體流過 該膜。其它生物學相互作用也可以被感測到，并且另外的應用可以包括免疫試 驗、臨床實驗室檢測、體內生物醫學監測以及生物醫學研究。上述實施方式中所用的測試溶液(比如封閉溶液106、樣品108和緩沖液110)都源自存儲槽容器112。存儲槽112的每一條通道路徑都有一個閥門114， 以控制特定測試溶液流到匯合點116，該匯合點116通向FPW器件104的入口 118。測試溶液流過FPW器件104并且通過出口 120流出，該出口120通向泵 122。泵122抽取通過通道網絡102且通過FPW器件104的測試溶液，并且將 測試溶液引導至廢物容器124。圖1B示出了分析物檢測系統100的另一個實施方式。本實施方式將FPW 器件104及其相關流體室160封裝成一個柱盒103，即一個可拆卸和替換的消 耗性組件。 一些實施方式可以包括流體控制器件101 (比如塞子、阻塞物或擋 板)，用于改變穿過該器件104的流體。在一個實施方式中，與沒有流體控制 器件101的情況相比，流體控制器件101可使流體在流過器件104時更靠近傳 感器表面143。此外，輸入測試溶液的源被顯示成一個輸入流體室105，該輸 入流體室105具有一個用于將測試溶液引導至柱盒103的入口 109的出口 107。 在一些實施方式中，磁性顆粒最初位于輸入流體室105中，并且含分析物的流 體與輸入流體室105中磁性顆粒混合，然后被引導至FPW器件104定位于其 中的柱盒103。可以用一器件(比如通過泵或磁性攪拌器)使磁性顆粒在輸入 流體室105中與含分析物的流體混合。圖1B還示出了帶有一入口 113的輸出 流體室111，用于接收來自柱盒103的出口 115的流體。這種輸出流體室111 可以包括上述的一個或多個流體控制器件，并且它可以包括一個或多個用于存 儲和/或處理廢液的機構。在至少一個實施方式中，輸入流體室105的出口 107與柱盒103的入口 109連接處被構造和布置成允許可重復的連接和斷開。相似的是，柱盒103的出口 115與輸出流體室111的入口 113連接處被構造和布置成允許可重復的連接和 斷開。在一些實施方式中，這些連接處被構造和布置成需要用于連接和斷開的 工具，比如螺紋連接需要扳手或其它工具來實現連接和斷開。在其它實施方式 中，這些連接處被構造和布置成允許迅速且容易的手動連接和斷開，而不需要
任何額外的工具或附件。這些需要工具和不需要工具的連接都是本領域已知 的。在一些實施方式中，有多個輸入流體室和輸出流體室。在一些實施方式中， 一個或多個輸入和/或輸出流體室是柱盒103的一部分。此外，在一些實施方式 中， 一個或多個磁通量的源是該柱盒的一部分。圖2更詳細地示出了 FPW器件104。在FPW器件104中，彎曲時在該器 件中產生了應變能和張力。在一些實施方式中，期望FPW器件104的厚度-波 長比小于l，并且在一些情況下遠小于1。通常，FPW器件104的波長"X"大約 等于上述交錯安置的電極的間距。在一個實施方式中，FPW器件104的厚度-波長比是2 |im/38 pm。在其它實施方式中，FPW器件104被設計成隔離特定的 模式(比如從第零階模式到更高階模式的任何模式)或與該器件相關的多個模 式的帶寬。例如，其厚度/波長比為2 pm/38 pm的FPW器件104將隔離FPW 器件104的第80個模式。FPW器件104可以被設計成通過針對該器件上所沉積的交錯安置的電極來選擇特定的圖案從而實現上述效果。在一個實施方式 中，FPW器件104的形狀是矩形的。FPW器件104可以是圓形或橢圓形的或 某種其它平面形狀。通常，通過使用本領域已知的微制造技術，從硅晶片130中構造出FPW 器件104。在上述實施方式中，腔132被蝕刻到晶片130中以產生薄的、懸著 的膜134，這種膜134大約1.6 mm長、0.3 mm寬和2 pm厚。整個晶片130的 厚度大約為500 pm，所以腔132的深度剛好稍微小于晶片130的厚度。如圖2 放大圖所示，在膜134的外表面(即與腔132相反的表面)上沉積氮化鋁(A1N) 構成的0.5 nm厚的層136。在A1N層上沉積了兩組交錯安置的金屬電極138。 在膜134的內表面(即面對著腔132的表面)上沉積金構成的薄層140 (大約 500埃)，以促進捕捉劑固定(下文會更詳細地描述)。在操作過程中，儀器/控制電子設備126 (參照圖1A)向至少一組電極138 施加時變電信號，以在懸著的膜134中產生振動。儀器/控制電子設備126還通 過接收來自至少第二組電極138的傳感器信號來監控膜134的振動特性。當液 體與膜134的腔面132相接觸時，板結構的最大響應是在15-25 MHz左右。儀 器/控制電子設備126將來自第二組電極的傳感器信號與參比信號進行比較，以 確定作為頻率的函數的傳感器信號的相對振幅和相角的變化。儀器/控制電子設
備126翻譯這些變化以檢測靶分析物的存在性。在一些實施方式中，儀器/控制電子設備還確定膜134的內表面上的靶分析物的濃度。如上所述，將靶向感興趣分析物的捕捉劑固定在覆蓋膜134內表面的薄金 層140上。該表面可以包被合適的連接化合物。合適的連接化合物是可商品化 購得的。在一個實施方式中，連接化合物包括下文所描述的生物素PEG二硫化 物。在另一個實施方式中，使硫醇封端的垸基鏈連接到上述金表面，從而形成 可自身裝配的單層(SAM) 。 SAM鏈的一部分用反應活性基團(比如羧基) 封端，從而能使用本領域已知的生化處理步驟將捕捉劑共價連接到SAM鏈。 SAM鏈的其余部分用無反應活性基團(最好具有親水特性)封端，以阻止非特 異性結合(比如，乙二醇的寡聚物)。其它表面修飾化學(方法)在文獻中都有 描述并且可以用于產生捕捉表面。FPW器件104被封裝成允許電連接到膜134的外表面上的電極138。另外， 通道塊142以機械方式支撐著FPW器件104，以允許膜134的內表面接觸測試 溶液，并且提供了一界面以便于傳感器表面143與液體樣品相接觸。通道塊142 產生一條路徑(流體室160)，以便讓測試溶液從輸入端口 118流入、穿過膜 134的內表面、再從出口 120出來。在FPW器件104和通道塊142之間形成了 密封144，以防止測試溶液從通道102中漏出，該通道102是在FPW器件104 和通道塊142的組合之內形成的。由此，通道塊142形成流體室，其中FPW器 件104包括多個內壁之一。通過FPW器件104和通道塊142的組合而構成的通道102直徑大約為0.5 mm。通道塊142可以由各種材料構成，其中包括塑料、金屬、或陶瓷和其它 材料。系統100包括一種或多種流體控制器件，用于改變系統100內的至少一種 流體特性，比如流速、壓力、或軌跡等。圖1A所示的泵122和閥門114都是 流體控制器件的示例，它們用于引導并控制各種測試溶液流過該器件并到達傳 感器表面143 (如執行測試方法所要求的那樣)。通常，流體控制器件改變器 件104的流體室160內的至少一個表面'附近的至少一種流體特性。通常，實現 這一點，以使磁性顆粒沿傳感器表面143的至少一部分分布。如上所述，在一 些實施方式中，流體控制器件是泵(比如，蠕動泵、離心泵、旋轉泵、電滲泵)。
