專利名稱：熒光檢測設備的制作方法
技術領域：
本發明涉及光譜學領域，特別涉及到熒光成像技術。
技術背景許多研究和應用，尤其在生物學里都利用熒光信號。熒光信號的 微弱性是一個主要的絆腳石。在大多數的應用和研究中，熒光標記或 者說是熒光團的數量經常是有限的。例如對于生物芯片的情況，或者 當監控細胞中少量的分子時，提高靈敏度是非常重要的。增強的熒光 信號也用于尋找有低熒光量子效率的分子。現今， 一些特定的觀察方法，特別是運用全反射的倏逝波的照明 技術，己經基本使需求得到了滿足。此外，熒光信號的微弱性使之有 必要使用附加的放大技術，通常價格不菲，需要大量的時間并引入必須進行控制的放大偏置。 一個典型的案例就是DNA芯片，對于DNA 芯片聚合酶鏈反應(PCR)中放大步驟經常是必要的。許多類型的載 體的發展都是為了增強熒光信號并使放大步驟的需求最小化。一些如美國專利US-5.866.433所述的載體采用在一個透明的惰性 分離層下引入納米金屬粉的方法來增強熒光。還存在一些具有透明間隔層的反射鏡型載體。美國專利 US-4.649.280中提出的載體就是由透明間隔層覆蓋的完美反射鏡。美國 專利US-5.006.716中提出了具有周期性波動起伏傳導層的反射鏡，以 便引導熒光至優先方向，因而需要沿一個明確定義的方向激發和檢測。 因此，在使用此類載體時需要特定的激發和觀測配置。然而，所有這些使熒光信號在一定程度上增強的載體都有一些缺 點，特別體現于檢測裝置的特定屬性或者特殊的使用配置上。因此， 使用這些載體仍然復雜和/或昂貴。因此，本發明的目標在于提供一種簡化的熒光檢測設備。此設備 起碼可以克服至少一種上文提到的弊端。 發明內容本發明由下文在權利要求書中定義的熒光檢測設備組成。 更準確的說，提供了一種熒光檢測設備，其包括承載樣品的載體 裝置、使樣品發射熒光的樣品激發裝置和用來檢測所述熒光的檢測裝 置，其特征在于所述的載體裝置包含具有粗糙表面的可以使所述熒光 偏向多個方向的層，所述的檢測裝置覆蓋觀測錐體，以便從多個方向 收集被偏轉的熒光。因此，這樣的設備可以使源于樣品中被激發的熒光團的熒光信號增強，所述的熒光信號在寬的傳輸管道(lobe)里而非一個特定的方向 上發射。因此寬孔徑中的檢測使收集大部分的熒光信號成為可能。收 集到的熒光信號可以在不需要任何前端放大和/或使用特殊的檢測系統 或特殊的配置情況下被增強。載體裝置的粗糙表面層的粗糙度由至少三個參數定義，第一個參 數代表粗糙度的標準差；第二個參數代表粗糙度的平均空間周期；第 三個參數代表粗糙度空間周期的范圍。第二個和第三個參數由粗糙界 面形貌圖的功率譜輻射狀剖面導出。其中，第一個參數為非零且小于 100納米(nm)，第二個參數為非零且小于1000納米，第三個參數為非 零且小于1500納米。按照本發明，優選但非限制的熒光檢測設備的樣式如下_觀測錐體具有至少IO度的頂角；一含有粗糙表面的層是連續的或者準連續的；一含有粗糙表面的層是傳導層；—傳導層是由銀、金、銅、鋁或鉑制成的金屬層；一傳導層是半導體；一傳導層的厚度大于20納米；—載體裝置包涵對在熒光過程中激發和輻射波長透明的間隔層； 一間隔層是高分子層或者陶瓷層； 一間隔層的厚度大于20納米；一間隔層大約60納米厚，傳導層大約60納米厚，傳導層表面的 粗糙度由大約為20納米的第一參數、大約350納米的第二參數以及大
