專利名稱：：測定非揮發性分析物濃度的方法測定非揮發性分析物濃度的方法本發明涉及一種使用光學傳感器測定存在于水性樣品介質中的非揮發性分析物濃度的方法，所述光學傳感器包含其發光取決于分析物濃度的發光指示劑染料，在用戶處利用單點校準法校準。
技術領域：
測定液體中的非揮發性物質(例如離子物質，如H+(pH)、Na+、K+、Ca++、Cl-，中性或帶電分子，如葡萄糖、尿素或乳酸)的分析4義應用于醫學、環境和工業技術。臨床診斷尤其嚴重地依賴用于測定生物流體(如尿液、血漿、血清，尤其是全血)中的所謂"危癥護理分析物，，的分析設備。這類系統經常包含不同的傳感元件，用于測定各自的參數。這種傳感元件可用于單一測定(單用途)，或重復用于多重測定(多用途)。于在臨床診斷中測定氣體參數、pH值、離子值或代謝值。優選地，測定不同分析物的多種傳感元件被包裹成"套筒"(參見例如Ann.Biol.Clin.61,183-91,2003)。臨床診斷需要高度精確的檢測結果。另外，單個檢測步驟應提供大量物質的檢測值。而且，期望檢測結果以最小延遲提供，并且每個檢測值的成本低。常常期望檢測緊密鄰近患者進行，例如"在床邊"、在醫生辦公室或在危癥監護病房。因此，在實際檢測前包含多種校準介質的耗時校準步驟將是不可接受的，尤其是在涉及"單用途"傳感器的情況下。因為小型化裝置和傳感元件的成本必須保持得比較低，所以需要昂貴裝置、復雜傳感元件或多種流體和其它供應品的方法無法令人滿意。電化學傳感器可基于幾種不同測量原理之一，例如電勢、電流或電導測量原理。所有原理都要求使用參比電極，經常應用于在測量未知樣品前需要和濕校準液接觸的配置中。美國專利笫4,734,184號(Burldgh等)公開了一種用于監測血液中存在的大量氣體和離子的濃度的電極裝置。盡管該裝置干貝i以促進延長的保存期，但電極在使用前要徹底水合(潤濕)。美國專利第4,654,127號(Baker等)公開了一種裝配有物質選擇性傳感器和可旋轉多室容器的傳感裝置，校準溶液和樣品溶液包含在可旋轉多室容器中，但在分開的室中。多種化學物質可通過該裝置檢測。而且，這些商品化傳感器在高濕度包裝(即基本濕的)中儲存。此包裝方法具有限制這些傳感裝置的儲存期限的作用。美國專利笫5,112,455號(Cozette等)公開了一種裝配有參比電極和至少一種基本千貯的傳感器的傳感裝置，所述傳感器能夠在傳感器達到完全平衡的潤濕之前對預先選定分析物的濃度變化表現出響應。但是，傳感器和參比電極在電極達到平衡的"潤濕"態之前必須接觸校準液，以由這種固態電極獲得有意義的分析信息。光化學傳感器可基于幾種不同光學測量原理中的一種，例如熒光、吸光度或反射比測量原理。它們以眾多非常不同的測量配置應用，與電化學傳感器相反，光學傳感器典型地不需要參比電極或參比傳感器。光化學傳感器或光生物化學傳感器典型地由一層或多層施加在透明載體或基質上的無機物和/或有機物、優選聚合物組成，至少一層含其光學特性(吸光度、發光)隨樣品介質中包含的特定分析物的濃度變化的染料。光生物化學傳感器含至少一種生物化學物質或天然生物物質，例如酶。載體可為平的、圓柱狀的或任意其它形狀的。例如，所述層可應用于微量滴定板的"孔"、光纖維束的尖端或者單光纖或光導結構上。光化學傳感器通常能夠可逆地并經常持續地測量。此常規的例外是攜帶某些酶的生物化學傳感器。這些測量間斷地并經常地消耗底物或反應物(例如氧)，即它們或其底物或反應物^皮消摔毛或改變，必須復原用于以后的測量。因為傳感器一般具有有限的壽命，所以它們必須以一定的間隔被替換。使光化學傳感器與樣品介質直接接觸，當光化學傳感器曝光時，提供有關樣品介質中存在的特定目標分析物的光學可讀取信息(例如濃度、活性或分壓)。大部分光化學傳感器需要用校準介質進行幾次校準測量，分析物濃度分布在整個測量范圍內。需要的校準測量次數取決于相關測量范圍中期望的測量精度、隨不同應用變化的精度和范圍。例如，血液中生理性鈉水平的測量典型地覆蓋每升至少120-160mM，因此需要在該范圍內的校準測量。至少就用戶而論，為了最小化校準測量次數，并使它們快速和簡單，可能在工廠處獲得一個或多個傳感器特性(例如通過校準生產批次或批量)，并提供相關數據連同適宜形式的傳感器。現有技術水平的裝置偶爾在其文件中使用術語"免校準傳感器，，。實際上沒有免校準傳感器這種事。新傳感器或新設計的或新開發的傳感器至少校準1次，或者至少檢測1次其一種或多種特性。例如，可能在傳感器制造過程中校準生產批次，隨后通過可重復的制造技術生產僅具有此已知特性的傳感器。而且，可能校準至少1個傳感器或1批中代表性數量的傳感器，并將測量的特性指定給該批所有的傳感器。這要求在1批中足以可重復地制造和/或在批間足以可重復地制造傳感器。還要求可重復地制造生產商提供或授權的任意檢測裝置或設備，以實施測量。這種工廠校準既耗時又昂貴，需要對傳感器特性極嚴謹的控制和伴隨的對測量裝置或設備的特性的控制。在此背景下已提議了許多溶液，例如通過時間分辨法或相位分辯法測量多個波長的發光強度或檢測光學傳感器的發光衰變時間。如下所述，在單系統中非常經常地應用多種方法，原因是缺乏在其各自的濃度范圍內對所有目標分析物響應的指示劑分子。例如，一種使用光化學傳感器的這種"免校準"系統在Clin.Chim.Acta307,225-233,2001中被提議用于血氣(尸02和尸(302)和血液pH值的"近患者檢驗"。在該系統中，通過檢測固定在膜上的發光染料的發光衰變時間進行尸02的測定。利用C02的直接紅外吸收測定尸。02，避免了使用光學傳感器。通過多波長透射測定固定在膜上的比色pH指示劑染料和取出的樣品以比色法(使用吸光度原理)測定pH值。使用多種方法的這種系統經常是復雜的和昂貴的。由美國專利第5,564,419號(Radiometer)還知道通過發光猝滅法檢測血樣氧含量。該方法使用其發光在氧存在時被猝滅的發光團。樣品的尸02通過檢測發光的衰變時間來測定。與發光衰變時間的檢測相比，就光學系統組件的參數而言，發光強度的檢測具有更大的問題。對于使用具有長衰變時間(>500納秒)的發光指示劑的傳感器來說，關于光學檢測裝置的現有技術水平要求是相當適中的。不幸的是，對于大量的分析物，尤其是離子和代謝物，無法獲得具有長發光衰變時間的簡單指示劑或指示劑系統。隨著指示劑發光壽命的增加，對眾所周知的猝滅物(尤其是02)的橫向靈敏度也將增加。衰變時間低于100納秒(ns)的指示劑不受此問題影響，但是，這種短衰變時間的精確度和免校準測定通常需要更昂貴和復雜的設備。現代醫學日益要求可緊鄰患者使用的低成本、堅固和小型化的分析儀。由美國專利第5,288,646號(Radiometer)知道通過比色法測定血樣的pH值，其中提議使用固定在膜上的比色(不發光)pH指示劑染料進行光度檢測，所述膜位于"取樣裝置"的通道壁上。使用多種分析波長的透射測定是昂貴的，需要校正光學元件特性和光路的變化的計量4義器。因為血液吸收光，所以樣品在測量前必須被從光路中去除，例如通過用壓力壓通道。在發光指示劑的范圍內，已提議(參見美國專利第5,108,932號(Wolfbeis))在一個波長照射，優選在等消光點照射，并在兩個不同的光發射波長測量。但是，在光學元件特性完全已知的情況下以多個波長工作或以多個波長測量需要較昂貴的技術。與pH值檢測相反，對于大量分析物，無法獲得適于多波長法的發光指示劑。在一個寬波段分析波長測量發光強度特別有優勢。與以上提及的技術相比，測量發光強度具有以下優勢檢測必需的光學和電子元件的配置相對簡單，可用低成本元件實現。在此方面的一個缺點是以下事實影響發光強度的檢測裝置光學元件和單個傳感器的某些參數將影響檢測結果。盡管基本上有可能建立具有穩定元件的光學系統和傳感器以及其特性被精確測定的傳感器，但就以上要求以及涉及的費用和成本而言這是不切實際的。解決問題的方法大體上是已知的，在于臨測量前進行單點校準，在所述校準中確定依賴于個體檢測設備的配置和個體傳感器元件并影響發光強度的參數。按照現有技術水平，例如對基于以寬波段分析波長測量發光強度的光學傳感器而言，有可能通過制造過程中的校準測量獲得相對特性(即不依賴于個體檢測系統的特性)，并以描述特性曲線的數學等式參數(系數)的形式提供此特性連同傳感器，用于在用戶處的檢測系統。參數可以條碼的形式提供，或儲存在電子、磁性或光學存儲介質上。為測定適用于用戶檢測系統的特性(即有效特性)，需要至少一次另外的發光強度檢測。按照現有技術水平，該檢測如下獲得利用含至少已知濃度的待測分析物的校準介質，在用戶檢測系統的傳感器設定對應于此已知濃度的發光值，并檢測發光，產生用戶處的校準值。參比用戶處校準值的相對特性將產生有效特性。對于其中通過用吸收譜帶中的光輻射電子激發發光指示劑并使用發射譜帶中的發射光強度測定分析物的簡單光化學傳感器系統，需要在用戶處實施至少一次校準測量。關于此用戶處校準，用于含一個或多個光化學傳感器和校準介質的單用途^^測元件的纟企測方法和裝置是已知的。在美國專利笫5,080,865號(Leiner)中提出了一種單用途檢測元件，其包含一個或多個電化學或光學傳感器，并包括一種適于給定傳感器的校準介質。在檢測之前，將檢測元件插入到分析儀中，進行校準檢測，之后進行樣品檢測。如果使用采用一種或多種氣體(例如02和CO》進行張力測量的液體，則可同時校準氣體和離子傳感器。將傳感器儲存在液體中具有以下優勢傳感器已準備好在達到檢測溫度后立即使用。缺點是傳感器儲存于液體中時其"儲存期限，，被限于幾個月。特別是對非常靈敏、攜帶酶的生物傳感器就是這種情況。其它缺點在于以下事實單用途檢測元件必須保持在于儲存期限中毫無損失的液體中，必須提供傳送校準液的流體系統。在美國專利第5,351，563號(Karpf)中提議將液體儲存介質(其同時是pH和離子傳感器的校準介質)整合入單用途檢測元件中。儲存介質被用水蒸氣飽和的校準氣體替換，此后進行校準和隨后的樣品檢測。美國專利笫5,166，079號(Blackwood等)公開了一種用于竟爭性免疫測定的方法和測試裝置，所述竟爭性測定使用用熒光部分標記的結合配偶體。在干態時，測試裝置的試劑層包含目標分析物(例如抗原)的固定化結合配偶體(例如抗體)的免疫復合物和標記分析物的綴合物。實際上，在將樣品施加于測定元件之前以光學方法讀取存在于試劑層中的標記。當含目標分析物的液體樣品已加至測試裝置時，存在于樣品中的分析物與試劑層中標記分析物的綴合物竟爭固定化結合配偶體上的可用結合位點。標記的分析物由該處解離，被樣品分析物以適宜地等于樣品分析物和標記分析物的相對量的比率替換。試劑層的第二個讀出信號在樣品已施加時獲得，該信號與樣品中分析物的量成反比。獲取第二個信號與第一個信號的比率，并與已知量的分析物的該比率對比，以確定樣品中分析物的量。根據美國專利5,166,079，其中公開的方法允許補償設備和元件與元件間試劑層厚度的變化，產生更好的精度。重要的是，美國專利5,166,079的方法是基于對所述層中熒光標記分析物的替換，該替換通過輻射探測，但樣品中的分析物不能同樣地影響熒光部分的熒光特性。