在一些實施方式中，該泵定位于該流體室的入口側，在其它實施方式中，泵位 于流體室的出口處。在一些實施方式中，該器件是相對于流體室而設置的分流 器(比如塞子、阻塞物或擋板)，以改變流體室的至少一個內表面附近的流體 流。參照圖1A，單個泵122安置在FPW器件104的廢物一側。泵122產生的 吸力吸取來自FPW器件104的供給一側的各個存儲槽112中的緩沖液110或 樣品108中的分析物。閥門114安置在器件104的供給一側，以便控制在測試 方法中任何時刻要將哪種測試溶液引導至傳感器表面143上。泵122控制該測試的流速。用于調節溫度的器件(比如熱電冷卻器)可以與FPW器件104和通道塊 142相關聯。這通過使器件104保持在相對恒定的已知溫度下從而減小了可變 環境條件對FPW器件104輸出的影響。在備選實施方式中，溫度傳感器被包 括在系統100之內，例如，作為FPW器件104的一部分。基于溫度傳感器的 輸出，在特定的瞬間(或在一段時間內)調整來自FPW器件104的傳感器信 號，以便產生不受溫度變化效應影響的信號。這種調整可以是基于數學模型、 或分析模型、或數學和分析模型的某種混合組合而實現的。在系統IOO的一些實施方式中，在測試溶液的路徑中包括一過濾器以選擇 性地濾除特定尺寸的顆粒(比如磁性顆粒和生物材料)從而防止它們進入流體 室。作為示例，特定的測試方法可以包括在檢測期間變化過濾器的步驟。這將 允許在該檢測的不同部分期間將不同類型(即尺寸)的分析物和磁性顆粒引導 至流體室中，從而能由系統IOO對它們進行檢測。在一個實施方式中，其表面包被有捕捉劑的磁性顆粒(比如順磁性或超順 磁性珠或微球)與含分析物的樣品相混合。在規定的混合時間之后，得到分析 物-顆粒復合物146，同樣得到已結合非特異性材料的顆粒147以及沒有結合任 何物質的顆粒148。顆粒146、 147和148位于樣品存儲槽112之內。系統IOO還包括磁場感應結構150，用于在膜134附近產生磁通量。在圖 1A中，磁通量的源是一個可收縮的磁體150，通常被布置在FPW器件104的 膜134的附近。當磁體150在膜134附近時，磁體150在膜134附近產生顯著 的梯度磁場。在儀器/控制電子設備126的控制下，可收縮的磁體150可以從膜 134處往回縮了一段距離，該距離足以在相當大的程度上減小膜134附近的磁 場。在一個實施方式中，當接近膜134時，磁體150位于從膜134的傳感器表 面143起約200 pm處。在另一個實施方式中，當接近該膜時，磁體150位于 從膜134的傳感器表面143起約50 pm到100 pm處。當磁體150接近膜134時，磁體150提供了一個磁通量的源以便將磁性顆 粒從樣品吸到傳感器表面143。分析物-顆粒復合物146以及含有非特異性結合 物質的顆粒147和沒結合任何物質的顆粒148從液體樣品中移出，直到它們遇 到傳感器表面143。分析物與傳感器表面143上的捕捉劑相結合。由此，分析 物形成了磁性顆粒與傳感器表面之間的連接。磁場將含有非特異性結合物質的 顆粒147和沒結合任何物質的顆粒148保持在傳感器表面143處。另外，弱結 合力可以作用于顆粒"6、 147、 148與傳感器表面143之間。在上述方法的洗 滌步驟(下文會更詳細地描述)中，收縮磁體150以減小在傳感器表面143處 已累積的顆粒所感受到的磁力。增大洗滌流速，以除去沒有通過分析物結合到 上述表面的那些顆粒147和148。因為與分析物-顆粒復合物146相比含有非特 異性結合材料的顆粒147和沒結合任何物質的顆粒148與傳感器表面143的結 合較弱，所以以較低的洗滌流速(和相應的流體動力)使它們從傳感器表面143 處脫離。因此，使用移動磁體150 (即顯著減小傳感器表面143處的顆粒146、 147和148所感受到的磁力)，來區分含有分析物的顆粒146和那些不含有分 析物的顆粒(147和148)。 一種用于接合和收縮磁體150的技術是將它安裝 在由凸輪系統(未示出)致動的柱架(未示出)上。磁體150的材料、幾何形狀以及離傳感器表面143的距離共同決定了磁場 形狀和磁場梯度，因此，也決定了分析物-顆粒復合物146所感受到的力。用作 可收縮磁體150的高強度永久磁體是可買到的。例如，1 mm直徑圓柱形NdFeB 磁體可以從若干供應商(比如Dexter磁技術公司)處買到。在一個實施方式中， 當彼此接合時，直徑為1 mm且長度為5 mm的NdFeB磁體150位于傳感器表 面143的0.1 mm之內。當收縮時，磁體150離傳感器表面143至少有0.5 mm。 因為FPW器件104的膜134非常薄(2nm)并且由非磁性材料(比如硅、氮化鋁 或金)構成，所以膜134并不顯著擾亂器件104的傳感器表面143這一側的磁 場。結果，如高收集效率所必需的那樣，可以實現高強度磁場以及很大的磁場 梯度。通過通道102的樣品流速是由良好的收集效率所必需的停留時間決定的(比如由操作人員指定)。調節樣品流速，使得傳感器表面143上的平均速度 介于l到5mm/s之間。對于直徑約為3pm的氧化鐵順磁性顆粒，可以實現接 近50%的收集效率。可以使用磁通量的源150 (即磁體)的其它配置。例如，可以使用電磁體 來替代永久磁體。電磁體包括延伸的極片，可以將磁場通量聚焦到器件104的 傳感器表面143附近。或者，在傳感器表面143附近(0.1 mm之內)可以形成和安置可磁化材料， 并且單獨的磁體與可磁化材料的自由面相結合以便在可磁化材料中感應出磁 場。上述材料中所感應出的磁場用于使所期望的場梯度定位于傳感器表面143 附近。這樣，根據上述材料的形成，可以使用較大的低成本磁體，并且可以使 用單個磁體來解決多個傳感器。為此目的可使用的示例材料是純鐵、高u金屬(比如合金49，高鎳含量鐵)、sna硅鋼(通常含硅1-2%)。使用這種與磁體 結合的可磁化材料的好處是可以簡化傳感器配置，從而允許更低成本制造。可 以使用低精確度致動器來接合和收縮上述磁體，因為該磁體只需要接觸氧化鐵 磁芯或者只需要完全收縮。在上述實施方式中，磁體150位于傳感器表面143 附近，需要更高水平的精確度來實現良好的試驗可重復性。盡管使用本方法會 損失一些場強，但是仍也可能設計出整個系統來實現良好的捕獲效率(比如 >10%)。場感應結構(比如磁體或鐵磁材料)的尖端形狀可以調整成增強和/或集中 上述表面處的場梯度。因為FPW器件104的尺寸(比如0.3mmx 1.6mm)通 常小于按常規方法形成的磁體或機械加工的感應器，所以靠近膜134的場感應 結構的部分可以調整成使磁場集中到傳感器表面143上的一個或多個位置。調 整該尖端可增大局部場強和局部場梯度。例如，楔形尖端很適合于當前的FPW 器件幾何形狀。系統100的一個實施方式包括任選的第二磁通量源150a，它與第一磁通量 源150相對或部分相對。第二磁通量源150a驅逐一些粘附于傳感器表面143 的磁性顆粒。例如，它驅逐沒有結合任何分析物的磁性顆粒148;它們不會像 200680024299.8說明書第28/41頁已結合分析物的那些顆粒146那樣強烈地粘附于傳感器表面143。在一些實施 方式中，第一磁通量源150被關閉或從傳感器表面143處移開，然后，第二磁 通量源150a相對于流體室的上述至少一個表面而定位以選擇性地除去磁性顆 粒。例如，實現這一點可除去那些沒有結合任何分析物的磁性顆粒，因此，它 們不會強烈地結合到傳感器表面143。這將實現與增大流體流速相似的效果， 從而除去沒有結合任何分析物的磁性顆粒148。控制分析物-顆粒復合物146在器件104的表面143上的分布情況便可以改 善該器件的性能，因為器件104具有懸著的膜134并且并非膜134的所有部分 都均等地貢獻于可檢測的共振運動質量。例如，系統ioo可以構造并布置成使 分析物-顆粒復合物146沿膜134縱軸中心線的中間三分之二分布且處于FPW 器件104的寬度的三分之一之內。考慮到流體場效應，場感應結構(比如磁體 150)的尖端的形狀可以使得場幅值和場梯度在傳感器膜134上的流動方向上 不斷增大。即，與上游區域中的分析物-顆粒復合物146相比，下游區域(其中 邊緣層部分程度耗盡了分析物)中的分析物-顆粒復合物146經歷更高的場和場 梯度。通常，系統100可以被構造和布置成使磁性顆粒集中到傳感器表面143的 一個或多個特定區域中。