專利名稱：一種蛋白質凝膠內酶解的方法
技術領域：
本發明涉及一種適用于質譜分析的蛋白質膠內酶解的方法。
背景技術：
隨著大規模生物基因組測序工作的完成，人類已經進入了蛋白質組時代。目前在蛋白質組研究中，質譜(MS)技術是最核心的蛋白質鑒定技術(Cánovas F M，ElianeD G，Recorbet G，Jorrin J，Mock H P and Rossignol M.Plant proteome analysis.Proteomics，2004，4285-298；Chen S and Harmon A C.Advances in plantproteomics.Proteomics，2006，65504-5516)。根據離子化方法的不同，質譜主要分為基質輔助激光解吸電離飛行質譜(Matrix-assisted laserdesorption/ionization time-of-flight，MALDI TOF)和電噴霧電離飛行質譜(Electrospray ionization time-of-flight，ESI-TOF)兩大類型(Cánovas F M，Eliane D G，Recorbet G，Jorrin J，Mock H P and Rossignol M.Plant proteomeanalysis.Proteomics，2004，4285-298)。通常是通過雙向電泳技術(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)將蛋白質混合物進行分離，切取目標蛋白點，用胰蛋白酶(trypsin)進行膠內酶解，然后進行質譜分析，得到肽質量指紋譜(peptide mass fingerprinting，PMF)，最終既可以直接根據PMF數據搜庫鑒定出目標蛋白，也可以進一步通過二級質譜獲得部分肽段序列后搜庫，得到更為可靠的鑒定結果(Cánovas F M，El iane D G，Recorbet G，Jorrin J，Mock H P andRossignol M.Plant proteome analysis.Proteomics，2004，4285-298；RossignolM，Peltier J B，Mock H P，Matros A，Maldonado A M，Jorrin J V.Plant proteomeanalysisA 2004-2006 update.Proteomics，2006，65529-5548)。
無論哪種質譜鑒定技術，蛋白質膠內酶解都是至關重要的一步。目標蛋白酶解是否完全、酶切位點是否特異、酶切片斷數量(peptide number)的多少、序列覆蓋率(sequence coverage)的高低，以及酶自切程度的高低、信噪比的強弱等，都會直接影響搜庫的結果和蛋白鑒定的成功率。雖然隨著各種先進的質譜儀器的出現，蛋白鑒定的成功率已經大大提高，但儀器的進步畢竟還沒有到達不需要進行膠內酶解的程度，最終要得到可信度高、重復性好的蛋白鑒定結果，在很大程度上仍然依賴于選用合適的膠內酶解方法(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and VincentR.An optimized protein in-gel digest method for reliable proteomecharacterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)。
許多酶解方法都可以用在質譜研究中，也取得了一定的效果，但均存在一定不足(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.An optimized proteinin-gel digest method for reliable proteome characterization byMALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemi stry，2005，34685-89)。加上目前質譜鑒定技術的成本還是非常高，每次實驗都去花費大量時間和資金去比較摸索不同酶解方法，對于小規模進行質譜鑒定的實驗室來說，代價還是太高。因此，摸索一種簡便易行、效果理想的酶解方法就十分必要。