因此，目前仍需要一種方法，其整合具有必需的長儲存期限、可預知的和可重現的光響應以及"潤濕"特性的傳感裝置、優選光化學傳感器，該方法允許獲得節省成本的和精確的分析物濃度測定。這種測定理想地在5分鐘或以下、最優選在約1分鐘內進行。基本原理為能夠更好地理解本發明，將總結發光物質A的發光信號強度S、其濃度cA及給定檢測系統的參數之間的關系，然后使用測定樣本領域已知的濕校準。為與有關濕校準的公開等式相一致，用字母S指示發光強度。與其相反，本發明的描述將在等式及其推導中對發光強度使用字母L。Parker等式描述了在給定激發波長(ex)和發射波長(em)時A物質的發光強度S及其濃度cA的關系(a)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中Io是光源強度，1^和kem是激發側或發射側的光學元件的傳輸參數，e是檢測器的靈敏度，全部都取決于光波長X。依賴于發光物質的光物理參數是摩爾吸光系數S、發光量子產率0和分析物濃度cA。d是含所述物質的介質中的平均光徑長。對于給定的A物質，參數I。、kex、e、kem、s、O和d的乘積可合并成新參數、(b)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>得到(c)S=kAcA光學元件的特性(例如光源的強度和光譜、濾光片的光譜透射特性、檢測器的光譜靈敏度等)和光學裝置的特性(光徑長)在一定限度內和隨著時間而變化。這將使參數kA在傳感器之間和裝置之間具有一定變化，這些變化也將隨時間(運行持續時間)改變。在進行需要高度的精確性和可重復性的檢測時這些變化必須被考慮進去。最小化這些變化是昂貴的，因此在考慮低成本檢測系統的情況下在經濟上是不可行的。用于pH測定的眾所周知的光化學傳感器使用ICT染料羥基芘三磺酸(HPTA)(Ann.Biol.Clin.61，183-91,2003)。傳感器的校準曲線可得自pH值與質子化(AH)和去質子化(A-)染料物質濃度之間的質量作用定律的簡單關系(d)pH=pK+log(cA_/cAH)當在水性環境中接近470nm激發時，質子化形式于520nm不產生發光。染料的總濃度cD是各個染料物質濃度的和(e)cD-cA—+cHA在高pH值(即pH〉pK+3)時，不存在質子化染料物質。因此，在高pH值時cD-cA-。以由等式(e)產生的表達式cHA=cD-cA-替換等式(d)中的cHA，簡化產生等式CyT_1①;=1+10^等式(f)等價于等式(g)"乂1+根據等式(c)還等價于等式(h)S一1其中S表示給定pH值的發光強度，Sm表示沒有質子化物質HA時的發光強度。最后，等式(h)移項得到傳感器的校準曲線(公開于Ann.Biol.Clin.61,183-91,2003)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>校準曲線(等式i)是一個反曲函數，特征在于發光強度從低pH值到高pH值增加，拐點(染料的pK值)以生理pH中值為中心，其中S是隨pH變化的相對發光強度，Sm是在高pH值時觀察到的最大強度，pK是指示劑的質子解離常數的負對數。對于pH解等式(i)得到<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>由該式可知，如果參數S、Sm和pK是已知的，則可計算pH值。為測定pH值，在用戶處由與水性樣品接觸的傳感器的發光測量值獲得發光強度S。pK值通過工廠校準獲得。用戶處的Sm值是未知的，必須在用戶處由與已知pH值的水性校準溶液接觸的傳感器的發光測量值確定。在用戶處測定Sm的必要性由等式(g)顯而易見。只有形成參數kA的量相等時在分數的分子和分母中的參數kA才相同。這些量可由(b)得出。如果在使用同一個測量配置測定S之前或之后不久測定Sm,則基本上保持相等性。Sm例如可在用戶處通過檢測與高PH值水性校準介質接觸的傳感器的發光來測定。優選地，通過檢測與水性校準介質接觸的傳感器的發光強度ScaI以及通過由等式(k)計算Sm獲得Sm,所述介質的pH值(pHJ接近由工廠校準已知的pK值<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>US6,211,359(He等)公開了用基于光誘導電子轉移(PET)作用的發光指示劑測定鉀的光學傳感器的相似特性。US6,211,359(He等)的等式6還可應用于其它離子的情況，此外還考慮了可能存在的干擾離子。US6,211,359的等式7用于獲得待測離子的濃度，與等式(j)類似。US6,211,359的等式8利用單點校準用于得到未知的Sm值，與等式(k)類似。US6,l71,866(He等)公開了用基于PET作用的發光指示劑測定鈣的光學傳感器的相似特性。US6,211,359的等式6和US6,171,866的等式4是等價的，例外之處是等式4未考慮干擾離子，濃度和&值以對數形式給出。定義對眾多基本概念給出以下定義。分析物:在下文中分析物指在水性樣品介質中要定性或定量測定的物質。術語非揮發性分析物將與揮發性分析物(即在標準條件下為氣態的物質，例如02或C02)區別使用。非揮發性分析物包括例如離子物質，如H+(pH)、Na+、K+、Ca++、C1—，中性或帶電分子，如葡萄糖或乳糖。光學傳感器中分析物和發光染料之間的相互作用可為直接的或間接的。"直接相互作用"指分析物接觸到染料，兩種物質實際上彼此反應。"間接相互作用"指分析物不與發光染料直接接觸，和/或染料的發光響應不是緣于化學或物理的分析物-染料相互作用。屬于生物化學傳感器類別的酶傳感器提供了實例。就該實例而言，一種或多種酶與分析物反應，產生反應產物，該反應產物又與指示劑染料直接反應。在某些已知的生物傳感器中，酶反應引起例如pH值改變，該改變可通過pH敏感性指示劑染料測定。實例可見于Biosensors&Bioelectronics10,1995,653-659(Konicki等)。另一類間接相互作用發生在基于熒光共振能量轉移(FRET)原理(參閱下文)的測定中，按照該原理，分析物與接納體染料相互作用，并檢測供體染料的發光。典的pH吸收染料類似，這些發光染料隨后被叫做發光指示劑染料。除非具體提及，否則術語"分析物，，連同其與發光染料的相互作用應包括如上定義的直接和間接相互作用兩者。例如，如果使用為H+和pH敏感性染料的非揮發性分析物，則發生分析物和染料的直接相互作用。但是，如果葡萄糖是分析物，使用的酶傳感器利用檢測pH變化(在葡萄糖被酶轉變時發生)的原理，則與染料相互作用的物質是H+,而不是葡萄糖。因此，在本文中，類似于"分析物與指示劑染料反應"、"分析物與指示劑染料相互作用，，、"分析物結合染料"的陳述和相似的陳述應包括如上定義的直接和間接的分析物-染料相互作用。樣品介質:樣品介質典型地是具有溶解鹽的水性溶液，其另外可包含有機組分、生物化學組分或生物組分。待測的樣品介質可來自環境
技術領域：
(水和廢水樣品)、生物
技術領域：
和醫學領域(血液、血清、血漿、尿樣或其它體液樣品)。光學傳感器:在本發明的應用中，術語"光學傳感器"指樣品介質和檢測裝置的光學元件之間的界面；具體地說，其指施加于透明載體或基質上的一層或多層無機物和/或有機物，優選聚合物，至少一層含其光學特性(吸光、發光)隨樣品介質中包含的特定分析物的濃度變化的染料。該界面也稱為光極(optode或optrode)。檢測系統或檢測裝置的元件，例如光源、檢測器、濾光片、電信號放大器和計算部件不是光學傳感器的組成部分。本發明涉及用于檢測在標準條件下為非揮發性(非氣態)的物質的光學傳感器，所述物質例如為無機離子(例如H+、Na+、K+、Ca++、Cl—、N03-、Fe"等)、電中性或帶電分子(例如乳糖、葡萄糖、尿素、肌酐、胺、醇)，它們優選溶解在水性樣品介質中。C02、S02等)的光學傳感器。具體地說，本發明不涉及光學氣體傳感器，即在干態下和與氣態樣品介質接觸的情況下對分析物(例如02、C02)的分壓變化響應以光信號變化的傳感器。本發明也不涉及用于溶解在水性樣品中的這種揮發性分析物的傳感器，所述水性樣品與所述傳感器接觸。時，可使用本發明。但是，在此情況下，本發明僅在用于非揮發性分析物的傳感器方面可用。發光光學傳感器:本發明優先涉及發光光學傳感器。此傳感器在至少一層中包含至少一種發光染料(也稱為發光指示劑染料)。干光學傳感器:該術語涉及依照以上定義的光學傳感器，其中組成傳感器的所有傳感器材料都是干的(即基本上無水)。該傳感器在儲存過程中和/或檢測應用前處于該狀態。為在功能上活化傳感器，其必須接觸水或含水的介質，例如水性活化介質、樣品介質或校準介質。濕光學傳感器:該術語涉及依照以上定義的光學傳感器，其接觸水性介質，例如水性活化介質、樣品介質或校準介質。活性:離子物質的活性"是其濃度c及其活性系數的乘積。活性取決于離子強度。在低離子強度活性系數為1，因此c-"。根據應用，技術人員將例如通過使用Debeye-Hiickel等式計算適宜的其它值。如果在下文中提到濃度測定，則也包括活性測定。測量系統:除了如上定義的光學傳感器自身以外，該術語還涉及應用光學傳感器所需要的所有光學、電子和機械元件，例如產生激發輻射的光源、檢測測量輻射強度的檢測器、濾光片、電子信號放大器、計算部件和測量池(例如傳感器連接至其壁的比色皿、具有進口并可能具有出口以及具有傳感器連接至其壁的測量通道的池或4敬量滴定板)。測量裝置或裝置:是測量系統所有元件的總稱。優選地，測量池(含光學傳感器)不是裝置的主要部分，但可與傳感器一起被替換。(p向應)特性或特性函數:所述特性描述了測量輻射的檢測強度(例如發光強度)和待測定分析物的濃度或活性之間的函數關系。對于光學傳感器而言，特性是非線性的，即在完整的動態檢測范圍內發光強度和分析物濃度之間的函數關系不能由直線以足夠的精確度代表。根據需要的檢測范圍寬度和需要的精確度，對于某些應用有可能以直線代表特性的至少一部分。通過檢測傳感器發光，確定具有不同已知濃度的待測定物質的一系列水性校準介質的特性，這些已知濃度分布在待測定分析物的預期濃度范圍內。由這些檢測的校準值獲得表格或圖形形式、優選為數學等式形式的特性。在實際檢測中，使用和樣品接觸檢測的發光強度和特性函數計算分析物的濃度。有效特性:對給定傳感器連同給定測量系統適用的特性。將由工廠處測量系統荻得的有效特性參比由工廠處測量系統獲得的校準值產生相對特性。相對特性:指與具體測量系統無關的特性。參比于所獲用戶特定測量系統的校準值的相對特性提供了適用于用戶特定測量系統的有效特性。典型地，相對特性(也參閱下文"有效特性"的定義)在工廠處荻得，并可參比濕對干校準值(也參閱下文"濕對干關系"的定義)。有效和相對特性可通過計算由一個轉變為另一個，前提是(a)對于適用有效特性的測量系統，至少一個校準值是已知的，(例如與已知分析物濃度的介質接觸的傳感器的測量輻射強度)，和(b)用于獲得有效特性和相對特性的測量系統以相同方式建立。"濕對干關系":就本申請而言，"濕對干關系"是允許使用均在用戶處檢測的用戶處干校準值和發光測量值在用戶處計算非揮發性分析物濃度的關系。"