在傳感器表面143上，器件104的響應可能是不均勻 的，這可能是制造材料的特征或傳感器設計的細節導致的。由此，器件104的 高靈敏度區域可以是不均勻的且關于器件104的長軸和短軸中心線不對稱。由 此，場感應結構的尖端可以定形成將磁性顆粒集中到最高靈敏度的區域中。對于給定的磁場分布，改變穿過器件104的流速也可以被用于實現分析物 -顆粒復合物146的更均勻覆蓋。對于給定的場，磁性顆粒按大量流體流速所確 定的那樣與傳感器表面143相互作用，很像是發射的物體在重力存在的情況下 可能下落。然而，在這種情況下，磁感應力占主導。通過改變流速，可以使分 析物-顆粒復合物146在沿流動方向的不同位置處與傳感器表面143相互作用。 此外，隨著磁性顆粒堆積(若它們將要接觸傳感器表面143，則不期望出現這 種情況)，可以使流動反向并且接下來再正向，以將該堆積拉回來，由此用傳 感器表面143傳送更多的顆粒。在系統100的一個實施方式中，通過在檢測方 法中選擇性地改變磁通量源以及沿傳感器表面143的流體流動性質中的一種或38 多種，便實現了使磁性顆粒選擇性地沿傳感器表面143定位。系統100的一個實施方式包括一種用于刻畫附著于或被吸引至傳感器表面143上的磁性顆粒的至少一種性質的器件(比如光學的或磁學的)。該器件可 以是FPW器件104整體的一部分，或者它可以是磁體150的一部分，或者它 可以是與系統100的其它組件相分開的分立組件。這種器件可以被用于檢測上 述顆粒的存在性，也用于確定與這些顆粒有關的參數(例如，被吸引至傳感器 表面143的顆粒的尺寸、數量、濃度、或密度)。系統100的一個實施方式包括標識器件，從而允許操作人員或計算機標識 系統IOO或該系統的特定組件以便跟蹤該系統或組件的使用情況。標識器件可 以包括符號或圖像(比如條形碼)、標識號、或其它標識標記。該標識器件可 以包括一個實際的無源或有源組件(比如RFID標簽、集成電路、或本領域已 知的其它組件)以便提供標識信息。許多這種器件都是本領域已知的，盡管任 何預想到的標識器件都是可以使用的。圖3示出了聯用FPW器件104與分析物-顆粒復合物146從而檢測生物分 析物的通用檢測方法200。檢測方法200的第一步202是獲取并準備分析物樣品。根據待測分析物的 特定類型，需要在測試之前先執行各種準備過程。例如，為了檢測食品中的微 生物(比如絞細的牛肉中的大腸桿菌)，先將樣品與濃縮的肉湯混合，再經消 化(stomach)、培育和過濾。對于檢測血液中的蛋白質，樣品將首先經過濾或離 心并且分離出血清。本文描述了包括樣品準備步驟的測試方法的特定示例。檢測過程的下一步204是將親和性包被的順磁性顆粒(即珠子)與已準備 好的分析物樣品相混和。順磁性或超順磁性顆粒可以從許多供貨商(比如挪威 Oslo的Dynal生物技術公司)處買到。典型的直徑是從50 nm到10 pm，并且 這種顆粒可以預先獲得，其上已經包被有靶向各種分析物(比如細胞、蛋白質 和核酸)的親和試劑(比如抗體、蛋白質和核酸探針)。或者，可以購買具有 各種反應化學基團(環氧的、羧基和胺)的顆粒，以便結合所選擇的捕捉劑。 標準生化方法可用于該目的。攪拌樣品和添加的順磁性顆粒(206)，攪拌時間量由具體分析物和捕捉劑 確定。在該過程中，這些顆粒與分析物結合，使得分析物被捕獲到這些顆粒上。
在一些情況下，此時可以直接測試該樣品。但在其它情況下，最好執行分離步驟208，以使結合顆粒的分析物與原始樣品的其余成分分離。這些分離步驟208減小了試驗中其它生物材料的干擾。用于執行這種分離步驟的手動或自動裝備是可以買到的(比如Dexter磁技術公司、Dynal生物技術公司)。上述基本過 程使用磁體將順磁性顆粒定位于一表面上，使得樣品液體的大部分都可以被吸 出。然后，撤去磁體(比如圖1A的磁體150)，并且加入清潔的緩沖液以使顆 粒重新懸浮。在一個實施方式中，在用FPW器件104來測試經處理的分析物樣品之前， 先執行基線步驟210。在基線步驟210中，參比溶液106流過該系統以沖洗/封 閉傳感器104，并且儀器/控制電子設備126啟動器件104并且記錄來自器件104 的初始基線信號。在基線步驟210之后，是樣品傳輸步驟212。在接合磁體150的情況下， 含分析物-顆粒復合物146的樣品108在傳感器表面143上流動。分析物-顆粒 復合物146被收集到傳感器表面143上。在規定體積的樣品108已流過該器件 104之后，收縮磁體150以使沒結合分析物的顆粒147和148從傳感器表面143 處剝離，并且將流體切換到洗滌溶液(比如緩沖溶液110)。增大洗滌溶液的 流速，以幫助除去松散結合的顆粒147和148以及樣品中可能己結合到傳感器 表面143的其它物質。在樣品傳輸步驟212之后，是獲取步驟214。參比溶液106再次穿過器件 104，并且儀器/控制電子設備126啟動器件104以獲取并記錄來自器件104的 最終基線信號。通過比較初始基線信號和最終基線信號(它們分別對應于獲取步驟214之 前和之后在參比溶液中FPW器件104的振動特征)，系統100確定了在傳輸 步驟212期間傳感器表面143上所累積的分析物量。結合到傳感器表面143的 分析物-顆粒復合物146改變了 FPW器件104的振動特征，并且振動特征量的 變化對應于結合到傳感器表面143的分析物-顆粒復合物的量。圖4示出了對于典型的檢測方法來自多個FPW器件104的信號隨時間的 變化。正方形符號對應于接觸分析物的器件104;三角形和星形對應于負的控 制(其中在珠子上沒有分析物)。圖4 (和下文所描述的圖5)所示數據代表
了典型的檢測方法，該方法適用的分析物是大腸桿菌或通常是細胞分析物。在特定的試驗中，諧振峰的頻率被跟蹤。圖4示出了隨著磁性顆粒146、 147和148在上述表面上累積，FPW器件104的諧振頻率在減小。 一旦除去磁 體150并且一些磁性顆粒被沖掉，則器件104的頻率會增大。最終，該系統建 立最終基線，可以將該最終基線與檢測開始時的或對照的最初基線進行比較。圖5是示出了檢測到的作為最初分析物濃度函數的最終信號變化的概要圖。在使用上述系統100的情況下，可以使用其它檢測方法。根據特定應用或 分析物的各種要求，可以取消或添加一些個別的步驟。例如，圖6示出了用于 檢測方法的時間演變圖，與圖4所示的相似。然而，圖6描繪了用于PSA試驗 的檢測方法，它證明了系統100能夠檢測蛋白質。此外，在該方法中，可以使 流動方向反向。例如，使流動方向反向可以用于從該器件上洗滌掉非特異性結 合的物質，或者更有效地使用所得到的樣品。該檢測方法的另一個變體包括交替進行洗滌步驟和結合步驟。這可以允許 更好地使用該器件的動態范圍，在一些情況下，上述顆粒中的很大一部分沒有 結合分析物，尤其是在分析物濃度較低時。通過重復地結合和洗滌顆粒，也可 能累積更多的分析物-顆粒復合物146，由此改進該測量的靈敏度。在傳輸步驟212期間改變或操縱傳感器表面143處的磁場分布可以增大結 合有分析物的特定顆粒遇到傳感器表面143的幾率。例如，如果在結合期間交 替改變磁場的空間分布，則也可能使傳感器表面143處的順磁性顆粒滾動。在 一些實施方式中，通過控制磁場的空間分布，操作人員或儀器/控制電子設備 126可以用于控制順磁性顆粒沿傳感器表面143的滾動。如上所述，將第二磁場(即第二磁通量源)引入系統100中便可以改善對 試驗條件的控制并且增大試驗的特異性。例如，在如上所述的方法的結合或洗 滌步驟中，向傳感器表面143施加第二磁場便可以使弱結合的磁性顆粒脫離。 第二磁場的強度可以被調整成在傳感器表面143處的分析物-顆粒復合物146上 產生作用力，該作用力低于特異性結合分析物的結合力但高于非特異性結合物 質的典型結合力。在試驗中可以使上述步驟順序重復多次以進一步增大該檢測 的特異性。通過在洗滌步驟中增大(連續地或分立地)該磁作用力，同時監控FPW
