反應容器中的分注方法及反應容器處理裝置的制作方法

專利名稱：反應容器中的分注方法及反應容器處理裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種使用適于以化學反應為主、在醫療現場等進行各種自 動分析例如基因分析的研究或臨床的反應容器，用于檢測以人為主以及動物或植物的基因組DNA的多態性、特別是SNP (單堿基多態性)的反應 容器處理裝置。可以使用檢測出的基因多態性檢測結果進行患病率的診 斷、給藥的種類與效果及副作用的關系的診斷等。
背景技術：
作為利用基因多態性來預測疾病的患病容易度等的方法或裝置，提出 了如下所述的方法或裝置。為了決定患者是否容易患上敗血病及/或敗血病是否快速進展，從患 者身上采集核酸樣品，檢測該樣品中的2型(pattern)等位基因或與2型 等位基因連鎖不平衡的標記基因，如果檢測出2型等位基因或與2型等位 基因連鎖不平衡的標記基因，則判斷為該患者容易患敗血病(參照專利文 獻1。)。為了診斷人的flt—l基因中的1或1以上的單核苷多態性，通過決定 人核酸的1或1以上的位置1953、 3453、 3888 (分別按照EMBL受理 編號X51602中的位置)、519、 786、 1422、 1429 (分別按照EMBL受理 編號D64016中的位置)、454 (按照序列編號3)及696 (按照序列編號5) 的序列，參照flt—1基因中的多態性，決定此人的體質(參照專利文獻2。)。有關于鑒別SNP位點的堿基即分型的很多手法的報道。下述方法為其中具有代表性的手法。為了使用較少量的基因組DNA，對涉及到數十萬處的SNP位點進行 分型，使用基因組DNA及多對引物同時擴增至少包括一個單堿基多態性 位點的多個堿基序列，使用擴增后的多個堿基序列，利用分型工序辨別該
堿基序列中含有的單堿基多態性位點的堿基。作為該分型工序，使用侵入(invader)法或熒光定量PCR法(Taqman PCR法)(參照專利文獻3。)。 專利文獻1: JP特表2002 — 533096號公報 專利文獻2: JP特開2001—299366號公報 專利文獻3: JP特開2002—300894號公報 專利文獻4: JP專利第3452717號公報本發明人等提出了一種以化學反應的測定或自動地檢測基因多態性 為目的，適于自動進行化學反應的測定或基因多態性檢測的反應容器。該反應容器至少具備設有多個使樣品反應的反應孔(well)的反應部。 使用時將比重低于反應液的礦物油等不揮發性液體分注于反應孔從而覆 蓋反應液的表面。這樣的反應容器為基因多態性診斷用反應容器的情況下，反應孔的尺 寸例如微小至直徑100pm 2mm,深50, 1.5mm。向這樣的反應孔中分注反應液例如微量達0.1 5|iL左右。如果想用 噴嘴分注這樣微量的反應液，有時在噴嘴的頂端附著液體，不能順利地分 注到反應孔中。另外，如果想要使噴嘴的頂端接觸反應孔再使反應液向反 應孔移動，那么在配置反應相關的物質的情況下，噴嘴的頂端如果接觸反 應孔的底面則會發生污染。在反應孔中，為了防止在反應中反應液揮發而分注礦物油等不揮發性 液體。此時，該不揮發性液體的分注量也微量至例如1 10&左右，而且 不揮發性液體的粘度高，不能從噴嘴頂端分離液體，難以正確地分注。如 果在反應孔內以不揮發性液體不能覆蓋反應液的上面從而露出的狀態下 進行反應，則反應中存在反應液蒸發從而不能進行精密度良好的測定的問 題。另外，先分注反應液，再從其上分注不揮發性液體的情況下，分注不 揮發性液體時的噴嘴的頂端如果與其頂端接觸會發生污染。發明內容本發明的目的在于能夠容易地向反應容器的反應孔分注反應液和不 揮發性液體。
本發明的分注方法是向至少具備設有多個使樣品反應的反應孔的反 應部的反應容器的反應孔中，利用噴嘴先后分注反應液和比重低于反應液 的不揮發性液體的分注方法。反應液和不揮發性液體均可以先分注。先分注的液體的分注工序是在噴嘴的頂端形成該液體的液滴，使該液 滴接觸反應孔的底面或內壁面向反應孔內移動的方法。后分注的液體的分注工序的第1方法是擠壓使噴嘴的頂端接觸反應 孔的內壁面，使該液體順著該內壁面向反應孔內移動的方法。后分注的液體的分注工序的第2方法是在噴嘴的頂端形成該液體的 液滴，使該液滴接觸反應孔的內壁面或先注入到反應孔的液體的表面向反 應孔內移動的方法。