濕對干關系"典型地來源于工廠處的干和濕校準值，其獲自使用來自生產批次或批量的代表數目的單個傳感器進行的檢測。然后，這些工廠處的干和濕校準值產生"濕對干關系"，其被^L為對代表性傳感器所來自的完整生產批次有效的關系。"濕對干關系"例如可為相對特性，或相對特性和比值，和/或等等。聯系某些典型的但非限制性的實例(參閱下文的實施例1、l丄、1.2.、1.3.、2、2丄和2.2.)和實施方案，以下說明書將表明如何能使用"濕對干關系"進行非揮發性分析物濃度的測定。參閱實施例l，具體地說是實施例l丄、1.2.和1.3.(下文)，"濕對干關系"包括參比于在工廠處獲得的濕校準值和比值的相對特性。參閱實施例2丄(下文)，"濕對干關系"包括參比于在工廠處獲得的干校準值的相對特性。參閱實施例2.2.(下文)，"濕對干關系"包括參比于干校準值的相對特性，所述干校準值基于在工廠處獲得的比值。校準:指特性確定。在校準光學傳感器時，使其與測量系統中的校準介質接觸，該介質含不同的已知濃度的待測分析物。參比于校準介質中已知濃度分析物的傳感器的光學可檢測響應，例如發光強度，用作待測樣品中未知濃度的分析物的參比值。在樣品測量前，傳感器可為濕的或干的。如果是干的，則其必須由校準介質活化。在此情況下，校準介質也是活化介質。還有可能使用儲存介質(如果提供的話)作為活化介質以及校準介質。其實例可見于US5,080,865A和US5,658,451A。單點校準:獲得干傳感器的發光測量值并視為校準值。由用給定測量系統獲得的校準值和由以相同方式建立的測量系統獲得的相對特性，可得到對給定測量系統有效的有效特性。測量和計算:在測量期間，使光學傳感器與含待測定濃度的分析物的樣品介質接觸。分析物的濃度參比光學傳感器的有效特性由檢測的傳感器信號(例如發光強度)獲得。工廠處校準:在工廠處用專用的水性校準介質確定特性參數(如果使用下文提到的等式7，則例如為參數&和q)是眾所周知的，不是本發明的主題。如果已在工廠處使用合適的測量系統實施一些校準步驟，則在用戶處可能僅需要1個校準步驟(單點校準)，前提是使用相同設計的測量系統。工廠處校準的必要條件是在工廠處獲得的特性在傳感器使用前一直不改變(或至少不以無法預見的方式改變)；改變例如可在運輸期間或儲存期間發生，原因在于溫度作用或化學或物理老化或分解。發光指示劑染料:在給定范圍內，術語發光指示劑染料、發光染料或發光-光學染料指其發光響應(例如發光強度、發光衰變時間)通過直接或間接相互作用依賴于分析物的濃度或活性的所有物質。典型地，發光指示劑染料固定在光學傳感器中，優選地固定在至少一個傳感器層中。根據染料和染料系統的類型，分析物濃度導致的發光響應受到非常不同的化學-物理和/或光物理機制影響。最要的染料類型是A)PET染料B)ICT染料C)FRET系統(能量轉移系統)如上文已定義的，"直接相互作用"指分析物接觸染料并與其反應。"間接相互作用"指分析物不與發光染料直接接觸和/或染料的發光響應不是緣于化學或物理的分析物-染料相互作用。PET染料:其發光被光誘導的電子轉移(PET)完全地或部分地猝滅的指示劑染料。發光猝滅將降低發光量子產率、發光強度和發光衰變時間。在PET指示劑染料中發生由電子供體至電子激發的電子接納體的電子轉移。供體和接納體經間隔體共價連接。間隔體的功能是電子去偶供體和接納體。接納體是發光物質。供體是能夠(優選可逆地)結合分析物的受體。如果結合的物質是離子物質，則反應性組分也叫做離子載體。在熱動力平衡反應中，分析物通過結合受體與指示劑染料可逆地反應。由發光特性(例如發光強度、發光衰變時間)可推斷分析物濃度，例如通過評z階紫外(UV)、可見(VIS)或近紅外(NIR)范圍中的可見或用光檢測器可測量的發射光強度。PET指示劑染料具有不結合分析物S的至少一種A物質和結合分析物S的至少一種B物質，兩種物質和分析物在一定時間后處于熱動力平衡狀態。B物質中的PET作用通過結合分析物完全地或部分地被封閉，導致B的發光強度具有最大值。A物質中的PET作用未被封閉，導致其發光強度最小。因為PET指示劑染料的染料組分基本上仍未受分析物結合的影響，所以技術人員會通過以下事實識別PET指示劑染料在給定化學環境中，兩種物質的染料吸收和發射光鐠就光譜位置而言基本上相當。因為總光譜來源于兩種物質光譜的相加，所以分析物的結合將改變激發和發射光譜的發光強度。實例可見于APdeSilva等，CoordinationChemistryReviews205,2000,41-57(PET染料的綜述)，He等，Anal.Chem.75,2003,549-555,圖2(Na+的PET指示劑染料)和J.Am.Chem.Soc.125，2003,1468-1469,圖3(K+的PET指示劑染料))。ICT染料:與PET指示劑染料相反，在ICT染料(ICT=分子內電荷轉移)中沒有兩個部分(染料和受體組分)的電子解偶。因為分析物的結合顯著改變染料組分的發色團系統，所以技術人員將根據以下事實識別ICT染料在給定化學環境中，兩種物質的染料組分的吸收和發射光i普就光譜位置而言是不同的。因為總光譜來源于兩種物質光譜的相加，所以分析物的結合將改變總光譜中兩種組分光譜的相對比例。實i"列可見于MolecularProbes,HandbookofFluorescentProbesandResearchProducts,2002,第9版，第21章，圖21.19(SNARF-4F)和圖21.24(HPTS)。FRET染料:FRET指示劑染料系統(FRET=熒光能量共振轉移)基本上由兩種染料一發光供體染料和接納體染料組成。供體染料的發光經非輻射能量轉移被接納體染料猝滅。發光猝滅改變發光強度和發光衰變時間。接納體染料與分析物直接或間接反應，因此改變其吸收值(吸收光譜)和能量轉移速率。由供體染料的發光強度可對分析物進行推斷。發生FRET的其中一個條件是接納體染料的至少一種物質的吸收光譜至少部分地與供體染料發射光譜重疊。FRET系統的一個優勢在于以下事實技術人員具有許多已知的、非發光指示劑染料(尤其是pH敏感型吸收染料)的選擇，可經更靈敏的發光檢測測定分析物。實例可見于US5，232,858A(Wolfbeis等)、US5,942,189A(Wolfbeis等)和Anal.Chim.Acta,1998,364，143-151(Huber等)。發明目標基于以上測定水性樣品介質中的非揮發性分析物濃度或pH值的方法，本發明的目標是提出改善和簡化，這些改善和簡化允許在用戶處測定非揮發性分析物的濃度(包括pH值)，無需使用校準介質。典型地，測量方法只基于使用僅一個激發和發射波長或語帶檢測發光強度。該目標通過提供以下幾項實現用與水性樣品介質接觸的傳感器在用戶處獲得發光測量值，該測量值參比于在工廠處獲得的濕對干關系(例如相對特性)和在用戶處獲得的干校準測量值，并由這些數據推斷pH值和非揮發性分析物的濃度(包括pH值)。因此，將首次實現基于測量發光強度的測量方法加校準步驟，其在用戶處將不需要校準介質，即便僅使用1個激發和發射波長。本發明利用了以下令人驚訝的事實可改造測定許多非揮發性(非氣態)物質的光學傳感器，以使用在干態表現出發光的發光染料(如果被適宜地激發的話)。本發明的目標是如權利要求1定義的方法。優選的實施方案是從屬權利要求的目標。本發明的目標是一種使用光學傳感器測定水性樣品介質中存在的非揮發性分析物濃度的方法，所述光學傳感器含發光指示劑染料，在用戶處通過單點校準法來校準，所述方法包括-在用戶處檢測干傳感器的發光，獲得用戶處的干校準值，-在用戶處獲得與水性樣品介質接觸的傳感器的發光測量值，和-由發光測量值、在工廠處獲得的濕對干關系和用戶處的干校準值推斷非揮發性分析物的濃度。具體地說，本發明的方法包括a)在工廠處i.由多個以相同方式制造的干傳感器Sn選擇代表性數量的干傳感器S0;ii.檢測各個選定干傳感器Sc的發光，獲得工廠處的干校準值；iii.隨后，在與至少兩種水性校準介質接觸后檢測各個選定傳感器S。的發光，所述校準介質具有不同已知濃度的非揮發性分析物，獲得工廠處的濕校準值；iv.由工廠處的濕校準值和工廠處的干校準值荻得傳感器S。的濕對干關系，該濕對干關系被視為以相同方式制造的所有傳感器Sn的濕對干關系；b)在用戶處i.檢測多個以相同方式制造的傳感器Sn中的干傳感器St的發光，獲得用戶處的干校準值；ii.獲得與水性樣品介質接觸的傳感器Si的發光測量值；和iii.由發光測量值、用戶處的干校準值和在工廠處獲得的濕對干關系計算水性樣品介質中存在的非揮發性分析物的濃度。在本發明的笫一種變更方法中，本發明的目標通過提供以下幾項實現a)在工廠處i.由以相同方式制造的大量干傳感器Sn(即生產批次或批量，乃至如果生產工藝是高度可重復的，則針對一個種類的所有傳感器)選擇代表性數量的干傳感器SQ;ii.檢測各個選定干傳感器S。的發光，獲得工廠處的干校準值；iii.接著，對于每個選定的傳感器Sq，使用至少兩種具有不同已知濃度的非揮發性分析物的水性校準介質檢測發光，所述校準介質隨后與傳感器接觸，獲得工廠處的濕校準值；iv.由工廠處的濕校準值得到傳感器S。的相對特性，其4皮;現為以相同方式制造的所有傳感器Sn(即屬于相同生產批次)的相對特性；v.由工廠處的濕校準值和工廠處的干校準值得到比值，該比值被視為以相同方式制造的所有傳感器Sn的對應比值；以及b)在用戶處i.測量以相同方式制造的多個傳感器Sn中的一個干傳感器S,的發光，獲得用戶處的干校準值；ii.用與水性樣品介質接觸的傳感器S!獲得發光測量值；和iii.由發光測量值、用戶處的干校準值、相對特性和在工廠處獲得的比值計算水性樣品介質中存在的非揮發性分析物濃度或pH值。本發明的第一個變更與最初描述的已知方法的不同之處在于多出的幾點。因此，在工廠處的校準當中，除了相對特性以外，還獲得工廠處的干校準值和工廠處的濕校準值的比值。在用戶處，在實際樣品檢測前僅需要1次干態傳感器的檢測，以便獲得用戶處的干校準值，該干校準值允許由樣品的測量發光值連同均在工廠處針對整個生產批量的傳感器測定的相對特性和比值，測定水性樣品介質中存在的非揮發性分析物的濃度。在本發明的另一個變更中，特性得自工廠處的濕校準值，該濕校準值參比干校準值，因此獲得參比于干校準值的相對特性，該變更與前述變更從步驟a)iv.起在以下范圍內不同在工廠處-由工廠處的濕校準值和工廠處的干校準值得到傳感器S。的相對特性，該相對特性被;枧為對相同方式制造的所有傳感器S。有效；和在用戶處-由發光測量值、用戶處的干校準值和相對特性計算水性樣品介質中存在的非揮發性分析物的濃度。本發明的該變更還在許多方面與最初描述的已知方法不同。因此，在工廠處校準過程中，獲得工廠處的干校準值，將該值輸入到相對特性的計算中。在用戶處，在實際樣品檢測前僅需要1次傳感器干法測量，以便獲得用戶處的干校準值，使得可以由測量發光值樣品介質中的非揮發性分析物的濃度。在本發明的又一個變更中，由工廠處的干和濕校準值計算比值，然后由這些比值獲得相對特性，該變更與上述變更從步驟a)iv.起在以下范圍內不同在工廠處-由工廠處的濕校準值和工廠處的干校準值計算比值；和-由該比值獲得傳感器S。