較早的膠內酶解方法是Rosenfeld等人在Analytic Biochemistry雜志上報道的(Rosenfeld J，Capdevielle J，Guillemont J C and Ferrara P.In-gel digestionof proteins for internal sequence analysis after one-or two-dimensional gelelectrophoresis.Analytical Biochemistry，1992，203173-179)；隨后，又有了幾種優化改進后的方法(Hellman U，Wernstedt C，Gonez J and Hel din C H.Improvement of an″In-Gel″Digestion Procedure for the Micropreparation ofInternal Protein Fragments for Amino Acid Sequencing.AnalyticalBiochemistry，1995，224451-455；Rachel R，Tracy I S，Charles M，JosephA L and Philip C A.Mass Spectrometry of Proteins Directly from PolyacrylamideGels.Anal Chem，1996，68(11)1910-1917；Alan D，David C and Liang L.ProteinConcentration and Enzyme Digestion on Microbeads for MALDI-TOF Peptide MassMapping of Proteins from Dilute Solutions.Anal Chem，2000，72(14)3355-3362；Volker E，Konrad B，Christine L，Hans L and Eckhard N.Improvements in Protein Identification by MALDI-TOF-MS Peptide Mapping.AnalChem，2000，72(13)2741-2750；Vukic S and Jasminka G Z.Improvement ofan in-gel tryptic digestion method for matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry peptide mapping byuse of volatile solubilizing agents.Proteomics，2001，11364-1367)。雖然這些方法已經被成功應用在質譜研究中，但均存在諸如酶解不完全、肽段復性效率低等各種不足(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.Anoptimized protein in-gel digest method for reliable proteomecharacterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)。最近(2005年)，Kumarathasan等人經過系統性研究，報道了一種改進的膠內酶解方法(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.An optimized protein in-gel digest method for reliable proteomecharacterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)，有效提高了蛋白鑒定的成功率，質譜鑒定的靈敏度較常規方法提高了6-10倍(為敘述方便，以下將該酶解方法簡稱為K法)。
雖然K法比常規酶解方法大大提高了蛋白鑒定可信度和成功率，但該方法存在幾個明顯不足。為了提高酶切位點的特意性，該方法將最終酶解的pH值調節為7.0，從而有效避免了酶的錯切。但是，牛胰蛋白酶(Trypsin)是一種堿性的酶，在pH7.5-9.0時具有最高的酶切特異性(詳見Roche公司產品說明書)。因此，通過調節pH值到中性來提高酶切特異性，是以降低Trypsin酶的活性和特異性為代價的。因此，Kumarathasan等人是通過加大酶量來進行彌補。每個蛋白點用的酶量達到500ng(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.An optimizedprotein in-gel digest method for reliable proteome characterization byMALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)，而通常有50ng就足夠了。加大酶量確實可以提高酶切效果，但加入過量的胰蛋白酶，在造成酶的浪費、提高成本(Roche公司的Trypsin價格昂貴)的同時，極易引起酶的自切和錯切，為后面質譜鑒定時如何消除酶自切峰和其它雜峰造成了很大的困難。另外，該方法還加大了最后肽段抽提的強度，通過逐步提高抽提液中乙腈(ACN)的濃度，可以獲得更好的抽提效果(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P andVincent R.An optimized protein in-gel digest method for reliable proteomecharacterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)。但是，在獲得盡可能多的肽段的同時，也將膠內的雜質一起抽提出來，從而嚴重干擾質譜鑒定時蛋白樣品有效離子化過程，造成丟峰。因此采用該方法進行酶解實驗，同樣存在酶解不充分、肽段丟失嚴重、酶消耗量大、操作繁瑣等不足，最終數據庫搜索的結果也不是太理想。
