通過小麥水溶性蛋白鑒定小麥品種的高效毛細管電泳方法

專利名稱：通過小麥水溶性蛋白鑒定小麥品種的高效毛細管電泳方法
技術領域：
本發明涉及一種小麥品種的快速鑒定方法，特別是通過高效毛細管電泳手 段快速分離小麥水溶性蛋白并構建標準圖譜進而在此基礎上實現對小麥品種的 鑒定方法。
背景技術：
小麥是世界上最重要的糧食作物之一，也是人類糧食消費中重要的蛋白質 來源。我國一直是世界小麥生產和消費大國，播種面積和總產都居世界第一位。 作為小麥種子蛋白重要組成部分的水溶性蛋白已受到越來越多的重視，在小麥
種子中，水溶性蛋白包括清蛋白(albumin)和球蛋白(globulin),主要是一些代 謝過程中的酶類、抑制因子等，如a-淀粉酶、蛋白酶抑制因子、調控酶、特殊 途徑的合成酶、代謝酶等，主要作用是調控小麥的各種代謝過程，對食物的功 能、淀粉的積累、小麥蛋白的級別、最終用途及顆粒的顏色等都具有重要的作 用和影響。清蛋白和球蛋白主要沉積在胚、糊粉層中，少部分存在于胚乳，分 別占種子蛋白的9%和5%左右。也有相關研究證明一些高分子量清蛋白和球蛋白
屬于小麥貯藏蛋白部分。研究表明，水溶性蛋白可以作為小麥品質和種子發育 研究以及品種鑒定的生化標記。
近年來隨著我國市場經濟的不斷發展，在小麥種子生產與經營、新品種選 育和品種權益保護以及流通加工等領域急需快速高效的小麥品種鑒定方法。目 前，鑒定小麥品種主要采用形態鑒定、同工酶鑒定、貯藏蛋白SDS凝膠電泳 (SDS-PAGE)鑒定和酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)鑒定、反相高效液相 色譜(RP-HPLC)鑒定、分子標記鑒定等方法。然而上述些方法均存在不同程 度的局限性，如形態特征易受環境因素影響，可靠性差；同工酶、蛋白質電泳 分離時間長，費工費時，多數情況下需要1-2天才能獲得分析結果，而且分辨 率低，對一些親緣關系近的品種往往無法區分，其分辨度和重復性也較差，難 以進行數量化分析和不同實驗室所得結果間的比較。另外PAGE方法還須使用 有神經毒性的丙烯酰胺以及其他污染試劑；RP-HPLC雖自動化程度高，但儀器 設備昂貴，分析成本高，分辨率也難以滿足需要；DNA分子標記技術，如PCR、 RAPD、 AFLP等，近年來研究較多，準確性較高，但技術復雜，費工費時，鑒定成本高，難以廣泛應用。因此，現有的小麥品種鑒定方法都存在一些缺點。
相對于"快速鑒定小麥品種的毛細管電泳方法"(CN200410037256.6)專 利技術，本發明提供了另外一種對小麥品種進行鑒定的高效毛細管電泳方法， 是通過小麥的水溶性蛋白的分離與鑒別實現的，而不是通過小麥種子貯藏蛋白 中醇溶蛋白的高效分離與鑒別實現的。
高效毛細管電泳(High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE)是一 種新型分離技術，具有分離效率高、分析速度快等特點，在蛋白質、氨基酸、 核酸等生物大分子的分離分析方面顯示了極大的優越性。由于種子水溶性蛋白 組成復雜，異質性高，高效的分離技術是快速分離鑒定的關鍵。毛細管電泳的 儀器裝置主要包括五個部分高壓電源、進樣系統、毛細管柱、檢測器和記錄 系統。制作毛細管的材料——熔融硅膠的等電點(pl)為1.5左右，在堿性和微酸