的相對特性，該相對特性凈皮^L為對以相同方式制造的所有傳感器Sn有效；和在用戶處-由用戶處的干校準值和發光測量值計算用戶處的比值；和-由用戶處的比值和相對特性計算水性樣品中存在的非揮發性分析物的濃度。本發明的該變更還在許多方面與最初描述的已知步驟不同。因此，在工廠處校準期間，獲得工廠處的干校準值，通過計算比值使工廠處的濕校準值與該干校準值相關聯。由這些工廠處的比值獲得相對特性。在用戶處用干傳感器進行發光測量，獲得用戶處的干校準值，通過計算用戶處的比值使由與樣品接觸的傳感器獲得的發光測量值與該干校準值相關聯。由用戶處的比值和相對特性確定水性樣品中存在的非揮發性分析物的濃度。根據本發明，用于測定非揮發性分析物的光學傳感器可與用于測定揮發性分析物(如02或C02)濃度的傳感器組合使用，或者以接合傳感器配置使用。氣體傳感器和用于非揮發性分析物的傳感器例如可組合在單用途測量裝置中，例如為傳感器陣列的形式。氣體傳感器被認為是"免校準的"，條件是測量利用發光衰變時間進行。借助于校準氣體，也有可能進行單點校準。為利于理解本發明，濕校準盡管在本領域是已知的，但仍隨后針對采用PET染料的光學傳感器的案例更詳細地描述。以下等式可直接用于PETpH指示劑染料。關于基于PET作用的用于Na+、K+、03++的指示劑染料，參見例如US5,981,746A、US6,211,359Bl和US6,171,866Bl。給定等式在某些限制下還可用于ICTpH指示劑染料，具體地說是用于這種染料其中通過適宜地選擇濾光器，可激發僅一種物質，或者其中可檢測僅一種物質的發光。響應信號將根據分析物結合時測量的發光是增加還是降低而改變。原則上，給定等式還可應用于以下的ICTpH指示劑染料其中通過適宜地選擇濾光器，可特異性地不激發兩種物質中的任一種，也不檢測其發光，例如在光譜重疊時。在此情況下數學表達式的復雜性增加。根據指示劑染料的熱動力平衡常數Kd和分析物S的濃度，指示劑染料將具有不結合分析物S的A物質和結合分析物S的B物質。可逆的結合由質量作用定律決定(1)B<""+S解離常數Kd取決于溫度和指示劑染料的物理-化學環境，通過等式2以第一近似值給出，c代表濃度，下標d表示解離常數。Kd以mol/l給出。因此，濃度cA和cB的比率由解離常數Kd和分析物S的濃度確定。(3):7pKd值(等式4)是解離常數以IO為底的負對數(4)logfc)PET指示劑的濃度cD(總濃度)是個體指示劑物質A和B的濃度的和。(5)cD二c^+o5指示劑物質B的濃度對指示劑總濃度的比率是(6)K二cS/cD如果不存在A物質，則比率為1。如果兩種物質的濃度相等，則比率為0.5。如果不存在B物質并只有A物質存在，則比率為0。對于給定的激發和發射波長，PET指示劑的發光強度L是個體物質A和B的發射光強度LA和LB的和。(7)丄=^4+4k和"與個體物質A和B的濃度cA和cB成比例，其中LA=kA-CA，LB=kB.cB。比例常數K和kB對測量系統有效，即適用于以相同方式制造的一組傳感器中的傳感器與適宜測量裝置的組合。對于給定的激發和發射波長，比例常數、和kB包括a)傳感器參數，例如染料的總濃度cD、傳感器中的有效光徑長、受輻照面積、A物質和B物質的吸收值和發光量子產率；P)個體測量系統的參數，例如光源強度、檢測器的靈敏度和光學元件的透過率。特別適合的PET指示劑的特征在于以下事實kB優選地大至kA的至少10倍，甚至更優選地大至100倍，即不結合分析物的A物質的發光強度低至結合分析物的B物質的發光強度的該分數。在下文中，假定ks〉kA。根據PET機制，可發現kA〉kB的指示劑。如ICT指示劑的情況一樣，技術人員因而應必須采用以下等式。組合等式2、5和6,最終得到描述傳感器特性的有效形式的等式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>其中q=kA/kB，Lm(m指最大強度)是在僅存在B物質時的測量發光強度。L^還可用作換算因數。對于給定的激發和發射波長以及對于給定的測量系統，等式8描述了作為分析物濃度函數的測量(有效)發光強度L。以下考慮因素適用于參數q:參數q代表比率kA/kB,因此代表純A物質的強度對純B物質的強度，q.lOO是純A物質的強度，為純B物質強度的百分率。以下考慮因素適用于換算因數Lm:對于給定測量系統，！^A是傳感器的最低可測量強度。例如可通過使傳感器與測量介質接觸將傳感器設定為最低強度，所述測量介質的分析物S濃度與Kd相比非常小(cS"Kd)，這意味著平衡(參見等式l)完全移向左側。典型地，如果cS小于Kd達10、l(^倍就足夠了。對于給定測量系統，LmB是傳感器的最高(最大)強度(其可用所述分析物實現)。例如可通過使傳感器與測量介質接觸將傳感器設定為最大強度，所述測量介質的分析物S濃度與Kd相比非常高(cSAKd),這意味著平衡(參見等式l)完全移向右側。典型地，如果cS大于Kd達至少103-104倍就足夠了。在等式8中，Lm被看作是LmB,即傳感器的最大強度。對特別有效的PET染料來說，q可趨向于O。這種染料是特別適合的，因為其A物質不發光，因此不需要考慮其干發光。對于其中通過使用適合的濾光器測量僅一種物質如B的ICT染料(參見上文描述)來說，q是0(因為不測量A的發光，無論其發光還是不發光)。因為q等于0,所以等式8讀為L=Lm(l-l/(l+cS/Kd))。如果檢測A物質而不是B物質，則等式8讀為L=Lm(l-l/(l+Kd/cS))。其它等式必須相應地改變。如果等式8除以常數(〉0),例如除以Lm，則產生參比于常數值的相對特性Lrel。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>等式9中的！^可假定為q和1之間的數值。參數&和q決定了特性形式，其與換算因數k無關。這些參數與以上段落a)和(3)中提及的量無關，并可通過工廠處校準確定。參數k考慮了以上段落a)和(3)中提及的量。通過將相對特性Lrel(其可用工廠處測量系統通過工廠處校準來確定)乘以參數I^(其可用用戶處測量系統來確定)，獲得對用戶處測量系統有效的特性(有效特性)。如果換算因數！^指濕態傳感器(濕傳感器)，則其在下文將以下標W(Lmw)表示。如果其指干態傳感器(干傳感器)，則其在下文將以下標D(L^)表示。換算因數LmW與可用給定濕傳感器在給定測量系統中測量的最大發光強度相同。Lmw在采用校準介質的濕校準中可直接測量，前提是選擇的分析物濃度使得僅存在B物質。對于pH傳感器來說，還可用pH=.1og(aH+)和pK=-log(Kd)將等式8寫成等式10的形式。(10)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>在下文中，上標*用于涉及工廠處(工廠處校準)的所有量。參數q和Kd例如通過以下步驟確定a)由多個以相同方式制造的傳感器中選擇至少一個傳感器；b)用選定傳感器在工廠處測量n數目(其中如果應用等式8或10的話，則n至少為3，優選為5或以上)的水性4交準介質的發光強度LiW*，所述水性校準介質具有已知的分析物濃度CS,，這些濃度至少分布在預期的測量變量范圍內，獲得n個數據對(cS,、Liw*;i-l...n);c)例如通過已知的最小二乘法，使描述傳感器特性的適宜數學等式(例如等式8或10)擬合n個數據對，獲得參數q、Kd和l^/的值。在工廠處獲得的參數I^/取決于在工廠處使用的測量裝置，與用戶處的測量無關。特別有利的是不用單個傳感器而是用代表性數量的傳感器確定參數q和Kd的情況。通過平均單個傳感器的q和Kd值，獲得這些參數的平均值，該值可被指定給以相同方式制造的多個傳感器。因此，有可能通過工廠處校準確定相對特性(為參數q和&或pK的形式)，并將其連同傳感器一起提供給用戶，例如以條碼的形式。如果隨后將來自以相同方式制造的一組傳感器的傳感器插入到用戶處的測量裝置中，則Lmw起初是未知的。其例如可以水性單點校準法直接測量。然后應知道描述有效特性的所有參數。如果校準介質被實際檢測中的樣品替代，并測量與樣品接觸的發光強度L,則可通過求解cS或pH由等式8或IO推斷分析物濃度。如果求解等式8的cS(設定Lm=LmW)，則人們可得到(11)"《((《-l)/(L/丄，-l)-l)因為在用于直接測定LmW的校準介質中必需的分析物濃度處于目標測量范圍之外，所以直接測定LmW經常不令人滿意。有利的是在處于預期樣品分析物濃度范圍中的分析物濃度實施單點校準。優選地，選擇的分析物濃度使cB/cD比率(等式6)具有0.1-0.9的值，甚至更優選具有0.3-0.7的值。采用在單點校準過程中于用戶處使用與已知分析物濃度cScal的校準介質接觸的濕傳感器測量的強度值Leal，以及由工廠校準知道的參數值q和Kd，由等式U計算Lmw。上述具有指示劑染料的光學傳感器的常規校準方法的缺點源于以下事實盡管大部分校準步驟已在工廠實施，但至少單點校準(用水性校準介質)仍必須在實際測量前于用戶處實施。這需要獲得和管理水性校準介質(操作、儲存、分配、再訂購、檢查有效期等)。本發明的方法克服了此缺點，在本發明方法中，在用戶處僅進行干校準步驟，而不進行濕校準步驟。附圖描述在下文中，將借助圖表和流程圖更詳細地描述本發明。圖la-lc顯示了對于本發明方法的不同副變更，作為pH值(在pH4.5-9.5的范圍內)函數的發光強度，其換算為pH傳感器的各個物質圖2顯示了作為離子濃度(mol/l)函數的發光強度，其換算為離子傳感器的各個物質的LmW=1，橫坐標為對數刻度。圖3顯示了6個個體pH傳感器的響應曲線(以相對發光強度Lrel換算，為時間t(秒)的函數)。圖4顯示了與圖3—致的換算的發光值，為pH值的函數。圖5顯示了如同圖4的圖，差異在于相對特性(實線曲線)以線性關系Lrel=U,+112口11表示。圖6顯示了兩組不同預處理的傳感器的換算發光強度Lrel(實線和符號)，為時間t的函數。圖7a和圖7b顯示了發光染料A41的合成途徑。實施例1(使用等式1-10的副變更1.1(圖la)、1.2(圖lb)和1.3(圖lc))在闡述了下文描述的副變更1.1、1.2和1.3的圖la-lc中，作為pH值的函數(即采用H+為非揮發性分析物)顯示了pH傳感器的個體物質的發光強度，其換算至I^w-l。曲線A代表相對特性，是個體物質A和B的發光強度L履和L服的和。其由等式10獲得，值7.4用于參數pK，值0.2用于參數q,并將等式10除以LmW。最低強度(右側)和最高強度(左側)之間的比率是參數q的值。曲線B是B物質的相對發光強度，為pH值的函數。曲線C是A物質的相對發光強度，為pH值的函數。由曲線B和C可以看出，對于pH<4.5的情況，基本上僅存在B物質，而對于pH〉9.5的情況，基本上只有A物質存在。曲線D是干傳感器中個體物質A和B的發光強度Lw和LBD的和，其在傳感器制造過程中為pH值的函數。為闡述目的，假定干態的B物質的發光強度大至濕態的1.25倍。根據染料和基質，其也可相等或更小。對于更高的pH值，干發光強度隨著發光較強的B物質濃度的下降而下降，而發光較差的A物質的濃度增加。