器件104的響應，便可以確定各種分析物-顆粒復合物146在傳感器表面143上 的相對結合強度。關于相對結合強度的信息可以用于在樣品108中的不同分析 物之間進行區分。在其它實施方式中，樣品與器件104相互作用的特定方式可以是不同的。 在上述實施方式中，系統100使樣品流過通道以便在分析物-顆粒復合物146和 傳感器表面143之間建立接觸。在系統100的備選變體中，FPW器件104被安 裝在探頭上并且至少部分地浸入測試溶液，該測試溶液包含結合到分析物的磁 性顆粒。對于本實施方式，浸入過程足以將經結合的磁性顆粒置于傳感器表面 143附近，使得朝著傳感器表面143吸引這些顆粒并接下來檢測它們。為了獲 得基線信號，器件104 (或柱盒103)被浸入參比測試溶液中，在一些實施方 式中，器件104的一部分(比如膜134)被安裝到探頭上。此外，只有膜134 的傳感器表面143的一部分才與上述含結合到分析物的磁性顆粒的溶液相接 觸。在這些實施方式中，上述探頭在流體中的浸入或受控移動已足以將經結合 的磁性顆粒置于傳感器表面143附近，使得朝著傳感器表面143吸引這些顆粒 并且接下來檢測它們。系統100的另一個備選實施方式涉及將上述器件104安裝到一管子內部， 可以將該管子部分浸入一容納樣品108的孔中并且接下來收縮。當浸入樣品時， 泵施加吸力以將樣品吸入上述管子中并吸到傳感器表面143 (或柱盒103)上。 然后，通過使泵逆轉或者簡單地使管子排空，便使樣品回注入該孔中。這種吸 收和釋放樣品的循環可以重復，從而能增大收集效率并因此改善試驗的性能。對于上述系統IOO的一個實施方式，以下實施例說明了準備并利用系統IOO 來檢測分析物的諸多步驟。實麗實施例I:捕捉劑功能化柔性板波器件表面的通用方法1. 將金沉積到柔性板波器件104的表面(例如，傳感器表面143)，用例如 氧等離子清潔該金表面143。2. 金表面143的理想表面化學(特性)應能提供l)防止非特異性結合和2) 位于該表面上用于共價結合捕捉劑的反應活性基團。金表面143的示范性表面 化學(特性)是烷硫醇的自裝配單層(SAM)。可用兩種垸硫醇的混合物形成SAM;一個末端含有反應活性基團用于隨后與捕捉劑共價相連， 一個末端含有非反應活性基團。例如，為此目的可使用末端為Cn-烷硫醇的EG6-OCH2COOH (EG6) 和EG3-OH (EG3)的混合物。在一個實施方式中，柔性板波器件104(具體來說 是器件104的表面143)與垸硫醇溶液接觸，室溫培育，例如約16小時。然后 用乙醇清洗該柔性板波器件104的表面143,用氮氣吹干。3.下一步驟包括將捕捉劑或分析物共價連接于該柔性板波器件104的表 面143。可采用許多方法共價連接捕捉劑或分析物。 一種示范性方法包括將生 物素接頭部分共價連接于SAM，然后通過鏈霉親和素連接層使生物素化抗體或 分析物結合于柔性板波器件表面143。實施例II:采用，例如圖3所示方法檢測絞細牛肉中的大腸桿菌0157:H7 (圖5包含代表各種濃度大腸桿菌的數據)1. 制備含有濃度高于約100cfu/ml的大腸桿菌O157:H7分析物樣品。2. 進行免疫磁性分離濃縮該分析物樣品溶液。可利用各種商品化儀器(例 如，模型顯微科學公司(Matrix Microsciences)的Pathatrix和Dynal生物技術公 司(Dynal Biotech)的Bead Retriever)或手工方法進行該免疫磁性分離。示范性手 工方法包括a. 重懸包被有大腸桿菌抗體的磁珠(例如，購自Dynal生物技術的 Dynabeads公司抗-大腸桿菌0157)直至沉淀在試管底部的磁珠分散。將微量離 心管置于磁板架上(例如，Dynal MPC-S)。將1-20 磁珠儲備液吸入該試管(根 據所需的最終珠濃度選擇磁珠儲備液體積)。b. 將lmL分析物樣品加入磁板架中的試管，關閉該試管。c. 倒轉架子數次。室溫培育試管中的溶液10-60分鐘，同時連續輕柔攪拌 以防磁珠沉降。d. 倒轉架子數次從而使磁珠聚集在試管一側而形成沉淀物。適當回收約3 分鐘。e. 打開試管，小心吸取并棄去樣品上清液以及試管蓋中的液體。f. 移去磁板。
g. 向試管中加入l mL洗滌緩沖液(PBS-吐溫)。關閉試管蓋，倒轉架子數 次使珠重懸。h. 重復步驟d-g兩次。i. 利用渦流混合器(vortex mixer)簡單混合試管的內含物。 3,檢測大腸桿菌0157:H7a. 用大腸桿菌0157:H7抗體功能化(與A.3和A.4的步驟所述相似)柔性板 波器件104的表面143。b. 將第一入口軟管置于含標準洗滌緩沖液(含0.05%吐溫20的1XPBS)的 試管中，將第二入口軟管置于含結合了大腸桿菌0157:H7的磁珠(B.2制備)的 試管中。用t-接頭連接第一和第二入口軟管，從而使此兩軟管流體相連，第一 入口軟管或第二入口軟管中的流體可引入流體室160的入口。兩個軟管各裝有閥門來允許或限制流體經各自軟管流動。c. 使第一出口軟管與流體室160的出口流體相連。將第一出口軟管的流體 收集入廢液收集瓶。d. 利用柔性板波器件獲得基線輸出信號。以標準泵速(例如，200)iL/分鐘) 使標準洗滌緩沖液流入和流出流體室160約5分鐘來檢測基線信號。e. 接合磁通量150的第一源，然后將含分析物的試管中的流體引入流體室 160的入口。將流體引入流體室160的入口，從而能在柔性板波器件160的至 少一個表面143上累積結合有大腸桿菌0157:H7的磁珠，直至該至少一個表面 143上結合了所需數量。在一個實施方式中，當例如柔性板波器件104的輸出 頻率漂移(frequency shift)約為4000 ppm時，達到所需數量。f. 然后中止含分析物試管的流體流動。然后將洗滌緩沖液試管的流體引入 流體室160以洗去非特異性結合的物質(即，除l)磁珠和2)結合有分析物的磁 珠以外的物質)。g. 然后撤去磁通量150的第一源。h. 啟動自動洗滌方案以除去任何磁珠或基質組分。i. 然后檢測柔性板波器件104的最終信號輸出。將基線信號與最終信號相 比確定分析物樣品中大腸桿菌0157:H7的濃度。
實施例III:采用，例如圖3所示方法步驟檢測人血清中的前列腺特異性 抗原(PSA)1. 制備通過離心人血樣品獲得的含人血清分析物樣品。2. 進行免疫磁性分離濃縮該分析物樣品溶液。可利用各種商品化儀器(例 如，模型顯微科學公司的Pathatrix和Dynal生物技術公司的Bead Retriever)或 手工方法進行該免疫磁性分離。示范性手工方法包括a. 重懸包被有PSA抗體的磁珠(例如，購自動力生物技術公司的Dynabeads 抗-PSA)直至沉淀在試管底部的磁珠分散。將微量離心管置于磁板架上(例如， Dynal MPC-S)。將1-20 磁珠儲備液吸入該試管(根據所需的最終珠濃度選擇 磁珠儲備液體積)。b. 將lmL分析物樣品加入磁板架中的試管，關閉該試管。c. 倒轉架子數次。室溫培育試管中的溶液10-60分鐘，同時連續輕柔攪拌 以防磁珠沉降。d. 倒轉架子數次從而將磁珠聚集在試管一側形成沉淀物。適當回收約3 分鐘。e. 打開試管，小心吸取并棄去樣品上清液以及試管蓋中的殘余液體。f. 移去磁板。g. 向試管中加入l mL洗滌緩沖液(PBS-吐溫)。關閉試管蓋，倒轉架子數 次使珠重懸。h. 重復步驟d-g兩次。i. 利用渦流混合器簡單混合試管的內含物。3. 檢測PSAa. 用PSA抗體功能化(與A.3和A.4的步驟所述相似)柔性板波器件104的 表面143。b. 將第一入口軟管置于含標準洗滌緩沖液(含0.05%吐溫20的IXPBS)的 試管中，將第二入口軟管置于含結合了 PSA的磁珠(B.2制備)的試管中。