發明內容
本發明的目的是提供一種蛋白質凝膠內酶解的方法。
本發明所提供的蛋白質凝膠內酶解的方法，包括下述步驟1)將含有目標蛋白的凝膠用超純水洗滌；將凝膠脫水，干燥；2)將干燥后的凝膠用酸化過的胰蛋白酶工作液浸泡0.5-1.5h后，吸去多余酶工作液；所述酸化過的胰蛋白酶工作液是用80-120mM鹽酸溶解胰蛋白酶，酸化8-12分鐘，再用NH4HCO3將pH值調節至8.0-9.0得到的溶液；
3)加入含有Ca2+的緩沖液，37℃酶解14-18hr，去除凝膠得到蛋白酶解液。
步驟2)中所述鹽酸的濃度為100mM；所述NH4HCO3的濃度為50mM；所述100mM鹽酸溶解胰蛋白酶后的酶濃度為0.08-0.12μg/μl，優選為0.1μg/μl；所述胰蛋白酶工作液的胰蛋白酶濃度為8-12ng/μl，優選為10ng/μl。
所述步驟1)中，超純水的用量為50-150μl/50μg含蛋白凝膠，優選為100μl/50μg含蛋白凝膠，洗滌時間為15-45min，優選為30min；洗滌次數為2次或2次以上，優選為2次。
所述步驟1)中還包括洗滌后，用脫色液脫去凝膠中考馬斯亮藍顏色的步驟；所述脫色液為含有質量百分含量為45-55％乙腈和質量百分含量為0.356-0.435％NH4HCO3，pH值為8.0-9.0的水溶液。所述脫色液優選為含有質量百分含量為50％乙腈和質量百分含量為0.395％NH4HCO3，pH值為8.0-9.0的水溶液。
所述步驟1)中用乙腈浸泡脫水。
所述步驟3)中的含有Ca2+的緩沖液為含有0.8-1.2mM CaCl2和20-30mMNH4HCO3，pH值為8.0-9.0的溶液。
所述含有Ca2+的緩沖液優選為含有1mM CaCl2和25m MNH4HCO3，pH值為8.5的溶液。
本發明的方法是一種適合于質譜分析的簡化的蛋白質膠內酶解方法。本發明的方法，首先，加大了凝膠洗滌強度(每50μg蛋白凝膠改用80-120μl超純水洗兩次，每次半個小時)，可以有效去除雜質和部分鹽離子；其次，增加酶酸化處理的步驟(用100mM鹽酸酸化10分鐘)，有效地提高了胰蛋白酶的酶解活性；同時，在預酶解時免除了加入CaCL2的步驟(Ca2+對于Trypsin的活性有重要作用)，并吸去多余的酶液，可以有效避免在還沒有正式進行酶解之前Trypsin的自切作用。本發明的方法得到的酶解液，可以直接進行質譜分析，不但節省了肽段抽提和真空干燥等繁瑣的步驟，而且可以較好地解決真空干燥之后肽段難于溶解的難題。
以鹽角草Rubisco和BSA為研究材料的實驗表明，利用K法和本發明簡化法酶解BSA和Rubisco蛋白，用MALDI TOF分析酶解產物，最終通過Mascot Distiller軟件搜索NCBI數據庫，都能購獲得很好的鑒定結果，得分和序列覆蓋率都很高(表1)，說明這兩種酶解方法都可以用在質譜研究中。
本發明簡化的膠內酶解方法與k法得到的MALDI TOF數據最終搜庫結果進行綜合比較，本發明簡化膠內酶解方法比K法得到的結果更為可信。首先，本發明簡化法得到的數據庫搜索得分高。用K法得到的Rubisco蛋白和BSA得分分別為104分(圖1D)和117分(圖2D)，而本發明簡化法得分分別為117分(圖1E)和148分(圖2E)(表1)。其次，本發明簡化法得到的PMF圖譜信息量要遠遠多于K法。用本發明簡化法酶解，分別可以得到53條(圖1C)和70條總肽段(圖2C)，而用K法，分別得到得49條(圖1B)和33條肽段(圖2B)。另外，本發明簡化法可以明顯提高鑒定蛋白的序列覆蓋率。在進行Rubisco蛋白和BSA質譜實驗中，本發明簡化法酶解產物中，分別有16條和23條肽段能夠和數據庫中的序列匹配得上，覆蓋率高達41％和37％。利用K法進行酶解，最終得不到這么高的序列覆蓋率(表1)。
表1.不同膠內酶解方法得到的質譜信息的數據庫搜索結果比較
本發明的方法在降低操作難度、簡化實驗步驟、降低成本的同時，能夠有效提高了酶解效率，獲得更多肽段信息，得到更高的數據庫搜索分值，顯著提高序列覆蓋率，最終取得了更好的質譜鑒定結果。因此，本發明的方法具有質譜兼容性，能夠有效地減少蛋白質酶解后肽段的損失，得到更為可靠的蛋白質鑒定結果，可作為一種效果好、穩定的膠內酶解方法，應用在蛋白質組學研究中。