由曲線E可見，在有限的pH范圍內(約pH7.0-7.8),相對特性可由通式Lw-a+b*pH的直線代表。在該范圍之外，所述特性不能由線性函數以足夠精確度近似。在各個圖中以*表示的測量值是工廠處值，無*的值屬于用戶處值。圖2圖解了離子傳感器的個體物質的發光強度，其換算至LmW=1,為離子濃度的函數。橫坐標為對數刻度。曲線A-D類似于圖la-lc的曲線。曲線A得自等式8,值0.0176用于參數Kd，值0.18用于參數q，并將等式8除以I^w。所述值取自US6,211,359的表1。等式8基本對應于US6,211,359的等式6，差異在于等式8未考慮干擾離子，以保持表達式簡化。等式8還對應于US6,171,866的等式4，差異在等式4中表達式是對數的。由曲線E可見，在有限的濃度范圍內(cS-約0.006-0.05mol/1),相對特性可以通式Lw=a+b.log(cS)的直線表示。在該范圍之外，所述特性不能用線性函數以足夠精確度近似。由于！^的定義(m指最大強度，即基本上僅存在B物質時的強度)，在以下的實施例1.1中描述了一種特別的情況，實施例1.2和1.3討論一般情況實施例1.1(圖la)令人驚奇的是，業已發現，對于以相同方式制造的并以相同類型的裝置測量的傳感器，比率(13)^mD/『=/=AD*/*是常數，可通過工廠處校準來確定。因此,換算因數LmW可由L^/R^w確定。因此，在用戶處，為測定換算因數Lmw將只需要單點干校準，而不需要校準介質。這意味著在用戶處獲得了發光-光學傳感器的真實干校準，使得用于單點校準的液體校準介質可一起省去。LmD*(相應地LmD)是用干傳感器于工廠處(相應地在用戶處)測量的最大強度值。如果傳感器的指示劑染料的裝配方式使得干態時指示劑的全部量都以B物質的形式存在，即發光指示劑染料基本上完全作為B物質存在，則可確定這些值，比率V=cB/cD(等式6)等于1,因為cD-cA+cB(等式5)。LmW*(相應地L^w)是用濕傳感器于工廠處(相應地在用戶處)測量的最大強度值。值1^/可在工廠處用與液體校準介質接觸的傳感器測量，所述校準介質的分析物濃度被調整得使潤濕后并達到平衡時(等式1(相應地等式2))基本上只有B物質存在，濕傳感器中的比率V-cB/cD(等式6)等于1。然后可由等式U計算L禮。具有指示劑染料的光學傳感器可表示為無分析物S的A物質或結合分析物S的B物質，其特性以等式8或等式IO給出，對于此光學傳感器，本發明的變更方法的特征在于以下事實在工廠校準當中，當指示劑染料基本上完全以B物質形式存在時，計算比值RmD/w(得自不用水性校準介質的強度值Lm/以及釆用水性校準介質的強度值LmW*)，使得在LmW=LmD/RmD/w的情況下等式8變成LmD可在g的用戶處單點干校準中確定，即不使用水性校準介質。如果傳感器的生產方式使得在干態時僅存在B物質，則在干態時測量的強度將為LmD。在工廠處用液體校準介質潤濕和平衡后，可由等式13直接確定RmD/w,其中選定所述液體校準介質的分析濃度，使得僅存在B物質。因此，本發明的第一個副變更(圖la)的特征在于在步驟a)i.中選擇傳感器SQ，其中發光指示劑染料基本上完全作為B物質存在，分析物或分析物類似物與B物質結合，在步驟a)ii.中獲得工廠處的干校準值L^、在步驟a)iii.中對于至少一種水性校準介質，選擇分析物S的濃度，使得在潤濕和平衡后基本上只有B物質存在，并^f企測工廠處的濕校準值LmW*，在步驟a)iv.中由工廠處的干校準值L^(和工廠處的濕校準值LmwH十算比值在步驟b)i.中獲得用戶處的干校準值L^D，和在步驟b)iii.中由LmD和比值R^w計算用戶處的換算因數LmW,并由發光測量值、用戶處的換算因數！^w和相對特性確定非揮發性分析物的濃度。實施例1.2(圖lb)在實施例1.1中，結合分析物S的B物質的濃度對指示劑總濃度D的比率V為1。換句話說在干態時指示劑染料完全以B物質的形式存在。典型地，光學傳感器的制造方式使得干態時比率V=cB/cD具有0.1-0.9的值，優選處于0.3-0.7之間。對于比率V的每個值，存在可用于由干態測量的強度Lo推斷最大濕發光強度LmW的值RD/W。如果cA趨于0，如在實施例1.1中所闡述的，則基本上僅存在B物質，并保持等式Rdzh-在等式13的變體中，人們由等式"(15)=1D/ivw『=*/Z/mPr*獲得比率RD/W,通過該比率可使相對特性與用戶處干校準值關聯。因此，本發明的第二個副變更(圖lb)的特征在于在步驟a)i.中選擇傳感器S。，其中指示劑染料以A物質和B物質的形式存在，分析物或其類似物結合B物質但不結合A物質，比率V=cB/cD(cD二cA+cB)是已知的，并處于0.1-0.9之間，優選處于0.3-0.7之間，在步驟a)ii.中獲得工廠處的干校準值Lj/,在步驟a)iii.中對于至少一種水性校準介質，選擇分析物S的濃度.，使得在潤濕和平衡后基本上只有B物質存在，并檢測工廠處的濕校準值Lmw、和在步驟a)iv.中由工廠處的干校準值LJ和工廠處的濕校準值！^wH十算比值RD/W,在步驟b)i.中獲得用戶處的干校準值LD,和在步驟b)iii.中由LD和比值Rrvw計算用戶處的換算因數Lmw,并由發光測量值、用戶處的換算因數！^w和相對特性確定非揮發性分析物的濃度。實施例1.3(圖lc)在上述實施例1.1和1.2中，必須選擇用于測量工廠濕校準值L,頁的分析物S的濃度，使得僅存在指示劑的B物質。設定校準介質中的分析物濃度，使得在潤濕和平衡(等式1或2)后基本上僅存在B物質，允許直接測量LmW*(參見上文a.iii下的內容)，這在實踐當中經常無法令人滿意，就某些傳感器或分析物而言是十分不利的或不可能的。其理由在于為了將平衡完全移向等式1的左側，在某些情況下應必須達到非常高的分析物濃度(〉1mol/l)。用于測量生理Na+濃度的Na+傳感器理想具有例如約0.150mol/1的Kd值。為將平衡(在等式1和2中)移向左側，使得基本上僅存在B物質，分析物濃度應必須高達Kd值的IOO倍，理想地達1000倍。在校準介質中獲得"mol/1或更高的分析物濃度既不實際也不可能，原因在于溶解度限制。作為另一個實例，采用pH傳感器(用H+作為非揮發性分析物)測定生理pH值，其理想地具有約3.4*10—8的Kd(相當于7.4的pK值)。為將平衡(在等式1和2中)移向左側，使得基本上僅存在B物質，分析物濃度必須高達Kd值的100倍，理想地達1000倍。將才交準介質中的分析物濃度(cH+)設定在3.4*10_8或更高(相當于pH4.4或以下)不存在問題，但是如果由于某些原因要避免弱酸性或強酸性校準介質則可能不合需要。當參數值q和Kd已知時(由工廠處校準獲得)，可選擇液體校準介質中的分析物濃度CSi，使得在工廠校準的過程步驟a)iii中，(在潤濕后)在濕傳感器中建立已知比率V=cB/cD，該比率優選位于0.1-0.9的范圍內，具體地說在0.3-0.7之間。特別有利的是選擇該濕態比率(過程步驟c)使其等于干態比率(過程步驟b)的情況。于是，該變更產生濕校準值Liw氣例如可使用等式12由1^*計fT承丹^mW。(16)丄**=Zw*(1+(-1)/(1+c《/。)因此，本發明的笫三個副變更(圖lc)的特征在于在步驟a)i.中選擇傳感器Sq,其中指示劑染料以A物質和B物質的形式存在，分析物或其類似物結合B物質但不結合A物質，物質濃度的比率V二cB/cD(cD-cA+cB)是已知的，處于0.1-0.9之間，優選處于0.3-0.7之間，在步驟a)ii.中獲得工廠處的干校準值IV5，在步驟a)iii.中用傳感器S。測量至少兩種具有已知不同分析物S濃度CSj的水性校準介質的發光強度，獲得至少兩個工廠處的濕校準值Liw^和在步驟a)iv.中由數值對Liw*、cS,獲得傳感器S。的相對特性和濕校準值LmW*，并由其計算對相同方式制造的所有傳感器Sn有效的相對特性，在步驟a)iv.中由干校準值L^和濕校準值L禮H十算比值RD/W,獲得在步驟b)i.中用戶處的干校準值LD，和在步驟b)iii.中由LD和比值RD/w計算用戶處的換算因數Lmw，并由發光測量值、干校準值LD、比值RVw和相對特性確定非揮發性分析物的濃度。實施例2(不使用等式1-10的副變更2.1和2.2)理論上推導的傳感器特性的函數等式的一個優勢在于，它們通常以足夠的精確度在可測量的分析物濃度的完整范圍內描述特性曲線的形態。但是，為了按照本發明進行干校準，不是絕對地必須使用以上的理論推導的等式。原則上，可使用替代的函數關系。至少在預期的分析物濃度范圍內，特性曲線形態可例如由一次或二次多項式、對數函ft、有理函數或這些函數的組合(例如Lw=a+b'cS、Lw=a+b'log(cS)、Lw=a+bcS+c'(cS)2或Lw=a+b.pH、Lw=a+b'log(pH)、Lw=a+b.pH+c-(pH)^足夠精確地代表。作為實例提及的函數與理論推導函數(例如等式8或IO)例如在以下情況下不同其參數集(a、b、c)不含可用作類似于、的換算因數的特定參數，此外與等式8的q和Kd相比個體參數不反映傳感器的具體特性。如果使用這種替代函數，且分析物濃度不可預期地處于理論范圍之外，則存在特性值與測量值不足夠緊密地關聯的風險，因此導致假結果。如果所述函數在預期的分析物濃度范圍內不能足夠緊密地近似特性形態，則結果將是不精確的。在以下條件下例如可使用替代函數誦理論推導函數無法獲得或已知不具有足夠精確度；-傳感器的動態范圍大于分析物濃度的預期范圍，替代函數以足夠的精確度代表了預期范圍內的特性形態。有兩種不同的方法，這兩種方法盡管在形式上和程序細節上不同，但基本上是等同的-通過干值標準化工廠處校準獲得的特性(參見實施例2.1),-通過干值標準化工廠處校準獲得的測量點(參見實施例2.2)。存在于干傳感器S。中的指示劑物質A和B的給定比率VD(等式6)將在干測量中產生強度LD。Ld是于給定比率Vo用干傳感器測量的發光強度，兩種指示劑物質A和B的濃度之間的比率對于以相同方式制造的多個傳感器Sn中的每個干傳感器都是相同的。與液體介質(即校準介質或控制介質)或含濃度為的待測分析物S的樣品接觸，在潤濕和平衡后于濕傳感器中建立A物質和B物質的新比率Viw，其中在濕傳感器中建立的比率V,w取決于樣品中的分析物濃度cSi和指示劑的解離常數Kd，并測量對應于比率Viw的發光強度LiW。因此，L,w是用與樣品接觸的濕傳感器測量的發光強度，所述樣品含待測濃度的分析物S。并因此在給定比率VD的情況下，每個比值Liw/LD都對應于樣品中某一濃度的分析物。比值LiW/LD基本上與上文在oc)和(3)項下提及的影響因素無關。為確定這些比值，必須用同一個傳感器并用相同測量裝置測量強度L;w和LD。對于干傳感器中的給定值VD,在比值Liw/L。和樣品中的分析物濃度之間存在一定的函數關系。實施例2.1在本發明方法的一個優選變更中，由多個以相同方式制造的傳感器Sn中選擇代表性數量的干傳感器SQ,在不用水性校準介質的情況下測量發光強度LD*。隨后，使每個傳感器S。與數量n的具有已知分析物濃度cSi的水性校準介質接觸，所述已知分析物濃度cSi至少分布在預期的待測量濃度范圍內，測量n個發光強度(1^*;i=l...n),產生n個數據對(cS^,L^;i=l...n)。