用t-接頭連接第一和第二入口軟管，從而使此兩根軟管流體相連，第一入口軟管或 第二入口軟管中的流體可引入流體室160的入口。兩個軟管各裝有閥門來允許 或限制流體經各自軟管流動。C.使第一出口軟管與流體室160的出口流體相連。將第一出口軟管的流體 收集入廢液收集瓶。d. 利用柔性板波器件104獲得基線輸出信號。以標準泵速(例如，200 ^L/ 分鐘)使標準洗滌緩沖液流入和流出流體室160約5分鐘來檢測基線信號。e. 接合磁通量150的第一源，然后將含分析物試管中的流體引入流體室 160的入口。將流體引入流體室160的入口，從而能在柔性板波器件104的至 少一個表面143上累積結合了 PSA的磁珠，直至該至少一個表面143上結合了 所需數量。在一個實施方式中，當例如柔性板波器件104的輸出頻率漂移約為 4000ppm時，達到所需數量。f. 然后中止含分析物試管的流體流動。然后將洗滌緩沖液試管的流體引入 流體室160以洗去非特異性結合的物質(g卩，除l)磁珠和2)結合有分析物的磁 珠以外的物質)。g. 然后撤去磁通量150的第一源。h. 啟動自動洗滌方案以除去任何磁珠或基質組分。i. 然后檢測柔性板波器件104的最終信號輸出。將基線信號與最終信號相 比確定分析物樣品中PSA的濃度。實施例IV:校驗液I中的PSA(PSA in Calibrator I)為了說明，根據本發明原理利用圖1A所示系統100進行實驗以獲得數據。 將用抗-前列腺特異性抗原(PSA)捕捉抗體(PN 90205，斯克利普斯實驗室公司 (Scripps Laboratories Inc.)圣迭戈辦事處，加利福尼亞州)功能化的Dynal甲苯磺 酰基-活化的超順磁珠與樣品接觸。樣品含有1 X PBS (磷酸緩沖鹽水)和1% 牛血清白蛋白(BSA)，摻加了約0 pg/mL、 10 pg/mL、 100 pg/mL和500 pg/mL 游離PSA [菲茨杰拉德工業國際公司(Fitzgerald Industries International, Inc.), Concord辦事處，馬薩諸塞州]。該實驗中，對于樣品所用的珠濃度約為2 X 104 珠/mL。與珠一起培育的摻加樣品輕柔連續攪拌1小時。先用含0.05%吐溫20(聚乙二醇脫水山梨醇單月桂酸酯)的IXPBS[西格馬-奧爾德里奇公司(Sigma-AldrichCo.)，圣路易斯辦事處，MO]初步致敏裝在柱盒 沐顯示)中一個芯片上的8個圖2所示柔性板波(FPW)器件104，再用互補性抗 -PSA抗體(PN 90197，斯克利普斯實驗室公司，圣迭戈辦事處，加利福尼亞州) 功能化。如2006年5月2日由Masters等提交的名為"試驗檢測的方法和設備"的 美國專利申請(代理人案件號BIO-008)所述獲得和分析數據。作出約17800秒 的8種單頻率的基線檢測值(類似于本文上述的)，各對應于追蹤的傳感器相位， 各自與參比信號有關。對于各器件，首先選擇該器件共振波段內的追蹤相位 (trackingphase),該波段位于響應幅度接近峰值和相位響應(phaseresponse)對于 頻率變化具有明顯線性范圍的頻率附近。當追蹤各時間點的傳感器相位時，通 過以下手段發現各器件追蹤頻率1)掃描各器件的頻率范圍并記錄各激發頻率 相對于參比信號的響應的相位，2)擬合激發頻率相關函數來檢測各器件的相 位，和3)利用該函數來計算對應于以前測定的追蹤相位的追蹤頻率。該實施方式在接近20MHz操作這些器件，掃描范圍約為20kHz。該范圍 的相位特征基本上是線性的，因而擬合的函數是線性。各器件的參比信號包括 由激發(頻率)同時驅動的被動電組件、電阻器和電容器構成網絡的輸出值。選 擇該參比網絡可匹配衰減作用，為各器件提供接近共振的優選相位漂移。基線 頻率參考追蹤頻率并根據追蹤頻率標準化，以所選擇時間點的百萬分之幾(ppm) 表示。用捕捉劑功能化各器件104的傳感表面143。用氧等離子源清潔金包被的 芯片，其典型的處理條件是約50 W,約2分鐘。隨后將芯片浸在純乙醇中30 分鐘。然后將芯片移至0.5 mM生物素PEG 二硫化物的乙醇溶液(目錄號 41151-0895，聚合純公司(PolypureAS)，奧斯陸辦事處，挪威)，培育過夜。將 芯片轉移回純乙醇溶液，30分鐘。最后用乙醇簡單清洗芯片，氮氣吹干。可改 變制備條件而仍能得到相似結果。使10 pg/ml中性親和素溶液流過器件104所產生的生物素化表面1小時， 從而用中性親和素(PN 31000，皮爾斯生物技術公司(Pierce Biotechnology, Inc.), Rockford辦事處，IL)包被該生物素化表面。根據生產商的使用說明書生 物素化抗體(PN F-6347,英杰生命技術公司(Invitrogen Co卬oration)， Carlsbad 辦事處，加利福尼亞州)，然后使生物素化抗體的5pg/ml溶液(用1 X PBS 0.1% BSA緩沖液稀釋)流過中性親和素包被表面1小時，從而與中性親和素化的表
面偶聯。引入PSA樣品，同時在接近傳感器表面143處產生約17900-約18200秒 的磁場。向兩種不同的器件104(總共8個器件)提供約0pg/mL、 10pg/mL、 100 pg/mL和500 pg/mL游離PSA的各樣品。樣品以約100 ^L/分鐘流過傳感器， 流過傳感器的總樣品運作/體積為500 nL。以此方式將包被了游離PSA的Dynal 甲苯磺酰基-活化的超順磁珠結合于器件104的實質表面(表面143)。各珠通過 多根鍵與器件104的表面143結合。多根鍵的每一根產生的結合力不同，各與 該器件的表面結合。對于每份樣品，珠系統的締合與解離特征確定了該樣品中 分析物的濃度。在約18200秒用致敏緩沖液(l X PBS， 0.05%吐溫20(聚乙二醇脫水山梨 醇單月桂酸酯))替代樣品。如圖ll所示，從18200秒-18400秒觀察到各信號中 有變化(見位置30)，該變化代表了與樣品流體轉換回緩沖液流體有關的流體整 體特性變化。在約18400秒撤去磁場。在約18200秒-18400秒之間的緩沖液流 體(含0.05%吐溫20的1 X PBS)流速是約50 ^L/分鐘(對應于傳感器表面143 處約1.5 mm/秒的流速)。在隨后的450秒中(約18400秒-18850秒)，流速以線性增量從約50 pL/分 鐘增加至約300 ^L/分鐘(流速每30秒增加約17 ^L/分鐘，共450秒，然后降低 至約50!iL/分鐘)。以此方式，通過提高約18400-約18850秒之間的流速對各珠 施加受控的外部影響(S卩，本實施方式中的流速)。這些曲線在約18400-約18850 秒之間的部分所代表的信號表示在該時間內與傳感器表面143結合的珠(和其 它非特異性物質)的數量有變化。圖11是獲得的數據與時間的關系圖。該圖的Y-軸是器件104在接近器件 104共振的追蹤傳感器相位處產生的信號輸出的相對幅度變化(以百萬分之一 計)。該圖的X-軸是以秒計的時間。該圖的追蹤頻率變化參考了所選擇時間點 的追蹤頻率并按照該追蹤頻率標準化。按照該曲線在約18350秒的數值并參考引入樣品流體之前檢測的基線頻率 進一步標準化以追蹤頻率的百萬分之一計的各曲線數據。因此，與引入樣品時 相比，將各數據曲線按約18350秒時的數值為100%成比例縮放。然后整合在 約18400秒時撤去磁場后的450秒期間(從約18400秒-約18850秒)各標準化曲