雖然反應液和不揮發性液體均可以先分注，但為了用不揮發性液體良 好地覆蓋反應液的表面，優選先分注的液體為反應液。反應容器的優選例為一體具備收容了不揮發性液體的不揮發性液體 收容部的反應容器。反應容器的進一步優選例為還一體具備收容分型試劑的分型試劑收 容部，作為反應部的反應孔具備分別保持與多個多態性位點分別對應而發 出熒光的探針的探針配置部的基因多態性診斷用反應容器。反應容器的進一步優選例為還一體具備收容含有夾著多個多態性位 點進行結合的多個引物的基因擴增試劑的基因擴增試劑收容部和相對基 因擴增試劑和樣品的混合液進行基因擴增反應的擴增反應部的基因多態 性診斷用反應容器。噴嘴在頂端安裝裝卸自如的噴頭，可以借助該噴頭進行液體的分注。 在本發明中，將在噴嘴的頂端安裝有噴頭的狀態的噴嘴稱為含頭噴嘴。作為比重低于反應液的不揮發性液體，可以使用礦物油(石油)、植 物油、動物油、硅油或二苯醚等。礦物油是從凡士林蒸餾得到的液體的烴 混合物，也被稱為液體石蠟、液體凡士林、白油等，也包括低比重的輕油。 作為動物油，可以使用鱈魚肝油、狹鱗庸鰈油、鯡魚油、羅非魚(Orange roughy)油或鱉魚肝油等。另外，作為植物油，可以使用卡諾拉(canola) 油、杏仁油、綿籽油、玉米油、橄欖油、花生油、紅花油、芝麻油、豆油 等。本發明的反應容器處理裝置至少具備安裝有至少具備設有多個使樣 品發生反應的反應孔的反應部的反應容器的反應容器安裝部；和如圖1所 示使用于吸引及噴出的噴嘴28移動，進行反應容器的液體的移送的分注 部112;和至少對分注部112的分注動作進行控制，控制部118執行本發 明的分注方法。為了從外部操作控制部118或顯示檢查結果，也可以使個人電腦(PC) 122與控制部118連接。在本發明中，先分注的液體在噴嘴的頂端形成該液體的液滴，使該液 滴接觸反應孔的底面或內壁面，使其向反應孔內移動，后分注的液體擠壓 使噴嘴的頂端接近反應孔的內壁面，使該液體順著該內壁面向反應孔內移 動，或者在噴嘴的頂端形成該液體的液滴，使該液滴接觸反應孔的內壁面 或先注入到反應孔的液體的表面，使其向反應孔內移動，所以可以正確地 進行反應液的微量分注而且沒有污染。另外，不揮發性液體也可以正確地 分注，而且分注時沒有污染。其結果，可以在反應孔用不揮發性液體覆蓋 反應液的表面，不會發生反應時的反應液的干燥，可以精密度很好地進行


圖1是概要地顯示本發明的框圖。 圖2A是反應容器的第1例的正面圖。 圖2B是反應容器的第1例的俯視圖。圖3A是表示使用同一反應容器的SNP檢測方法的工序的前半部分的 正面圖。圖3B是表示使用同一反應容器的SNP檢測方法的工序的前半部分的 俯視圖。圖4A是表示使用同一反應容器的SNP檢測方法的工序的后半部分的 正面圖。圖4B是表示使用同一反應容器的SNP檢測方法的工序的后半部分的 俯視圖。圖5A是反應容器的第2例的正面圖。圖5B是反應容器的第2例的俯視圖。圖5C是表示反應容器的第2例的圖，是在圖5B的X—X線位置剖 開的截面圖。圖6A是將同一反應容器中的基因擴增擴增反應部在圖5B的Y—Y 線位置剖開的截面圖，其為反應液被注入的狀態。圖6B是將同一反應容器中的基因擴增擴增反應部在圖5B的Y—Y 線位置剖開的截面圖，其為反應液被回收的狀態。圖7A是表示使用同一反應容器的SNP檢測方法的工序的前半部分的 正面圖。圖7B是表示使用同一反應容器的SNP檢測方法的工序的前半部分的 俯視圖。圖8A是表示使用同一反應容器的SNP檢測方法的工序的后半部分的 正面圖。圖8B是表示使用同一反應容器的SNP檢測方法的工序的后半部分的 俯視圖。圖9是表示本發明的反應容器處理裝置的一個實施例的概要截面圖。 圖IO是表示同一實施例中的分型反應部的截面圖。 圖11A是表示液體向探針配置部的分注方法的實施例的截面圖，其 是分注反應液的情況。圖11B是表示液體向探針配置部的分注方法的實施例的截面圖，其 是分注礦物油的情況。圖11C是表示液體向探針配置部的分注方法的實施例的截面圖，其 是分注礦物油的情況。圖12是表示同一實施例中的熒光檢測部的概要結構圖。 圖13是概要地表示本發明相關的SNP檢測方法的流程圖。 圖中，2 —樣品，4一PCR反應試劑，6—侵入試劑，8—探針配置部， 10、 10a—基板，12—樣品注入部，14一分型試劑收容部，16—礦物油收 容部，18—探針配置部，20—薄膜，22—密封材料，28 —噴嘴，30—基因 擴增試劑收容部，31—PCR中止液注入部，32—基因擴增反應部，40—礦 物油，40a—礦物油的液滴，41一反應容器，60、 62 —加熱模塊，64 —熒 光檢測部，66 —送液臂，70 —噴頭，112 —分注部，118 —控制部，170 — 反應液，170a—反應液的液滴。