通式為Lw*=f(P*,Pn*，cS或pH)(例如IV^P^+P^'cS或IV^PJ+P,pH)的適宜函數描述了傳感器特性的形態，使該函數擬合n個數據對，至少對待測分析物濃度范圍的一部分產生在工廠處獲得的有效傳感器特性參數P/,…，PJ的值。通過以干值L^換算由在工廠處獲得的有效特性獲得相對特性，即將所述特性除以干值LD*。例如將有效的工廠處特性L^-PJ+P/'cS除以LD*，即計算比率p,W和p2=P2*/LD*，換算過的特性是KP,"P2*.CS)/LD*=(p1+p2-cS)。在用戶處使用來自以相同方式制造的多個傳感器的干傳感器進行單點干校準(不用水性校準介質)，產生發光強度LD。將相對特性L^乘以在用戶處測量的干校準值LD,得到對用戶處有效的有效特性。繼續以上實例相對特性Lre,(p!+口2^3)乘以用戶處的干校準值LD。即相對特性的參數p,和p2乘以在用戶處測量的干校準值LD:P,=LD'Pl和P2-LD'p2;用戶處的有效特性是=LD《Pl+p2.cS)=(Ld.p,+Ld.P2'cS)-(p,+P2.cS)。因此，將用戶處的相對特性參比干校準值。通過求解等式的cS(或pH),并輸入與樣品接觸測量的發光強度值Liw,由用戶處的有效特性獲得分析物濃度。在本實例中cSi-(LlW為了能夠獲得特性參數P廣Pn的可信平均值，技術人員可選4奪代表性數量m個傳感器。理論上m=1是可能的，但實際上m將是一個較大的數字，這取決于給定的用途，m將》16，優選>40。在第二個變更的有利副變更中，提供選擇至少m個傳感器，在工廠處獲得m個干校準值LD*，并在干測量后使用n>2的不同水性校準介質中的至少兩種由每個傳感器獲得濕校準值Liw*，每個校準介質在所有選定傳感器的校準過程中使用至少1次。對于每個傳感器，由n>2的濕才吏準值Liw*t的至少兩個獲得通式Lw*=f(P,,...，Pn*，cS或pH)的有效特性，并對于每個傳感器，通過將有效特性除以干校準值IVH十算為通式Lrel=f(p!,Pn,cS或pH)的相對特性。隨后，通過平均個體傳感器特性系數PrPn獲得相對特性，該相對特性被指定給以相同方式制造的所有傳感器Sn的總體，即生產批量的傳感器。因此，本發明的笫二個變更的副變更(圖lc)的特征如下在工廠處-由大量以相同方式制造的多個傳感器中選擇至少m個傳感器S0;-測量各個逸定傳感器S。的無水性校準介質的發光強度，獲得每個傳感器的工廠處干校準值LD*;-對于各個選定傳感器，當其與n(n》2)種不同的水性校準介質中的至少2種接觸時測量發光強度，每個校準介質在所有選定傳感器的校準中使用至少1次，獲得每個傳感器的至少2個工廠處濕校準值L^;-對于各個選定傳感器，使描述傳感器特性形態的通式、*=f(PJ,…，P/，cS或pH)的適宜函數擬合數據對(cS,，Liw*)，對每個傳感器獲得有效工廠處特性的參數P/的值；-對于每個選定傳感器，有效工廠處特性以對應的工廠處干校準值1^*換算，獲得個體傳感器的通式Lrel=f(Pl，...，pn,cS或pH)的相對特性的參數P廣Pn;-通過平均個體傳感器特性的系數獲得相對特性，該相對特性被指定為以相同方式制造的所有傳感器S。的總體。在用戶處-對于來自以相同方式制造的多個傳感器Sn的傳感器S,,測量發光強度，獲得用戶處的干校準值Lo;-對于與水性樣品介質接觸的傳感器S,，測量發光強度Liw;-在工廠處獲得的相對特性以用戶處的干校準值LD換算，獲得在用戶處的有效特性的參數P廣Pn的值，該有效特性具有通式Lw=f(P,,…,Pn,cS或pH);-通過求解通式Lw=f(P,,Pn,cS或pH)的等式的cS或pH(cS或pH=f(P,,Pn,Lw))，并輸入用戶處的發光測量值LlW,計算分析物濃度。實施例2.2在本發明的一個特別優選的變更中，以下在實施例2.1中所概述方法的變更也是可能的。由具有數目n的校準液的工廠處濕校準值I^/和工廠處干校準值IVH十算第一個比值，濕值對干值的這些比率與分析物濃度或pH值之間的函數關系以表的形式表示，或以通式Lrel=f(ulv..,un,cS或pH)的適宜函數形式表示。在本發明方法的此變更中，至少一個干傳感器S。選自以相同方式制造的多個傳感器，不用水性校準介質測量發光強度LD*。隨后，使傳感器與數目n的水性校準介質接觸，所述水性校準介質具有已知的分析物濃度cSi,該分析物濃度cSi至少分布在待測濃度的預期范圍內，測量n個發光強度(1^*;i-l…n)，產生n個數據對(cSi^，LlW*;卜l...n)。對于每個選定的傳感器SQ，將測量的發光強度LZ除以LD*，獲得比值U,-L^/L^;i=L,n,并因此獲得n個數據對(cS,，U,;i=1,…,n)。然后，使描述傳感器相對特性的通式Lr,f(U,，...,Un,cS或pH)的適宜函數(例如Lrel=*+ivcS或Lrel=+ivpH)擬合獲得的數據對，獲得相對特性的參數U廣、的值。在用戶處，使用干傳感器Sn進行單點干校準(不用水性校準介質)，獲得發光強度L0，其為用戶處的干校準值；然后使傳感器接觸含具有(未知)濃度cSi的分析物S的樣品，并進行濕測量，即其中傳感器與水性樣品接觸的測量，獲得發光強度Liw,即發光測量值。由樣品強度值Liw和干強度值Lo計算比率U^Liw/LD。使用參比干強度值的樣品強度值Ui和也參比干值的通式Lrel=f(Ul，...,un,cS或pH)的特性，通過求解cS或pH推斷分析物濃度或pH值。本變更和實施例2.1所述變更之間的基本差異如下在2.1中，通過用n個水性校準介質測量n個校準值，計算參數PJ-P/,并通過以工廠處測量的干值換算有效特性得到通式l^-f(Pl,pn,cS或pH)的相對特性，獲得通式Lw*=f(P,*,Pn*，cS或pH)的有效工廠特性；而在2.2中，首先以工廠處測量的干值換算n個個體濕校準值(即n個濕校準值除以干值L/,獲得n個比值)，然后通過將n個比值擬合為通式Lrel=f(Ul,un,cS或pH)的相對特性，獲得相對特性。在本發明的另一個有利實施方案中，提議在工廠處選擇至少m個傳感器，獲得m個干校準值ti,i=l-m，用n>2種不同水性校準介質中的至少一種由每個傳感器獲得濕校準值，每個校準介質使用至少1次，使得獲得k》n個濕校準值kij,j=l-n,由個體對ti、^計算比值ki/t,，由這些比值獲得傳感器的相對特性。選定傳感器的數目是m(m可為1,典型地為〉1,實際上為灃交大的數，例如>16,優選地>40，取決于應用，以便獲得代表性平均值)，選定傳感器的下標i為l-m。因此，將有m個干校準值ti,i-l-m。不同的水性校準介質的數目為n>2,水性校準介質的下標j為j-l-n。因此，有k》n個濕校準值kij和k個比值k;/ti。下表列出了2、3和5種校準介質的值:<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>因此，本發明該變更的副變更的特征如下在工廠處-由相同方式制造的多個傳感器中選擇至少m個傳感器S0;-對于每個選定傳感器，不用水性校準介質測量發光強度，獲得每個傳感器的工廠處干校準值LD*;-對于每個選定傳感器，當其與n(n》2)種不同的水性校準介質中的至少1種接觸時測量發光強度，每個校準介質在所有選定傳感器的校準中使用至少1次，獲得每個傳感器的至少一個工廠處的濕校準值L^;-由個體傳感器的工廠處干和濕校準值計算比值=Liw*/LD*;-使描述相對傳感器特性形態的通式Lrel=f(Ul，...，un,cS或pH)的適宜函數擬合所有m個傳感器的比值U,，獲得參數u,，...,Un的值；在用戶處-對來自相同方式制造的多個傳感器Sn的干傳感器S,測量發光強度，獲得用戶處的干校準值LD;-對于與水性樣品介質接觸的傳感器Sp測量發光強度Liw,荻得發光測量值；-以干值LDj換算發光測量值LlW，獲得比值Ui，通過將比值Ui輸入通式Lrel=f(Ul，…，un,cS或pH)的等式，并求解cS或pH(cS或pH=f(Ul,un,Lrel))，計算分析物濃度。應指出的是，在用戶處的實際樣品測量中，僅最后3步必須實施，因為得自工廠處校準的值以合適形式和傳感器一起提供，例如為以條碼、磁性或電子碼載體或ROM-Key編碼的批特有校準信息。在2.2中描述的變更具有某些優勢，尤其是如果在工廠處校正中獲得的特性參數不僅來自一個傳感器S。，而是更實際地來自統計學代表性數目的傳感器，并指定給全體傳感器。實施例3在該實施例中，描述了適于本發明的指示劑染料的化學合成、其與纖維素纖維的固定、干光學傳感器片(disc)的制備以及使用如此獲得的光學傳感器進行的pH、Na+、〖+和03++測量。3.1.具有下式的DH敏感型發光染料A41的合成化學物質DCM(二氯曱烷)RiedeldeHaen24233〉99%;TFA(三氟乙酸)Fluka91700〉98%;NHS(N-幾基琥珀酰亞胺)Fluka56480>97%;DIC(二異丙基碳二亞胺)Fluka38370〉98%;DMAP(4-二曱基氨基吡咬)Fluka39405〉98%;DIPEA(二異丙基乙胺):Fluka03440>98%;乙腈Merck-HPLC級；4-氨基曱基苯曱酸:Fluka:08400〉98%;S0C12:Fluka:88950〉99%;無水EtOH:RiedeldeHaen:32221;TEA(三乙胺)Merck:808352;S02C12:Fluka:862212;一水合肼Fluka:53850;鄰苯二甲酸酐Fluka:80020;鹽酸酪胺Fluka93820〉97%;NMP(N畫曱基吡咯烷酮):Fluka:69116;4-Cl-l,8-萘二曱酸酐Aldrich:19,149-395%。合成途徑示于圖7a和7b。鹽酸4-氨基曱基苯甲酸乙酯n):將20.0g(132mM)4-氨基甲基苯甲酸懸浮在200ml無水乙醇(EtOH)中，并用水冷卻。滴力。28.0g(17ml)(236mM)亞硫酰氯。然后回流澄清的混合物3小時。在冷卻至室溫后，蒸發EtOH。加入:50ml曱苯/EtOHl/l,蒸發3次。干燥殘余物，得到27g(1)。4-Cl-萘二曱酰亞胺-甲基苯甲酸-乙酯(2):將20.0g(93.2mM)鹽酸4-氨基曱基苯曱酸乙酯、21.68g(93.2mM)4-Cl-l,8-萘二曱酸酐和19.78g三乙胺(195.5mM)的400mlDMF溶液加熱至90。C，并過夜攪拌。在冷卻至室溫后，加入100mlH20,以沉淀目標產物。由EtOH重結晶4-Cl-萘二甲酰亞胺-曱基苯甲酸乙酯(2)。產量15.8g。HPLC(Vydac10-90-15)顯示出于t=14.04的單峰，用malditof質譜觀察到質量峰MH+=394.8(M=393.82)。酪胺苯鄰二曱酰亞胺(3):將29.6g(200mM)鄰苯二甲酸酐、34.73鹽酸酪胺(200mM)和27.7ml三乙胺(200mM)加熱至115。C達4小時。在冷卻至室溫后，將混合物傾入1.51冰水中。過濾沉淀物(3)，用水清洗。產量45g。