線的相關數據。通過累加各器件的信號水平(各間隔水平乘以各間隔時間)并將最終的總和 除以獲得總和的時間進行整合。這能提供與器件表面143結合的物質元件(珠) 經時間標準化后的數量，在本文中這些數值顯示是各樣品的相關分析物濃度的檢測值。以此方式，可根據在約18400秒-約18850秒期間與各器件104的表面 143結合的物質元件數量變化來測定分析物的濃度。如圖ll所示，在樣品引入 系統后不到約9分鐘內檢測到約10pg/mL游離的PSA。在一些實施方式中，省去了一些數據點，例如曲線中觀察到正常偏差以外 的數據點。例如，與毗鄰數據點相比，隨后的分析刪去了數值變化超過一個數 量級的偽數據點。例如，可由操作者或計算機程序除去數據中的這些數據點。實施例V:血清雌二醇的競爭性試驗采用標準方法將游離雌二醇特異性綿羊單克隆抗體偶聯于Dynal M280-甲 苯磺酰基活化珠。如上所述，通過將二硫化物-PEG-生物素與金傳感器表面偶聯，然后偶聯 中鏈親和素(Pierce PN 31000)和生物素化抗體來構建傳感器表面。使1XPBS緩沖液稀釋的10嗎/mL BSA偶聯的雌二醇流過抗體表面1小 時，從而將BSA偶聯的雌二醇，E2-6-CMO-BSA (Sigma PNE5630)偶聯于抗體 表面。由于雌二醇偶聯于BSA上多個胺基位點(每摩爾BSA偶聯30摩爾雌二 醇)，上述方法能在溶液中提供中等密度的小分子表面。制備含有70。/。活性碳處理的(charcoal striped)人血清(德克薩斯生物制品 公司(Texas Biologicals))、 30% 1 X PBS、 0.05%吐溫20 (聚乙二醇脫水山梨醇 單月桂酸酯)的樣品溶液，其中摻加了Opg/ml、 10pg/ml、 30pg/ml、 200 pg/ml 的游離雌二醇(西格馬)。將濃度約2Vml的珠與樣品培育2小時。然后采用常規 方案使各珠流過FPW，在約0.5小時獲得結果。在一些樣品中，還加入了達那唑作為解復合拮抗劑以分離任何干擾性分子 (例如性激素結合蛋白)與雌二醇。加入約10-100 ng/ml的水平。接合磁場的同時使樣品以70 ^L/分鐘流過FPW，各珠積累在傳感器表面。 將結合的珠從傳感器上洗下所用的洗滌方案開始時為50 pL/分鐘，結束時為500 HL/分鐘，每30秒增加50 nL/分鐘。按照獲得標準信號的接觸程度(exposure level) 標準化FPW信號并整合洗滌期間的這些信號。如圖12所示，在拮抗性添加劑 36存在下，可以檢測低于10pg/mL，在沒有拮抗性添加劑34存在下可以檢測 低于50pg/mL。如圖12所示，檢測到1,000 pg/mL-10pg/mL濃度的雌二醇。實施例VI: FK506的競爭性試驗1. 將FK-506加入2 ml緩沖液(0.05% 1 X PBS吐溫20，含有1% BSA) 產生FK506濃度為0、 0.5、 2.0和20ng/ml的分析物樣品。2. 將上述制備的8 pl 1 X 10々ml抗-FK-506 IgM包被珠加入各樣品中， 室溫培育30-60分鐘。按照生產商的使用說明書(英杰生命技術公司)將抗-FK506 IgM(菲茨杰拉德工業公司)與順磁珠偶聯來制備各珠。如上所述濃縮分析物樣品 溶液。3. 將含有用FK-506(戴索林公司(Diasorin Inc.))標記的載體(HRP)的500 pl 溶液加入樣品中，室溫培育60分鐘。4. 用FPW器件分析這些樣品，該器件的傳感器已用捕捉劑(抗-KF-506 IgM) 功能化。參考圖10，如上所述，用中性親和素30功能化傳感器12，采用標準 生物素化方法生物素化抗-FK-506 32。如圖10中的B圖所示，將分析物IO(在 本例中是FK-506)與競爭分子24和用捕捉劑14(在本例中是抗-FK-506抗體)標 記的顆粒16混合。對于本實施例，競爭分子24包含用分析物FK-506標記的 載體HRP。如C和D圖所示，預計樣品中FK-506濃度較低能使顆粒與競爭分 子結合，從而與傳感器表面結合。預計較高水平的FK-506能導致與傳感表面 結合的顆粒較少，因為更多的顆粒會與樣品中的FK-506結合。如圖13和14 所示，樣品引入系統后，最少可在15分鐘內檢測0.5ng/ml-20ng/ml濃度范圍 的FK-506。實施例VII:經處理的人全血基質中FK-506的競爭性試驗1.給四份100 pl血液樣品摻加0、 3、 10或30ng/mlFK-506。按照生產商 使用說明書(戴索林公司)實施蛋白質消化方法從血液基質中提取藥物。
2. 向各樣品中加入600微升蛋白質消化試劑。
3. 旋振(vortex)混合樣品，室溫(約23"C)培育15分鐘，得到半透明的混合物。
4. 75'C培育樣品35分鐘以終止消化反應，得到暗棕色混合物。
5. 旋振混合樣品，以1800 g離心IO分鐘，得到500-600 nl上清液。
6. 將500微升上清液轉移入新的試管中，(含)相同濃度FK-560的四份樣 品合并在一個試管中，得到各種濃度FK-506的2ml上清液。
7. 如上所述分析樣品。如圖15和16所示，將樣品引入器件后，最快可在 8分鐘內檢測0.5 ng/ml-20 ng/ml濃度范圍的FK-506。本發明可體現為其它具體形式而不脫離其構思或基本特征。因此，應認為 這些實施方式是說明性而非限制性的，本發明的范圍由附加的權利要求書體現 而不是以上敘述，因此該權利要求書應包括與這些權利要求等價的含意和范圍 相伴的所有變化。
權利要求
1.一種檢測樣品中是否存在一種或多種分析物的方法，包括a)將多個包被有捕捉劑的磁性顆粒引入流體室，其中該流體室的至少一個表面裝有結合了第一分析物的聲學器件；b)在該聲學器件附近產生磁通量以將多個磁性顆粒的至少一個引向所述表面；和c)監測所述聲學器件產生的信號輸出，從而檢測了樣品中是否存在一種或多種分析物。
2. 如權利要求1所述的方法
3. 如權利要求1所述的方法
4. 如權利要求1所述的方法 信號作比較。
5. 如權利要求1所述的方法 再引入所述流體室。
6. 如權利要求l所述的方法 引入多個顆粒。
7. 如權利要求1所述的方法
8. 如權利要求6所述的方法 構成的組唾液、痰、腦脊液、血液、血清、血漿、尿液和活檢材料。
9. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述對照信號是標準曲線。
10. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，在沒有樣品存在下獲得所述 對照信號。
11. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，通過以下步驟獲得所述對照 信號a) 將第二份多個包被有捕捉劑的磁性顆粒引入流體室，其中該流體室的至 少一個表面裝有結合了第二分析物的聲學器件；b) 在該聲學器件附近產生磁通量以將第二份多個磁性顆粒的至少一個引 向所述表面；和，其特征在于，所述聲學器件是柔性板波器件。 ，其特征在于，在步驟c)前撤去所述磁通量。 ，其特征在于，還包括將c)的信號輸出與對照，其特征在于，先使多個磁性顆粒與樣品接觸，，其特征在于，先將樣品引入所述流體室，再，其特征在于，所述樣品是生物學樣品。，其特征在于，所述生物學樣品選自以下材料C)監測所述聲學器件產生的信號輸出。
12. 如權利要求ll所述的方法，其特征在于，所述第一和第二分析物具有 相同的化學結構。
13. 如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述第一/第二分析物是較大分子的一部分。
14. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物間接結合于所述表面。
15. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述表面包被有結合對的第 一成員，所述分析物與該結合對的第二成員結合。