具體實施方式
圖2A及圖2B是本發明的反應容器處理裝置中使用的反應容器的第 l例。圖2A為正面圖，圖2B為俯視圖。在平板狀的基板10的同一側，試劑收容部14及不揮發性液體收容部 16形成為凹部。以下將礦物油用作不揮發性液體。將不揮發性液體收容 部稱為礦物油收容部。在基板10的同一側進而還形成反應部18。試劑收 容部14和礦物油收容部16被薄膜20密封，在用噴嘴吸入試劑和礦物油 并移送至其他場所時，去除該薄膜20用噴嘴吸入，或者可以用噴嘴穿透 該薄膜20時使噴嘴穿透該薄膜，用噴嘴吸入。從薄膜20上，用大小為覆蓋試劑收容部14、礦物油收容部16及反 應部18的可以剝離的密封材料22覆蓋基板10的表面。作為該反應容器的具體用途的一例，為注入利用PCR反應擴增DNA 的樣品反應液并利用侵入反應檢測SNP的基因多態性診斷用試劑盒。在此，如果表示多態性位點與引物的關系，則是為了擴增一個多態性 位點而必需夾著該多態性位點進行結，的一對引物。成為對象的生物體樣 品中存在多種多態性位點，所以在這^多態性位點存在于彼此分離的位置 的情況下，必需多態性位點的種類的數目的2倍種引物。不過，2個多態 性位點接近的情況下，分別夾著這些多態性位點結合引物擴增也可以在這 2個多態性位點之間不結合引物，而只在2個多態性位點的序列的兩側結 合引物擴增。因而，必要的引物種類不一定需要為多態性位點的種類的數 目的2倍。本發明中的"夾著多個多態性位點中各個多態性位點進行結合 的多個引物"不只包括一對引物夾著1個多態性位點進行結合的情況，也 包括夾著2或2以上的多態性位點進行結合的情況，是指擴增多個多態性 位點所必需的種類的引物。多態性包括變異、缺失、重復、轉移等。具有代表性的多態性是SNP。生物體樣品為血液、唾液、基因組DNA等。擴增工序可以使用PCR法等。這種情況下，優選在25°C下pH為8.5 9.5的條件下進行PCR法。這種情況下，基因擴增試劑為PCR反應試劑。 SNP的分型中，在進入擴增工序的階段必須調整基因組DNA，其中 需要花費時間、人力和成本。如果只著眼于擴增DNA的PCR法，還提出 了不用進行前處理而從血液等樣品直接進行PCR反應的方法。于是，在 擴增含有基因的樣品中的目的基因的核酸合成法中，向基因擴增反應液中 添加含有基因的樣品中的基因包含體或含有基因的樣品本身，添加后的該 反應液的pH在為8.5 9.5 (25'C)下，擴增含有基因的樣品中的目的基 因(參照專利文獻4。)。已經構建的分型系統，為了用PCR法擴增要進行分型的多個SNP區 域，雖然最初采集的DNA量很少即可，但在PCR法擴增之前，必需進行 預先從生物體樣品中提取DNA的前處理。為此該前處理需要花費時間和 人力。在將直接PCR法與分型方法結合起來時，對需要進行分型的多個SNP 位點同時進行擴增的自動化系統尚未構建起來。所述分型工序可以使用侵入法或熒光定量PCR法。這種情況下，分 型試劑為侵入試劑或熒光定量PCR試劑。圖13是概要地表示本發明的反應容器處理裝置也有時執行的基因多 態性檢測方法的圖。在此，按照擴增工序使用PCR法、分型工序使用侵 入法進行說明。在PCR工序中，向血液等生物體樣品2中添加PCR反應試劑4，或 相反，向PCR反應試劑4中添加生物體樣品2。例如采集lpL生物體樣 品2，向其中添加10pL左右PCR反應試劑4。 PCR反應試劑4被預先調 整，含有用于要測定的SNP位點的多個引物，向其中添加用于調節pH的 緩沖液、4種脫氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)、其他必要的i^式劑， 在與樣品2混合時將pH調整至8.5 9.5。使生物體樣品2與PCR反應試劑4的混合液，按照規定的溫度循環 進行PCR反應。PCR溫度循環包括改性、引物附著(退火(annealing)) 及引物延伸的3個工序，通過反復進行該循環，使DNA擴增。作為各工 序的一例，改性工序為94i:下l分鐘，弓(物附著工序為55'C下1分鐘， 引物延伸為72'C下1分鐘。生物體樣品可以為實施了基因組提取操作的