約600納米的第三參數定義；
一間隔層根據厚度的梯度安排，并且從載體裝置的第一末端到載 體裝置的第二末端增加；
—激發裝置覆蓋于發光錐體。
根據本發明，熒光檢測設備用來監控樣品中的熒光團。它尤其可 以用來進行熒光團間的能量交換研究。
本發明中熒光檢測設備的另外一個優選但非限制的用途為測量透 明樣品的厚度。
本發明中，還為熒光監測器提供了樣品載體裝置，其特征是包含 具有粗糙表面的能使所述熒光偏向多個方向的層。
最后，本發明涉及的熒光檢測方法包括一些連續的步驟激發由
載體裝置承載的樣品使所述樣品發射熒光以及檢測所述樣品發射的所 述熒光。此熒光檢測方法的特征是，所述的載體裝置包含有粗糙表面 的能使熒光偏向多個方向的層，熒光檢測步驟包括在一個錐體內進行 觀測，以便從多個方向收集被偏轉的熒光。
本發明的其他特征及優點將在如下描述中變得清晰起來，這些描
述只是說明性的而非限定性的，應當結合附圖進行參考 一圖1為本發明的熒光檢測設備的示意圖， 一圖2為本發明所定義的粗糙表面的橫截面圖，
一圖3為原子力顯微鏡下粗糙表面的形貌圖，
一圖4顯示了從圖3所示的形貌圖得到的功率譜的輻射狀剖
面，作為空間頻率的函數，
一圖5顯示了作為空間周期的函數的功率譜輻射狀剖面， 一圖6為熒光檢測設備的第一優選實施方案中的載體橫截面
圖，
一圖7為熒光檢測設備的第二優選實施方案中的載體橫截面
圖，
一圖8為熒光檢測設備的第三優選實施方案中的載體橫截面圖。
具體實施例方式
圖1為本發明熒光檢測設備的示意圖。此設備包含承載樣品11的
載體裝置1 ，激發裝置2和熒光檢測裝置3 。
樣品11的激發裝置2被設定為用來激發在樣品中的待檢熒光團。 熒光團以2種譜線為特征入射光吸收譜(或激發譜)和熒光發射譜。 因此，激發裝置2包含光源21和能使激發裝置2以對應于待檢熒光團 的吸收譜的波長進行發射的激發濾波器22。而且，激發裝置2可能在 一個立體角的范圍內分布，以按照照明錐體來激發待分析的樣品。
熒光檢測設備的檢測裝置3被設置為僅檢測與待檢熒光團的發射 譜線特征對應的熒光輻射。因而，檢測裝置3包含觀測裝置31和只允 許傳輸具有待檢熒光的輻射特征的發射濾波器32。而且，檢測裝置3 覆蓋于觀測錐體上，而能夠檢測從多個方向進行發射的輻射。觀測錐 體可以被定義為至少IO度的頂角。
熒光檢測設備還包含分色鏡4，分色鏡使入射光線朝樣品方向反 射，并且只允許傳輸具有由待檢熒光團發射的熒光特征的輻射。
例如，幾何光學系統中運用的載體1可能是標準的，共焦的，單 光子或雙光子的熒光顯微鏡之一或者掃描儀之一。
更進一步的，當將載體1制造為自增強發射熒光時，油浸接物鏡 (如水、油)就不再需要了。因此，載體1的自增強使簡單的空氣接 物鏡成為可能，當油浸接物鏡比較復雜或者苛求度高時，優勢會更明 顯的表現出來。
圖2， 3， 4， 5闡明了定義表面粗糙度所選的參數。
表現表面S形貌特征的統計型參數由參考面R決定。參考面R的 位置對應于不同表面點的平均高度。圖2所示為表面地形的一維剖面 圖。此剖面證明了所用的第一參數，稱為粗糙度標準差3，描述了剖面 高度上的特征。此參數對應于剖面與參考面R的差值h(x，y)的均方根， 即<formula>formula see original document page 8</formula>
其中k和Ly為所分析的粗糙界面的尺寸，h(x，y)為在位置(x,y)處表