圖1A為鹽角草Rubisco蛋白雙向電泳分離結果圖1B為用K法酶解鹽角草Rubisco蛋白后獲得的質譜1C用本發明膠內酶解法酶解鹽角草Rubisco蛋白后獲得的質譜1D為用K法酶解鹽角草Rubisco蛋白后獲得的質譜數據的NCBI搜庫結果圖1E為用本發明膠內酶解法酶解鹽角草Rubisco蛋白后獲得的質譜數據的NCBI搜庫結果圖2A為BSA單向電泳分離結果圖2B為用K法酶解BSA后獲得的質譜2C為用本發明簡化膠內酶解法酶解BSA后獲得的質譜2D為用K法酶解BSA后獲得的質譜數據的NCBI搜庫結果圖2E為用本發明簡化膠內酶解法酶解BSA后獲得的質譜數據的NCBI搜庫結果
具體實施例方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
下述實施例中以鹽角草Rubisco蛋白和BSA為研究材料，系統地比較了本發明蛋白質的簡化的膠內酶解法(簡化法)和最新報道的酶解方法(Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.An optimized protein in-gel digestmethod for reliable proteome characterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemi stry，2005，34685-89；以下簡稱K法)的質譜鑒定效果。
所用蛋白材料鹽角草Rubisco蛋白提取自溫室種植的鹽角草(Salicorniaeuropaea)，鹽角草的培養方法為種子萌發后，用1/2 Hoagland營養液澆灌，每3天1次，澆透。一個月后取材，用液氮研磨后置-80℃保存。
牛血清蛋白(BSA)購自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。
下述實施例中所用的試劑胰蛋白酶(Trypsin)購自瑞典Roche公司(商品目錄號Cat.No.11418 033 001)，為經過修飾的質譜測序級產品，常規分析純藥品購自北京化工廠；所用到的其它試劑如無特別說明，均購自Amersham公司(Amersham Biosciences，Sweden)，雙向電泳及質譜分析中所用到的水均為超純滅菌水。
在利用質譜技術鑒定蛋白時，體現最終鑒定結果好壞的最為關鍵的指標就是搜庫得分高低，分值越高，說明鑒定結果越可靠，蛋白鑒定的可信度就越高(RossignolM，Peltier J B，Mock H P，Matros A，Maldonado A M，Jorrin J V.Plant proteomeanalysisA 2004-2006 update.Proteomics，2006，65529-5548)。在Mascot搜索中，通常軟件認為最終搜庫得分大于67分時，則可信度達到95％以上，鑒定的蛋白是可信的。體現蛋白鑒定結果好壞的另外一個參數是序列覆蓋率(SequencingCoverage，SC)，序列覆蓋率越高，說明酶解產物中包含的目標蛋白的肽段序列越多，鑒定結果當然就越可靠。此外，所獲得的肽段總數與能夠匹配得上得肽段得數目也是重要的參考因素，通常肽段總數越多，能配對的肽段數量越大，結果越可信。
下面對本發明的簡化膠內酶解方法利用上述指標進行效果驗證實施例1、簡化膠內酶解方法酶解鹽角草Rubisco蛋白及其效果驗證在綠色植物中，Rubisco蛋白(ribμlose-1，5-bisphospatecarboxylase/oxygenase)含量非常豐富，可以達到可溶性總蛋白的50％以上，并且不同植物的Rubisco蛋白具有很高的保守性(Rossignol M，Peltier J B，Mock H P，Matros A，Maldonado A M，JorrinJ V.Plant proteome analysisA 2004-2006update.Proteomics，2006，65529-5548)。在質譜研究中，通常用Rubisco蛋白來檢測相關實驗條件是否適合。
1、蛋白質電泳及目標蛋白點的切取按照Saravanan和Rose的改進酚抽法(Saravanan R S and Rose J C.A criticalevaluation of sample extraction techniques for enhanced proteomic analysisof recalcitrant plant tissues.Proteomics，2004，42522-2532)提取鹽角草地上部分(shoot)總蛋白，按Bradford方法定量蛋白質(Bradford M M.A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem，1976，72248-254)。取700μg鹽角草地上部分總蛋白，進行雙向電泳分離，鹽角草總蛋白雙向電泳具體操作按照Amersham公司雙向電泳說明書進行。雙向電泳(2-DE)結果顯示，鹽角草地上部分總蛋白中，Rubisco蛋白大亞基含量同樣非常高(圖1A中箭頭所示)。因此，用它來摸索酶解以及進行質譜分析、數據庫分析等條件。小心切取含量最豐富的蛋白點(Rubisco)，平均分成100份，則每份中含有約5μg Rubisco蛋白。將凝膠樣品置于干凈的1.5毫升離心管中，-80℃保存備用。