樣品，但在此也可以使用沒有實施基因組提取操作的樣品。即使是沒有實施基因組提取操作的生物體樣品，也可以在PCR溫度循環的高溫下，DNA 從血細胞或細胞游離出來，PCR反應所必需的試劑與DNA接觸，反應進行。PCR反應結束后，添加作為分型試劑的侵入試劑6。侵入試劑6中含 有發出熒光的FRET探針及切割酶(cleavase:結構特異的DNA分解酶)。 FRET探針是具有與基因組DNA完全沒有關系的序列的熒光標記寡核苷 酸，無論SNP的種類如何，序列大多共用。接著，向分型反應部的多個探針配置部8中添加已添加侵入試劑6的 反應液，使其反應。在各探針配置部8，分別對應各多個SNP位點保持侵 入探針和報告(reporter)探針，反應液與侵入探針反應，只要存在對應 該報告探針的SNP，就可以發出熒光。在專利文獻3的段落

中有關于侵入法的詳細記載。各報告探針只要根據與其對應的SNP堿基準備2種，就可以辨別出 該SNP為純合子還是雜合子。有時在本發明中使用的擴增工序的PCR法是同時使需要的多個SNP 位點擴增的方法，而且利用直接PCR法從沒有實施核酸提取操作的生物 體樣品中擴增含有這些SNP位點的多個基因組DNA。所以，使含有用于 這些SNP位點的多個引物的基因擴增反應試劑作用于生物體樣品，使其 在25。C下的pH成為8.5 9.5的條件下發生PCR反應。PCR反應試劑含有pH緩沖液、MgCl2、 KC1等鹽類、弓l物、脫氧核 糖核苷酸類、熱穩定性合成酶。此外，還可以根據需要添加表面活性劑或 蛋白等物質。除了三(羥甲基)氨基甲烷與鹽酸、硝酸、硫酸等無機酸的組合以外， pH緩沖液還可以使用各種pH緩沖液。在PCR反應試劑中，優選以 10mM 100mM的濃度使用已調整pH的緩沖液。引物是指作為起到利用PCR反應合成DNA的開始點作用的寡核苷 酸。引物可以合成，也可以從生物界中分離。合成酶是通過附加引物來合成DNA用的酶，也包括化學合成系。作 為適當的合成酶，包括大腸桿菌(E.coli)的DNA聚合酶(polymerase))的DNA聚合酶的Klenow fragment、 T4DNA聚合 物、TaqDNA聚合酶、T. litoralis DNA聚合酶、TthDNA聚合酶、PfUDNA 聚合酶、Hot Start Taq聚合酶、KODDNA聚合酶、EXTaqDNA聚合酶、逆轉錄酶等，但不僅于這些。"熱穩定性"是指即使在高溫下、最好在 65 95"C下也可以保持其活性的化合物的性質。在分型工序中使用的侵入法是通過使等位基因特異寡核苷酸與含有 分型對象的SNP的DNA發生雜交(hybridyzation)，來分型SNP位點的 方法，是使用如下所述物質的方法，即含有分型對象的SNP的DNA、 對含有分型對象的SNP的各等位基因特異的2種報告探針及1種侵入探 針、和識別DNA結構并切斷的具有特殊內切酶(endonuclease)活性的酶 (參照專利文獻3。)。下面進行反應容器的具體說明。參照圖2A及圖2B，詳細說明該基 因多態性診斷用試劑盒的實施例。在平板狀的基板10的同一側，樣品注入部12、分型試劑收容部14 及礦物油收容部16形成為凹部。在基板10的同一側，進而還形成多個探 針配置部18。樣品注入部12是注入利用PCR反應擴增DNA的生物體樣品反應液 的部位，以在使用前的狀態下尚未注入樣品的空的狀態提供。分型試劑收 容部14收容10 300^iL左右對應多個多態性位點配制的分型試劑，礦物 油收容部18收容20 300pL用于防止反應液的蒸發的礦物油，這些分型 試劑收容部14和礦物油收容部18被噴嘴可以穿透的薄膜20密封。這樣 的薄膜20例如為鋁箔、鋁與PET (聚對苯二甲酸乙二醇酯)薄膜等樹脂 薄膜的層疊膜等，為了不容易剝落，利用熔融或粘接貼附。各探針配置部18分別保持對應各多個多態性位點并發出熒光的探 針，成為可以在從礦物油收容部16分注礦物油時保持該礦物油的凹部。 各探針配置部18的凹部的尺寸例如為直徑100pm 2mm、深5CHim 1.5mm的圓形。從薄膜20上，用大小為覆蓋樣品注入部12、分型試劑收容部14、礦 物油收容部16及探針配置部18的可以剝離的密封材料22覆蓋基板10的 表面。