二氯酪胺苯鄰二曱酰亞胺(4):將15.35g(57mM)酪胺苯鄰二曱酰亞胺(3)緩慢并分部地加入到24.75g(170mM)煮沸的磺酰氯和75mlCHCl3中。繼續回流，直至混合物變澄清。然后，于室溫過夜敞開攪拌溶液，以去除磺酰氯。通過蒸發去除溶劑，粗產物(4)由75mlMeOH重結晶。產量7.2g。二氯酪胺(5):在170ml無水EtOH中過夜回流7.2g二氯酪胺苯鄰二曱酰亞胺(4)和1.6ml—水合肼。在冷卻至室溫后，濾出沉淀物。粗產物(5)不用純化就用于下一步合成。A-040:將1.5g(7.26mM)二氯酪胺(5)、2.85g4-氯萘二甲酰亞胺曱基苯曱酸乙酯(2)和4mlDIPEA在l50mlNMP中的混合物加熱至90。C達4天。在冷卻至室溫后，加入1.51水和7ml乙酸(AcOH)。濾出沉淀物，并溶解在400mlCHC13中。用0.5NNaOH提取有機層3次，用6NHC1酸化NaOH層。用乙酸乙酯提取水層，含染料的有機層經MgS04干燥。溶劑通常蒸發去除。最后，粗品A-040經干快速硅膠柱層析純化。沖弟度石油醚石油醚/乙酸乙酯9/1;石油醚/乙酸乙酯8/2;石油醚/乙酸乙酯7/3;石油醚/乙酸乙酯1/1HPLC(Vydac:10-90-15)顯示了于t=13.42分鐘的單峰，通過malditof測量觀察到質量峰M=563(M=563)。A國041:將A-040溶解在50ml乙腈和50ml1NNaOH中。溶液加溫至60°C,并攪拌1小時。然后，用HC1酸化溶液，并用乙酸乙酯提取。用水清洗含染料的乙酸乙酯層3次。在經MgS04干燥有機層后，通過蒸發去除溶劑。產量350mg。HPLC(Vydac:10-90-15)顯示了于t=11.3分鐘的單峰，通過malditof測量觀察到質量峰MH+=535.4(M=534.4)。3.2.Na+敏感型發光染料4-M'-『4"-C-氮雜-15-冠-51-3"-曱氣基苯基-乙氨基l-1',8'-萘胺-甲基}苯曱酸的合成使用的Na+傳感器描述于US5,952，491(Leiner等)。Na+敏感型PET指示劑染料制備的準確描述以及傳感器的光i普和測量數據可見于Anal.Chem.75,549-555，2003He等，"Afluorescentchemosensorforsodiumbasedonphotoinducedelectrontransfer"。3.3.K+敏感型發光染料的合成使用的K+傳感器描述于US6,211,369(He等)。K+敏感型PET指示劑染料制備的準確描述以及傳感器的光譜和測量數據可見于出版物J.Am.Chem,Soc.125，1468-1469,2003,支才寺信息,He等，"Afluorescentsensorwithhighselectivityandsensitivityforpotassiuminwater"。3.4.03++敏感型發光染料的合成。3++敏感型指示劑染料如US6,171,866(He等)所述制備。3.5.氨基纖維素纖維的制備氨基纖維素纖維如SUl,O28，677、CA".l77723b所述制備。3.6.pH、Na+、K+和03++敏感型指示劑染料在氨泉纖維素纖維上的固類似于US6,211,359(He等)中的實施例18進行全部4種染料與氨基纖維素纖維的固定。3.7.建立相應的指示劑物盾A和B的已知比率為了建立A物質和B物質的已知比率V(等式6),在固定指示劑染料后，用含合適濃度的相關分析物的水性介質清洗攜帶指示劑的纖維，使得在達到平衡(等式1和2)后建立期望的指示劑物質A和B的濃度比率。隨后，通過與去離子水短暫接觸淋洗纖維并干燥，這不改變兩種指示劑物質的已確立比率。或者，還有可能先生產整個傳感器，用含適宜濃度的相關分析物的水性介質清洗傳感器，使得在達到平衡(等式1和2)后建立期望的指示劑物質A和B的濃度比率，隨后干燥傳感器。為建立A物質和B物質的某一比率，例如對pH傳感器而言，有可能用具有已知pH的酸、堿或緩沖液平衡傳感器或原料(例如攜帶指示劑的纖維、顆粒等)。對于離子傳感器而言，可用含適宜濃度的待測離子的水性溶液平衡原料(相應的傳感器)。或者，對于US5,952,491(Leiner等)、US6,211,359(He等)、US6,171,866(He等)描述的PET指示劑染料而言，有可能在沒有待測離子的情況下，用酸(例如HC1)或pH緩沖溶液建立兩種物質A和B的某一比率。這是有可能的，因為離子載體部分的自動結合的氮原子是pH活性的。自動結合的N原子的pK值例如約為5。與酸性液體接觸時氮被質子化，PET作用被消除。質子化物質的發光對應于結合分析物(待測離子)的B物質的發光。因此，對用于金屬陽離子的具有pH活性離子載體部分的某些發光指示劑，有可能利用質子建立弱和強發光指示劑物質的預定比率。質子用作分析物-類似物。3.8.H+(pH)、Na+、K+和03++敏感型光學傳感器(傳感器片)的制造類似于US6,211,359(He等)的實施例19進行4種傳感器的制造。將具有實施例3.7的固定化指示劑的、篩分過的0.5g(25pm)纖維素粉懸浮在9.5g的10%親水性聚醚-聚尿烷-共聚物的90%乙醇-水溶液中持續16小時。這種聚醚-聚尿烷共聚物可得自例如CardioTechInternational,Inc.Woburn,MA,U.S.A。獲得的均勻分布物包被在聚酯薄片(Melinexfoil，ICIAmerica)上,最終的干層厚度為10pm。該薄片用在10%聚醚-聚尿烷共聚物的90%乙醇-水溶液中的3%炭黑涂層，涂層干厚度為5iiim。然后穿出3mm直徑的小片。制備傳感器片的方法由M.J.P.Leiner和P.Hartmann描述于SensorsandActuatorsB,11(1993),281-189("TheoryandPracticeinopticalpHsensing")。3.9.含H+(pH)、Na+、K+和。3++敏感型光學傳感器陣列的一次性測量室的制造把實施例3.8的傳感器片放入到一次性塑料測量室中。所述室由注射成型的頂部和底部、傳送校準物和樣品的通道、可密封的進口和出口組成。底部具有圓柱腔，用于鑲嵌傳感器片。將H+(pH)、Na+、K+和。3++敏感型傳感器片放入腔中后，底部和頂部粘合在一起，形成最終的測量室。相應指示劑染料的照射和較長波長發光的收集通過所述室的底部進行。在組裝后，一次性室在含適宜干燥劑的密閉容器中放置幾天，以使傳感器進一步干燥，降至期望的濕度水平。在干燥后，密封進口和出口，將所述室連同適宜的干燥劑儲存于密閉容器中，直至使用。或者，還有可能在組裝一次性室后立即密封進口和出口，并將所述室儲存在含干燥劑的密封包裝中，直至使用。在此情況下，干燥通過密封材料和/或通過塑料材料發生。由于塑料的低水透過性，所以干燥過程將耗時更長(即幾周)。制作一次性測量室的方法由M.J.P.Leiner描述于SensorsandActuatorsB,29(1995),269-173("Opticalsensorsforinvitrobloodgasanalysis")。3.10.測量裝置中一次性室的干和濕測量為進行測量，將一次性室放入到不透光的恒溫測量室中。將進口和出口連^妄至射流系統，以允許通入具有不同pH值和/或不同石成離子濃度的水性溶液。對于每個通道(傳感器)，光學測量系統都由作為光源的藍色LED、作為檢測器的光電二極管、用于選擇波長的濾光器、用于將激發光導入傳感器的指示劑染料中并將發射光導入光檢測器中的光學裝置以及用于電子信號加工的裝置組成。在激發結束時使用干涉濾光片(峰值傳輸為480nm),在發射結束時使用520nm截止濾光片。3.11.采用pH傳感器的測量結果在圖3中，顯示了6個個體pH傳感器在干態時以及在采用水性流體的平衡期當中作為時間t(以秒測量)函數的響應曲線(作為時間函數的發光強度)，所述pH傳感器選自以相同方式制造的多個傳感器。以2秒的時間間隔測量強度值。對于該組傳感器(參見3.7項)，用HC1(pH約為3)清洗攜帶指示劑(纖維素纖維)的材料，然后把其放入傳感器層中。因此，在該組的干傳感器中僅存在B物質。因此，在干傳感器中比值V-cB/cD等于1(等式6)。在將與干燥氣態介質接觸儲存的傳感器放入到測量裝置中后，將它們于37。C恒溫(未顯示)，照射并測量干發光強度(此時間間隔為0-60秒)。然后，用水性液體(每個傳感器不同)替換氣態介質。在時間間隔60-240秒當中，發生傳感器對流體pH值的平衡。用不同干傳感器測量的強度是不同的(未顯示)。為明晰表達式，換算圖3的響應曲線，使得顯示的干強度平均值具有值1.15。該值1.15代表(等式U的)比值Rm磨。在此背景下的換算指以2秒間隔測量的強度值乘以因數(==1.15/在時間間隔0-60秒內的干強度平均值)。使用2組樣品流體。具有pH值7.18、7.41、7.59的組別由水性電解液組成，所述電解液典型地用于血液參數測量中的控制和校準用途(參見例如US6,174,728)。具有pH值6.84、7.15、7.18的組別由具有生理值的Na+、K+、Ca^和Cr的HEPES緩沖液組成。在時間間隔60-240秒內，同時發生兩個步驟，即潤濕和對流體pH值的平衡。在時間間隔230-240秒當中，這些步驟基本上已結束。在此間隔中的發光強度是樣品的濕強度。由曲線形態可觀察到，平衡步驟的動力學實際上取決于樣品類型。在圖4的曲線圖中，將圖3的換算過的發光值對橫坐標上的pH值作圖。三角形符號表示在實例中質子化的B物質獨自以干態存在。實心三角形(相應地虛線)表示干校準值1^0*和LmD。于干態時沒有pH依賴性！空心三角形表示僅存在質子化B物質時的濕校準值LmW*。方形符號表示平衡后個體傳感器的強度Liw*,其通過干值換算。實線是依據等式10的相對特性，其中1^禱*等于1。通過最小二乘法使等式10擬合方形符號表示的測量數據，獲得特性的參數q和pK。近似產生結果q=0.17，pK=7.08。至于存在的B物質，干強度1^0*和Lmo大于濕強度LmW至Rm魔M.15的倍數。按照實施例1.1，相對特性(等式IO)以參數L禱-I、q=0.17、pK=7.08給出，比率R^/wM.15。圖5的曲線圖對應于圖4的曲線圖，差異在于等式Lre廣u,+ivpH用于表示相對特性(實線)。為對比原因，圖4的相對特性顯示為虛線。按照實施例2.2，相對特性以參數3.59和u2=-0.42給出。在有限的pH范圍6.3-7.6中，該特性的形狀近似于圖4的特性形狀。圖6顯示了具有不同預處理的兩組傳感器的發光強度Lrej(組a:實線；組b:符號)。在組a(參見實施例3.7)中，指示劑的載體(纖維素纖維)在被放入到傳感器層當中之前用HC1(pH約為3)清洗。結果在該組的干pH傳感器中僅存在B物質。在組b(參見實施例3.7)中，指示劑的載體(纖維素纖維)在被放入到傳感器層當中之前用磷酸鹽緩沖液(pH約為7.4)清洗。因此，兩種指示劑物質的比率V=cB/cD(等式6)在該組的干傳感器中實現。在將與干氣態介質接觸儲存的傳感器放入到測量裝置中后，將它們恒溫至37。C(未顯示)，用藍光照射，并以2秒的時間間隔測量作為時間函數的發光強度。