性(PH>2.5)溶液中，熔硅表面的硅羥基(Si-OH)電離成SiOVf吏其內表面帶 負電。負電荷表面在溶液中積聚相反電荷的離子，在管壁和溶液之間形成雙電 層。在高電場的作用下，雙電層中的水合陽離子引起的流體整體將朝負極方向 移動，該現象被稱為電滲(Electroosmosis)。粒子在毛細管內一方面受到電場作 用而在緩沖溶液中發生定向移動，即電泳；另一方面受到電滲的影響。粒子最 終的遷移速度等于電泳流和電滲流的矢量和。樣品中的正離子電泳方向與電滲 流方向一致，故最先流出；中性粒子僅在電滲流的作用下流向負極，速度較正 離子慢；負離子運動方向與電滲相反，在電滲速度大于電泳速度時，將在中性 粒子之后流出，如果負離子泳流速度大于滲流速度，則無法流出。 一般來說， 電滲流速度大于電泳速度，所以樣品中所有組分將朝一個方向移動，這樣各種 粒子因在毛細管介質中的遷移速度不同實現了分離。
影響毛細管電泳分離效果的因素較多，主要包括操作電壓、溫度、緩沖溶 液的類型與濃度、pH值、添加劑的選擇與濃度的確定、毛細管柱的改性等。在 實際應用中，需要針對的具體檢測物對這些因素進行優化，以達到最佳分離效 果。

發明內容
本發明的目的是提供一種快速分離小麥種子水溶性蛋白的高效毛細管電泳 方法，給出優化的操作程序和條件，進而通過小麥種子水溶性蛋白的HPCE圖 譜實現對小麥品種的鑒定，相對于現有的鑒定方法，該技術具有快速、準確、 成本低、可重復性好的特點。
本發明的技術方案包括取樣及樣品制備、毛細管電泳和數據處理分析，通 過建立小麥水溶性蛋白的標準高效毛細管電泳圖譜，進而實現對小麥品種或種
質進行鑒定，其特征是取單粒種子無胚端(約15-20mg),按lmg加10^il的比 例加入20%乙醇，室溫下震蕩提取15分鐘，10000rpm離心IO分鐘，上清液即 為毛細管電泳樣品；髙效毛細管電泳時的電泳緩沖液(Buffer)為0.1M磷酸一 甘氨酸緩沖液，該緩沖液pH為2.5，添加有20%乙腈和0.05%羥脯氨酰甲基纖 維素，具體電泳條件參數為
毛細管長度31.5cm
毛細管內徑5(Him
運行電壓 ll.OkV
毛細管溫度35 °C
樣品槽溫度15°C
進樣10kV,6-8秒
在上述技術方案中，為了能夠連續檢測樣品和保證檢測結果的準確性，在 進行高效毛細管電泳時，對毛細管進行沖洗必須按沖洗程序操作，按照沖洗目
的的不同，沖洗程序具體分為以下四種情況
(1) 對于新的毛細管在使用前要進行預處理沖洗，沖洗程序如下
H20 5分鐘
O.lMNaOH 10分鐘
H20 5分鐘
1MH3P04 10分鐘
電泳緩沖液 60分鐘
(2) 進樣前對毛細管進行沖洗，沖洗程序如下
H20 5分鐘
O.lMNaOH 10分鐘
H20 5分鐘
1MH3P04 10分鐘
電泳緩沖液 30分鐘
(3) 當一次鑒定測定多個樣品時，兩次樣品檢測之間要進行沖洗，沖洗 程序如下
1MH3P04 3分鐘
電泳緩沖液 3分鐘
(4) 檢測結束后對毛細管進行沖洗，沖洗程序如下
1MH3P04 H20
O.lMNaOH H20
5分鐘 5分鐘 2分鐘 15分鐘 10分鐘
本發明的優點是
(1) 樣品用量少只需半粒種子約15-20mg即可進行多次分析。利用本 方法可在10分鐘內完成一個樣品的分離，效率明顯高于常規的PAGE方法。
(2) 分辨度高明顯高于傳統電泳方法，而且圖譜穩定。
(3) 重復性高峰遷移時間和峰高的相對標準偏差(RSD)分別小于1% 和3%。
(4) 易于操作從樣品制備到蛋白質分離分析自動化程度高，方法簡單， 易于操作。每次可連續分離30個樣品，均由軟件控制。