該密封材料22也可以為鋁箔、鋁與PET薄膜等樹脂的層疊膜等， 但貼附強度比薄膜20弱，所以利用粘合劑等貼附成可以剝離的程度。為了從底面側測定熒光，用低自熒光性(很少從其自身產生熒光的性質)而且光透過性的樹脂例如聚碳酸酯等原材料形成基板10。基板10的 厚度為1 2mm。下面顯示該反應容器的使用方法。如圖3A及圖3B所示，使用時剝下密封材料22。密封分型試劑收容 部14和礦物油收容部18的薄膜20不被剝下而殘留不變。利用吸量管26等向樣品注入部12注入2 20mL已在外部利用pcr 反應擴增DNA的樣品反應液24。然后，將該反應容器安裝于檢測裝置。在檢測裝置中，如圖4A及圖4B所示，噴嘴28穿透薄膜20插入分 型試劑收容部14吸入分型試劑，分型試劑被該噴嘴28移送至樣品注入部 12。通過在樣品注入部12反復進行噴嘴28的吸入和噴出，使樣品反應液 與PCR反應試劑混合。然后，利用噴嘴28向各探針配置部18以0.5 4pL逐次分注樣品反 應液與分型試劑的反應液。從礦物油收容部18利用噴嘴28向各探針配置 部18逐次分注0.5 10pL礦物油。礦物油向探針配置部18的分注也可以 在反應液向探針配置部18分注之前進行。在各探針配置部18，該礦物油 覆蓋反應液的表面，防止伴隨著檢測裝置的分型反應部的加熱而分型反應 時間中的反應液的蒸發。在各探針配置部18，反應液只要有與探針反應的規定的snp，就會 從該探針發出熒光。通過從基板io的背面側照射激發光來檢測出熒光。圖5A、圖5B及圖5C是本發明的反應容器處理裝置中使用的反應容 器的第2例。圖5A是正面圖，圖5B是俯視圖，圖5C是在基因擴增反應 部的X—X線位置的截面圖。該反應溶液將沒有實施核酸提取操作的生物體樣品作為樣品注入，同 時進行利用PCR反應的DNA的擴增和利用侵入反應的SNP檢測。其中， 也可以注入沒有實施核酸提取操作的生物體樣品。與圖2A及圖2B的反應容器同樣，在平板狀的基板10a的同一側形 成樣品注入部12、分型試劑收容部14、礦物油收容部16及多個探針配置 部18。在該反應容器中進而在基板10a的同一側形成基因擴增試劑收容
部30、 PCR中止液注入部31及基因擴增反應部32。基因擴增試劑收容部30也在基板10a形成為凹部，收容含有夾著多 個多態性位點中各個多態性位點進行結合的多個引物的基因擴增試劑。基 因擴增試劑收容部30與分型試劑收容部14及礦物油收容部16 —起用可 以被噴嘴穿透的薄膜20密封。在基因擴增試劑收容部30中收容2 300(iLPCR反應試劑。與圖2A及圖2B的反應容器同樣，在分型試劑收 容部14收容10 300pL分型試劑，在礦物油收容部16收容20 300pL 礦物油。PCR中止液注入部31是用于混合在基因擴增反應部32中止PCR反 應的反應液與分型試劑的部位，在基板10a形成為凹部，以使用前的狀態 為空的狀態提供。基因擴增反應部32是對PCR反應試劑和樣品的混合液進行基因擴增 反應的部位。圖6A及圖6B表示放大基因擴增反應部32的部分截面。圖6A及圖 6B是在圖5B的Y—Y線位置剖開的截面圖。如圖6A及圖6B所示，基 因擴增反應部32的液體分注用噴口 34a、 34b具有對應噴嘴28的頂端形 狀的形狀的開口 36a、36b，為了可以與噴嘴28的頂端貼緊而用PDMS(聚 二甲基硅氧烷)或硅酮橡膠等彈性原材料構成。基因擴增反應部32為了使熱傳導系數很好而該部分的基板10a的下 面側如圖5C、圖6A及圖6B所示，壁厚變薄。該部分的壁厚例如為0.2 0.3mm。樣品注入部12在該反應容器中被注入沒有實施核酸提取操作的生物 體樣品，但以使用前的狀態尚未注入樣品的空的狀態提供。與圖2A及圖2B的反應容器相同，分型試劑收容部14收容對應多個 多態性位點配制的分型試劑，礦物油收容部18收容用于防止反應液的蒸 發的礦物油。各探針配置部18也與圖2A及圖2B的反應容器相同，分別保持對應 各多個多態性位點發出熒光的探針，成為在從礦物油收容部16分注礦物 油時可以保持該礦物油的凹部。從薄膜20上，用大小為覆蓋樣品注入部12、 PCR中止液注入部31、分型試劑收容部14、礦物油收容部16、基因擴增試劑收容部30、基因擴 增反應部32及探針配置部18的可以剝離的密封材料22覆蓋基板10a的 表面。薄膜20與密封材料22的材質及其貼附方法與圖2A及圖2B的反 應容器相同。