以0-60秒的時間間隔干燥傳感器。在60-70秒的間隔內用樣品液體^,換氣態介質(在該時間內未進行測量)。以時間間隔70-240秒發生潤濕和傳感器對樣品pH值的平衡。每組3個傳感器的潤濕和平衡用水性電解液(pH值7.18、7.41、7.59)進行，所述電解液典型地在血液參數測量裝置中用于控制和校準用途(描述于US6,174,728)。不同干傳感器的測量強度是不同的(未顯示)。圖6中每條曲線的測量強度以2步標準化。步驟1:平均每個干傳感器測量的最后10個值。然后將曲線的所有測量值除以平均值。步驟2,組a:平均pH值7.41曲線的濕傳感器測量的最后10個值。然后將組a的全部3條曲線除以該平均值。步驟2,組b:組b的3條曲線類似于組a處理。由選定的表達式可見，在平衡后，兩個組的相對強度基本相同，與樣品流體的pH值相關。而且，顯然(正如所料)，組a的干強度大于組b的干強度兩組具有相同量的指示劑染料；在組a中，染料以強發光B物質存在，而在組b中，有強和弱發光物質的混合物。表l:含組a的測量的干和濕強度，如圖6所示。在該組別的干pH傳感器中，僅存在B物質。通過將測量濕值除以對應的測量干值，獲得濕/干強度比率(例如463944/172253=2.69)。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表l表2:含組a的濕值，如圖6所示，其通過干值被標準化。干值被標準化為1(例如463944/463944=1)。通過將表1的測量濕值除以表1的對應干值獲得標準化濕值(例如172253/463944=0.371)。通過將標準化干值除以標準化濕值獲得干/濕強度比值(例如1/0.371=2.69)。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表2表1和表2的對比表明，獲得等同的干/濕比值，與是否通過將測量濕值除以測量干值荻得該比值無關，或與是否首先通過干值標準化測量濕值然后通過除以標準化值計算比值無關。標準化允許以圖形形式對比具有不同發光強度的傳感器的測量曲線或測量數據。表3:包含如圖6中提出的組b的濕值，其通過干值標準化。在該組別的干pH傳感器中，A物質和B物質都存在。pH標準化的干強度標準化的濕強度干/濕強度比7.1810.5031.997.4110.3992.517.5910.3382.96表33.12.Na+傳感器的測量結果表4:用于測定水性樣品中Na+離子濃度的傳感器的標準化干強度和濕強度。cNa+[mmo1/1]標準化的干強度標準化的濕強度干/濕強度比12210.2903.4514310.3193.1315510.3382.96表43.13.K+傳感器的測量結果表5:用于測定水性樣品中K+離子濃度的傳感器的標準化干強度和濕強度。cK+[mmo1/1〗標準化的干強度標準化的濕強度干/濕強度比3.010.3462.894.910.3832.615.910.4012.49表53.14.Ca+M專感器的測量結果表6:用于發光-光學測定水性樣品中離子化03++的傳感器的標準化干強度和濕強度。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>表63.16.cr傳感器的測量結果表7:用于測定水性樣品中Cl—離子濃度的傳感器的標準化干強度和濕強度。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>表7使用的Cl—傳感器描述于美國專利笫6,613,282號(Huber)。權利要求1.用光學傳感器測定水性樣品介質中存在的非揮發性分析物濃度的方法，所述光學傳感器包含發光指示劑染料，并在用戶處利用單點校準法校準，所述發光指示劑染料的發光依賴于分析物濃度，所述方法包括在用戶處檢測干傳感器的發光，獲得用戶處的干校準值，在用戶處獲得與水性樣品介質接觸的傳感器的發光測量值，并由發光測量值、在工廠處獲得的濕對干的關系和用戶處的干校準值推斷非揮發性分析物的濃度。2.權利要求l的方法，所述方法包括a)在工廠處i.由多個以相同方式制造的干傳感器Sn中選擇代表性數量的干傳感器S。；ii.檢測各個選定干傳感器S。的發光，獲得工廠處的干校準值；iii.隨后，在與至少兩種水性校準介質接觸后檢測各個選定傳感器S。的發光，獲得工廠處的濕校準值，所述水性校準介質具有已知不同濃度的非揮發性分析物；iv.由工廠處的濕校準值和工廠處的干校準值獲得傳感器S。的濕對干關系，該該濕對干關系被視為以相同方式制造的所有傳感器Sn的濕對干關系；b)在用戶處i.檢測來自以相同方式制造的多個傳感器Sn的干傳感器S,的發光，荻得用戶處的干校準值；ii.獲得與水性樣品介質接觸的傳感器S,的發光測量值；和iii.由發光測量值、用戶處的干校準值和由工廠處獲得的濕對干關系計算水性樣品介質中存在的非揮發性分析物的濃度。3.權利要求2的方法，其中所述濕對干關系包括相對特性和比值，所述方法還包括在步驟a)iv.中由工廠處濕校準值獲得傳感器S。的相對特性，該相對特性被視為以相同方式制造的所有傳感器S。的相對特性；并由工廠處濕校準值和工廠處干校準值得出比值，該比值被視為以相同方式制造的所有傳感器Sn的比值；和在步驟b)iii.中由發光測量值、用戶處的干校準值、相對特性和在工廠處獲得的比值計算水性樣品介質中存在的非揮發性分析物的濃度。4.權利要求3的方法，所述方法包括在步驟a)i.中選擇傳感器S。，其中發光指示劑染料基本上完全作為B物質存在，分析物或分析物類似物與B物質結合，在步驟a)ii.中荻得工廠處的干校準值LmD*，在步驟a)iii.中選擇至少一種水性校準介質的分析物S的濃度，使得在潤濕和平衡后基本上只有B物質存在，并檢測工廠處的濕校準值LmW*，在步驟a)iv.中由工廠處的干校準值I^/和工廠處的濕校準值！^wH十算比值在步驟b)i.中獲得用戶處的干校準值I^D，和在步驟b)iii.中由L^和比值Rm磨計算用戶處的換算因數LmW,并由發光測量值、用戶處的換算因數！^w和相對特性測定非揮發性分析物的濃度。5.權利要求3的方法，所述方法包括在步驟a)i.中選擇傳感器SQ,其中發光指示劑染料以A物質和B物質的形式存在，分析物或分析物類似物結合B物質但不結合A物質，B物質濃度(cB)相對于發光指示劑染料總濃度(cD)的比率V(V-cB/cD)是已知的，處于0.1-0.9之間，優選處于0.3-0.7之間，其中cD是以A物質形式存在的發光指示劑染料的濃度(cA)和以B物質形式存在的發光指示劑染料的濃度(cB)的和，在步驟a)ii.中獲得工廠處的干校準值L/,在步驟a)iii.中選擇至少一種水性校準介質的分析物S的濃度，使得在潤濕和平衡后基本上只有B物質存在，并檢測工廠處的濕校準值LmW*，在步驟a)iv.中由工廠處的干校準值L^和工廠處的濕校準值1^/計算比值RD/w,在步驟b)i.中獲得用戶處的干校準值Lo，和在步驟b)iii.中由LD和比值R，計算用戶處的換算因數Lmw，并由測量發光值、用戶處的換算因數L碰和相對特性確定非揮發性分析物的濃度。6.權利要求3的方法，所述方法包括在步驟a)i.中選^t奪傳感器S。，其中發光指示劑染料以A物質和B物質的形式存在，分析物或其類似物結合B物質但不結合A物質，B物質濃度(cB)相對于發光指示劑染料總濃度(cD)的比率V(V-cB/cD)是已知的，處于0.1-0.9之間，優選處于0.3-0,7之間，其中cD是以A物質形式存在的發光指示劑染料的濃度(cA)和以B物質形式存在的發光指示劑染料的濃度(cB)的和，在步驟a)ii.中獲得工廠處的干校準值LD*，在步驟a)iii.中檢測傳感器S。對至少兩種水性校準介質的發光強度，所述水性校準介質具有已知不同的分析物S濃度cS,,獲得至少兩個工廠處的濕校準值1^*,和在步驟a)iv.中由數值對LlW*、cSi獲得傳感器S。的相對特性和工廠處的濕校準值Lmw承,并由其計算對相同方式制造的所有傳感器Sn有效的相對特性，及由工廠處的干校準值L/和工廠處的濕校準值1^/計算比值R。/w,獲得在步驟b)i.中用戶處的干校準值LD,和在步驟b)iii.中由LD和比值RD/w計算用戶處的換算因數I^w,并由發光測量值、用戶處的換算因數L碰和相對特性測定非揮發性分析物的濃度。7權利要求2的方法，所述方法包括在步驟a)iv中由工廠處的濕校準值和工廠處的干校準值獲得傳感器S。的相對特性，該相對特性被視為以相同方式制造的所有傳感器Sn的相對特性；和在步驟b)iii.中由發光測量值、用戶處的干校準值和在工廠處獲得的相對特性計算水性樣品介質中存在的非揮發性分析物的濃度。8.權利要求2的方法，所述方法包括在步驟a)iv中計算工廠處的濕校準值和工廠處的干校準值的比值；并由該比值獲得傳感器S。的相對特性，該相對特性被視為以相同方式制造的所有傳感器S。的相對特性；和在步驟b)iii.中由用戶處的干校準值和發光測量值計算用戶處的比值；并由用戶處的比值和相對特性計算水性樣品介質中存在的非揮發性分析物的濃度。9.權利要求7或8的方法，所述方法的特征在于，在工廠處選擇至少m個傳感器，并獲得m個干校準值ti,其中i-l-m，以及用n>2種不同水性校準介質中的至少1種由每個傳感器獲得濕校準值，每種校準介質使用至少1次，使得獲得k》n個濕校準值k,j，j=l-n,并由各對t,、kij計算比值k/t,，由這些比值得出傳感器的相對特性。10.權利要求5或6的方法，其特征在于，為在傳感器Sn中建立A物質和B物質的預定已知比率V=cB/cD，其中cD=cA+cB,用水性清洗介質清洗攜帶指示劑的基質或傳感器，所述水性清洗介質包含適宜濃度的分析物或分析物類似物，預定比率在平衡后建立，并通過干燥攜帶指示劑的基質或傳感器固定。11.權利要求10的方法，其特征在于，對于pH傳感器，使用具有已知pH值的酸、堿或緩沖液作為清洗介質。12.權利要求10或11的方法，其特征在于，對于多個以相同方式制造的傳感器Sn的每個干傳感器，A物質和B物質的比例基本相同，并隨時間推移恒定。13.權利要求1-12中任一項的方法，其特征在于，光學傳感器以干態儲存于工廠處和用戶處。14.權利要求1-13中任一項的方法，其特征在于，用于測定非揮發性分析物的至少一種光學傳感器與用于測定揮發性分析物如o2或C02的濃度的傳感器組合使用，或者以接合傳感器配置使用。全文摘要本發明涉及一種使用光學傳感器測定水性樣品介質中的非揮發性分析物濃度的方法，所述光學傳感器包含發光染料，在用戶處利用單點校準法校準。為能使用戶完全免去所有的校準介質，在用戶處用與水性或血類樣品介質接觸的傳感器獲得發光測量值，該值參比于在工廠處獲得的相對特性和在用戶處獲得的干校準測量值，由這些數據推斷非揮發性分析物的濃度。文檔編號G01N21/64GK101213439SQ200680024288公開日2008年7月2日申請日期2006年7月4日優先權日2005年7月7日發明者J·K·圖薩,M·J·-P·萊納申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司