16. 如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述結合對選自生物素/親 和素、生物素/鏈霉親和素和生物素/中性親和素。
17. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述捕捉劑是抗體。
18. —種檢測樣品中是否存在一種或多種分析物的方法，包括a) 將多個磁性顆粒和競爭分子引入流體室，所述磁性顆粒包被有能結合分 析物的捕捉劑，其中該流體室的至少一個表面裝有包被了能結合競爭分子的第 二捕捉劑的聲學器件；b) 在該聲學器件附近產生磁通量以將所述多個磁性顆粒的至少一個引向 所述表面；禾口c) 監測所述聲學器件產生的信號輸出，從而檢測樣品中是否存在一種或多 種分析物。
19. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，先使所述多個磁珠與樣品和 競爭分子接觸，再引入所述流體室。
20. 如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述競爭分子包含與標簽結 合的分析物，所述第二捕捉劑能結合該標簽。
21. 如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述標簽是生物素。
22. 如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述競爭分子包含與載體結 合的兩個或多個分析物分子，所述第二捕捉劑能結合該分析物。
23. 如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述載體選自辣根過氧化物 酶和白蛋白。
24. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，先將樣品和競爭分子引入流 體室，再引入多個顆粒。
25. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述樣品是生物學樣品。
26. 如權利要求25所述的方法，其特征在于，所述生物學樣品選自唾液、 痰、腦脊液、血液、血清、血漿、尿液和活檢材料。
27. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，還包括將c)的信號輸出與對 照信號作比較。
28. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述對照信號是標準曲線。
29. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，在沒有樣品存在下獲得所述 對照信號。
30. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述捕捉劑間接結合于所述 表面。
31. 如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述表面包被有結合對的第 一成員，所述捕捉劑與該結合對的第二成員結合。
32. 如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述結合對選自生物素/親 和素、生物素/鏈霉親和素和生物素/中性親和素。
33. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述捕捉劑是抗體。
34. —種確定是否要調整個體藥物劑量的方法，包括a) 檢測樣品中一種或多種分析物的水平，包括i) 將樣品和多個包被有捕捉劑的磁性顆粒引入流體室，其中該流體室的 至少一個表面裝有結合了第一分析物的聲學器件；ii) 在該聲學器件附近產生磁通量以將多個磁性顆粒的至少一個引向所 述表面；和iii) 監測所述聲學器件產生的信號輸出，從而檢測樣品中一種或多種分 析物的水平，和b) 根據樣品中一種或多種分析物的水平確定是否要調整藥物劑量。
35. —種檢測能結合捕捉劑的分析物的方法，包括a)將多個顆粒引入流體室，其中所述多個顆粒包被有不同分析物，其中該 流體室的至少一個表面裝有結合了捕捉劑的聲學器件；和 b)監測所述聲學器件產生的信號輸出。
36. 如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述聲學器件是柔性板波器件。
37. 如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述多個顆粒是磁性的，所 述方法還包括在所述聲學器件附近產生磁通量以將多個顆粒的至少一個引向 所述表面。
38. 如權利要求35所述的方法，其特征在于，還包括制備所述多個顆粒， 包括使顆粒與一群分析物接觸，從而用不同分析物包被所述多個顆粒。
39. 如權利要求35所述的方法，其特征在于，還包括制備所述多個顆粒， 包括在所述顆粒的表面上合成分析物。
40. —種檢測樣品中雌二醇的方法，該方法包括以下步驟a) 將包被有能結合雌二醇的捕捉劑的多個顆粒引入流體室，其中該流體室 的至少一個表面裝有結合了雌二醇的聲學器件；和b) 監測所述聲學器件產生的信號輸出，從而檢測了樣品中的雌二醇。
41. 如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述聲學器件是柔性板波器件。
42. 如權利要求40所述的方法，其特征在于，與參比相比，雌二醇水平增 加表明個體患乳腺癌的可能性增加。
43. 如權利要求40所述的方法，其特征在于，先使所述多個顆粒與樣品接 觸，再引入流體室。
44. 如權利要求40所述的方法，其特征在于，先將所述樣品引入流體室， 再引入多個顆粒。
45. 如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述顆粒是磁性的，所述方 法還包括在所述聲學器件附近產生磁通量以將多個磁性顆粒的至少一個引向 所述至少一個表面。
46. 如權利要求45所述的方法，其特征在于，在步驟b)之前撤去磁通量。
47. 如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述樣品中雌二醇的濃度約 為10pg/ml。
48. 如權利要求40所述的方法，其特征在于，雌二醇選自游離雌二醇、與 性激素結合球蛋白(SHBG)結合的雌二醇、雌酮-3-葡糖苷酸和雌二醇-3-葡糖苷酸。
49. 如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述樣品選自血液、血清、 血槳、尿液、唾液和活檢材料。
50. 如權利要求40所述的方法，其特征在于，還包括比較b)的信號輸出與 對照信號。
51. 如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述對照信號是標準曲線。
52. 如權利要求50所述的方法，其特征在于，在沒有樣品存在下獲得所述 對照信號。
53. 如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述雌二醇間接結合于所述 表面。
54..如權利要求53所述的方法，其特征在于，所述表面包被有結合對的第 一成員，所述雌二醇與該結合對的第二成員結合。
55. 如權利要求54所述的方法，其特征在于，所述結合配對選自生物素/ 親和素、生物素/鏈霉親和素和生物素/中性親和素。
56. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述捕捉劑是抗體。