為了從底面側測定熒光，也用低自熒光性而且光透過性的樹脂例如聚 碳酸酯等原材料形成基板10a。基板10的厚度為1 2mm。 下面顯示該例的反應容器的使用方法。如圖7A及圖7B所示，使用時剝下密封材料22。密封分型試劑收容 部14、礦物油收容部18及基因擴增試劑收容部30的薄膜20不被剝下而 殘留不變。利用吸量管26等向樣品注入部12注入0.5 2|iL樣品25。在圖2A 及圖2B的反應容器中，注入的樣品為在外部利用PCR反應擴增DNA的 樣品反應液，但在該反應容器中注入的樣品為沒有實施核酸提取操作的生 物體樣品例如血液。樣品也可以為實施了核酸提取操作的生物體樣品。注 入樣品之后，將該反應容器安裝于檢測裝置。在檢測裝置中，如圖8A及圖8B所示，噴嘴28穿透薄膜20插入基 因擴增試劑收容部30吸入PCR反應試劑，2 20^LPCR反應試劑被該噴 嘴28移送至樣品注入部12。通過在樣品注入部12反復進行噴嘴28的吸 入和噴出，使樣品反應液與PCR反應試劑混合，成為PCR反應液。接著，如圖6A所示，該PCR反應液被噴嘴28分注到擴增反應部32。 即，噴嘴28插入擴增反應部32的一方的噴口 34a，注入該PCR反應液 38，接著，為了防止在擴增反應部32的反應中PCR反應液38蒸發，利 用噴嘴38向噴口34a、 34b注入礦物油40，用礦物油40覆蓋在噴口 34a、 34b的PCR反應液38的表面。在分注該礦物油40時，利用本發明，在噴嘴的頂端形成由礦物油40 構成的液滴，使噴嘴移動，接近噴口34a、 34b，使礦物油40構成的液滴 接觸噴口34a、 34b的底面或壁面，進行分注。在此，由礦物油40構成的液滴，可以按照該液滴接觸噴口 34a、 34b 的底面或壁面的程度使噴嘴接近噴口34a、 34b之前，在噴嘴的頂端形成， 也可以在使噴嘴接近噴口 34a、 34b之后形成。 PCR反應中止后，利用噴嘴28回收PCR反應液，但此時為了容易回 收，如圖6B所示，從基因擴增反應部32的一方噴口34a注入礦物油40。 反應中止后的PCR反應液38a被壓向另一方噴口 34b。因此，插入該噴嘴 28， PCR反應液38a被吸入到噴嘴28。噴口 34a、 34b形成為其開口 36a、 36b的形狀與噴嘴28的形狀一致，而且用彈性原材料形成，所以噴嘴28 與噴口34a、 34b貼緊，防止液體漏出，容易進行PCR反應液的注入和回 收的操作。利用噴嘴28，從基因擴增反應部32回收的反應中止后的PCR反應 液38a被移送至PCR中止液注入部31 。接著，噴嘴28穿透薄膜20插入分型試劑收容部14，吸入分型試劑， 分型試劑被該噴嘴28移送并被注入PCR中止液注入部31。在PCR中止 液注入部31，通過反復進行噴嘴28的吸入和噴出，混合PCR反應液和分 型試劑。然后，將PCR反應液與分型試劑的反應液被噴嘴28以0.5 4pL逐 次分注到各探針配置部18。從礦物油收容部18利用噴嘴28向各探針配 置部18逐次分注0.5 10pL礦物油。礦物油向探針配置部18的分注也可 以在反應液向探針配置部18分注之前。在各探針配置部1S，礦物油覆蓋 反應液的表面，防止伴隨著在檢測裝置的分型反應部的加熱而分型反應時 間中的反應液的蒸發。在各探針配置部18，反應液只要有與探針反應的規定的SNP，就會 從該探針發出熒光。通過從基板10的背面側照射激發光來檢測出熒光。以下顯示各反應試劑的組成，詳細說明本發明，但本發明的技術范圍 不限于這些反應容器。PCR反應試劑為已知的試劑，例如可以使用如專利文獻3的段落
中記載的含有引物、DNA聚合酶及TaqStart (CLONTECH Laboratories 公司制)的反應試劑。另外，也可以在PCR反應試劑中混入AmpDirect (島津制作所制)。引物例如可以使用在專利文獻3的表1中記載的SNP ID1 20、序列編號1 40等。作為分型試劑使用侵入試劑。作為該侵入試劑，使用侵入檢測試劑盒 (invader assay kit: Third Wave Technology公司制)。例如，將信號緩沖 液(signal buffer) 、 FRET探針、結構特異DNA分解酶及等位基因特異 探針配制成如專利文獻3的段落