2、簡化膠內酶解方法酶解蛋白將步驟1得到的-80℃保存的含有目標蛋白點的凝膠中的一份約5μg Rubisco蛋白的樣品，置室溫解凍10min，平均分成5等份，每份蛋白含量為1μg Rubisco蛋白(含該蛋白的凝膠為50ug)，取兩份，分別用本發明的簡化膠內酶解方法和常規膠內酶解方法。常規膠內酶解方法按照Kumarathasan等人((Kumarathasan P，Mohottalage S，Goegan P and Vincent R.An optimized protein in-gel digestmethod for reliable proteome characterization by MALDI-TOF-MS analysis.Analytical Biochemistry，2005，34685-89)的方法進行(簡稱K法)。
本發明簡化膠內酶解方法，具體操作步驟如下(1)洗滌將有1μg Rubisco蛋白的凝膠(凝膠為50ug)置于干凈的1.5毫升離心管中，加入100μl超純水(ddH2O)，輕輕混勻30min，瞬時離心(室溫，1000g，1min)，棄上清。重復該步驟一次。
(2)脫色步驟(1)洗滌過的凝膠，用50μl脫色液(pH為8.5，含有質量百分含量為50％乙腈(ACN)和質量百分含量為0.395％NH4HCO3的水溶液)脫色兩次，每次30min，期間混勻3到5次。若顏色脫不盡，可以再脫色一次，直到考馬斯亮藍顏色脫盡為止，然后離心(室溫，1000g，1min)，棄上清。
(3)脫水干燥在裝有步驟(2)脫色過的凝膠的離心管中，加入50μl乙腈(ACN)，置室溫5min，離心(室溫，1000g，1min)后棄上清。重復一次。在超凈臺中微風吹干約1hr，讓凝膠充分干燥。
(4)酶工作液的配制向胰蛋白酶(Trypsin)干粉(Roche公司修飾測序級產品)加入100mM鹽酸，使酶的終濃度為0.1μg/μl，常溫酸化10分鐘，得到Trypsin原液。分裝成20μl/管，-20℃可以儲存一個月。使用之前再向原液中加入9倍體積的50mM NH4HCO3(pH 8.5)，混勻即得Trypsin酶工作液(酶終濃度為10ng/μl)。
(5)預酶解向干燥好的凝膠中加入10μl步驟(4)制備的Trypsin酶工作液(10ng/μl)，4℃放置1h，使酶液充分浸入膠粒中。不用離心，吸去多余的酶液。
(6)酶解加入8μl酶緩沖液(含有1mM CaCL2和25mM NH4HCO3，pH為8.5的溶液)，此時酶解反應體系的pH為8.5，37℃水浴酶解16hr。
(7)酶解完成后，在常溫下5000g離心5min，小心吸取上清，將上清轉移到PCR薄壁管中，直接利用上清進行質譜分析。
3、酶解產物的質譜鑒定及數據庫搜索利用Bruker公司的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI TOF MS/MS II)進行K法酶解和簡化酶解法的酶解產物進行鑒定，并以基質峰、酶自動降解片段峰進行校正，測定各肽段的質譜數據，具體操作按照說明書進行。
結果表明，利用K法酶解Rubisco后進行MALDI TOF分析，得到的PMF圖譜中，有49條肽段，質核比(m/z)分布從700到3000(圖1B)；而用本發明的簡化酶解法進行相同實驗，可以得到53條肽段，主峰主要分布在1000到2000之間，更加利于數據庫搜索，并且主要峰的信噪比(S/N)也提高了很多(圖1C)。這些結果說明，利用K法酶解，會造成肽段丟失，引起質譜圖譜部分峰丟失，從而造成蛋白鑒定得分降低，而用本發明的簡化酶解法，成功的解決了這一問題。
將利用質譜分析得到PMF圖譜數據通過Mascot Distiller軟件進行數據分析，然后通過Matrixscience搜索網站(http://www.matrixscience.com/search)，在相應的查詢條件下(具體查詢條件EnzymeTrypsin，Allow up to 1 missed cleavage，Peptide tolerance±0.3 Da，Mass valuesMH+，Monoisotopicaverage，Reporttop20 hits)搜索NCBI數據庫，得到各蛋白的具體鑒定信息。用K法和本發明簡化膠內酶解法酶解鹽角草Rubisco蛋白后獲得的質譜數據的NCBI搜庫結果分別如圖1D和圖1E所示。結果表明，本發明簡化法得到的數據庫搜索得分高，用K法得到的Rubisco蛋白得分為104分(圖1D)，而簡化法得分為117分(圖1E)。
實施例2、簡化膠內酶解方法酶解牛血清蛋白(BSA)及其效果驗證牛血清蛋白(BSA)是牛血清中含量非常豐富的一種蛋白，在NCBI數據庫中，有大量的數據信息可供參考，從而大大降低了利用質譜技術鑒定該蛋白的難度。為了對K法和簡化酶解法進行量化比較，以BSA為實驗材料進行了進一步對比研究。