57. —種檢測樣品中雌二醇的方法，該方法包括以下步驟a) 將多個顆粒和競爭分子引入流體室，所述顆粒包被有能結合雌二醇的捕 捉劑，其中該流體室的至少一個表面裝有包被了能結合競爭分子的第二捕捉劑 的聲學器件；和b) 監測所述聲學器件產生的信號輸出，從而檢測雌二醇。
58. 如權利要求57所述的方法，其特征在于，所述聲學器件是柔性板波器件。
59. 如權利要求57所述的方法，其特征在于，與參比相比，雌二醇水平增 加表明個體患乳腺癌的可能性增加。
60. 如權利要求57所述的方法，其特征在于，先使所述多個顆粒與樣品和 競爭分子接觸，再引入流體室。
61. 如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述競爭分子包含與標簽結 合的雌二醇，所述第二捕捉劑能結合該標簽。
62. 如權利要求61所述的方法，其特征在于，所述標簽是生物素。
63. 如權利要求58所述的方法，其特征在于，所述競爭分子包含與載體結 合的兩個或多個雌二醇分子，所述第二捕捉劑能結合雌二醇。
64. 如權利要求63所述的方法，其特征在于，所述載體選自辣根過氧化物 酶和白蛋白。
65. 如權利要求57所述的方法，其特征在于，所述顆粒是磁性的，所述方 法還包括在所述聲學器件附近產生磁通量以將多個磁性顆粒的至少一個引向 所述至少一個表面。
66. 如權利要求65所述的方法，其特征在于，在步驟b)之前撤去磁通量。
67. 如權利要求57所述的方法，其特征在于，所述樣品中雌二醇的濃度約 為10pg/ml。
68. 如權利要求57所述的方法，其特征在于，雌二醇選自游離雌二醇、與 性激素結合球蛋白(SHBG)結合的雌二醇、雌酮-3-葡糖苷酸和雌二醇-3-葡糖苷酸。
69. 如權利要求57所述的方法，其特征在于，所述樣品選自血液、血清、 血漿、尿液、唾液和活檢材料。
70. 如權利要求57所述的方法，其特征在于，還包括比較b)的信號輸出與 對照信號。
71. 如權利要求70所述的方法，其特征在于，在沒有樣品存在下產生所述 對照信號。
72. 如權利要求70所述的方法，其特征在于，所述對照信號是標準曲線。
73. 如權利要求57所述的方法，其特征在于，所述捕捉劑間接結合于流體 室的至少一個表面。
74. 如權利要求73所述的方法，其特征在于，所述至少一個表面包被有結 合對的第一成員，所述捕捉劑與該結合對的第二成員相連。
75. 如權利要求74所述的方法，其特征在于，所述結合對選自生物素/親 和素、生物素/鏈霉親和素和生物素/中性親和素。
76. 如權利要求57所述的方法，其特征在于，所述捕捉劑是抗體。
77. —種檢測樣品中一種或多種免疫抑制劑的方法，該方法包括 a) 將包被有能結合免疫抑制劑的捕捉劑的多個顆粒引入流體室，其中該流 體室的至少一個表面裝有結合了所述免疫抑制劑的聲學器件；和b) 監測所述聲學器件產生的信號輸出，從而檢測樣品中的免疫抑制劑。
78. 如權利要求77所述的方法，其特征在于，還包括根據樣品中所述藥物 的水平調整給予個體的所述免疫抑制劑的劑量。
79. 如權利要求77所述的方法，其特征在于，先使所述多個顆粒與樣品接 觸，再引入流體室。
80. 如權利要求77所述的方法，其特征在于，先將所述樣品引入流體室， 再引入所述多個顆粒。
81. 如權利要求77所述的方法，其特征在于，所述顆粒是磁性的，所述方 法還包括在所述聲學器件附近產生磁通量以將多個磁性顆粒的至少一個引向 所述至少一個表面。
82. 如權利要求81所述的方法，其特征在于，在步驟b)之前撤去磁通量。
83. 如權利要求77所述的方法，其特征在于，所述樣品選自血液、血清、 血漿、腦脊液、尿液、唾液和活檢材料。
84. 如權利要求77所述的方法，其特征在于，所述免疫抑制劑選自環孢 菌素、他克莫司、雷帕霉素和麥考酚酸。
85. 如權利要求77所述的方法，其特征在于，還包括比較b)的信號輸出與 對照信號。
86. 如權利要求85所述的方法，其特征在于，在沒有樣品存在下產生所述 對照信號。
87. 如權利要求85所述的方法，其特征在于，所述對照信號是標準曲線。
88. 如權利要求77所述的方法，其特征在于，所述免疫抑制劑間接結合于 所述表面。
89. 如權利要求88所述的方法，其特征在于，所述表面包被有結合對的第 一成員，所述免疫抑制劑與該結合對的第二成員結合。
90. 如權利要求88所述的方法，其特征在于，所述結合對選自生物素/親 和素、生物素/鏈霉親和素和生物素/中性親和素。
91. 如權利要求77所述的方法，其特征在于，所述捕捉劑是抗體。
92. —種檢測樣品中一種或多種免疫抑制劑的方法，該方法包括a) 將多個顆粒和競爭分子引入流體室，所述顆粒包被有能結合免疫抑制劑的第一捕捉劑，其中該流體室的至少一個表面裝有包被了能結合該競爭分子的第二捕捉劑的聲學器件；和b) 監測所述聲學器件產生的信號輸出，從而檢測樣品中的免疫抑制劑。
93. 如權利要求92所述的方法，其特征在于，所述聲學器件是柔性板波器件。
94. 如權利要求92所述的方法，其特征在于，還包括根據樣品中所述藥物 的水平調整給予個體的所述免疫抑制劑的劑量。
95. 如權利要求92所述的方法，其特征在于，先使所述多個顆粒與樣品和 競爭分子接觸，再引入流體室。
96. 如權利要求95所述的方法，其特征在于，所述競爭分子包含與標簽結 合的免疫抑制劑，所述第二捕捉劑能結合該標簽。
97. 如權利要求96所述的方法，其特征在于，所述標簽是生物素。
98. 如權利要求95所述的方法，其特征在于，所述競爭分子包含與載體結 合的兩個或多個免疫抑制劑分子，所述第二捕捉劑能結合該免疫抑制劑。
99. 如權利要求98所述的方法，其特征在于，所述載體選自辣根過氧化物 酶和白蛋白。
100. 如權利要求92所述的方法，其特征在于，所述顆粒是磁性的，所述 方法還包括在所述聲學器件附近產生磁通量以將多個磁性顆粒的至少一個引 向所述至少一個表面。
101. 如權利要求100所述的方法，其特征在于，在步驟b)之前撤去磁通量。
102. 如權利要求92所述的方法，其特征在于，所述樣品選自血液、血清、 血漿、腦脊液、尿液、唾液和活檢材料。
103. 如權利要求92所述的方法，其特征在于，所述免疫抑制劑選自環 孢菌素、他克莫司、雷帕霉素和麥考酚酸。
104. 如權利要求92所述的方法，其特征在于，還包括比較b)的信號輸出 與對照。
105. 如權利要求104所述的方法，其特征在于，在沒有樣品存在下產生所 述對照信號。
106. 如權利要求104所述的方法，其特征在于，所述對照信號是標準曲線。
107. 如權利要求92所述的方法，其特征在于，所述捕捉劑間接結合于該 表面。
108. 如權利要求107所述的方法，其特征在于，所述表面包被有結合對的 第一成員，所述捕捉劑與該結合對的第二成員結合。
109. 如權利要求108所述的方法，其特征在于，所述結合對選自生物素/ 親和素、生物素/鏈霉親和素和生物素/中性親和素。
110. 如權利要求92所述的方法，其特征在于，所述捕捉劑是抗體。
全文摘要
提供了檢測樣品中分析物的方法。將多個顆粒與樣品混合以形成多個分析物顆粒復合物，所述各顆粒包被了對分析物有親合力的捕捉劑。該系統還包括用于將樣品和/或顆粒轉運至傳感器表面的轉運裝置和任選的磁場感應結構，構建與安裝該結構能在傳感器表面與其附近產生磁場。共振傳感器產生的信號對應于與該傳感器表面結合的分析物顆粒復合物的數量。
文檔編號G01N33/543GK101213453SQ200680024299
公開日2008年7月2日 申請日期2006年5月2日 優先權日2005年5月2日
發明者A·斯里瓦斯塔納, B·P·馬斯特斯, M·盧恩斯托姆, M·米勒, V·K·古拉提, W·王 申請人:柏奧斯柯勒股份有限公司