中記載的濃度。圖9是表示將上述反應容器用作試劑盒，將本發明適用于檢測生物體 樣品的SNP的簡易型反應容器處理裝置的一個實施例的圖。在裝置內上下配置一對加熱模塊60和62，構成檢查試劑盒安裝部， 在下側加熱模塊60上平行地并列設置5張向本發明的反應容器41中注入 樣品的反應容器。這些加熱模塊60、 62可以向箭頭所示的Y方向移動。如圖10所示，檢查試劑盒安裝部在下側的加熱模塊60上具備使反應 容器41滑動并在規定的位置定位的引導部。下側的加熱模塊60構成將基 因擴增反應部32的溫度控制成規定的溫度循環的擴增部(未圖示)。另 外，還具備利用兩加熱模塊60、 62而將探針配置部18的溫度控制成使 DNA與探針反應的溫度的分型反應部。擴增部和分型反應部在圖1中分 別用符號120、 IIO表示。擴增部的溫度例如被設定成在94t、 55'C及72 。C的3個階段依次變化，重復進行該循環。分型反應部的溫度例如被設定 成63。C。構成分型反應部的上側的加熱模塊62只在對應探針配置部的位置具 有開口 150，在下側加熱模塊60，構成分型反應部的部分也只在對應探針 配置部的位置具有開口 152。在加熱模塊62上覆蓋分型反應部罩子154， 在該罩子154也只在加熱模塊62的開口 152的位置打開開口 156。在加熱模塊60的下部設置進行熒光檢測的熒光檢測器64，熒光檢測 器64從反應容器41的下面側借助加熱模塊60的開口 152向探針配置部 照射激發光，在反應容器41的下面側借助加熱模塊60的開口 152檢測來 自探針配置部的熒光。熒光檢測部64向圖9的箭頭X方向移動，檢測來 自探針配置部18的熒光。利用檢查試劑盒安裝部的探針配置部18的Y 方向移動和熒光檢測器64的X方向移動，進行在各探針的熒光檢測。回到圖9進行說明，為了進行利用噴嘴28的液體的吸入和噴出，作 為分注部設置在X方向、Y方向及Z方向移動的送液臂66，送液臂66 具備噴嘴28。噴嘴28在其頂端裝卸自如地安裝一次性噴頭70。分注部在 圖1中用符號112表示。如圖10所示，分注部的噴嘴28借助罩子154的開口 156和加熱模 塊62的開口 150向探針配置部分注反應液。回到圖9進行說明，為了控制加熱模塊60、 62、熒光檢測部64及送 液臂66的動作，在它們的附近配置控制部118。控制部118具備CPU， 保持用于動作的程序。控制部118控制利用加熱模塊60、 62實現的分型 反應部110或擴增部120的溫度控制、熒光檢測部64的檢測動作及分注 部112的送液臂66的分注動作。在作為反應容器41使用圖2A及圖2B的反應容器那樣的不具備基因 擴增反應部的反應容器的情況下，不需要控制基因擴增反應部的溫度的擴 增部，擴增部18也不需要具備用于控制擴增部的溫度的功能。圖IIA、圖11B及圖11C表示反應液170和礦物油40向探針配置部 18的分注方法的圖。在此，以先分注反應液170后向該反應液170之上 分注礦物油40的情況為例進行說明。但是，分注的順序也可以相反。圖11A為表示先向探針配置部18分注反應液170的方法的圖。在噴 嘴的噴頭70的頂端形成反應液170的液滴170a，使該液滴170a接觸探 針配置部18的反應孔的底面或內壁面，再使其向反應孔內移動。圖11B為表示在先向探針配置部18分注的反應液170上分注礦物油 40的第1方法的圖。擠壓使噴嘴的噴頭70的頂端接近探針配置部18的 反應孔的內壁面使礦物油40順著其內壁面向反應孔內移動。圖11C為表示在先向探針配置部18分注的反應液170上分注礦物油 40的第2方法的圖。在噴嘴的噴頭70的頂端形成礦物油40的液滴40a， 使該液滴40a接觸反應孔的內壁面或先分注于反應孔的反應液170的表 面，再使其向反應孔內移動。即使先分注礦物油40后再分注反應液170，由于比重，也會成為礦 物油40覆蓋反應液170的表面的狀態。圖12是具體地表示熒光檢測器64的圖。熒光檢測器64具備發出 473nm的激光的激光二極管(laser diode) (LD)或發光二極管(LED) 92作為激發光源，具備使該激光聚光、照射于反應容器41的探針配置部 的底面的一對透鏡94、 96。透鏡94使來自激光二極管92的激光聚光成 為平行光，透鏡96是使變為平行的激光會聚、照射于反應容器41的底面 的物鏡。物鏡％還起到使從反應容器41產生的熒光聚光的透鏡的作用。