面在參考面R上方的高度。
此外，粗糙度還將由表明表面粗糙度特征的兩個參數人和A義來定 義。這對參數由源于所分析的粗糙表面形貌圖的功率譜所確定。利用 原子力顯微鏡(AFM)對粗糙表面進行觀察所得到的圖像如圖3所示。 從形貌圖出發，就可以根據圖像的傅立葉變換形式對功率譜進行處理。 這種新的表現形式相當于以給定方向的正弦函數為基礎的表面分解。 因為一個粗糙表面并沒有一個優先的方向，它的頻譜表現形式也不會 有。繼而能夠只考慮功率譜的輻射狀剖面，如圖4所示。表面粗糙度 本質上由在輻射譜上具有顯著值的空間頻率組成。還可以把輻射狀剖 面表示成空間周期A的函數，如圖5所示。在最大輻射狀剖面的中間高 度處定義譜寬A義。此輻射狀剖面的譜寬AA表示了組成表面的不同波長 的波。因此空間周期的平均值、和譜寬AA將足以準確的描述表面粗糙 度。
已經定義了不同的表明粗糙度特征的參數，也應當對用來增強熒 光信號的載體1做一個更詳細的描述。增強熒光的重要特征表現為， 必須被間隔層覆蓋的傳導層的存在和粗糙界面的存在。
對于在熒光過程中引入的波長，也就是對于待測熒光團的激發和 輻射波長間隔層必須是透明的，這樣才能使電磁輻射到達傳導層。間 隔層的厚度通常是幾十納米(nm)，也可能針對給定的熒光團和激發波 長進行調整。間隔層可能是高分子層(PPMA, PEG等)，或者陶瓷層 (SiC^AlA,Ti02等)。例如當樣本的目標是用于觀察生物分子時，樣 品本身也可以組成間隔層；因此樣本的油脂層，細胞膜可能構成間隔 層。在稍后的例子里，使用包含間隔層的載體則都是不必要的。
傳導層的屬性并不是特別關鍵。例如，它可以由金屬，如金，銀， 銅，鋁或鉑制成。傳導層也可以是半導體。這層必須是連續的或者準 連續的，但是厚度并不關鍵。連續的意思是，它必須完全覆蓋載體的 與熒光相關的活躍表面。準連續的層是指該層有一些非常小的不完整 使之不能嚴格覆蓋整個載體的活躍表面。
存在于傳導層和間隔層之間的胞質基因激發現象可能導致熒光輻 射的能量損失，而造成待檢熒光信號的衰減。然而，胞質基因與通過
粗糙表面傳輸的電磁波的耦合可以將能量傳遞給熒光信號。因此載體1
應包含更多的粗糙界面15以促使此類耦合的發生，以便檢測裝置3將 增強的熒光信號檢測出來。界面的粗糙度由粗糙度標準差3 (非零，值 約為幾十納米)和A、 A義(兩個均非零，值約為幾百納米)來定義。
粗糙表面的各向同性和隨機屬性也是很重要的，因為沿各個方向存在 的多個空間頻率的譜傳播，是將入射波束與表面耦合，并且將樣品的 熒光團所發射的熒光反射到覆蓋有檢測裝置的整個觀測錐體上的方 法。
圖6顯示了以粗糙界面作為傳導層113的表面115的載體101。這 樣以粗糙界面作為傳導層113的表面115的載體101可以按如下方法 制造。
載體101包含其上連續沉積了傳導層113、間隔層112和樣品111 的襯底114。這樣的襯底114可以是玻璃片或者硅晶片。
傳導層113可以用不同的技術進行制造。例如，載體表面可以利 用化學或者機械侵襲的方法使其變為粗糙，然后利用熱蒸發，激光消 融，電化學，濺射等方法進行傳導材料的沉積。如果載體本身已經是 可傳導的，唯一的步驟就是粗糙化了。
間隔層112，如果它不包含在待觀測樣品中時，可以用與沉積傳導 層相似的方法將其沉積于粗糙表面115之上。如果是高分子層的情況， 可以運用"浸鍍"或"旋涂"法。