(5) 分析成本低、無污染只需廉價毛細管和一些常用試劑，用量很少， 無毒害，對環境無污染。
圖1.普通小麥品種"濟麥20"水溶性蛋白高效毛細管電泳標準圖譜；
圖2.鄭州9023等7個不同小麥品種水溶性蛋白高效毛細管電泳比較圖譜；
圖3.優質品種(A-藁城8901， B-優選9號和C-中作8331-1)和劣質品種 (D-淮麥16， E-原冬6號和F-魯麥21)水溶性蛋白的高效毛細管電泳鑒定。
具體實施例方式
實施例1:小麥品種水溶性蛋白標準HPCE指紋圖譜的構建
(1)取樣及樣品制備
以小麥品種"濟麥20"為例。取單粒種子，用刀片去掉胚端，準確稱量(約 15-20mg)后用硫酸紙和小鐵錘扎碎成細粉，放入lml離心管中，按lmg加 的比例加入20%乙醇，室溫下震蕩提取15分鐘，10000rpm離心IO分鐘，上清


液用于毛細管電泳。
(2)毛細管電泳
① 儀器設備采用Bio-Rad公司生產的BioFocus3000型高效毛細管電泳儀 系統(配有軟件用于系統操作和數據處理)進行CE分析。
② 毛細管彈性石英毛細管柱，內徑為50pm、長度為31.5cm (檢測長度 26.5cm)，外層涂有聚酰亞胺保護層，內壁均未涂層。
③ 電泳緩沖液100mm磷酸一甘氨酸緩沖液(pH2.50，添加有20%乙腈 和0.05^羥脯氨酰甲基纖維素HPMC)。500ml磷酸一 甘氨酸緩沖液的制備方法 85X的磷酸1.6ml，甘氨酸2.0g，乙腈100ml， HPMC 0.25g，加入雙蒸水定容 至500ml，調節pH為2.50，經0.45pm濾膜過濾，4"C保存。
④ 毛細管柱沖洗方法 A.新毛細管預處理程序
H205分鐘
O.lMNaOH10分鐘
H205分鐘
1M H3P0410分鐘
電泳緩沖液60分鐘
B.進樣前沖洗:
H205分鐘
O.lMNaOH10分鐘
H20分鐘
1MH3P0410分鐘
電泳緩沖液30分鐘
C. 樣品間沖洗程序
1MH3P04 3 分鐘
電泳緩沖液 3分鐘
D. 結束實驗沖洗
1M H3P045分鐘
H205分鐘
O.lMNaOH2分鐘
H2015分鐘
N210分鐘⑤運行電泳參數
運行電壓
毛細管溫度
樣品槽溫度
進樣
電極
10kV, 6秒
由+向
⑥數據處理利用軟件進行數據處理，同時將電泳結果轉換成ASC碼， 進行Excel處理分析。
(3)指紋圖譜構建根據各蛋白組分的遷移時間、峰高、峰面積等參數構建 標準指紋圖譜。小麥品種"濟麥20"的標準圖譜如圖1所示。
實施例2不同小麥品種水溶性蛋白的分離表征與品種鑒定
(1) 實驗操作取樣及樣品制備、毛細管電泳、標準圖譜構建等同實施例1。
(2) HPCE圖譜分析根據不同品種水溶性蛋白組分的遷移時間、峰高、 峰面積等參數的差異，分析其電泳組成特征。每個品種重復電泳3-5次，計算 峰遷移時間、峰高、峰面積的相對標準偏差(RSD)，獲得各個水溶性蛋白組分 的平均值和相對標準差，作為品種真實性和純度鑒定或品種權保護的標準電泳 圖譜。
(3) 品種或種質鑒定進行品種真實性和品種權保護鑒定時，每個品種隨 機取樣分析10粒種子，每個樣品重復分離3次，根據電泳圖譜的差異進行品種 或種質鑒定。品種純度鑒定隨機取50-100粒種子，重復分離3次，然后與標準 圖譜比較，計算品種純度。
鄭州9023等6個不同小麥品種水溶性蛋白HPCE圖譜比較如圖2所示。
實施例3小麥優質資源篩選與品質改良標記輔助選擇
(1) 實驗操作取樣及樣品制備、毛細管電泳、圖譜分析等同實施例1和 同實施例2。