取10μg-5ng BSA進行單向電泳分離，不同量的BSA經過單向SDS-PAGE分離后(圖2A)，手工切取含量為0.1微克的蛋白條帶(圖2A，箭頭所指的條帶)，平均分為10等份，則每份凝膠中含有10ng牛血清蛋白(含該蛋白的凝膠的重量為50ug)。取兩份，分別用實施例1所述的K法和本發明簡化膠內酶解法進行膠內酶解。
利用Bruker公司的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI TOF MS/MS II)進行K法酶解和本發明的簡化酶解法的酶解產物進行鑒定，并以基質峰、酶自動降解片段峰進行校正，測定各肽段的質譜數據，具體操作按照說明書進行。然后按照相同查詢條件(具體查詢條件EnzymeTrypsin，Allow up to 1 missed cleavage，Peptide tolerance±0.3 Da，Mass valuesMH+，Monoisotopicaverage，Reporttop20hits)進行數據庫搜索。重復三次。結果表明，在MALDI TOF所得的肽指紋圖譜(PMF)中，利用K法酶解可以得到33條肽段(圖2B)，數據庫搜索得分為117分(圖2D)；而用簡化法可獲得70條肽段，信息量約為K法的2倍(圖2C)，蛋白鑒定得分為148分(圖2E)，遠遠比前者要高。這些結果進一步說明，在蛋白量較少(10ng)的情況下，簡化酶解方法優越性更為明顯，可以得到更多PMF數據，為搜庫提供更多有用信息，從而得到更高的分值，有效提高了蛋白質鑒定的可信度和成功率。
權利要求
1.一種蛋白質凝膠內酶解的方法，包括下述步驟1)將含有目標蛋白的凝膠用超純水洗滌；將凝膠脫水，干燥；2)將干燥后的凝膠用酸化過的胰蛋白酶工作液浸泡0.5-1.5h后，吸去多余酶工作液；所述酸化過的胰蛋白酶工作液是用80-120mM鹽酸溶解胰蛋白酶，酸化8-12分鐘，再用NH4HCO3將pH值調節至8.0-9.0得到的溶液；3)加入含有Ca2+的緩沖液，37℃酶解14-18h，去除凝膠得到蛋白酶解液。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中所述鹽酸的濃度為100mM；所述NH4HCO3的濃度為50mM；所述100mM鹽酸溶解胰蛋白酶后的酶濃度為0.08-0.12μg/μl；所述胰蛋白酶工作液的胰蛋白酶濃度為8-12ng/μl。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，超純水的用量為80-120μl/50μg含蛋白凝膠，洗滌時間為20-40min；洗滌次數為2次或2次以上。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述100mM鹽酸溶解胰蛋白酶后的酶濃度為0.1μg/μl；所述胰蛋白酶工作液的胰蛋白酶濃度為10ng/μl。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，超純水的用量為100μl/50ug含蛋白凝膠，洗滌時間為30min；洗滌次數為2次。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟1)中還包括洗滌后，用脫色液脫去凝膠中考馬斯亮藍顏色的步驟；所述脫色液為含有質量百分含量為45-55％乙腈和質量百分含量為0.356-0.435％NH4HCO3，pH值為8.0-9.0的水溶液。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述脫色液為含有質量百分含量為50％乙腈和質量百分含量為0.395％NH4HCO3，pH值為8.5的水溶液。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟1)中用乙腈浸泡脫水。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟3)中的含有Ca2+的緩沖液為含有0.8-1.2mM CaCl2和20-30mM NH4HCO3，pH值為8.0-9.0的水溶液。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述含有Ca2+的緩沖液為含有1mMCaCl2和25mM NH4HCO3，pH值為8.5的水溶液。
全文摘要
本發明公開了一種蛋白質凝膠內酶解的方法。該方法包括下述步驟1)將含有目標蛋白的凝膠用超純水洗滌；將凝膠脫水，干燥；2)將干燥后的凝膠用酸化過的胰蛋白酶工作液浸泡0.5－1.5h后，吸去多余酶工作液；所述酸化過的胰蛋白酶工作液是用80－120mM鹽酸溶解胰蛋白酶，酸化8－12分鐘，再用NH
文檔編號G01N30/00GK1987401SQ20061016528
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月15日 優先權日2006年12月15日
發明者李銀心, 王旭初 申請人:中國科學院植物研究所