特別的，這種載體可以在大約10—8托的高真空條件下制作。首先在 一個干凈的顯微鏡片上以高溫蒸發GO(TC)沉積大約60納米厚的銀 層。這個幾十納米厚的第一層沉積創造了粗糙的底層。第二層沉積以 低溫(環境溫度)方法制造一個60納米厚的銀層，以便形成粗糙而連 續的傳導層。粗糙表面層的粗糙度被定義為粗糙度標準差3為20納米， 粗糙度平均空間周期^為350納米，粗糙度空間周期范圍為A義約600 納米(在200和800納米之間)。然后以每100次激光照射幾納米的沉 積速率，通過脈沖激光消融方法沉積60納米厚的氧化鋁(A1203 )層，
由此形成間隔層。
根據另外一種實施方式和圖7的載體201，還進一步含有包含粗糙 表面216的間隔層212。
如上文所述的熒光檢測設備將特別被用來監控樣品里的熒光團。 特別是，本發明不僅可以用于濕或干生物傳感器(例如，生物芯片)， 還可以用于生物學和醫療圖像(細菌，細胞，膜，生物分子，病理切
片等)。
此外，本類熒光檢測設備還可以用來研究能量轉移，例如熒光共
振能量轉移(FRET)， FRET對于研究生物分子間的互相作用是非常有 價值的，但以前常常受到信號的微弱的局限。載體/熒光團的交互作用 改變了電磁能量的傳播從而改變了 FRET類型的過程。運用本發明的 熒光檢測設備件即可增強此類過程的性能。
熒光檢測設備還可以用來測量透明樣品的厚度。
熒光信號的增強程度取決于間隔層的厚度。為了測量透明樣品的 厚度，熒光檢測設備將包含如圖8所示的載體301，其中傳導層313 的表面315是粗糙的，間隔層312被安排為一個厚度梯度的形式，即 厚度從載體的一端向另一端增大。透明樣品的厚度將根據在沒有透明 樣品的載體301和加上透明樣品311的載體301之間檢測到的熒光密 度的最大偏移量進行計算。
運用此類設備的好處在于，它可以在不利用特定的橢率計類儀表 的基礎上實現厚度的精確測量。
讀者應了解，在不超越在此描述的新信息和優點的基礎上可以進 行許多改動。因此，所有此類的改動應當在后附的權利要求書中限定 的熒光檢測設備及其用途的范圍之內。
權利要求
1.一種熒光檢測設備，包括承載樣品(11)的載體裝置(1)、使樣品(11)發射熒光的樣品激發裝置(2)和用來檢測所述熒光的檢測裝置(3)，其特征在于所述的載體裝置(1)包含具有粗糙表面(15)的、用于使所述熒光偏向多個方向的層，所述的檢測裝置(3)覆蓋在觀測錐體上，以便在各個方向收集被偏轉的熒光。
2. 根據權利要求1所述的熒光檢測設備，其特征在于觀測錐體 的頂角至少為10度。
3. 根據權利要求1或2所述的熒光檢測設備，其特征在于粗糙 表面(15)具有由非零且小于100納米的粗糙度標準差(3)定義 的粗糙度。
4. 根據權利要求1至3中任意一項所述的熒光檢測設備，其特 征在于粗糙表面(15)具有由粗糙度的平均空間周期(4)定義的 粗糙度，所述粗糙度的平均空間周期(&)得自于粗糙表面(15) 形貌圖的功率譜輻射狀剖面，為非零且小于1000納米。
5. 根據權利要求1至4中任意一項所述的熒光檢測設備，其特 征在于粗糙表面(15)具有由粗糙度的空間周期范圍(M)定義的 粗糙度，所述粗糙度的空間周期范圍(M)得自于粗糙表面(15) 形貌圖的功率譜輻射狀剖面，為非零且小于1500納米。
6. 根據權利要求1至5中任意一項所述的熒光檢測設備，其特 征在于含有粗糙表面(15)的層為連續或者準連續的。