(2) 優質蛋白亞基鑒定與優質資源篩選通過對不同品種或種質資源材料 水溶性蛋白電泳圖譜的比較分析，鑒定只在優質品種或種質中出現的特異蛋白 亞基，作為優質蛋白篩選鑒定的標記。例如，我們通過對大量品種的分析，發 現了與優質密切相關的蛋白標記，該蛋白亞基(圖3箭頭所指)與面筋強度高 度相關，通過該標記可以對優質和劣質品種進行快速鑒定。藁城8901等6個不
同優質和劣質小麥品種水溶性蛋白毛細管電泳圖譜比較如圖3所示。
(3)標記輔助選擇通過實施例2中所鑒定的與品質密切相關的水溶性蛋 白標記選擇親本，配制雜交組合，在早期世代(一般F2-F4代)通過該標記進 行品質改良輔助選擇，可大大提高品質育種效率。
權利要求
1.一種通過小麥水溶性蛋白鑒定小麥品種的高效毛細管電泳方法，包括取樣及樣品制備、毛細管電泳和數據處理分析，通過建立小麥水溶性蛋白的標準高效毛細管電泳圖譜，進而實現對小麥品種或種質進行鑒定，其特征是取單粒種子無胚端，約15-20mg，按1mg加10μl的比例加入20％乙醇，室溫下震蕩提取15分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清液即為毛細管電泳樣品；高效毛細管電泳時的電泳緩沖液為0.1M磷酸-甘氨酸緩沖液，該緩沖液pH為2.5，添加有20％乙腈和0.05％羥脯氨酰甲基纖維素，具體電泳條件參數為毛細管長度31.5cm毛細管內徑50μm運行電壓 11.0kV毛細管溫度35℃樣品槽溫度15℃進樣10kV，6-8秒。
2. 根據權利要求1所述的高效毛細管電泳方法，其特征是為了能夠連續檢 測樣品和保證檢測結果的準確性，在進行高效毛細管電泳時，對毛細管進行沖 洗必須按沖洗程序操作，按照沖洗目的的不同，沖洗程序具體分為以下四種情 況(1)對于新的毛細管在使用前要進行預處理沖洗，沖洗程序如下H20O.lMNaOH H201MH3P04電泳緩沖液5分鐘 10分鐘 5分鐘 10分鐘 60分鐘(2)進樣前對毛細管進行沖洗，沖洗程序如下:H20O.lMNaOH H201MH3P04電泳緩沖液5分鐘 10分鐘 5分鐘 10分鐘 30分鐘(3)當一次鑒定測定多個樣品時，兩次樣品檢測之間要進行沖洗，沖洗程序如下:1MH3P04 3 分鐘電泳緩沖液 3分鐘(4)檢測結束后對毛細管進行沖洗，沖洗程序如下:1MH3P04 5 分鐘H20 5分鐘O.lMNaOH 2 分鐘H20 15分鐘N2 10分鐘。
全文摘要
本發明涉及一種小麥品種的快速鑒定方法。該方法包括取樣及樣品制備、毛細管電泳和數據處理分析，通過建立小麥水溶性蛋白的標準高效毛細管電泳圖譜，進而實現對小麥品種或種質進行鑒定，其特征是取單粒種子無胚端，約15-20mg，按1mg加10μl的比例加入20％乙醇，室溫下震蕩提取15分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清液即為毛細管電泳樣品；高效毛細管電泳時的電泳緩沖液為0.1M磷酸一甘氨酸緩沖液，該緩沖液pH為2.5，添加有20％乙腈和0.05％羥脯氨酰甲基纖維素，并給出了具體的電泳條件參數以及沖洗程序。相對于現有小麥品種的鑒定方法，該方法具有快速、準確、成本低、可重復性好的特點。
文檔編號G01N27/447GK101201334SQ20061016529
公開日2008年6月18日 申請日期2006年12月15日 優先權日2006年12月15日
發明者倩 張, 張艷貞, 晏月明, 王愛麗, 高利艷 申請人:首都師范大學