在一對透鏡94、 96之間設有分色鏡(dichroic mirror) 98，分色鏡98的波 長特性被設定為使激發光透過、使熒光反射。在分色鏡98的反射光(熒 光)的光程上進一步設置分色鏡100。分色鏡100的波長特性被設定為反 射525nm的光、透過605nm的光。在分色鏡100的反射光的光程上配置 有檢測525nm的熒光的透鏡102和光檢測器104，在分色鏡100的透過光 的光程上配置有檢測605nm的熒光的透鏡106和光檢測器108。通過利用 此兩個檢測器104、 108檢測2種熒光，檢驗對應固定于各探針配置部位 置的侵入探針的SNP的有無，和該SNP為純合子還是雜合子。作為標記 熒光體，可以使用例如FAM、 ROX、 VIC、 TAMRA、 Redmond Red等。 圖12的檢測器64構成為在光源的激發光下激發，測定2波長的熒光， 但為了測定2波長的熒光而可以用不同的激發波長激發，作為檢測器64 也可以構成為使用2個光源。產業上的可利用性本發明除了各種化學反應的測定以外，例如可以在基因分析的研究或 臨床領域用于各種自動分析，例如可以檢測以人為主以及動物或植物的基 因組DNA的多態性、特別是SNP (單堿基多態性)，進而可以用于使用 該結果進行患病率的診斷、給藥的種類與效果及副作用的關系的診斷等， 此外還可以用于動物或植物的品種判定、傳染病診斷(感染菌的型判定) 等。
權利要求
1.一種分注方法，其向至少具備設有多個使樣品反應的反應孔的反應部的反應容器的所述反應孔中，利用噴嘴先后分注反應液和比重低于反應液的不揮發性液體，其特征在于，先分注的液體的分注工序在噴嘴的頂端形成該液體的液滴，使該液滴接觸所述反應孔的底面或內壁面并向反應孔內移動。
2. —種分注方法，其向至少具備設有多個使樣品反應的反應孔的反 應部的反應容器的所述反應孔中，利用噴嘴先后分注反應液和比重低于反 應液的不揮發性液體，其特征在于，后分注的液體的分注工序擠壓使噴嘴的頂端接觸所述反應孔的內壁 面，使該液體順著該內壁面向反應孔內移動。
3. —種分注方法，其向至少具備設有多個使樣品反應的反應孔的反 應部的反應容器的所述反應孔中，利用噴嘴先后分注反應液和比重低于反 應液的不揮發性液體，其特征在于，后分注的液體的分注工序在噴嘴的頂端形成該液體的液滴，使該液滴 接觸所述反應孔的內壁面或先注入到反應孔的液體的表面并向反應孔內 移動。
4. 根據權利要求1 3中任意一項所述的分注方法，其中， 先分注的液體為反應液。
5. 根據權利要求1 4中任意一項所述的分注方法，其中， 所述反應容器一體具備收容了所述不揮發性液體的不揮發性液體收容部。
6. 根據權利要求1 5中任意一項所述的分注方法，其中， 所述反應容器是基因多態性診斷用反應容器，所述反應容器還一體具備收容了分型試劑的分型試劑收容部，作為所述反應部的反應孔具備探針 配置部，該探針配置部分別保持與多個多態性位點分別對應并發出熒光的 探針。
7. 根據權利要求1 6中任意一項所述的分注方法，其中，所述反應容器是基因多態性診斷用反應容器，所述反應容器還一體具 備收容基因擴增試劑的基因擴增試劑收容部和相對所述基因擴增試劑和 樣品的混合液進行基因擴增反應的擴增反應部，所述基因擴增試劑含有夾 著多個多態性位點中各個多態性位點進行結合的多個引物。
8. 根據權利要求1 7中任意一項所述的分注方法，其中， 所述不揮發性液體為從礦物油、植物油、動物油、硅油及二苯醚構成的組中選擇的液體。
9. 一種反應容器處理裝置，其特征在于，至少具備反應容器安裝部，其安裝反應容器，該反應容器至少具備設有多個使樣品發生反應的反應孔的反應部；和分注部，使用于吸引及噴出的噴嘴移動，進行所述反應容器的液體的 移送；和控制部，至少對所述分注部的分注動作進行控制，執行權利要求l 4中任意一項所述的分注方法。
全文摘要
一種反應容器中的分注方法及反應容器處理裝置，可以容易地分注微量的不揮發性液體。優選的方式為在先向探針配置部(18)分注的反應液(170)上分注礦物油(40)時，在噴嘴的噴頭(70)的頂端形成礦物油(40)的液滴(40a)，使該液滴(40a)接觸反應孔的內壁面或先分注到反應孔的反應液(170)的表面而使其向反應孔內移動。
文檔編號G01N35/10GK101151537SQ20068001049
公開日2008年3月26日 申請日期2006年3月30日 優先權日2005年3月30日
發明者此下龍, 緒方是嗣, 花房信博 申請人:株式會社島津制作所;凸版印刷株式會社