7. 根據權利要求1至6中任意一項所述的熒光檢測設備，其特 征在于含有粗糙表面(115)的層為傳導層(113)。
8. 根據權利要求7所述的熒光檢測設備，其特征在于傳導層 (113)為金屬層。
9. 根據權利要求8所述的熒光檢測設備，其特征在于金屬層由 銀、金、銅、鋁或鉑制成。
10. 根據權利要求7所述的熒光檢測設備，其特征在于傳導層 (113)為半導體。
11. 根據權利要求7至10中任意一項所述的熒光檢測設備，其特征在于傳導層(113)厚度大于20納米。
12. 根據以上權利要求中任意一項所述的熒光檢測設備，其特 征在于是載體裝置(101)包含有間隔層(112)，該間隔層對與熒光 過程有關的激發和輻射波長透明。
13. 根據權利要求12所述的熒光檢測設備，其特征在于間隔層 (112)為高分子層。
14. 根據權利要求12所述的熒光檢測設備，其特征在于間隔層 (112)為陶瓷層。
15. 根據權利要求12至14中任意一項所述的熒光檢測設備， 其特征在于間隔層(112)厚度大于20納米。
16. 根據以上權利要求中任意一項所述的熒光檢測設備，其特 征在于間隔層(112)的厚度約為60納米，傳導層(113)的厚度約 為60納米，傳導層(113)的表面粗糙度由約為20納米的粗糙度標 準差(3)、約為350納米的粗糙度平均空間周期(AA)以及約為 600納米粗糙度空間周期范圍(M)定義。
17. 根據權利要求12至14中任意一項所述的熒光檢測設備， 其特征在于間隔層(312)被設置為具有厚度梯度。
18. 根據權利要求17所述的熒光檢測設備，其特征在于間隔層 (312)的厚度由載體裝置的第一末端向載體裝置的第二末端增加。
19. 根據以上權利要求中任意一項所述的熒光檢測設備，其特 征在于激發裝置(2)覆蓋于照明錐體之上。
20. 根據以上權利要求中任意一項所述的熒光檢測設備，其用 途是監控樣品中的熒光團。
21. 根據以上權利要求中任意一項所述的熒光檢測設備，其用 途是研究熒光團間的能量轉換。
22. 根據權利要求1至19中任意一項所述的熒光檢測設備，其 用途是測量樣品厚度。
23. 根據以上權利要求中任意一項所述的熒光檢測設備的樣品 載體裝置，其特征在于包含具有粗糙表面的、能使所述熒光偏向多 個方向的層。
24. —種熒光檢測方法，包括下列步驟 一對承載于載體裝置上的樣品的激發，使得所述樣品發射熒光；—對由所述激發樣品所發射熒光的檢測； 其特征在于所述的載體裝置包含具有粗糙表面的能使所述熒光偏向 多個方向的層，所述熒光檢測步驟包含在錐體中的觀測，此錐體在 多個方向收集被偏轉的熒光。
全文摘要
本發明涉及一種熒光檢測設備，此設備包括承載樣品(111)的載體裝置(101)、使樣品(111)發射熒光的樣品激發裝置和用來檢測所述熒光的檢測裝置，所述的載體裝置(101)包含具有粗糙表面(115)的可以使所述熒光偏向多個方向的層，所述的檢測裝置覆蓋在觀測錐體上，在多個方向收集被偏轉的熒光。
文檔編號G01N21/55GK101133318SQ200680006700
公開日2008年2月27日 申請日期2006年3月2日 優先權日2005年3月3日
發明者C·里科萊奧, E·勒莫阿爾, E·福爾, M-P·方丹-奧帕爾, S·萊韋克-福爾 申請人:國家科學研究中心